细菌的分离培养及培养性状的观察
实验四 细菌的分离培养及培养性状的观察
在细菌学检验中，细菌的分离培养是重要的基本技术之一。从混杂微生物中获得单一菌株纯培养的方法称为分离；纯培养是指一株菌种或一个培养物中所有的细菌都是由一个细胞分裂、繁殖而产生的后代。分离培养的目的在于从被检材料中，或者从污染的众多杂菌中分离出纯的病原菌。细菌分离培养应先从被检材料或病料中分离培养单个菌落，然后钓取可疑菌落进行纯培养，再将纯培养物移植培养。
目的要求
1．学习、掌握需氧菌和厌氧菌分离培养的基本要领和技术。
2．了解细菌的菌落形态及其在各种培养基上的培养性状。
3．了解培养性状对细菌鉴别的重要意义。
4．掌握钓菌、纯培养及移植技术。
操作步骤
一．需氧性细菌分离培养法
1. 平板划线分离法
菌种被其他杂菌污染时或混合菌悬液常用平板划线法进行纯种分离，此法是借助将蘸有混合菌悬液的接种环在平板表面多方向连续划线，使混杂的微生物细胞在平板表面分散，经培养得到分散的由单个微生物细胞繁殖而成的菌落，从而达到纯化目的。 但划线分离的培养基必须事先倾倒好，需充分冷凝待平板稍干后才可使用；为便于划线，一般培养基不宜太薄，每皿约倾倒20 ml 培养基，培养基应厚薄均匀，平板表面光滑。划线分离主要有连续划线法（图4-1）和分区划线法（图4-2）两种。划线法示意图见图4-3。
（1）连续划线法
以无菌操作用接种环直接取
平板上待分离纯化的菌落。将菌种
点种在平板边缘一处，取出接种
环，烧去多余菌体。将接种环再次
通过稍打开皿盖的缝隙伸入平板，
在平板边缘空白处接触一下使接
种环冷却，然后从接种细菌的部位
在平板上自左向右轻轻划线，划线时平板面与接种环面成30～40度
角，以手腕力量在平板表面轻巧滑
动划线，接种环不要嵌入培养基内划破
培养基，线条要平行密集，充分利用平
板表面积，注意勿使前后两条线重叠。
划线完毕，关上皿盖。灼烧接种环，待
冷却后放置接种架上。培 养皿倒置于适
宜的恒温箱内培养。培养后在划线平板
上观察沿划线处长出的菌落形态，涂片镜检为纯种后再接种斜面。 (2)分区划线法（四分区划线法）
取菌、接种、培养方法与“连续划
线法”相似。分区划线法划线分离时平
图4-1连续划线法 图4-2分区划线法
图4-3 划线分离示意图
板分4个区，故又称四分区划线法。其中第4区是单菌落的主要分布区，故其划线面积应最大。为防止第4区内划线与1、2、3区线条相接触，应使4区线条与1区线条相平行，这样区与区间线条夹角最好保持120度左右。先将接种环蘸取少量菌在平板上1区划3-5条平行线，取出接种环，左手关上皿盖，将平板转动60～70度。灼烧接种环，待在平板边缘上冷却后，再按以上方法以1区划线的菌体为菌源，由1区向2区作第2次平行划线。第2次划线完毕，同时再把平皿转动约60～70度，同样依次在3、4区划线。划线完毕，灼烧接种环，关上皿盖，倒置于37℃恒温箱中培养24h后，在划线区观察单菌落。
2. 倾注平皿分离法
被检材料若含有两种或两种以上细菌时,可借助溶化的琼脂将细菌稀释，待琼脂冷凝后,分散的细菌就被固定在原地形成菌落.这样也能达到分得纯种的目的。根据材料中存在菌数的多少，倾注平皿前可将被检材料不稀释或用生理盐水作适当稀释。其具体方法如下：取三支预先准备的普通琼脂培养基试管，水浴加热融化，冷至约50℃，用火焰灭菌接种环钓取待分离物接种至第一管内，充分摇匀后，自第一管取一接种环内容物至第二管，以同样方法自第二管移种至第三管。然后分别倾注一个已灭菌的平皿，凝固后倒转置于37℃温箱内培养24h。结果多数细菌在琼脂内生长成菌落，仅少数菌落出现在表面，通常第一个平板内的菌落数较多而密集，第二、三个平板则逐渐减少，可见单个菌落。
3. 芽胞需氧菌分离培养法
如果被检材料中可疑有带芽孢的细菌，可先将被检材料加少量生理盐水或肉汤，置于80℃水浴箱中维持15～20分钟，或85℃加热10分钟，再进行培养。材料中若有带芽孢的细菌仍可存活而生长繁殖，不耐热的细菌繁殖体则被杀灭。
4．利用化学药品的分离培养法
（1）抑菌作用有些药品对某些细菌有极强的抑制作用，而对另外一些细菌没有抑制作用，所以可利用这种特性进行细菌的分离，例如通常在培养基中加入结晶紫或青霉素等化学药品来抑制革兰氏阳性菌的生长，以分离得到革兰氏阴性菌。
（2）杀菌作用将病料如结核病料用15％硫酸溶液处理，其他杂菌均被杀死，而结核杆菌因具有抗酸性而存活。
（3）鉴别作用利用细菌对某种糖的分解能力，通过培养基中指示剂的变化来鉴别某种细菌。例如远藤氏培养基可以用来鉴别大肠杆菌与沙门氏杆菌。
5. 实验动物分离法
被检病料中疑有某种病原菌存在，可将病料以无菌操作取出，放入灭菌乳钵或组织匀浆器内，加3～5倍量无菌生理盐水制成混悬液，吸取一定量混悬液注射（肌肉、腹腔、皮下或静脉）入易感实验动物,待实验动物死后，取其脏器，常可分离到纯的病原菌。例如，疑有猪丹毒杆菌存在的病料，可注射于鸽体，鸽死后，再取其脾脏以分离猪丹毒杆菌，可得到纯培养。
6. 琼脂斜面分离法
取琼脂斜面3管，用接种环蘸取欲检病料少许（如为脏器，先将表面烧烙后，用灭菌解剖刀切开，以灭菌接种环由切口插入、转动、钓取组织），混合于第1管的凝集水中，再作斜面划线；然后抽出接种环，不经烧灼，继续在第2管、第3管斜面上作同样划线。划毕，置37℃温箱中培养。经此法分离培养后，第2管的菌落较第1管为少，第3管的菌落更少，如此较易得到单个菌落，达到纯培养之目的。
7. 琼脂平板涂布分离法
被检病料如血液、腹水等，可用灭菌毛细吸管或吸管吸取1～2滴置于平板中央，用灭菌的L形玻棒作均匀涂布。如估计细菌数很多，可直接用火焰灭菌的接种环钓菌，并做分区划线。如为脏器病料，可先作成乳悬液再行涂布；或取其一小块，用镊子夹住，表面烧烙
后，用灭菌刀切开，以其切面直接进行涂布，此法适用于含菌量较少的病料的分离。
8. 营养肉汤分离法
当组织病料中含病原菌少，或有抗菌药残留时，用上述琼脂斜面或平板分离法可能无菌落长出，这时可以无菌操作剪取一小块病料直接投入肉汤，经37℃培养，在肉汤中长出细菌后，再用琼脂斜面或琼脂平板分离。
二、厌氧性细菌分离培养法
细菌接种后，直接放在恒温箱内培养，可以使需氧菌与兼性厌氧菌生长繁殖；但对厌氧菌，则需将培养环境或培养基中的氧气除去，或将氧化型物质还原，降低其氧化还原电势，才能生长繁殖。在有氧的环境下，培养基的氧化还原电势较高，不适于厌氧菌的生长。为使培养基降低电势，降低培养环境的氧分压是十分必要的。现有的厌氧培养法很多，主要有生物学法、化学法和物理学法，可根据各实验室的具体情况而选用。
（一）生物学方法
培养基中含有植物组织（马铃薯、燕麦、发芽谷物等）或动物组织（新鲜动物组织小片，或加热的肌肉、心脑等），因组织的呼吸作用，以及组织中可氧化物质的氧化而消耗氧气（肌肉、脑磷脂中不饱和脂肪酸的氧化，碎肉培养基的应用），造成厌氧环境，以利于厌氧性细菌的生长繁殖。同时，组织中所含的还原性化合物（谷胱甘肽）也可使氧化-还原电势下降。
此外，将厌氧菌与需氧菌共同培养在同一环境中，则环境中的氧被需氧菌消耗，造成厌氧环境，也有利于厌氧菌的生长繁殖。
1. 动物组织及其他物质加入法在液体培养基内加入肝脏、肾脏等动物脏器，因其中的半胱氨酸的一SH基极不稳定，为强还原剂，所以可利用此培养基进行厌氧培养，在培养之前将肝片肉汤加热，以驱出空气，冷却，然后接种培养。
2. 共栖培养法将厌氧菌与需氧菌共同培养在同一个平皿内，利用需氧菌的生长繁殖将氧气消耗后，造成厌氧环境利于厌氧菌生长。其具体方法是将培养皿的一半接种消耗氧气能力极强的需氧菌如灵杆菌、大肠杆菌、枯草杆菌等。另一半接种厌氧菌，接种后将平皿倒扣在一块玻璃板上，并用石蜡密封，置37℃恒温箱中培养2～3d，即可观察到需氧菌和厌氧菌均先后生长。
（二）化学方法
利用还原能力强的化学物质，将环境或培养基内的氧气消耗，或还原氧化型物质，降低氧化-还原电势。
1. 焦性没食子酸法焦性没食子酸在碱性溶液内能大量地吸收氧而造成厌氧环境，有利于厌氧菌的生长繁殖。通常100cm3空间用焦性没食子酸1g及10％氢氧化钠或氢氧化钾10m1。具体方法有下列几种：
（1）平板培养法将厌氧菌划线接种于适宜的琼脂平板，取一小团直径约2cm的脱脂棉，置于平皿盖的内面中央，其上滴加0.5ml 10％氢氧化钠溶液；在靠近脱脂棉的一侧放置0.5g焦性没食子酸，暂勿使两者接触。立即将已接种的平板覆盖于平皿盖上，迅速用融化的石蜡密封平皿四周。封毕，轻轻摇动平皿，使被氢氧化钠溶液浸湿的脱脂棉与焦性没食子酸接触，然后置37℃恒温箱中培养24～48h后，取出观察。
（2）Buchner氏试管法（图4-4）取一大试管，在管底放焦性没食子酸0.5g及玻璃珠
数个或放一螺旋状铅丝。将已接
种的培养管放入大试管中，迅速
加入2％NaOH溶液0.5ml，立即
将试管口用橡皮塞塞紧，必要时
周围用石蜡密封。37℃培养24～
48h后观察。
图4-4 Buchner氏厌氧培养法图4-5 瑞氏厌氧培养法
（3）瑞氏厌氧培养法（图4-5） 将已接种细菌的培养管的脱脂棉棉塞在火焰中灼烧灭菌后，塞入管中离培养基1～1.5cm 处，置适量焦性没食子酸于其上，加入10%NaOH 溶液2ml ，迅速用橡皮塞将管口塞紧，以胶泥或石蜡严密封闭置温箱中培养。
（4）史氏厌氧培养法 用图4-6所示的厌氧培养皿，在皿底一边置焦性没食子酸，另一边置NaOH 溶液，将已接种的平皿翻盖于皿上，并将接合处用胶泥或石蜡密封，然后摇动底部，使氢氧化钠与焦性没食子酸混合，置温箱中培养。
（5）平皿厌氧培养法 置一片中有小圆孔的金属板于两平皿之间，上面的平皿接种细菌，下面的平皿盛焦性没食子酸及氢氧化钠溶液，用胶泥封闭后置温箱中培养（图4-7）
（6）玻罐或干燥器法 置适量焦性没食子酸于一干燥器或玻罐的隔板下面，将培养皿或试管置于隔板上，并在玻罐内置美兰指示剂一管，从罐侧加入氢氧化钠溶液于罐底，将焦
性没食子酸用纸或纱布包好，用
线系住，暂勿与氢氧化钠接触，
等一切准备好后，将线放下，使
焦性没食子酸落入氢氧化钠溶
液中，立即将盖盖好，密封，置温箱中培养。 2. 李伏夫（B.M.JIbBOB ）
氏法 此法是利用连二亚硫酸
钠（Sodium hyerosulphite ）和碳
酸钠以吸收空气中的氧气,释放二氧化碳造成厌氧环境。其反应式如下：
Na 2S 2O 4+Na 2CO 3+O 2→Na 2SO 4+Na 2SO 3+CO 2
取一有盖的玻璃罐，罐底垫一薄层棉花，将接种好的平皿重叠正放于罐内（如是液体培养基，则直立于罐内），最上端保留可容纳1～2个平皿的空间（视玻罐的体积而定），按玻
罐的体积每1000cm 3空间用连二亚硫酸钠及碳酸钠各30g ，在纸上混匀后，盛于上面的空平
皿中，加水少许使混合物潮湿，但不可过湿，以免罐内水分过多。若用无盖玻罐，可将平皿重叠正放在浅底容器上，以无盖玻罐置于皿上，罐口周围用胶泥或水银封闭,如图4-8所示。
3. 硫乙醇酸钠法 硫乙醇酸钠是一种还原剂，加入培养基中，能除去其中的氧或还原氧化型物质，促使厌氧菌生长。其它可用的还原剂包括葡萄糖、维生素C 及半胱氨酸等。
（1）液体培养基法 将细菌接入含0.1%的硫乙醇酸钠液体培养基中，并加入美兰溶液作为氧化还原的指示剂，37℃培养24～48h 后观察，在无氧条件下，美兰被还原成无色。
（2）固体培养基法 利用特殊构造的Brewer 氏培养皿，可使厌氧菌在培养基表面生长而形成孤立的菌落。具体方法如下：先将Brewer 氏培养皿干热灭菌，将溶化冷却至50℃左右的硫乙醇酸钠固体培养基倾入皿内。待琼脂冷凝后，将厌氧菌接种于培养基的中央部分。盖上皿盖，使皿盖内缘与培养基外围部分相互紧密接触（图4-9）。此时皿盖与培养基中央部分留在空隙间的氧气被硫乙醇酸钠还原，美兰指示剂逐渐褪色，而外缘部分，因与大气相通，仍呈蓝色。将Brewer 氏培养皿于37℃恒温箱内24～48h 后观察。
图4-6 史氏厌氧培养法 图4-7 平皿厌氧培养法
图4-8 李伏夫氏厌氧培养法 图4-9 Brewer 氏培养皿 图4-10 Mc1gtosh －
Fildes 二氏厌氧罐
（三） 物理学方法
利用加热、密封、抽气等物理方法，以驱除或隔绝环境及培养基中的氧气，造成厌氧环境，有利于厌氧菌的生长繁殖。
1. 厌氧罐法 常用的厌氧罐有Brewer 氏罐、Brown 氏罐和Mc1gtosh －Fildes 二氏罐（图4-10）。将接种好的厌氧菌培养皿依次放于厌氧罐中，先抽去部分空气，代以氢气至大气压。通电，使罐中残存的氧与氢经受铂或钯的催化而化合成水，使罐内氧气全部消失。将整个厌氧罐放入温箱培养。
2. 真空干燥器法 将接种好的平皿或试管放入真空干燥器中，开动抽气机，抽至高度真空后，替代以氢、氮或二氧化碳气体。将整个干燥器放进孵育箱中培养。
3. 加热密封法 将液体培养基放在阿诺氏锅内加热10min ，驱除溶解液体中的空气，取出，迅速置于冷水中冷却。接种厌氧菌后，在培养基液面覆盖一层0.5cm 的无菌凡士林石蜡。置37℃培养24～48h 后观察。
4. 高层琼脂柱法 加热融化一管适合分离厌氧菌用的琼脂培养基，待冷至50℃左右，接入少许经适当稀释的待分离的培养物或含菌材料，充分摇震均匀。在琼脂凝固前，迅速以无菌滴管吸取上述已接种的琼脂培养基，注入准备好的玻璃管内（长约15 cm ，一端塞小胶塞或小木塞，另一端塞棉花塞，高压灭菌备用），装至4／5左右之处，塞好棉花塞，放在大试管或玻璃筒内，置37℃恒温箱中培养。长出菌落后，拔去胶塞和棉花塞，以无菌玻棒将琼脂柱推出于无菌平皿中，再用灭菌接种环钓取独立菌落作厌氧纯培养。
三、兼性厌氧菌的分离培养方法(二氧化碳培养法)
在细菌培养中，有少数细菌（如牛型布氏杆菌）在含有5～10％二氧化碳的环境下才能生长。最简单的二氧化碳培养法是烛缸法：将接种细菌的培养基置玻璃干燥器或其他可以密闭的玻璃缸内，在其内点燃一小段蜡烛，加上盖（盖边涂上凡士林以防漏气），约1min 左右蜡烛自然熄灭，此时缸内氧气已被消耗，缸内所含二氧化碳约5～10％。注意蜡烛勿太长，而且不宜靠近缸壁，以免因局部玻璃过热而破裂。也可用化学物质作用生成二氧化碳气体如碳酸氢钠与硫酸钠或碳酸氢钠与硫酸。
四、细菌的钓菌、纯培养和移植
将划线分离培养37℃24h 的平板从温箱中取出，挑取单个菌落，经涂片、染色镜检，证明不含杂菌，此时用接种环挑取单个菌落，移植于琼脂斜面培养，所得培养物即为纯培养物，再作其它各项试验检查和致病性试验等。具体操作方法如下：
1. 接种环移植法 两试管斜面移植时，左
手斜持菌种管和新鲜空白琼脂斜面各一管，使管
口互相并齐，稍上斜，管底握于手中，松动两管
棉塞，以便接种时容易拔出（图4-11）。右手食
指和拇指执接种环，烧灼接种环，以右手小指扭
开一管的棉塞，无名指扭开第二管的棉塞。棉塞
头向掌心内，将试管口通过酒精灯火焰灭菌，待
冷却后将接种环插入菌种管中，钓取细菌少许取出接种环立即接种在新鲜空白琼脂斜面上，不要
碰及管壁，直达斜面底部。从斜面底部开始划曲
线或直线，向上至斜面顶端为止，管口通过火焰灭菌后，塞好棉塞。接种完毕，将接种环烧灼灭菌后放下接种环。用蜡笔在试管上标明细菌名称和接种日期，置37℃温箱中培养。斜面接种无菌操作过程如图4-12所示。
图4-11 斜面接种时试管的拿法
2. 吸管或注射器移植法 欲移植定量的液体培养物或表面有液体石蜡油的厌氧菌培养物，可以利用吸管或注射器移植，其操作方法是以无菌吸管或无菌注射器吸取培养物，代替接种环进行移植。
五
、穿刺
培养
明
胶穿
刺和
琼脂
柱穿刺方法基
本上与纯培养接种相同，不同的是用接种针挑取菌落，垂直刺入培养基中。要从培养基表面的中部一直刺入管底，然后按原方向退出即可。
六、细菌培养性状的检查
（一）细菌在固体培养基上的生长表现
1. 琼脂平皿上的生长表现 细菌于固体培养基表面生长繁殖，形成单个肉眼可见的细菌集落群体，称为菌落。各种细菌的菌落，按其特征的不同，可以在一定程度上鉴别某种细菌。如葡萄球菌在琼脂平皿上，由于产生色素的不同，形成各种颜色的圆形而突起的菌落；炭疽杆菌形成扁平干燥，边缘不整齐的火焰状菌落，用放大镜观察时，呈卷发样构造；肠道杆菌属的细菌，形成圆形、湿润、粘稠、扁平、大小不等的菌落；巴氏杆菌和猪丹毒杆菌，形成细小露珠状菌落。观察菌落的方法除肉眼外，还可用放大镜，必要时也可用低倍显微镜进行检查。观察的主要内容有（图4-13，图4-14）：
1 2 3 4
5 6 7 8
图4-13 菌落的形状、边缘和表面构造
1． 圆形、边缘整齐、表面光滑；2．圆形、边缘整齐、表面有同心圆；3．圆形、叶状边缘、表面有放
射状皱褶；4．圆形、锯齿状边缘、表面较不光滑；5．不规则形、波浪状边缘、表面有不规则皱纹；
6．圆形、边缘残缺不全、表面呈颗粒状；7．毛状 ；8根状
1 2 3 4
图4-12 斜面接种无菌操作程序
5 6 7 8
图4-14 菌落的隆起度
1．扁平状； 2．低隆起；3．隆起；4．台状； 5．脐状；6．纽扣状；7．乳头状；8．褶皱凸面
（1）大小 菌落的大小，规定用毫米（mm ）表示，一般不足lmm 者为露滴状菌落； 1～2mm 者为小菌落；2～4mm 者为中等大菌落；4～6mm 或更大者称为大菌落或巨大菌落。
（2）形状 菌落的外形有圆形、不规则形、根足形、葡萄叶形。
（3）边缘 菌落边缘有整齐、锯齿状、网状、树叶状、虫蚀状、放射状等。
（4）表面性状 观察其是否平滑、粗糙、皱襞状、旋涡状、荷包蛋状，甚至有子菌落等。
（5）隆起度 表面有隆起、轻度隆起、中央隆起，也有陷凹或堤状者。
（6）颜色及透明度 菌落有无色、灰白色，有的能产生各种色素；菌落是否有光泽，其透明度可分为透明、半透明及不透明。
（7）硬度 黏液状、膜状、干燥或湿润等。
（8）溶血情况 若是鲜血琼脂平皿，应看其是否溶血、溶血情况怎样。
2. 琼脂斜面上生长表现（图4-15） 将各种细菌分别以接种针直线接种于琼脂斜面上（自底部向上划一直线），培养后观察其生长表现。
3．琼脂柱穿刺培养中的生长表现 将各种细菌分别以接种针穿刺接种于琼脂柱中，培养后观察其生长表现，如图4-16所示。
1 2 3 4 5 1 2 3 4 5
（二）细菌在明胶柱穿刺培养中的生长表现 取大肠杆菌、枯草杆菌和其他细
菌分别以接种针穿刺接种于明胶柱，
置22℃温箱中培养后观察其液化与否和液化的情况，不同细菌对明胶柱的液化作用各不相同，其形式如图4-17所示。
（三）细菌在液体培养基中的生长表现（如图4-18所示）
将马腺疫链球菌、绿脓杆菌、葡萄球菌、大肠杆菌、炭疽杆菌等分别接种于肉汤中，培养后观察其生长情况，主要观察其混浊度、沉淀物、菌膜、菌环和颜色等。
1. 混浊度 细菌接种在液体培养基中经适当培养后其表现性状不同,有均匀混浊,轻度混浊或培养基保持透明（表面有菌膜或底部有沉淀物）。
2. 沉淀物 细菌在液体培养基中所形成的沉淀有：颗粒状沉淀、粘稠沉淀、絮状沉淀、小块状沉淀。另外还有不生成沉淀的细菌。
3. 表面性状 主要是细菌在液体培养基中培养后,有无菌膜或菌环形成等。
4-15 琼脂斜面直线接种培养的菌落表现
．线状；2．棘状；3．珠状；4．扩散状；5．根状
图4-16 琼脂柱穿刺培养的菌落表现 1． 线状；2．棘状；3．珠状； 4．绒毛状；5．根状
4. 颜色 有的细菌在生长繁殖过程中能产生色素,色素能溶于水,所以细菌在液体培养基中培养后,所产生的色素会使培养基的颜色发生变化。
1 2 3 4 5 6 1 2 3 4
图4-17 细菌明胶柱穿刺培养生长表现
1． 不液化；2．火山口状；3.芜箐状； 4.漏斗状；5.囊状；6.层状 图4-18 细菌在肉汤中生长表现 1．絮状；2．环状；3．厚膜状；4．均匀状
真菌的生物学特性
木霉菌属于半知菌亚门、丝孢纲、丝孢目，粘孢菌类，是一类普遍存在的真菌。绿色木霉是木霉菌中具有重要经济意义的一种，目前在工业、农业和环境科学等方面有着广泛的用途。绿色木霉在自然界分布广泛，常腐生于木材、种子及植物残体上。绿色木霉能产生多种具有生物活性的酶系，如：纤维素酶、几丁质酶、木聚糖酶等。绿色木霉是所产纤维素酶活性最高的菌株之一，所产生的纤维素酶的降解作用，目前日益受到重视，国内外对这方面的研究也很多。同时，绿色木霉又是一种资源丰富的拮抗微生物，在植物病理生物防治中具有重要的作用。它的作用机制有以下几种：产生抗生素；重寄生作用，这是木霉菌作为拮抗菌最重要的机制；溶菌作用；竞争作用。 纤维单胞菌属拉丁学名[Cellulomonas (Bergey et al.,1923),Clark,1952] 在幼龄培养物中细胞为细长的不规则杆菌，0.5～0.6μm×2.0～5.0μm，直到稍弯，有的呈V字状排列，偶见分支但无丝状体。老培养物的杆通常变短，有少数球状细胞出现。革兰氏阳性，但易褪色。常以一根或少数鞭毛运动。不生孢，不抗酸。兼性厌氧，有的菌株在厌氧条件下可生长但很差。在蛋白胨-酵母膏琼脂上的菌落通常凸起，淡黄色。化能异养菌，可呼吸代谢也可发酵代谢。从葡萄糖和其他碳水化合物在好氧和厌氧条件下都产酸。接触酶阳性。能分解纤维素。还原硝酸盐到亚硝酸盐。最适生长温度30℃。广泛分布于土壤和腐败的蔬菜。 康宁木霉菌丝有隔膜,蔓延生长,广铺于固体培养基上,菌外观为浅绿,黄绿或绿色,反面无色,分生孢子.梗为菌丝的短侧枝,其上对生或互生分枝,分枝上又可继续分枝,形成2级,3级分枝,分枝末端即为瓶状梗.分生孢子由小梗相继生出面,靠黏液把它们聚成球形或近球形的孢子头,分生孢子卵形成椭圆形,壁光滑.单个孢子近无色,形成堆状为绿色,与此相似的还有绿色木霉! 此菌有很强的纤维素霉及纤维,二糖淀粉酶等,它能利于农副产品,如麦杆,木材,木屑等纤维素原料,使之转变为糖质原料 佛州侧耳子实体覆瓦状丛生。菌盖直径3~12cm，低温时白色，高温时带青蓝色转黄色至白色，初半球形，边缘完整，后平展成扇形或浅漏斗形，边缘不齐或有深刻。菌肉稍薄，白色。菌褶浅黄白色，干时变淡黄色，稍密集至稍稀疏，延生，常在菌柄上形成脉络状。菌柄侧生（有孢菌株），或偏心生至中央生（无孢菌株），细长，内实，白色，长3~7cm，粗1~2cm，基部有时有白色绒毛。孢子印白色；孢子近柱形，6~9μm×2.5~3μm。 黑曲霉半知菌亚门，丝孢纲，丝孢目，丛梗孢科，曲霉属真菌中的一个常见种。 分生孢子梗自基质中伸出，直径15～20pm，长约1～3mm，壁厚而光滑。顶部形成球形顶囊，其上全面覆盖一层梗基和一层小梗，小梗上长有成串褐黑色的球状分生孢子。孢子直径2.5～4.0μm。分生孢子头球状，直径700～800μm，褐黑色。菌落蔓延迅速，初为白色，后变成鲜黄色直至黑色厚绒状。背面无色或中央略带黄褐色。有时在新分离的菌株中能找到白色、圆形、直径约1mm的菌核。分生孢子头褐黑色放射状，分生孢子梗长短不一。顶囊球形，双层小梗。分生孢子褐色球形。 广泛分布于世界各地的粮食、植物性产品和土壤中。是重要的发酵工业菌种，可生产淀粉酶、酸性蛋白酶、纤维素酶、果胶酶、葡萄糖氧化酶、柠檬酸、葡糖酸和没食子酸等。有的菌株还可将羟基孕甾酮转化为雄烯。生长适温37℃，最低相对湿度为88%，能引致水分较高的粮食霉变和其他工业器材霉变。 侧孢霉是一种嗜热丝状真菌,具有分解纤维素的特性.固体PDA培养条件下进行形态观察表明,所采用的嗜热侧孢霉菌株,菌丝丛枝状、有隔,分生孢子浅褐色,顶生或侧生.利用ITS序列
各种细菌的生物学特性
金黄色葡萄球菌 形态与染色：G+，球形葡萄串状排列，无特殊结构。无鞭毛无芽胞，一般不形成荚膜。 菌落特点：呈圆形，表面光滑、凸起、湿润、边缘整齐、有光泽、不透明的白色或金黄色菌落，周围有β溶血环 培养基：营养要求不高，琼脂平板、血平板均可。 生化反应：β溶血（+），触酶试验（+），能分解葡萄糖、麦芽糖、蔗糖，产酸不产气，分解甘露醇（致病菌）。 a群链球菌（化脓性链球菌） 形态染色：G+，球菌链状排列，可有荚膜，无芽胞，无鞭毛，有菌毛。 菌落特点：在血平板上可形成灰白色、圆形、凸起、有乳光的细小菌落，菌落周围出现透明溶血环。 培养基：营养要求较高，加有血液、血清等成分的培养基。 生化反应：β溶血（+），触酶（-），分解葡萄糖，产酸不产气，不分解菊糖，不被胆汁溶解肺炎链球菌 形态与染色：G+，矛头状尖向外双球菌，有荚膜 ，无鞭毛，无芽胞。 菌落特点：在固体培养基上形成小圆形、隆起、表面光滑、湿润的菌落，菌落周围有草绿色溶血环。随着培养时间延长，细菌产生的自溶酶裂解细菌，使血平板上的菌落中央凹陷，边缘隆起成“脐状” 培养基:营养要求较高，加有血液、血清等成分的培养基。 生化反应：分解葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖等，产酸不产气。对菊糖发酵，大多数新分离株为阳性。肺炎链球菌自溶酶可被胆汁或胆盐激活，使细菌加速溶解，故常用胆汁溶菌试验与甲型链球菌区别。 淋病奈瑟菌 形态与染色：G-，双球菌 ,肾形，似一对咖啡豆，无芽胞，无鞭毛，有菌毛，新分离菌株有荚膜。 菌落特点：菌落凸起、圆形、灰白色或透明、表面光滑的细小菌落。 培养基：专性需氧，营养要求高，多用巧克力培养基 生化反应：氧化酶、触酶试验阳性,对糖类的生化活性最低,只能氧化分解葡萄糖，产酸不产气。 脑膜炎奈瑟菌 形态染色：G-菌，呈肾形或豆形，两菌相对呈双球状，无鞭毛，无芽胞，新分离的菌株有多糖荚膜和菌毛。 菌落特点：无色、圆形、凸起、光滑、透明、似露滴状的小菌落。 培养基：专性需氧，在普通琼脂培养基上不能生长。需在巧克力色血琼脂培养基上。 生化反应：绝大多数菌株能分解葡萄糖和麦芽糖，产酸不产气(因淋病奈瑟菌不分解麦芽糖，借此可与淋球菌区别)，不分解乳糖、甘露醇、半乳糖和果糖，触酶试验阳性，氧化酶试验阳性。能产生自容酶。 大肠杆菌（大肠埃希菌） 形态染色：G-菌，短杆状，有周身鞭毛和周身菌毛，无芽胞。 菌落特点：灰白色，圆形，湿润，有的可出现溶血环，中等大小S型菌落。 培养基：无特殊要求，琼脂平板、血平板均可。 生化反应：β溶血+，能发酵葡萄糖、乳糖等多种糖类，产酸并产气。吲哚试验阳性、甲基红反应阳性、VP试验阴性、枸橼酸盐（IMViC）试验阴性。
实训六 细菌的分离、移植及培养
实训六细菌的分离、移植及培养性状的观察 目的要求能利用不同的被检材料进行细菌的分离培养，观察细菌的培养特性，并会进一步移植培养。 仪器及材料温箱、病料、实验用菌种、营养琼脂培养基、肉渣汤(疱肉)培养基、接种环、酒精灯、烙刀、镊子、剪子等。 方法与步骤 (一)细菌的分离培养 1．平板划线分离法（视频四）平板划线是通过将被检材料连续划线而获得单个菌落，因而划线愈长，获得单个菌落的机会也愈多。具体操作步骤如下： (1)右手持接种环于酒精灯上烧灼灭菌，待冷。 (2)无菌操作取病料若为液体病料，可直接用灭菌的接种环取病料一环；若为固体病料，首先将烙刀在酒精灯上灭菌，并立即用其将病料表面烧烙灭菌，然后用灭菌接种环从烧烙部位插入组织中缓缓转动接种环，取少量组织或液体。 (3)左手持平皿，用拇指、食指及中指将皿盖打开一侧(角度大小以能顺利划线为宜，但以角度小为佳，以免空气中细菌污染培养基)。 (4)将已取被检材料的接种环伸入平皿，并涂于培养基一侧，然后自涂抹处成30～40°角，以腕力在平板表面轻轻地分区划线。 在细菌病诊断或药敏试验时，为了提高效率，常可将皿盖放于酒精灯附近，左手持培养基，使划线的平面与右侧台面的角度小于90°且在酒精灯附近，右手持接种环取病料连续划线。 (5)划线完毕，烧灼接种环，将培养皿盖好，用记号笔在培养皿底部注明被检材料及日期，倒置37℃温箱中，培养18～24h观察结果(实图6-1)。凡是分离菌应在划线上生长，否则为污染菌。 2．倾注分离法取3支融化后冷至50℃左右的琼脂管，用灭菌的接种环取一环培养物(或被检材料)移至第一管中，随即用掌心搓转均匀，再由第一管取一环至第二管，搓转均匀后，再由第二管取一环至第三管经同样处理后，分别倒入三个灭菌培养皿中，待凝固后，倒置于37℃温箱中培养24h观察结果。(实图6-2) (二)厌氧菌的分离培养厌氧菌的分离培养常用肉渣汤(疱肉培养基)培养法。先将试管倾斜，使培养基表面露出一点，然后接种被检材料或菌种，接种后将试管直立，即封闭液面。最后置37℃温箱中培养24～48h。 (三)细菌移植 1．斜面移植(实图6-3) (1)左手持菌种管及琼脂斜面管，一般菌种管放在外侧，斜面管放在内侧，两管口并齐，管身略倾斜，斜面向上，管口靠近火焰。 (2)右手拇指、食指及中指持接种环在酒精灯上烧灼灭菌。 (3)将斜面管的棉塞夹在右手掌心与小指之间，菌种管棉塞夹在小指与无名指之间，将二棉塞一起拔出。 (4)把灭菌接种环伸入菌种管内，挑取少量菌苔将其立即伸入斜面培养基底部，由下而上在斜面上弯曲划线，然后管口和棉塞通过火焰后塞好，接种环烧灼灭菌。
痢疾杆菌分离与鉴定培训
痢疾杆菌的分离与鉴定 濮阳市疾病预防控制中心 许银怀 第一节概述 志贺菌属（Shigellae）细菌又称痢疾杆菌，引起人类及灵长类动物细菌性痢疾。 1899年由日本人志贺首先发现。 全球每年感染人次约为1.65亿，死亡110万，发病率、死亡率居感染性腹泻之首位。 发展中国家发病率较高，如阿根廷990.6／10万、印度972.3／10万；发达国家相对较低，如美国6～12／10万、德国2.7／10万、法国0.3／10万；我国上世纪50～80年代发病率在46.37～1018.93／10万之间。 近20年痢疾发病率在法定传染病中由第一位降至第三位，但在卫生状况不良的地区，发病率仍居高不下。 人群对细菌性痢疾普遍易感，各年龄组均可受到感染，5岁以下儿童发病率最高。 据估计，在临床就诊的腹泻病人中的5%～15%是志贺菌引起的，而因腹泻死亡病例中有75%是志贺菌感染造成的。 发展中国家福氏志贺菌最常见，发达国家以宋内志贺菌为主。美国
宋内志贺菌>75%，但在男-男性行为人群仍以福氏志贺菌常见。 鲍氏志贺菌最先在印度发现，除印度次大陆地区较为常见外，其它地区较为少见。 细菌性痢疾发病有明显的季节性，发病高峰为夏秋季，通常在7～9月份。 细菌性痢疾防治仍需探索、研究内容： 细菌性痢疾在不同地区、不同人群的发病强度、分布特征、病原学特点缺乏全面、准确的数据； 缺乏快速、简便的病原学诊断方法，细菌性痢疾漏诊和误诊现象普遍； 志贺菌耐药性谱的不断扩大，细菌性痢疾抗菌治疗难度加大； 洗手、母乳喂养、安全饮水、粪便无害化处理等行之有效的干预措施的落实需要强化； 目前所用痢疾菌苗免疫保护效果仍需进一步评价。 第二节病原学 一、抗原分类 志贺菌属细菌有菌体（O）抗原，某些新分离菌株有表面（K）抗原。 (一) 菌体（O）抗原 1.型特异性抗原：多糖，光滑型菌株主要抗原；分A、B、C、D 4个群及35个抗原型。 2.群特异性抗原：光滑型菌株次要抗原，主要存在于B群，籍此将菌型分
实验四：细菌的接种、培养和分离技术
实验四：细菌的接种、培养和分离技术 一、实验目的与要求： （1）掌握从环境（土壤、水体、活性污泥等）中分离培养细菌的方法，从而获得若干种细菌纯培养技能 （2）掌握细菌纯种分离的方法：稀释平板分离法和平板划线法。 （3）掌握几种接种技术：斜面接种技术、穿刺接种、稀释平板涂布法等。 二、实验原理 在土壤、水、空气或人及动、植物体中，不同种类的微生物绝大多数都是混杂生活在一起，当我们希望获得某一种微生物时，就必须从混杂的微生物类群中分离它，以得到只含有这一种微生物的纯培养，这种获得纯培养的方法称为微生物的分离与纯化。 为了获得某种微生物的纯培养。一般是根据该微生物对营养、酸碱度、氧等条件要求不同，而供给它适宜的培养条件，或加入某种抑制剂造成只利于此菌生长，而抑制其他菌生长的环境，从而淘汰其他一些不需要的微生物，再用稀释涂布平板法或稀释混合平板法或平板划线分离法等分离、纯化该微生物，直至得到纯菌株。 三、实验器材 1、牛肉膏蛋白胨培养基 2、盛9ml无菌水的试管，盛90m1无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶，1ml和5ml无菌 吸管，无菌培养皿； 3、接种环，土样，酒精灯等。 四、操作步骤 1、倒平板将加热融化的牛肉膏蛋白胨培养基倒平板，并标明培养基的名称。 2、贴标签接种前在试管上贴上标签，注明菌名、接种日期、接种人姓名等。贴在距试管口径2-3厘米的位置。 3、点燃酒精灯。 4、接种 取接种环右手拿接种环(如握钢笔一样)、在火焰上将环端烧红灭菌，然后将有可能伸入试管的其余部分，均用火烧过灭菌。 环冷却将灼烧过的接种环伸入菌种管，先使环接触边壁，使其冷却。 取菌种待环冷却后轻轻沾取经稀释10倍的土壤悬液-环，然后将接种环移出菌种管，注意不要使环的部分碰到管壁，取出后不可使环通过火焰。 接种在火焰旁迅速将沾有菌种的接种环在平板上划线。划线的方法很多，但无论哪种方法划线，其目的都是通过划线将样品在平板上进行稀释，使形成单个菌落。常用的划线方法有下列二种： ⑴用接种环以无菌操作挑取土壤悬液一环，先在平板培养基的一边作第一次平行划线3-4条，再转动培养皿约70°角，并将接种环上剩余物烧掉，待冷却后通过第一次划线部分作第二次平行划线，再用同法通过第二次平行划线部分作第三次平行划线和通过第三次平行划线部分作第四次平行划线(图A)。划线完毕后，盖上皿盖，倒置于温室培养。 ⑵将挑取有样品的接种环在平板培养基上作连续划线(图B)。划线完毕后，盖上皿盖，倒置温室培养。 环灭菌将接种环烧红灭菌。 5、挑菌将培养后长出的单个菌落分别挑取接种到上述三种培养基的斜面上，分别置25℃和28℃温室中培养，待菌苔长出后，检查菌苔是否单纯，也可用显微镜涂片染色检查是否是单一的微生物，若有其他杂菌混杂，就要再一次进行分离、纯化，直到获得纯培养。
微生物检验第九章 细菌的培养与分离技术讲义
第九章细菌的培养与分离技术 本章内容 一、基本条件 二、细菌的接种与分离技术 三、细菌培养的方法 四、细菌的生长现象 五、细菌L型的检查 基本条件 （一）细菌实验室：生物安全柜。 （二）无菌实验室 （三）基本设备和器具：温箱、CO2培养箱、厌氧培养设备；显微镜；高压蒸汽灭菌器、干烤箱；接种环和接种针；火焰灯或酒精灯；平皿、试管、吸管等玻璃器皿，以及离心机、天平等。 细菌的接种与分离技术 平板划线分离法：分散生长，各自形成菌落。 连续划线法：杂菌不多。 分区划线法：杂菌多。 斜面接种法：单个菌落纯培养、保存菌种或观察细菌的某些特性。 液体接种法：多用于一些液体生化试验管的接种。 穿刺接种法：半固体培养基，接种针。 倾注平板法：测定牛乳、饮水和尿液等标本细菌数。将标本适当稀释后，取一定量加入已灭菌的平皿内，再倾入已溶化并冷却至45℃左右的定量培养基，混匀，待凝固后倒置、培养。
涂布接种法：常用于纸片法药物敏感性测定，也可用于被检标本中的细菌计数。 细菌的培养方法 培养条件：根据临床初步诊断及待检细菌的种类，选用不同环境条件进行培养。 细菌的生长现象 分离培养基上菌落的生长现象 观察菌落的大小、形状、突起、边缘、颜色、表面、透明度等。 血琼脂上的溶血： α溶血：菌落周围出现绿色环状，红细胞外形完整无缺。 β溶血：菌落周围形成一个完全清晰透明的环，红细胞溶解。 γ溶血：没有溶血，红细胞无溶解。 双环：菌落周围完全溶解的晕圈外有一个部分溶血的第二圆圈。 气味 液体培养基中的生长现象 肉汤培养基的混浊度、沉淀、菌膜，气味和色素等。细菌数量达106～107CFU/ml，培养肉汤才见混浊。
实验三 细菌纯种分离、培养和接种技术
实验三细菌纯种分离、培养和接种技术 一、实验目的 (1)了解和学习水中细菌总数和大肠菌群的测定原理和测定意义。 (2)学习和掌握用稀释平板计数法测定水中细菌总数的方法。 (3)学习和掌握水中大肠菌群的检测方法。 二、实验原理 水的微生物学的检验，特别是肠道细菌的检验，在保证饮水安全和控制传染病上有着重要意义，同时也是评价水质状况的重要指标。国家饮用水标准规定，饮用水中大肠菌群数每升中不超过3个，细菌总数每mL不超过100个。它反映的是检样中活菌的数量。 所谓大肠菌群，是指在37℃24h内能发酵乳糖产酸、产气的兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌的总称。水的大肠菌群数是指100mL水检样内含有的大肠菌群实际数值，以大肠菌群最近似数(MPN)表示。水源中大肠菌群的数量，是直接反映水源被人畜排泄物污染的一项重要指标。目前，国际上已公认大肠菌群的存在是粪便污染的指标。因而对饮用水必须进行大肠菌群的检查。 水中大肠菌群的检验方法，常用多管发酵法和滤膜法。多管发酵法可运用于各种水样的检验，但操作繁琐，需要时间长。滤膜法仅适用于自来水和深井水，操作简单、快速，但不适用于杂质较多、易于阻塞滤孔的水样。 三、实验材料 1、菌落总数的测定： 1)培养基：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，无菌生理盐水。 2)器材：灭菌三角瓶，灭菌的具塞三角瓶，灭菌平皿，灭菌吸管，灭菌试管等。 2、大肠菌群的测定： 1)培养基： ①乳糖胆盐蛋白胨培养基： 蛋白胨20g，胆盐(或牛、羊胆盐)5g，乳糖10g，0.04%溴甲酚紫水溶液25mL，水1000mL，pH7.4。 制法：将蛋白胨、胆盐、乳糖溶于水中，校正pH，加入指示剂，分装，每瓶50mL或每管5mL，，并倒置放入一个杜氏小管，121℃灭菌15min。 ②伊红美蓝琼脂培养基： 制法：将伊红美蓝琼脂粉溶于水中，校正pH后分装．121℃灭菌15min备用。 平板划线法：接种是采用平板划线的方法将初发酵的大肠杆菌进行接种。
细菌分离培养及药敏试验方法及步骤
细菌分离培养方法及操作步骤 无菌取血液或脏器、淋巴结划线接种于鲜血琼脂平板或血清琼脂平面培养基、普通肉汤培养基，37℃恒温培养24 h，观察其生长特性。目前细菌分离培养的常用方法有平板划线分离法、加热分离法和实验动物分离法。 平板划线接种法 这是目前临床上最常用的分离接种方法。它可以从被检病料中通过划线可使细菌分离、分散生长而形成单个菌落（有利于从含有多种细菌的标本中分离出目的菌），以便挑选可疑菌落作纯培养加以鉴定。具体操作： 1、右手持接种环，在酒精灯上火焰灭菌； 图1 病料采集图2 接种环灭菌 2、待接种环冷却后，挑取被检料少许，左手持琼脂平板，以食指为支点，用拇指和无名指将平皿揭开一空隙。大约20℃时，迅速地将接种环轻轻地涂布在培养基的边缘。
3、在涂布处来回移动作曲线形划线接种。（注意：划线时，以腕力使接种环在琼脂平板表面划动，尽量不要划破培养基，划的线条要密，但不能重复旧线，以免培养物形成菌苔。） 图3 平板划线接种法 4、划线完毕，合上平皿盖，将琼脂平板倒置，放入37℃温箱内培养18－24小时。 注意：分离培养用的平板培养基应表面干燥，可于临用前置37℃孵育箱内30分钟，这样表面即干燥有利于分离培养，又使培养基预温，对培养某些较娇弱的细菌有利。
细菌药敏试验方法操作步骤 药敏试验是抗菌药使用以前必不可少的一个基本环节，一个正确的药敏结果能够科学的指导养殖户用药，减少抗菌素使用的盲目性，从而减少养殖户损失。在临床实际生产中具备重要意义。 1、在“超净台”中，用经（酒精灯）火焰灭菌的接种环挑取适量细菌培养物，以划线方式将细菌涂布到平皿培养基上。具体方式；用灭菌接种环取适量细菌分别在平皿边缘相对四点涂菌，以每点开始划线涂菌至平皿的1/2。然后，找到第二点划线至平皿的1/2，依次划线，直至细菌均匀密布于平皿。 图4 接种环划线 2、以无菌操作将灭菌的不锈钢小管（外径为4毫米、孔径与孔距均为3毫米，管的两端要光滑，也可用玻璃管、瓷管），放置在培养基上打孔，将孔中的培养基用针头挑出，并以火焰封底，使培养基能充分的与平皿融合（以防药液渗漏，影响结果）。
细菌分离培养及移植
细菌分离培养及移植 在细菌学诊断中，分离培养是不可缺少的一环。分离培养的目的主要是在含多种细菌的病料或培养物中挑选出某种细菌。在分离培养时应注意：选择适合于所分离细菌生长的培养基、培养温度、气体条件等。同时应严格按无菌操作程序进行实验，并做好标记。 [目的要求] (1)掌握细菌分离培养的基本要领和方法。 (2)掌握厌氧菌培养的原理及其方法。 [实验材料] 菌种：大肠杆菌斜面、大肠杆菌与金黄色葡萄球菌混合培养肉汤等。 器械：剪刀、记号笔(以上小组共用)。 培养基：普通肉汤和普通琼脂斜面、普通琼脂和鲜血琼脂平板、酒精灯、接种环(以上每人一套)。 [需氧性细菌分离培养法] 1．划线分离培养法此法为常用的细菌分离培养法。平板划线培养的方法甚多，可按各人的习惯选择应用，其目的都是达到使被检材料适当的稀释，以求获得独立单在的菌落，防止发育成菌苔，以致不易鉴别其菌落性状。划线培养时须注意以下几点：
(1)左手持皿，用左手的拇指、食指及 中指将皿盖揭开呈20。左右的角度(角度愈小愈好，以免空气中的细菌进入皿中将培养基污染)。 (2)右手持接种环，从大肠杆菌与金黄色葡萄球菌混合培养肉汤中取少许材料涂布于培养基边缘，然后将接种环上多余的材料在火焰中烧毁，待接种环冷却后，再与所涂材料的地方轻轻接触，开始划线，方法如图(5-l)。 (3)划线前先将接种环稍稍弯曲，这样易和平皿内琼脂面平行，不致划破培养基。 (4)划线中不宜过多地重复旧线，以免形成菌苔。 (5)接种完毕，在皿底上作好菌名、日期和接种者等标记，平皿倒扣，置37℃培养。 2．纯培养的获得与移植法将划线分离培养37℃24h的平板从温箱取出，挑取单个菌落，经染色镜检，证明不含杂菌，此时用接种环挑取单个菌落，移植于琼脂斜面培养，得到的培养物，即为纯培养物，再作其他各项试验检查和致病性试验等。具体操作方法如下：
细菌的生物学特性
细菌就是一种具有细胞壁的单细胞微生物,在适宜条件下,能进行无性二分裂繁殖,其形态与结构相对稳定。掌握细菌形态结构特征,对鉴别细菌,研究致病性,诊断疾病与防治原则等都有 重要意义。 第一节细菌大小与形态 一细菌的大小 细菌体积微小,一般要用光学显微镜放大几百倍到一千倍左右才能观察到。通常以微米(μm)为测量其大小的单位。细菌种类不同,大小差异很大,同一种细菌在不同生长环境中,或在同一生长环境的不同生长繁殖阶段,其大小也有差别。 二细菌的形态 细菌的基本形态有球状、杆状及螺旋状,根据形态特征将细菌分为球菌、杆菌与螺形菌三大 类、 (一)球菌(coccus) 球菌单个菌细胞基本上呈球状。按细菌生长繁殖时的分裂平面及分裂后排列方式不同,可将球菌分为: 1、双球菌:细菌在一个平面分裂,分裂后两个菌细胞成双排列,如肺炎链球菌。 2、链球菌:细菌由一个平面分裂,分裂后菌细胞连在一起,呈链状,如乙型溶血性链球菌。 3葡萄球菌:细菌在多个不规则的平面上分裂,分裂后菌细胞聚集在一起似葡萄串状,如金黄色葡萄球菌。 4、四联球菌:细菌在两个相互垂直的平面上分裂,分裂后四个菌细胞联在一起。 5、八叠球菌:细菌在上下、前后与左右三个相互垂直的平面上分裂,分裂后八个菌细胞联在一起。 (二)杆菌(bacillus) 杆菌呈杆状,多数为直杆状,也有稍弯的。不同杆菌的大小、长短、粗细差异很大。大杆菌如 炭疽杆菌长3～10μm,中等的如大肠杆菌长2～3μm,小的如流感杆菌长0、7～1、5μm。菌体粗短呈卵园形的称为球杆菌;菌体末端膨大成棒状,称棒状杆菌;菌体常呈分枝生长趋势,称为分枝杆菌,大多数杆菌就是单个、分散排列的,但有少数杆菌分裂后菌细胞连在一起呈链状,称为链杆菌。 (三)螺形菌(spirillar bacterium) 螺形菌菌细胞呈弯曲或旋转状,可分为两类: 1、弧菌:菌细胞只有一个弯曲呈弧形或逗点状,如霍乱弧菌。 2、螺菌:菌细胞有多个弯曲,如鼠咬热螺菌。弯曲呈“S”或海鸥形者如空肠弯曲菌、幽门螺 杆菌等。 第二节细菌的结构与化学组成 细菌的基本结构有细胞壁、细胞膜、细胞质与核质四个部分组成。某些细菌除具有其基本结 构外,还有荚膜、鞕毛、菌毛、芽胞等特殊结构。 一、基本结构 (一)细胞壁(cell wall) 细胞壁位于细菌的最外层,就是一层质地坚韧而略有弹性的膜状结构,其化学组成比较复杂,并随不同细菌而异。用革兰染色法可将细菌分为革兰阳性菌与革兰阴性菌两大类。两类细菌细胞壁的共有组分为肽聚糖,但各自还有其特殊组成成分。 1、肽聚糖(peptidoglycan) 细菌细胞壁的基本结构就是肽聚糖,又称粘肽。它就是原核生物细 胞所特有的物质,不同种类的细菌,其组成与连接的方式亦有差别。革兰阳性菌的肽聚糖由聚 糖骨架、四肽侧链与五肽交联桥三部分组成(图11-3,a),革兰阴性菌的肽聚糖由聚糖骨架与四 肽侧链两部分组成(图11-3,b)。
(完整版)细菌培养技术
第二节细菌培养检测技术 节概述 细菌的培养技术是微生物实验中基本技术之一。大多数细菌均可用人工方法培养，只有将细菌培养出来才能对它进行研究和鉴定 知识点导航 一.培养基的种类 培养基（culture medium）是细菌生长繁殖所需要的各种营养物质的人工制品。适宜的培养基 能使细菌在体外迅速生长繁殖，便于对细菌进行分离和鉴别。可分为基础培养基、营养培养基、选 择培养基、鉴别培养基、厌氧菌用培养基和特殊培养基。 （一）基础培养基 只含有细菌生长所需的最基本营养成分，应用最广泛，为制备多种培养基的基础，常见的有肉 汤培养基、琼脂培养基。 （二）营养培养基 在基础培养基中加入葡萄糖、血液、血清、腹水或酵母浸膏等有机物，可供营养要求较高的细 菌生长需要或增菌用。如结核分枝杆菌培养基中添加鸡蛋、马铃薯、甘油等。 （三）选择培养基 利用不同种类细菌对化学物质的敏感性不同而制成，使分离菌大量繁殖而抑制其它细菌生长的 培养基。培养基中含有的抑制剂能抑制非目的菌生长或使其生长不佳，有利于目的菌的检出和识别 。选择培养基多为固体平板，用于从标本中分离某些特定的细菌。 （四）鉴别培养基 培养基中加有某些特定成分，如糖、醇类和指示剂等，用于检查细菌的各种生化反应，以资鉴 别和鉴定细菌。 （五）厌氧菌用培养基 专性厌氧菌须在无氧条件下才能生长，故需在培养基中加入半胱氨酸、硫乙醇酸钠等还原剂，降低培养基中氧化还原电势，并应与外界空气隔绝，使培养基本身为无氧的环境。 （六）特殊培养基 为某些需要在特殊条件下才能生长的细菌培养之用。如高渗盐增菌培养基、高渗糖增菌培养基、改良Kagan氏培养基等。 二.培养基的制备 制备一般培养基的主要过程基本相似，包括调配、溶化、调整pH、过滤、分装、灭菌及检定和 保存。 三.细菌检验室的注意事项及无菌技术
初中八年级(初二)生物 实验四细菌的分离培养及培养性状的观察
实验四 细菌的分离培养及培养性状的观察 在细菌学检验中，细菌的分离培养是重要的基本技术之一。从混杂微生物中获得单一菌株纯培养的方法称为分离；纯培养是指一株菌种或一个培养物中所有的细菌都是由一个细胞分裂、繁殖而产生的后代。分离培养的目的在于从被检材料中，或者从污染的众多杂菌中分离出纯的病原菌。细菌分离培养应先从被检材料或病料中分离培养单个菌落，然后钓取可疑菌落进行纯培养，再将纯培养物移植培养。 目的要求 1．学习、掌握需氧菌和厌氧菌分离培养的基本要领和技术。 2．了解细菌的菌落形态及其在各种培养基上的培养性状。 3．了解培养性状对细菌鉴别的重要意义。 4．掌握钓菌、纯培养及移植技术。 操作步骤 一．需氧性细菌分离培养法 1. 平板划线分离法 菌种被其他杂菌污染时或混合菌悬液常用平板划线法进行纯种分离，此法是借助将蘸有混合菌悬液的接种环在平板表面多方向连续划线，使混杂的微生物细胞在平板表面分散，经培养得到分散的由单个微生物细胞繁殖而成的菌落，从而达到纯化目的。 但划线分离的培养基必须事先倾倒好，需充分冷凝待平板稍干后才可使用；为便于划线，一般培养基不宜太薄，每皿约倾倒20 ml 培养基，培养基应厚薄均匀，平板表面光滑。划线分离主要有连续划线法（图4-1）和分区划线法（图4-2）两种。划线法示意图见图4-3。 （1）连续划线法 以无菌操作用接种环直接取 平板上待分离纯化的菌落。将菌种 点种在平板边缘一处，取出接种环， 烧去多余菌体。将接种环再次通过 稍打开皿盖的缝隙伸入平板，在平 板边缘空白处接触一下使接种环 冷却，然后从接种细菌的部位在平 板上自左向右轻轻划线，划线时平 板面与接种环面成30～40度角， 以手腕力量在平板表面轻巧滑动 划线，接种环不要嵌入培养基内划破培 养基，线条要平行密集，充分利用平板 表面积，注意勿使前后两条线重叠。划 线完毕，关上皿盖。灼烧接种环，待冷 却后放置接种架上。培 养皿倒置于适宜 的恒温箱内培养。培养后在划线平板上 观察沿划线处长出的菌落形态，涂片镜检为纯种后再接种斜面。 (2)分区划线法（四分区划线法） 取菌、接种、培养方法与“连续划线法”相似。分区划线法划线分离时平 图4-1连续划线法 图4-2分区划线法 图4-3 划线分离示意图
细菌的分离培养及培养性状的观察
实验四 细菌的分离培养及培养性状的观察 在细菌学检验中，细菌的分离培养是重要的基本技术之一。从混杂微生物中获得单一菌株纯培养的方法称为分离；纯培养是指一株菌种或一个培养物中所有的细菌都是由一个细胞分裂、繁殖而产生的后代。分离培养的目的在于从被检材料中，或者从污染的众多杂菌中分离出纯的病原菌。细菌分离培养应先从被检材料或病料中分离培养单个菌落，然后钓取可疑菌落进行纯培养，再将纯培养物移植培养。 目的要求 1．学习、掌握需氧菌和厌氧菌分离培养的基本要领和技术。 2．了解细菌的菌落形态及其在各种培养基上的培养性状。 3．了解培养性状对细菌鉴别的重要意义。 4．掌握钓菌、纯培养及移植技术。 操作步骤 一．需氧性细菌分离培养法 1. 平板划线分离法 菌种被其他杂菌污染时或混合菌悬液常用平板划线法进行纯种分离，此法是借助将蘸有混合菌悬液的接种环在平板表面多方向连续划线，使混杂的微生物细胞在平板表面分散，经培养得到分散的由单个微生物细胞繁殖而成的菌落，从而达到纯化目的。 但划线分离的培养基必须事先倾倒好，需充分冷凝待平板稍干后才可使用；为便于划线，一般培养基不宜太薄，每皿约倾倒20 ml 培养基，培养基应厚薄均匀，平板表面光滑。划线分离主要有连续划线法（图4-1）和分区划线法（图4-2）两种。划线法示意图见图4-3。 （1）连续划线法 以无菌操作用接种环直接取 平板上待分离纯化的菌落。将菌种 点种在平板边缘一处，取出接种 环，烧去多余菌体。将接种环再次 通过稍打开皿盖的缝隙伸入平板， 在平板边缘空白处接触一下使接 种环冷却，然后从接种细菌的部位 在平板上自左向右轻轻划线，划线 时平板面与接种环面成30～40度 角，以手腕力量在平板表面轻巧滑 动划线，接种环不要嵌入培养基内划破培养基，线条要平行密集，充分利用平 板表面积，注意勿使前后两条线重叠。 划线完毕，关上皿盖。灼烧接种环，待 冷却后放置接种架上。培 养皿倒置于适 宜的恒温箱内培养。培养后在划线平板 上观察沿划线处长出的菌落形态，涂片 镜检为纯种后再接种斜面。 (2)分区划线法（四分区划线法） 取菌、接种、培养方法与“连续划 线法”相似。分区划线法划线分离时平 板分4个区，故又称四分区划线法。其中第4区是单菌落的主要分布区，故其划线面积应最图4-1连续划线法 图4-2分区划线法 图4-3 划线分离示意图
病原菌的分离培养和纯化
普通植物病理学 实验十七、病原菌的分离培养和纯化 一、目的要求 (1)了解分离与纯化微生物的基本原理及方法。 (2)掌握倒平板的方法和组织分离、稀释分离、平板划线分离的基本操作技术。 (3)掌握在平板、斜面及液体培养基上培养病原菌及观察其培养性状的方法。 二、基本原理植物病原菌的分离培养，是植物病理实验室工作中的基本技能。为了获得某微生物的纯培养，一般是根据该微生物对营养、酸碱度、氧气等条件要求不同，而供给它们适宜的生活条件，即让病原菌生活在适宜的培养基上，或加入某种抑制剂造成只利于此菌生长，而抑制其他菌生长的环境，从而得到纯菌株。植物病原真菌的分离方法主要有组织分离法和稀释分离法两种。最常用的方法是组织分离法，而稀释分离法主要用于病组织上产生大量孢子的病原真菌的分离。病原细菌的分离方法以划线分离法为最常用，在有些情况下也采用稀释分离法。为了获得分离菌的纯培养，必须要进行分离菌的纯化，纯化的方法类似于分离工作中采用的稀释分离法或划线分离法。 三、材料、仪器与用具 1．材料(依当地情况进行选择，下列材料供参考) (1)稻瘟病叶、病节、病穗颈(pyricularia orycae)。 (2)玉米大斑病叶(exserohilum turcicum)。 (3)玉米弯孢菌叶斑病叶(curvularia lunata)。 (4)玉米小斑病叶(bipolaris maydis)。 (5)番茄灰霉病果(botrytis cinefca)。
(6)黄瓜菌核病果(sclerotinia sclerotiorum)。 (7)黄瓜细菌性角斑病叶(pseudomonas syringaepv．1achrymans)。 (8)水稻白叶枯病叶(xanthomonas campestms 。 (9)大豆细菌性斑点病叶(pseudomonas syringaepv．glycinea)。 (10)白菜软腐病叶(erudnia carotovora subsp．carotovora)。 2．培养基pda培养基；肉膏蛋白胨培养基；加寄主组织煎汁的培养基等。 3．仪器与用品超镜工作台、培养箱、培养皿、吸管、吸水纸、三角玻璃棒、剪刀、解剖刀、镊子、接种铲(针)、接种环(铒)、70％酒精、0．1％升汞、酒精灯、火柴、记号笔、橡皮筋套、可调式电炉、铝锅等。0．1％升汞溶液配制：升汞1e 浓盐酸2．5ml 蒸馏水1000ml。先将升汞溶于盐酸中，待充分溶解后，再加水稀释。升汞是剧毒药物，在操作时应特别小心。 四、实验操作 (一)病原真菌的分离 1．组织分离法按照以下步骤进行： (1)取灭菌培养皿一个，置于湿纱布上，在皿盖上用玻璃铅笔注明分离日期、材料和分离人的姓名。提示：为了保证无菌操作，应注意下面几点：工作前最好将所需的物品都放在超净工作台内，工作中临时去取容易带来杂菌；保证工作人员自身的洁净，工作前用肥皂洗手；无菌操作前还要用70％酒精擦拭双手；工作中，特别在使用无菌操作间时，呼吸要轻，不要说话。 (2)用无菌操作法向培养皿中加入25％乳酸1--2滴(可减少细菌污染)，然后将融化而冷至60c 左右的pda培养基倒人培养皿中，每皿倒10--15ml，轻轻摇动使之成平面。凝固后即成平板培养基。提示：加入25％乳酸1～2滴，可基本保证平板上不出现污染细菌苗落。除乳酸外，在培养基中加入适当的抗菌素抑制细菌的生长，也是常用的方法。加青霉素(20μg／ml)可以抑制g+细菌生长；加多黏霉素b(5．0μg／ml)可以抑制g—细菌生长；加链霉素(40μg／ml)或氯霉素(50μg／ml)可以抑制大部分细菌的生长。除了氯霉素可在灭菌前加入外，其他抗菌素都应在灭菌后并冷却到45c左右(以手背触三角瓶感到烫，但尚可以忍耐为宜)’时加
实验四细菌的分离培养及培养性状的观察
实验四细菌的分离培养及培养性状的观察 在细菌学检验中，细菌的分离培养是重要的基本技术之一。从混杂微生物中获得单一菌株纯培养的方法称为分离；纯培养是指一株菌种或一个培养物中所有的细菌都是由一个细胞分裂、繁殖而产生的后代。分离培养的目的在于从被检材料中，或者从污 1 2 连续划线，使混杂的微生物细胞在平板表面分散，经培养得到分散的由单个微生物细胞繁殖而成的菌落，从而达到纯化目的。但划线分离的培养基必须事先倾倒好，需充分冷凝待平板稍干后才可使用；为便于划线，一般培养基不宜太薄，每皿约倾倒20ml培
养基，培养基应厚薄均匀，平板表面光滑。划线分离主要有连续划线法（图4-1）和分区划线法（图4-2）两种。划线法示意图见 图4-3。 （1）连续划线法 将菌 取出接 养后在划线平板上观察沿划线处长出的菌落形态，涂片镜检为纯 种后再接种斜面。 (2)分区划线法（四分区划线法） 取菌、接种、培养方法与“连续划线法”相似。分区划线法
划线分离时平板分4个区，故又称四分区划线法。其中第4区是单菌落的主要分布区，故其划线面积应最大。为防止第4区内划线与1、2、3区线条相接触，应使4区线条与1区线条相平行，这样区与区间线条夹角最好保持120度左右。先将接种环蘸取少量菌在平板上1区划3-5条平行线，取出接种环，左手关上皿盖， 2次平 . 至约 分摇匀后，自第一管取一接种环内容物至第二管，以同样方法自第二管移种至第三管。然后分别倾注一个已灭菌的平皿，凝固后倒转置于37℃温箱内培养24h。结果多数细菌在琼脂内生长成菌落，仅少数菌落出现在表面，通常第一个平板内的菌落数较多而
密集，第二、三个平板则逐渐减少，可见单个菌落。 3.芽胞需氧菌分离培养法 如果被检材料中可疑有带芽孢的细菌，可先将被检材料加少量生理盐水或肉汤，置于80℃水浴箱中维持15～20分钟，或85℃加热10分钟，再进行培养。材料中若有带芽孢的细菌仍可存活而 而对 放入灭菌乳钵或组织匀浆器内，加3～5倍量无菌生理盐水制成混悬液，吸取一定量混悬液注射（肌肉、腹腔、皮下或静脉）入易感实验动物,待实验动物死后，取其脏器，常可分离到纯的病原菌。例如，疑有猪丹毒杆菌存在的病料，可注射于鸽体，鸽死后，再
细菌鉴定学习
现有一株细菌宽度明显大于大肠杆菌的粗壮杆菌,请你鉴定其革兰氏染色反应.你 怎样运 传统的细菌革兰氏染色法操作繁琐，初学者不易掌握，寻找一种简便方法。方法：玻璃片上将细菌与碱液混合，用接种环或接种针往上挑，观察有无丝状物出现，我们把它叫作“细菌拉丝实验”。结果：用本法鉴别细菌革兰氏染色性质，G＾－菌有丝状物出现，即拉丝实验阳性，G＾＋菌无丝状物，拉丝实验阴性经过对照使用，本法具有快速，准确，简便，结果易判断，成本低廉等优点，值得推广应用。 由于细菌细胞壁的结构不同，革兰氏染色法可使有的细菌染上初染的的紫色，为革兰氏阳性细菌，有的细菌染上复染的的红色，为革兰氏阴性细菌。大肠杆菌是革兰氏阴性菌，染色后为红色，细菌形态为短小的杆状，单个存在。枯草杆菌是革兰氏阳性菌，染色后为紫色，细菌形态为杆状，比大肠杆菌大，可排成链状的，有的菌体里有椭圆芽孢（无色）或在视野中有散在的芽孢。 实验十肠杆菌科 肠杆菌科(Enterobacteriaceae)是一大群寄居于人和动物肠道中、生物学性状相似的革兰阴性杆菌。多数为肠道的正常菌群，但在机体免疫力低下或寄居部位发生改变时可引起感染。根据其生化反应、血清学试验、DNA同源性等可将肠杆菌科分为120多个菌种，其中与医学密切相关的有埃希菌属、志贺菌属、沙门菌属等。 一、大肠埃希菌 大肠埃希菌(E. coli)俗称大肠杆菌，是寄居于人和动物肠道的正常菌群。当机体抵抗力下降、该菌侵入肠外组织或器官，可引起急性炎症或继发感染；有些血清型可引起腹泻。从水和食品中检出较多大肠杆菌时，可判断它们已被粪便污染。因此，大肠杆菌常被作为饮水、牛乳及食品的卫生学检测指标。 （一）形态与培养特性 【材料与方法】 1．大肠杆菌革兰染色标本片。 2．大肠杆菌普通琼脂平板、SS平板、中国蓝平板、伊红美蓝(EMB)平板培养物。 【结果】 1．大肠杆菌为革兰阴性、中等大小杆菌，两端钝圆或稍弯曲，呈分散排列。 2．菌落特征(表10-1)。 表10-1 大肠杆菌在普通琼脂平板及选择鉴别培养基上的菌落特征 培养基菌落特征 普通琼脂平板圆形，中等大小，灰白，整齐，光滑菌落 SS平板呈红色 中国蓝平板呈蓝色 伊红美蓝平板呈紫黑色，有金属光泽 （二）生化反应 【材料与方法】 1．取大肠杆菌、产气杆菌分别接种于葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖发酵管，37℃培养24h，观察结果。 2．取大肠杆菌、产气杆菌分别接种于双糖铁培养基，37℃培养24h，观察结果。 3．靛基质产生、甲基红、VP、枸橼酸盐利用试验(IMViC试验)，见实验四。 【结果】
实验四 细菌、真菌、放线菌的分离与培养
实验报告 课程名称：环境微生物学实验实验类型：综合实验 实验项目名称：微生物的分离与培养与菌落观察 学生姓名：专业：环境工程学号： 同组学生姓名： 指导老师： 实验地点：实验日期：2018 年 10月16日 一、实验目的和要求 1.掌握微生物接种培养技术 2.掌握微生物分离纯化技术 3.学习并掌握放菌落形态结构的观察方法，认识并理解它们的形态特征。 二、实验内容和原理 土壤是微生物生活的大本营，是寻找和发现具有重要价值微生物的主要菌源。在不同土壤中，各类微生物的数量千差万别。为了分离获得某种微生物,需要预先制备不同稀释度的菌悬液，并添加相应的抗生素抑制不需要的微生物，例如，添加链霉素25~50U/mL抑制细菌;添加0.5%重铬酸钾液或制霉素50 U/mL 抑制霉菌。通过10倍稀释以及平板分离、平板涂布和平板划线等操作，微生物可在平板上分散成单个的个体，经过适宜条件培养，单个个体可形成单个菌落。挑取单个菌落转接至新鲜平板上，即可使目的菌种纯化。 1.菌种的分离纯化：从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离 与纯化。在分子生物学的研究及应用中，不仅需要通过分离纯化技术从混杂的天然微生物群中分 离出特定的微生物，而且还必须随时注意保持微生物纯培养物的“单一性”，防止其他微生物的 混入。 2.平板涂布法：因为将微生物悬液先加到较烫的培养基中再倒平板易造成某些热敏感菌的死亡，且 采用稀释倒平板法也会使一些严格好氧菌因被固定在琼脂中间缺乏氧气而影响其生长，因此在微 生物学研究中常用的纯种分离方法是涂布平板法。用途上，一般多用于从菌种的纯化;优点是可 以观察菌落特征，对混合菌进行分离;但不能计数 3.平板划线法：最简单的分离微生物的方法是平板划线法，其原理是将微生物样品在固体培养基表 面多次作“由点到线”稀释而达到分离目的的。划线的方法很多，常见的比较容易出现单个菌落 的划线方法有斜线法、曲线法、方格法、放射法、四格法等。用途一般多用于筛选菌株。一般用 于平板培养基的回收率计数。优点是可以计数，可以观察菌落特征。缺点是吸收量较少，较麻烦，平板不于燥效果不好，容易蔓延。如果菌液密度天的话，长不出单菌落。 4.稀释倒平板法：稀释倒平板法是将细菌与液态的培养基混合后倒入培养皿再冷却凝固，使样品中 的微生物细胞充分分散开，使其均匀分布于平板中的培养基内。经培养后，单个细胞及聚在一起 的细胞可以生长繁殖，形成一个肉眼可见的菌落，统计菌落数目，即可用以评价样品中的微生物 的数量。所以细菌在培养基的内部和表面都有,适合厌氧型微生物。 5.菌种保藏：菌种保藏是将微生物的菌种经长时间的保存，不污染其它杂菌，及可保持其形态特征 和生理性状，减少变异，防止衰老，以便于将来使用。保藏菌种一-般是选用它的休眠休，如孢 子;芽孢等等，并且要创造一一个低温;干燥; 缺氧;避光和缺少营养的环境条件，以利于休眠体 能长期地处于休眠状态。对于不产孢子的微生物，应使其新陈代谢处于最低状态，又不会死亡，
实验四 细菌的划线分离与培养
实验四细菌的划线分离与培养 一、实验前要说明的几点问题 点名,查看学生出勤情况。总结上次作业，提出作业中出现的问题并讲解。 二、板书部分 （一）目的要求 1.掌握需氧菌分离培养的基本要领。 2.了解厌氧菌的分离培养原则及方法。 （二）实验容 1.用普通琼脂平板做一次划线分离培养。 2.用普通肉汤做一管大肠杆菌的移植培养。 3.用普通琼脂斜面做一管金黄葡萄球菌的移植培养。 4.用划线法进行真菌的分离培养（示教） （三）作业 1.为什么要进行细菌的分离培养？ 2.进行分离培养应注意哪些事项？ 3.细菌分离培养的方法有哪些？（重点叙述平板划线法） 4.叙述真菌的划线分离方法。 三、实验容 主要容有分离培养及目的、注意事项、分离培养的方法、真菌的培养方法、患病动物病料中分离培养、钓菌、移植。 1.什么是分离培养及目的：分离培养是细菌学检验的基本技术之一。分离培养之目的，在于从被检材料中由多种细菌里分离出一种细菌。 2.注意事项： 1）分离培养前应考虑所分离的细菌的特性，选择适合其生长需要的培养基（需氧还是厌氧、营养的要求高还是不高、培养温度等）等。例如：链球菌在普通琼脂不长，要加血清或血液。大肠杆菌和葡萄球菌要求较低，普通的培养基即可生长。 2）防止污染。分离培养的整个过程要严格无菌操作。培养基和一切用具必
须彻底灭菌；操作时必须靠近火焰；操作完毕后，禁止再让培养基接触外界空气。 3）防止接种器械过热，很容易杀死分离培养的细菌，如接种环在烧灼灭菌后，不能立即钓取细菌材料，应在酒精灯旁凉凉；另外还应注意防止已钓取菌料的接种环，不慎通过火焰而将细菌杀死。 4）初代分离时发现有多种细菌，观察找到目的菌落，再拿一肉汤培养基纯化培养。然后在接种实验动物，作成凝集抗原，做血清学鉴定，。还可以反过来做抹片染色观察。 3.分离培养的方法： 主要分需氧菌的分离培养方法、厌氧菌的分离培养方法和需要CO菌的培养分离方法。 1）需氧菌的分离培养法 （1）平板划线法：划线后有单个菌落，便于观察菌落的形态、溶血性等。方法左手拿琼脂平板，使其与水平面成45。角；右手拿铂金耳，使之与水平面平行，靠近酒精灯火焰操作。将接种环于酒精灯火焰中灼烧灭菌，待其冷却后，蘸取欲检材料少许，注意不要划破琼脂，不要划得太疏，以免造成浪费，不要重复划线，以免形成菌苔。划线方法：方格划线、蛇形划线、区域划线、交叉划线，选择其中一种进行划线。划毕，将接种环烧灼灭菌，于皿底用蜡笔标记被检材料名称及日期，倒转置恒温箱中培养。 思考题：方格划线哪个地方会长出单个菌落比较多？ （2）倾注法：不常用，这里不做介绍 2）厌氧菌的分离培养方法 厌氧菌生长繁殖的环境不能有游离氧的存在。故在培养厌氧菌时，必须创造一个厌氧环境，一般以降低氧的力或保持减低的氧力为原则。目前应用于厌氧菌的分离方法颇多，现就其中较简便且常用的几种方法介绍如下： （1）焦性没食子酸法利用焦性没食子酸在碱性溶液能大量地吸收氧的原理进行厌氧培养。通常100cm3空间用焦性没食子酸1g，10%氢氧化钠或氢氧化钾10ml。具体方法有下列有平板培养法、干燥器培养法。平板培养法是将厌氧菌划线接种于适宜的琼脂平板，取一小团直径约2cm的脱脂棉，置于平皿盖的面中央，其上滴加10%氢氧化钠溶液约5ml；在靠近脱脂棉的一侧放置焦性没食子酸约