细胞治疗生长板损伤的研究
分 类 号 学号D201078368学校代码 10487 密级
博士学位论文
细胞治疗生长板损伤的研究
学位申请人：张雪琴
学科专业：外科学·小儿外科
指导教师：魏明发 教授
答辩日期：2013年5月
A dissertation submitted to Huazhong University of
Science and Technology for the Degree of
Doctor of Medicine
Cell therapy to growth plate injury
M.D.Candidate: Xueqin Zhang
Major : Surgery·Pediatric Surgery
Supervisor : Prof. Mingfa Wei
Huazhong University of Science & Technology
Wuhan 430074, P. R. China
May, 2013
独创性声明
本人郑重声明，本学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果的总结。尽我所知，除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本人将承担本声明引起的一切法律后果。
学位论文作者签名：
日期： 年 月 日
学位论文版权使用授权书
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保密□ ，在_____年解密后适用本授权书。
本论文属于
不保密□。
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学位论文作者签名： 指导教师签名：
日期：年月日日期：年月日
目 录
前 言 (1)
摘 要 (3)
Abstract (5)
正 文
第一部分 兔髂嵴软骨细胞分离及提纯的实验研究 (7)
参考文献 (14)
第二部分 兔髂嵴软骨细胞原代培养及鉴定的实验研究 (15)
附 图 一 (25)
参考文献 (30)
第三部分 兔胫骨近端生长板损伤模型构建的实验研究 (32)
附 图 二 (36)
参考文献 (37)
综 述
第一部分 生长板形态生理学的研究进展 (38)
参考文献 (49)
第二部分 骨骺损伤的研究进展 (60)
参考文献 (69)
第三部分 软骨组织工程学的研究进展 (73)
参考文献 (79)
攻读学位期间以第一作者发表论文 (86)
缩 略 词 (87)
致 谢 (88)
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前 言
生长板是儿童区别于成人所特有的骨骼结构，是骨骺与干骺端之间的薄层板状软骨组织，是四肢长骨生长区域的重要组成部分，通过软骨内成骨的方式使骨干的长度增加。儿童生长板区域组织结构薄弱，暴力、感染及肿瘤等多种因素易引起损伤，发生率约为17.9%~30%。由于软骨细胞自我修复增殖能力弱，损伤部位往往由纤维骨性结构（即骨桥）修复，连接骨骺和干骺端，导致生长板功能的提前部分或全部丧失，从而发生肢体不等长和（或）成角旋转畸形，并且随着患儿的生长发育，畸形的程度也逐渐加重，可严重影响肢体的外观形态和功能。
生长板损伤及随后所引发的肢体不等长和（或）成角旋转畸形仍是目前临床治疗的一大难题，目前的临床治疗主要以改善畸形的矫形手术为主。生长板软骨形成、软骨内成骨以及损伤的过程中有大量的细胞因子和转录因子参与，但这之中详细的生理病理机制仍不甚清楚。软骨细胞是生长板结构中唯一的细胞类型，分泌细胞外基质（Extracellular matrix，ECM），在软骨及骨的形成和成熟中具有重要的功能作用。理想的治疗是促使生长板损伤部位的再生，恢复其原有的组织结构和生理功能。软骨组织工程就是基于这种目的的研究，而目前软骨组织工程学研究中关于软骨细胞及组织工程软骨修复生长板损伤的报道较少。
本研究取材兔髂嵴软骨，将分离获得的软骨细胞体外原代培养扩增并构建生长板损伤动物模型，可进一步用于软骨细胞自体移植修复生长板损伤的实验研究。
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Preface
Growth plate is a unique skeletal structure in children,which is a thin plate of cartilage between the epiphysis and metaphysis,which is an important part of long bone of limbs with the function of increasing the length of limbs through endochondral ossification.Growth plate is weak,the incidence of damage by various factors including violence,infection and tumor is about 17.9%~30%. The self-repair ability of growth plate is also weak, often replaced by fibro-osseous structure(i.e. bone bridge) between the epiphysis and metaphysis after injury, which result in partial or complete loss of growth function, leading to limb length inequality,angular and rotation deformity.With the growth and development,the degree of deformity can gradually aggravate, which can seriously affect the appearance and function of limbs.
The clinical treatment of growth plate injury and subsequently triggered limb length inequality,angular and rotation deformity is still a big problem,orthopedic operation is currently the main solution,only to improve the clinic symptoms.In the process of growth plate cartilage formation, endochondral ossification and damage,a large number of cytokines and transcription factors is involved in, but the details of the physiological and pathological mechanisms are still unclear.Chondrocyte is the only cell type in growth plate,secreting extracellular matrix, has great significance in the formation and maturation of the cartilage and bone. The ideal treatment is to promote the regeneration of growth plate injury site,restoring original structure and physiological function.Cartilage tissue engineering is the study on this purpose,and the present study on repair of growth plate injury with chondrocytes and tissue engineered cartilage is less.
This study is on separation,purification,primary culture and identification of chondrocytes from rabbit iliac crest cartilage and construction of growth plate injury model, that can be used for further experimental study for repair of growth plate injury with chondrocytes on autologous transplantation.
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摘 要
第一部分
兔髂嵴软骨细胞分离及提纯的实验研究
目的建立一种简单可靠的软骨细胞体外分离和纯化的方法。
方法将2只幼龄新西兰兔心脏空气栓塞处死后，无菌操作下取得髂嵴部位的软骨块，修剪成1~2mm2组织块，经0.1%透明质酸酶、0.25%胰蛋白酶和0.1%II型胶原蛋白酶三步法消化滤过后获得软骨细胞悬液，再经台盼蓝染色检测活细胞存活率后，接种到含10%胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）细胞培养液的培养瓶中进行原代培养。
结果取材兔髂嵴软骨经三步酶消化法后可获得多量的单个软骨细胞，具有良好的细胞活性。
结论此方法是一种简单可靠的软骨细胞分离纯化方法，可进一步通过原代培养扩增后用于软骨或生长板损伤修复的各种基础研究。
关键词兔；软骨细胞；分离；提纯
第二部分
兔髂嵴软骨细胞原代培养及鉴定的实验研究
目的建立一种简便可靠的软骨细胞体外原代培养的方法。
方法将2只幼龄新西兰兔心脏空气栓塞处死后，无菌操作下取得髂嵴部位的软骨块，修剪成1~2mm2组织块，经0.1%透明质酸酶、0.25%胰蛋白酶和0.1%II型胶原蛋白酶三步法消化滤过后获得软骨细胞悬液，接种到含10%FBS细胞培养液的培养瓶和培养板中进行原代培养。倒置相差显微镜下观察软骨细胞生长状态，软骨细胞计数法绘制生长曲线，甲苯胺蓝染色、II型胶原免疫组织化学染色和透射电镜观察鉴定培养的软骨细胞。
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结果软骨细胞接种后24h基本贴壁生长，向四周伸出伪足，呈梭形、三角形或多角形。培养第3~5天增殖活跃，呈细胞岛样结构，培养第7天增殖渐停滞，呈结节状的铺路石样外观。甲苯胺蓝染色，细胞质呈蓝色，伴深蓝色颗粒，长期培养细胞浆严重空泡化，胞浆体积增大，越接近结节中间越明显；II型胶原免疫组织化学染色，细胞浆呈淡棕色，伴棕色颗粒；透射电镜下观察，核大居中，细胞浆内线粒体和内质网丰富，部分内质网扩张。
结论此方法是一种简便可靠的软骨细胞原代培养方法，培养的软骨细胞具有良好的细胞活性和稳定的特征性生物表型，可进一步用于自体移植重塑修复软骨或生长板损伤的实验研究。
关键词兔；软骨细胞；原代培养；鉴定
第三部分
兔胫骨近端生长板损伤模型构建的实验研究
目的建立一种简单可靠的动物生长板损伤实验模型的方法。
方法将1只幼龄新西兰兔腹腔麻醉后，无菌操作下用针头刺入破坏双侧胫骨近端生长板。阴性对照组未行手术操作。放射学观察生长板损伤和修复情况。
结果术后1周，手术组双侧胫骨近端生长板部位呈斑片状模糊样影，为局部炎症表现；术后6周，手术组双侧胫骨近端生长板中央部分骨桥形成。对照组双侧胫骨近端生长板部位呈清晰不透亮线状影。
结论此方法是一种简单可靠的动物生长板损伤模型构建的方法，可进一步用于软骨细胞自体移植修复生长板损伤的实验研究。
关键词兔；生长板；损伤
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Abstract
Part I Separation and purification of chondrocytes from rabbit iliac crest cartilage
Objective To develop a simple and reliable method of separation and purification of chondrocytes in vitro.
Methods Chondrocytes were obtained from rabbit iliac crest cartilage with aseptic operation,and digested by 0.1% hyaluronidase,0.25% trypsin and 0.1% type II collagen enzyme, then cultured in DMEM/F12 supplemented with 10% fetal bovine serum.The cells were identified by trypan blue staining.
Results Large quantities of individual chondrocytes were obtained with this method with good viability.
Conclusions This might be a simple and reliable method for separation and purification of chondrocytes that can be used for further research for cartilage or growth plate injury and repair through amplification by primary culture.
Key words rabbit; chondrocyte; separation; purification
Part II Primary culture and identification of chondrocytes from rabbit iliac crest cartilage
Objective To develop a simple and reliable method of primary culture of chondrocytes in vitro.
Methods Chondrocytes were obtained from rabbit iliac crest cartilage with aseptic operation,and digested by 0.1% hyaluronidase,0.25% trypsin and 0.1% type II collagen enzyme, then cultured in DMEM/F12 supplemented with 10% fetal bovine serum.The cells
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were identified by phase-contrast microscope,toluidine blue staining,type II collagen immunohistochemical staining and transmission electron microscopy.
Results Morphologic characteristics of chondrocytes were observed in cell cycle of 7~8 days.Toluidine blue staining and type II collagen immunohistochemical staining showed positive phenotype features of chondrocytes.Transmission electron microscopy showed cytoplasm was rich in mitochondria and endoplasmic reticulum,part of endoplasmic reticulum were expansion.
Conclusions This might be a simple and reliable method for primary culture of chondrocytes that can be used for further research for cartilage or growth plate injury and repair on autologous transplantation.
Key words rabbit; chondrocyte; primary culture; identification
Part III Establishment of growth plate injury model in
rabbit proximal tibia
Objective To develop a simple and reliable method of growth plate injury model. Methods Growth plates of bilateral proximal tibia from New Zealand rabbit were destructed with needle- pricking with aseptic operation after intraperitoneal anesthesia. The control group was without operation. Injury and repair of growth plates were evaluated by radiological examination.
Results 1 week after the operation, operation group showed local inflammation in bilateral proximal tibial growth plate;6 weeks after the operation, operation group showed bone bridge formation in the center of bilateral proximal tibial growth plates. Conclusions This might be a simple and reliable method for establishment of growth plate injury model that can be used for further research for growth plate injury and repair on autologous transplantation with chondrocytes.
Key words rabbit; growth plate; injury
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第一部分
兔髂嵴软骨细胞分离及提纯的实验研究
引 言
生长板损伤及随后所引发的肢体不等长和（或）成角旋转畸形仍是目前临床治疗的一大难题，并且由于损伤后生长板功能提前全部或部分闭合，随着患儿的生长发育临床症状会逐渐加重。在这一系列病理生理学过程中有大量的细胞因子和转录因子参与，但其具体机制仍不甚清楚[1-5]。软骨细胞是生长板结构中唯一的细胞类型，在软骨和骨的形成和成熟中具有重要的功能作用，因此，针对软骨细胞的研究是非常的必要和重要。目前关于软骨细胞的研究大多来源于关节软骨，不易活体取材且对实验动物的后继损伤较大，局限于细胞研究。本研究取材兔髂嵴软骨，成功分离并提纯出软骨细胞，可进一步通过原代培养扩增后用于软骨或生长板损伤修复的各种基础研究。
材 料
一、实验动物
4周龄健康新西兰兔2只，清洁级，体重350~450g左右，雌雄不限，由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供。实验中所有动物的处理方法均符合中华人民共和国及华中科技大学同济医学院实验动物管理规则和条例。
二、所用试剂及配置方法
1．碘伏，500g/瓶，武汉同济美迪生科技有限公司。
2．FBS，100ml/瓶，美国Hyclone公司。
3．DMEM/F12培养基，500ml/瓶，美国Hyclone公司。
4．青霉素/链霉素溶液，各1万单位/ml，100ml/瓶，美国Invitrogen公司。
5．基础细胞培养液的配置方法：①100ml含10%FBS细胞培养液：FBS 10ml置于100ml无菌玻璃瓶中，再加入DMEM/F12 90ml，摇匀后保存于4℃冰箱中备用；
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②100ml含10%FBS及双抗生素细胞培养液：FBS 10ml置于100ml无菌玻璃瓶中，再加入DMEM/F12 89ml和青霉素/链霉素溶液1ml，摇匀后保存于4℃冰箱中备用。
6．II型胶原蛋白酶，100mg/瓶，美国Invitrogen公司。
7．0.1%II型胶原蛋白酶的配置方法：称取II型胶原蛋白酶 100mg，充分溶解于2ml双蒸水中，经0.22um无菌滤器滤过除去细菌后置于100ml无菌玻璃瓶中，再加入DMEM/F12培养基98ml，摇匀后保存于4℃冰箱中备用。
8．透明质酸酶，100mg/瓶，美国Sigma公司。
9．0.1%透明质酸酶的配置方法：称取透明质酸酶 100mg，充分溶解于2ml双蒸水中，经0.22um无菌滤器滤过除去细菌后，置于100ml无菌玻璃瓶中，再加入DMEM/F12培养基98ml，摇匀后保存于4℃冰箱中备用。
10．0.25％胰蛋白酶/0.1%乙二胺四乙酸（Ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA），100ml/瓶，美国Gibco公司。
11．氯化钠，500g/瓶，国药集团化学试剂有限公司。
12．氯化钾，500g/瓶，国药集团化学试剂有限公司。
13．磷酸二氢钾，500g/瓶，国药集团化学试剂有限公司。
14．磷酸氢二钠，500g/瓶，国药集团化学试剂有限公司。
15．0.01M磷酸盐缓冲液（phosphate-buffer saline，PBS）的配置方法：称取氯化钠 8.00g，氯化钾 0.20g，磷酸二氢钾 0.20g，磷酸氢二钠 2.08g，用玻璃棒搅拌充分溶解于双蒸水1000ml中，分装于250ml玻璃瓶中高压蒸汽消毒灭菌（101.33kPa，121.3℃，20min）后保存于4℃冰箱中备用。
16．重铬酸钾，500g/瓶，天津市广成化学试剂有限公司。
17．浓硫酸，1L/瓶，中平能化集团开封东大化工有限公司。
18．5L重铬酸钾和浓硫酸清洁液的配制方法：称取重铬酸钾600g置于不锈钢箱中，加入双蒸水5L，用木棍搅拌使其充分溶解后，缓慢倒入浓硫酸1000ml，边倒边用木棍搅拌，放置完全散热后备用。
19．台盼蓝染色细胞存活率检测试剂盒（C0011），中国碧云天公司。
20．无水乙醇，500ml/瓶，天津富宇精细化工有限公司。
21．不同浓度酒精的配置方法：将双蒸水和无水乙醇按照不同比例（如下表所示）置于100ml玻璃瓶中，摇匀后室温保存备用。
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75%85%95%
无水乙醇 75ml 85ml95ml
双蒸水 25ml15ml5ml
三、仪器
1．无菌手套，上海科邦医用乳胶器材有限公司。
2．无菌纱布，湖北中健医疗用品有限公司。
3．无菌棉签，江西中惠医械塑料有限公司。
4．50ml无菌塑料细胞培养瓶，德国Greiner Bio-One GmbH。
5．35mm塑料培养皿，德国Greiner Bio-One GmbH。
6．1000μl塑料蓝吸头，美国Axygen。
7．35mm及75mm玻璃培养皿，江苏海门百得福实验器材有限公司。
8．15ml塑料离心管，德国Greiner Bio-One GmbH。
9．1.5ml塑料离心管，德国Greiner Bio-One GmbH。
10．0.5ml塑料离心管，德国Greiner Bio-One GmbH。
11．1ml玻璃移液管，德国Greiner Bio-One GmbH。
12．5ml玻璃刻度移液管，德国Greiner Bio-One GmbH。
13．0.22um无菌滤器，美国merck millipore公司。
14．5ml无菌塑料注射器，浙江灵洋医疗器械有限公司。
15．50ml玻璃烧杯，购买于江都市红旗玻璃厂。
16．150ml酒精灯，浙江常青化工有限公司。
17．4℃和-20℃冰箱，青岛海尔集团。
18．电子分析天平，北京赛多利斯仪器系统有限公司。
19．YX280A手提式不锈钢压力蒸汽灭菌器，上海三申医疗器械有限公司。
20．HH-2数显可调式恒温水浴锅，江苏省金坛市富华仪器有限公司。
21．NW超纯水系统，中国Heal Force公司。
22．HF 90/240细胞培养箱，中国Heal Force公司。
23．GZX-DH电热可调式恒温干燥箱，上海跃进医疗器械厂。
24．ZHJH-C1112B超净工作台，上海智诚公司。
25．可调移液器（50~300μl，100~1000μl、1000~5000μl），芬兰Dragon。
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26．Neofuge 15R台式高速冷冻离心机，中国Heal Force公司。
27．倒置相差显微镜，日本Nikon公司。
28．血球计数板，江苏省盐城市广汇医保器材厂。
方 法
一、实验前器材的准备
1．玻璃器皿的清洗：自来水稍冲洗后放置于碱性洗衣粉水中泡置6~8小时，器皿内壁刷洗两遍，流水冲洗10次后置干燥箱中烘干，完全浸置于酸性次强清洁液中泡置6~8小时（可过夜）后，流水冲洗10次，双蒸水冲洗2~3次后置干燥箱中烘干，用牛皮纸包裹瓶口备用。
2．清洗干净的玻璃器皿、金属器械、耐热塑料器皿以及高温下不变性液体（如PBS）等用101.33kPa，121℃高压蒸汽灭菌15~20min。解剖操作台喷洒75%酒精后用紫外线杀菌灯照射30min。
3．高压蒸汽灭菌法的操作要求：每次使用前加双蒸水至覆盖锅底三个电极柱，锅盖上电极丝插入内锅内侧，盖上锅盖后对角线螺丝同时拧紧，保持安全阀关闭，排气阀开放，待蒸汽锅内液体沸腾时，关闭排气阀，压力逐渐上升直至指针维持在101.33kPa左右，安全阀开始喷气时，开始计时15~20min，之后关闭电源，待压力下降至5kPa以下再打开锅盖，器材置干燥箱中烘干后备用。
4．超净工作台的操作要求：将已经消毒灭菌的器材、加样器、不锈钢镊子、打火机以及废液盒等放置于超净台上，物品和台面上喷洒75%酒精，紫外杀菌灯照射20~30min后开启风机。每次进入超净台操作前，双手需均匀擦拭75%酒精，而不能经紫外线照射杀菌但需要拿入超净台操作的物品，如装有酶或基础细胞培养液的玻璃瓶、培养有细胞的培养瓶或培养板，需要均匀喷洒75%酒精后再放入超净台操作。二、兔髂嵴软骨的取材
1．预先将幼龄新西兰兔下背部以双侧髂嵴为中心周围约3cm处毛发剪除，避免伤及皮肤。
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2．将新西兰兔仰卧四肢固定于解剖操作台上，用指尖腹侧触及左侧胸腔心脏搏动的最强处，擦拭碘伏消毒两遍，无菌注射器针头刺入皮肤后继续推入约1~1.5cm，抽吸见鲜红色血液后缓慢注入空气3ml，拔除针头。
3．将经心脏空气栓塞处死的新西兰兔俯卧四肢固定于解剖操作台上，下背部喷洒75%酒精，将四周未剃除的毛发自双侧髂嵴内侧抚向外侧，将已剃除毛发部位的皮肤用碘伏消毒两遍。以下操作过程严格遵从无菌操作技术及规范。
4．打开已消毒的装有取材器材饭盒的盒盖，双手带无菌手套，在取材部位周围铺四层无菌纱布。
5．剪开皮肤，钝性分离皮下疏松结缔组织，暴露取材部位，在下背部粉红色肌肉组织包绕中所见到的白色片状物即髂嵴软骨，换用尖刀片和无齿镊钝锐性分离包绕其上的肌肉组织，直至完全暴露出髂嵴软骨，轻柔操作，避免损伤肌肉引起出血。
6．小心分次切取髂嵴软骨层获得白色软骨块，避免附带周边肌肉组织或结缔组织，避免切除过深至骨髓腔引起造血细胞的干扰。
三、兔髂嵴软骨细胞的提纯
1．把取得的软骨块标本完全淹没于装有PBS的35mm玻璃培养皿中，转到超净工作台继续后续操作步骤，遵从无菌操作技术及规范；
2．剪除软骨块周围的肌肉纤维结缔组织，再将软骨块放置于另一35mm玻璃培养皿中，用预冷的PBS清洗2次；
3．用眼科剪将软骨块剪至1~2mm2的小组织块，PBS清洗2次；
4．用预温的0.1%透明质酸酶消化15min（室温37℃，振荡），PBS清洗3次，将组织块装入15ml离心管内；
5．用预温的0.25%胰蛋白酶/0.1%EDTA消化15min（室温37℃，振荡），见组织块周边呈羽毛样改变时，加入等量的含10%FBS细胞培养液中止胰蛋白酶的消化作用，800rpm离心5min，去上清液，PBS清洗3次，去上清液；
6．加入预温的0.1%II型胶原蛋白酶及含10%FBS细胞培养液，吸管反复吹打后，置于37℃，5%CO2培养箱中2.5小时，800rpm离心5min，去上清液，PBS清洗3次，去上清液；
7．加入预温的含10%FBS细胞培养液，吸管反复吹打；
8．用200目不锈钢筛网过滤软骨细胞悬液，收集软骨细胞滤液；
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9．将收集的部分软骨细胞悬液移入50ml玻璃培养瓶中，加入含10%FBS细胞培养液覆盖瓶底；
10．将收集的部分软骨细胞悬液移入另一50ml玻璃培养瓶中，加入含10%FBS 及双抗生素细胞培养液覆盖瓶底；
11．将上述两个玻璃培养瓶标记后置于37℃，5%CO2培养箱中培养；
12．台盼蓝染色检测软骨细胞活细胞存活率：吸取收集的部分软骨细胞悬液，800rpm离心5min，去上清液，加入细胞重悬液，吸管反复吹打，吸取少量含软骨细胞重悬液于0.5ml塑料离心管中，加入等量台盼蓝染色液（2x），振荡摇匀3min，吸取少量软骨细胞悬液，血球计数板软骨细胞计数（蓝色为死细胞，无色透明为活细胞），算出活细胞存活率；
细胞存活率＝(细胞总数－蓝色细胞数)/细胞总数×100%
结 果
取材兔髂嵴软骨经三步酶消化法后可获得多量的单个软骨细胞，用台盼蓝染色检测法示细胞存活率为96％~98％。
讨 论
软骨自身增殖能力差，损伤后多由纤维骨性结构修复，失去原有结构的功能。生长板则是儿童所具有的独特软骨结构，由软骨细胞和ECM组成，根据组织结构特性分为储备区、增生区、钙化区和成骨区四层不同的功能区，促进长骨的纵向生长，待成年后退化消失[6,7]。相对于周边的韧带、肌腱以及骨骼，生长板结构较为薄弱，容易受到创伤、感染等多方面因素作用而发生损伤，从而继发生长发育障碍导致畸形的发生和发展。目前临床治疗主要以骨桥切除和矫形手术为主[8]，新兴发展的软骨组织工程学则为日后软骨组织自我修复提供了基础的研究背景和结果。软骨细胞是软骨发生和成熟过程中起着重要作用的组成部分，是目前软骨组织工程学研究感兴趣的对象之一，是用于软骨生物学和临床应用研究的细胞模型，是用于软骨损伤生长板缺损组织工程材料的种子细胞。
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本研究取材兔髂嵴软骨，相对于大多数研究取材关节软骨来说，虽然一次取材获得的软骨细胞数较少，但取材部位在皮下，技术简单，操作时间短，可用于活体动物实验研究。另外髂嵴软骨由于部位特殊，且具有软骨内成骨的功能，局部的损伤和缺失不会对实验动物日后的生理活动造成严重的影响，可经过体外原代培养扩增后用于自体移植，更适于生长板损伤修复的临床基础研究。
目前通过酶消化法获得软骨细胞的方法多种多样，本研究采用0.1%透明质酸酶、0.25%胰蛋白酶和0.1%II型胶原蛋白酶三步法消化获得多量单个的软骨细胞，存活率为96％以上，具有良好的细胞活性。小心分次少量取材以获得单纯的软骨组织，修剪成小软骨块后先用透明质酸酶消化以降低分子间质的黏性来增加液体的渗透性，再用胰蛋白酶和II型胶原蛋白酶依次顺序消化，以逐步破坏ECM中各种蛋白分子间的连接及其构建所形成的胶原网状结构，使包埋其中的软骨细胞游离出来。在此过程中需灵活控制胰蛋白酶的消化时间，当见到软骨组织块周边呈羽毛样改变时，即需要加入含血清培养液中止消化，避免消化过度造成软骨细胞的活性降低；由于II型胶原蛋白酶消化时间较长，在消化的同时加入含血清培养液可营养分离的软骨细胞，以保持其活性和功能。
结 论
本研究取材兔髂嵴软骨，位置浅表，实验技术简单，且熟练操作后耗时短，可用于活体动物实验研究。并且髂嵴软骨损伤和缺失对实验动物日后的生理活动无特别影响，适宜于自体移植取材，具有临床实用性。
本研究采用0.1%透明质酸酶、0.25%胰蛋白酶和0.1%II型胶原蛋白酶三步酶消化法获得多量单个的软骨细胞，具有良好的细胞活性。
华中科技大学博士学位论文
参考文献
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第二部分
兔髂嵴软骨细胞原代培养及鉴定的实验研究
引 言
软骨是由软骨细胞和ECM共同所构成的，并且ECM中基质蛋白（如II型胶原蛋白、聚集蛋白聚糖、连接蛋白和透明质酸）的合成、组装和降解是由软骨细胞所介导而发生的动态过程，是由软骨细胞维持其功能的稳定和平衡[1-6]。而生长板软骨内的软骨细胞具有活跃的增殖、分化和成熟能力，依据其不同的功能、结构和形态分成序贯相连的四个区域：储备区、增生区、钙化区和成骨区，在大量的细胞因子和转录因子的调节下，经过增生、退化和成骨的模式完成软骨内成骨的过程[7-12]。目前生长板损伤后的临床治疗主要以改善临床症状的矫形手术为主，而立足于修复的软骨组织工程学研究中关于软骨细胞及组织工程软骨修复损伤生长板的报道较少。通过体外软骨细胞的原代培养能够为软骨及生长板的生理组织学特性研究提供平台，为软骨及生长板损伤后病理学变化发展提供依据，从而了解软骨细胞是否具有修复软骨及生长板损伤的潜在临床应用特性。本研究取材兔髂嵴软骨，成功将分离的软骨细胞在体外通过原代培养扩增，具有良好的细胞活性和特征性生物表型，可进一步用于自体移植重塑修复软骨或生长板损伤的实验研究。
材 料
一、实验动物
4周龄健康新西兰兔2只，清洁级，体重350~450g左右，雌雄不限，由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供。实验中所有动物的处理方法均符合中华人民共和国及华中科技大学同济医学院实验动物管理规则和条例。
二、所用试剂及配置方法
1．碘伏，500g/瓶，武汉同济美迪生科技有限公司。
华中科技大学博士学位论文
2．FBS，100ml/瓶，美国Hyclone公司。
3．DMEM/F12培养基，500ml/瓶，美国Hyclone公司。
4．青霉素/链霉素溶液，各1万单位/ml，100ml/瓶，美国Invitrogen公司。
5．基础细胞培养液的配置方法：①100ml含10%FBS细胞培养液：FBS 10ml置于100ml无菌玻璃瓶中，再加入DMEM/F12 90ml，摇匀后保存于4℃冰箱中备用；
②100ml含10%FBS及双抗生素细胞培养液：FBS 10ml置于100ml无菌玻璃瓶中，再加入DMEM/F12 89ml和青霉素/链霉素溶液1ml，摇匀后保存于4℃冰箱中备用。
6．II型胶原蛋白酶，100mg/瓶，美国Invitrogen公司。
7．0.1%II型胶原蛋白酶的配置方法：称取II型胶原蛋白酶 100mg，充分溶解于2ml双蒸水中，经0.22um无菌滤器滤过除去细菌后置于100ml无菌玻璃瓶中，再加入DMEM/F12培养基98ml，摇匀后保存于4℃冰箱中备用。
8．透明质酸酶，100mg/瓶，美国Sigma公司。
9．0.1%透明质酸酶的配置方法：称取透明质酸酶 100mg，充分溶解于2ml双蒸水中，经0.22um无菌滤器滤过除去细菌后，置于100ml无菌玻璃瓶中，再加入DMEM/F12培养基98ml，摇匀后保存于4℃冰箱中备用。
10．0.25％胰蛋白酶/0.1%EDTA，100ml/瓶，美国Gibco公司。
11．氯化钠，500g/瓶，国药集团化学试剂有限公司。
12．氯化钾，500g/瓶，国药集团化学试剂有限公司。
13．磷酸二氢钾，500g/瓶，国药集团化学试剂有限公司。
14．磷酸氢二钠，500g/瓶，国药集团化学试剂有限公司。
15．0.01M磷酸盐缓冲液（phosphate-buffer saline，PBS）的配置方法：称取氯化钠 8.00g，氯化钾 0.20g，磷酸二氢钾 0.20g，磷酸氢二钠 2.08g，用玻璃棒搅拌充分溶解于双蒸水1000ml中，分装于250ml玻璃瓶中高压蒸汽消毒灭菌（101.33kPa，121.3℃，20min）后保存于4℃冰箱中备用。
16．重铬酸钾，500g/瓶，天津市广成化学试剂有限公司。
17．浓硫酸，1L/瓶，中平能化集团开封东大化工有限公司。
18．5L重铬酸钾和浓硫酸清洁液的配制方法：称取重铬酸钾600g置于不锈钢箱中，加入双蒸水5L，用木棍搅拌使其充分溶解后，缓慢倒入浓硫酸1000ml，边倒边用木棍搅拌，放置完全散热后备用。
19．台盼蓝染色细胞存活率检测试剂盒（C0011），中国碧云天公司。
干细胞治疗卵巢早衰的研究进展_左侠
·综述· 作者单位： 100048北京，中国人民解放军海军总医院妇产科（左侠，陈蕾）；第四军医大学（左侠） 通信作者：陈蕾，E-mail ：chenleis@https://www.wendangku.net/doc/e210596856.html, △ 审校者 干细胞治疗卵巢早衰的研究进展 左侠，陈蕾△ 【摘要】卵巢早衰（POF ）是由多种病因导致的卵泡功能衰竭。大约80%患者属于特发性POF 。POF 治疗棘手，近年国内外取得了应用干细胞恢复卵巢功能及生育力等方面的动物试验成果，为POF 患者卵巢功能及生育功能的恢复带来了希望。干细胞包括胚胎干细胞和成体干细胞，胚胎干细胞治疗因其引起伦理争议而受到限制。目前成体干细胞治疗包括生殖干细胞、骨髓间充质干细胞和胎儿间充质干细胞的治疗。干细胞可能通过分化为卵母细胞或通过旁分泌抑制卵泡凋亡来修复受损卵巢。现对POF 的干细胞治疗进展进行综述。 【关键词】卵巢功能早衰；干细胞；胚胎干细胞；成体干细胞 Research Progress of Stem Cells in the Treatment of Premature Ovarian Failure ZUO Xia ，CHEN Lei.Department of Obstetrics and Gynecology ，PLA Navy General Hospital ，Beijing 100048，China （ZUO Xia ，CHEN Lei ）；The Fourth Military Medical University ，Xi ′an 710032，China （ZUO Xia ） Corresponding author ：CHEN Lei ，E-mail ：chenleis@https://www.wendangku.net/doc/e210596856.html, 【Abstract 】Premature ovarian failure （POF ）refers to failure of follicle function which is caused by a variety of causes. About eighty percentages of POF belongs to idiopathic POF.Therapy of POF is very tricky.In recent years ，stem cell therapy has obtained some achievements in the restoration of ovarian function in animal experiments at home and abroad.These achievements bring hope in aspect of recovery of ovarian function and fertility for patients with POF.Stem cell includes embryonic stem cells and adult stem cells.Study in embryonic stem cell therapy is restricted because of ethical controversy.The adult stem cell therapy includes germline stem cell therapy ，bone marrow mesenchymal stem cell therapy ，fetal mesenchymal stem cells therapy.Stem cells may differentiate into oocytes or inhibit follicle apoptosis through paracrine to restore damaged ovaries.This article mainly reviews research progress about stem cell therapy of POF. 【Keywords 】Ovarian failure ，premature ；Stem cells ；Embryonic stem cells ；Adult stem cells （J Int Obstet Gynecol ，2014,41：25-28） 卵巢早衰（POF ）是指女性在40岁以前出现持 续性闭经、性器官萎缩，伴有促性腺激素包括卵泡刺激素（FSH ）和黄体生成激素（LH ）升高，而雌激素降低的综合征。在国外，普通人群POF 发病率约为1%[1]，中国约3.8%，其中特发性POF 约占80%[2]。对于POF 患者来说，现有的临床治疗主要为激素替代治疗（HRT ）。HRT 能缓解更年期症状及远期并发症，但长期HRT 有增加乳腺癌、心脏病和中风风险的担忧[3]。目前尚无明确有效的治疗措施恢复卵巢功能。近10年来，干细胞治疗在动物试验方面取得的成果为POF 患者卵巢功能及生育能力的恢复带来了希望。现就干细胞治疗POF 的研究进展综述如下。1 干细胞的发现、分类及治疗作用 干细胞是一类具有多向分化潜能和自我复制能 力的原始未分化细胞，是形成哺乳类动物的各组织 器官的原始细胞。干细胞研究开始于20世纪60年代，在加拿大科学家James E.Till 和Ernest A.McCulloch 发现并命名造血干细胞之后。1970年Martin Evans 从小鼠中分离出胚胎干细胞并在体外进行培养，其能分化出成体动物的所有组织和器官，包括生殖细胞。在1998年末，美国两个研究小组成功培养出人类胚胎干细胞，保持了胚胎干细胞分化为各种体细胞的全能性。造血干细胞是最早被发现的，且研究最多、最先用于治疗疾病的成体干细胞，长期以来，一直认为干细胞只属于造血系统。随着干细胞研究的不断深入，近年来，几乎在所有组织中都发现了干细胞，干细胞生物学和干细胞生物工程已成为继人类基因组大规模测序之后最具活力、最有影响和最有应用前景的生命学科。 干细胞按发育阶段分为两大类：胚胎干细胞和成体干细胞。胚胎干细胞取自囊胚里的内细胞团，而成体干细胞则来自各式各样的组织。目前发现，心
干细胞研究现状及应用前景
干细胞研究现状及应用前景 在人类生命形成的开始，单个受精卵可以分裂发育形成不同的组织和器官，并通过进一步分裂分化，形成生命个体。在成体细胞中，大部分高度分化的细胞则失去了再分化的能力，而特定组织正常的生理代谢或病理损伤也会引起组织或器官的修复再生，这种具有在分化能力的细胞，即为干细胞。干细胞（Stem Cells，SC）是一类具有自我更新能力的多向分化潜能细胞，在一定的条件下，它可以分化成多种功能的器官组织。 一、干细胞的研究现状 干细胞根据发育阶段，可分为胚胎干细胞和成体干细胞。胚胎干细胞的分化和增殖是构成机体发育的基础，而成体干细胞的进一步分化则是机体组织和器官修复再生的基础。 1、胚胎干细胞（Embryonic Stem cell，ESC） 在受精卵发育成囊胚时，内细胞层（Inner Cell Mass）的细胞即为胚胎干细胞。胚胎干细胞具有全能性，在体外培养条件下可以建立稳定的干细胞系，并保持高度未分化状态，可以分化形成成体的所有组织和器官，包括生殖细胞。 在1998年末，两个研究小组成功地培养出人类ESC，保持了ESC 分化为各种体细胞的全能性，这使得科学家利用人类ESC治疗各种疾病成为可能。随着ESC的研究日益深入，科学家对人类ESC的了解迈入到了一个新的阶段。目前，关于胚胎干细胞的研究大多以小鼠胚胎干细胞为基础的：德美医学小组成功地将由ESC培养出的神经
角质细胞移植到了小鼠体内，随后，密苏里的研究人员通过鼠胚细胞移植技术，使瘫痪的猫恢复了部分肢体活动能力。 2、成体干细胞(Adult stem cells，ASC) 成体干细胞存在于成年体的许多组织器官中，如表皮干细胞和造血干细胞，具有修复和再生能力。在特定的条件下，ASC或产生新的干细胞，或分化形成功能细胞，从而使组织和器官维持生长和衰退的动态平衡。最新研究表明，高度分化的神经组织仍包含神经干细胞，这证明了机体中成体干细胞普遍存在，关键在于如何寻找和分离特异性干细胞。 2.1造血干细胞（hematopoietic stem cell, HSC） 造血干细胞主要存在于骨髓、外周血、脐带血中，是体内各种血细胞的唯一来源，具有重要的临床价值。 20世纪50年代，临床上就开始应用骨髓移植来治疗血液系统疾病。八十年代末，外周血干细胞移植技术逐渐被推广使用，提高了治疗的效率并缩短了疗程。近年，脐血干细胞移植的成功，为造血干细胞移植技术注入了新的活力。与前两者相比，脐血干细胞无来源限制，对HLA配型要求不高，且不易受病毒和肿瘤的感染，在临床上具有明显的优势。随着脐血干细胞移植技术的不断完善，造血干细胞将成为治疗血液系统疾病、先天性遗传疾病以及多发性和转移性恶性肿瘤疾病的最有效方法，为世界上更多的血液病和肿瘤患者带来希望。2.2间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSC) 间充质干细胞主要来源于骨髓，在合适的条件下，MSC可以分化
中国音乐治疗的现状分析及前景展望
中国音乐治疗的现状分析及前景展望 中国音乐治疗的现状分析及前景展望 ABSTRACT Musi treatment has existed no more than more half of entur, but it spread ith an astonishing speed at man ountries in the orld. Experts in related field of the orld all expressed tremendous enthusiasm to the brand-ne subjet. Musi treatment as introdued into China from the estern ountries in80s, starting its development in China. But Musi treatment did not get to develop and appl pletel in China. There are to reasons for the phenomenon. On the one hand the theories and linial experiene of Musi treatment are not onsummate; on the other hand it lies in the bottlenek of Musi treatment development and traditional thought of Chinese, ignoring the eonomi funtion of Musi treatment still ill be important fator of baffling Musi treatment development. So the author ants to analsis the advantage and disadvantage in the development of Musi treatment and explore the proper measure from the angle of the eonomis, b giving the outline of the present ondition. In the end the author provide suggestions to the development of Musi treatment in China using the theories of eonomis.Ke ords: Musi treatment; Analsis of present ondition; Advantage; Disadvantage; Prospet
细胞培养技术在医药研究中的应用
细胞培养技术在医药研究中的应用 摘要：近年来，动物细胞培养技术在生物制药领域成为最受关注的热点之一，动物细胞培养技术广泛应用于动物细胞高密度培养，推动了现代生物医药 产业的发展。动物细胞培养是指离散的动物活细胞在体外模拟体内的: 生理环境 , 在无菌、适宜的培养条件下生长、繁殖的过程。利用人工培养的动物细胞可以进行科学研究和生物制药, 动物细胞的大规模的培养技术是生物制药中非 常重要的环节。在动物细胞培养过程中, 最重要的是使细胞的培养条件达到最 优化程度, 尽可能消除或减轻环境对细胞的影响, 因此动物细胞培养环境的控 制是细胞培养的关健技术。 关键词：动物细胞培养技术，生物制药，培养条件,人工培养。 自1885 年，Roux 从鸡胚中分离细胞首次建立体外细胞培养; Dulbecco于1943 年创建单层细胞培养已有半个多世纪。因其具有的培养简单、操作方便、消耗少、大量运用等优点，被广泛运用于生命科学的各个领域[1]。全球生物制药技术和市场的迅速发展为动物细胞培养基市场提供了快速成长的发展环境， 并使之保持强劲的发展势头。 1 细胞培养的环境及条件 1.1 无污染的环境 无菌无毒的操作环境和培养环境是保证细胞在体外培养成功的首要条件[3]。 1.2 适宜的温度 维持培养细胞旺盛生长, 必须有恒定而适宜的温度。不同种类的细胞对培养温度要求也不同[3]。 1.3 气体环境和氢离子浓度 气体是哺乳动物细胞培养生存必需条件之一, 所需气体主要有氧气和二氧化碳[3]。 1.4 适宜的p H 值 每种细胞都有其最适p H 值。p H 值随培养的细胞种类不同而不同, 大多数细胞的适宜pH 为7.2至7.4, 偏离这一范围对细胞培养将产生有害的影响[3]。 1.5 培养基 培养基不仅提供细胞营养和促使细胞生长增殖的基础物质, 而且还提供培养细胞生长和繁殖的生存环境[3]。 1.6 细胞培养外部环境 细胞培养是一种无菌操作技术, 对实验室、常用设施及设备、培养器皿等都有严格的要求[3]。 2 细胞培养无菌操作基本技术无菌操作技术分为: 工作环境及表面、细胞培养所用器皿、培养液与培养细胞的处理。 2.1 工作环境的处理 使用层流超净工作台是最经济有效的手段[3]。 2.2 细胞培养所用玻璃及塑料制品的清洗与消毒 消毒方法分为物理灭菌法( 紫外线、湿热、干烤、过滤等), 化学灭菌法( 各种化学消毒剂) 和抗生素三类。[3] 细胞培养基的质量标准及产品质量控制参考国内外细胞培养基产品企业标 准的现状，着重考虑了生物制药用户对产品质量的要求以及《中华人民共和国
细胞研究进展概述
细胞研究进展概述——干细胞技术 20092358 谢芬霏16120901 生物技术 摘要：干细胞是人体及各种组织细胞的最初来源，具有高度自我复制、高度增殖和多项分化的潜能。干细胞的研究正在向现代生命科学和医学等各个领域交叉渗透，干细胞的研究也成为了生命科学的热点，本篇就几个干细胞的研究方向的进展展开一些介绍。 关键词：干细胞；多能性；神经干细胞；造血干细胞 引言： 干细胞是一类具有自我复制能力的多潜能细胞，在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞。根据干细胞所处的发育阶段分为胚胎干细胞(embryonic stem cell，ES细胞)和成体干细胞(somatic stem cell)。根据干细胞的发育潜能分为三类：全能干细胞(totipotent stem cell,TSC)、多能干细胞（pluripotent stem cell）和单能干细胞（unipotent stem cell）。干细胞(Stem Cell)是一种未充分分化，尚不成熟的细胞，具有再生各种组织器官和人体的潜在功能，医学界称为“万用细胞”。干细胞的形态上具有共性，通常呈圆形或椭圆形，细胞体积小，核相对较大，细胞核多为常染色质，并具有较高的端粒酶活性。胚胎干细胞(Embrtibuc stem cell)的发育等级较高，是全能干细胞（Totipotent stem cell），而成体干细胞的发育等级较低，是多能干细胞或单能干细胞。据最新研究发现，成体干细胞可以横向分化为其他类型的细胞和组织，为干细胞的广泛应用提供了基础。在胚胎的发生发育中，单个受精卵可以分裂发育为多细胞的组织或器官。在成年动物中，正常的生理代谢或病理损伤也会引起组织或器官的修复再生。胚胎的分化形成和成体组织的再生是干细胞进一步分化的结果。胚胎干细胞是全能的，具有分化为几乎全部组织和器官的能力，而成体组织或器官内的干细胞一般认为具有组织特异性，只能分化成特定的细胞或组织。 1 胚胎干细胞 1.1 胚胎干细胞的概念和生理学特性 胚胎干细胞（Embryonic Stem cell，ES细胞）。胚胎干细胞当受精卵分裂发育成囊胚时，内层细胞团（Inner Cell Mass）的细胞即为胚胎干细胞。胚胎干细胞具有全能性，可以自我更新并具有分化为体内所有组织的能力。胚胎干细胞的生物学特性有：①全能性，在体外培养的条件下, 胚胎干细胞可以诱导分化为机体的任何组织细胞。全能性的标志是细胞表面有胚胎抗原和Oct4蛋白【1】。②无限增殖性。胚胎干细胞在体外适宜条件下, 能在未分化状态下无限增殖。③胚胎干细胞具有种系传递的功能。④胚胎干细胞易于进行基因改造操作。⑤细胚胎干胞保留了正常二倍体的性质且核型正常。早在1970年Martin Evans已从小鼠中分离出胚胎干细胞并在体外进行培养【2】，而人的胚胎干细胞的体外培养直到最近才获得成功。进一步说，胚胎干细胞（ES细胞）是一种高度未分化细胞。它具有发育的全能性，能分化出成体动物的所有组织和器官，包括生殖细胞。研究和利用ES细胞是当前生物工程领域的核心问题之一。ES细胞的研究可追溯到上世纪五十年代，由于畸胎瘤干细胞（EC细胞）的发现开始了ES细胞的生物学研究历程。目前许多研究工作都是以小鼠ES细胞为研究对象展开的，如：德美医学小组在去年成功的向试验鼠体内移植了由ES细胞培养出的神经胶质细胞。此后，密苏里的研究人员通过鼠胚细胞移植技术，使瘫痪的猫恢复了部分肢体活动能力。随着ES细胞的研究日益深入，生命科学家对人类ES细胞的了解迈入了一个新的阶段。在98年末，两个研究小组成功的培养出人类ES细胞，保持了ES细胞分化为各种体细胞的全能性。这样就使科学家利用人类ES细胞治疗各种疾病成为可能。然而，人类ES 细胞的研究工作引起了全世界范围内的很大争议，出于社会伦理学方面的原因，有些国家甚至明令禁止进行
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8大成果揭露干细胞最新研究状况 导读：干细胞研究是一个永恒的话题，2015年国内外诸多新研究，为干细胞应用开辟了更为广阔的空间。2015上半年国内外干细胞研究成果 干细胞研究是一个永恒的话题，2015年国内外诸多新研究，为干细胞应用开辟了更为广阔的空间。2015上半年国内外干细胞研究成果盘点： 成果一：重编程干细胞或能预防辐射后癌变 简要：据美国科罗拉多大学(UC)癌症中心一项最新研究发现，一种叫做程序性平常化的保护程序就是其中一种，让被辐射破坏的干细胞分化为其他细胞，不再永生。相关论文发表在最近的《干细胞》杂志上。该研究显示，通过重编程这种保护程序，除去被辐射伤害的干细胞，就可能预防癌症的发生。 成果二：干细胞培养新方法筹建安全防护墙 简要：斯克里普斯研究所(TSRI)和加州大学(UC)圣迭戈医学院的
研究人员带领的一项新研究表明，某些特定干细胞培养方法与DNA 突变增加有关。这项研究为研究人员指出了更安全和更可靠的干细胞培养方法，来治疗疾病和损伤。 成果三：碳纳米物质狙击肿瘤干细胞 简要：中科院高能物理研究所国家纳米科学中心纳米生物效应与安全性重点实验室和中国科学技术大学生命学院合作，研究发现金属富勒醇Gd@C82(OH)22碳纳米材料可高效抑制三阴性乳腺癌干细胞的自我更新能力，Gd@C82(OH)22通过调控肿瘤微环境阻断细胞从上皮样(EMT)到间质样(MET)的转换，实现高效清除肿瘤干细胞，终止肿瘤发生和转移。 成果四：干细胞首次被诱导成三维迷你肺 简要：美国科学家首次成功诱导干细胞发育成人体肺部类器官一个三维迷你肺，它能模拟人体肺部的复杂结构，有助于科学家们研究肺部疾病并找到新疗法。这一组织在实验室内发育成三维球形结构，最后，通过让其与肺部发育有关的蛋白质接触，这些结构最终发育成肺部组织。而且，得到的肺部类器官在实验室存活了100多天。 成果五：区域选择性多能干细胞被发现
音乐治疗的主要方法
赵小飞080105261 音乐治疗技术方法以及应用 摘要：音乐治疗是运用与音乐相关手段：听、唱、演奏、创作、律动、音乐其他艺术形式等等方法技术，使被治疗者达到健康的目的。 关键词：听，唱，奏，运动 Music therapy techniques and methods Abstract：Music therapy is associated with music, singing, means: performance, the creation, the rhythm, music and other art forms, etc, which is technique to health therapy. Keywords：Listen, singing, play and movement 1.什么是音乐治疗 音乐治疗在西方国家已经有半个多世纪的发展历史了。在第二次世界大战时，在美国在菲律宾的一所野战医院里，到处都躺着伤兵。当时的医疗和生活条件都十分恶劣，因此伤兵们的情绪都非常糟糕，每天叫骂不正。伤兵手术后的感染率很高，死亡率也很高。这时有一个医生突然想出了一个主意——用留声机播放士兵们熟悉的家乡歌曲。很快伤兵们的情绪稳定下来了，他们不再发脾气。令人意外的是，手术后的感染率大大下降，死亡率也随之下降，甚至手术后的愈合期也明显缩短。这一发观使美国国防部大为振奋，立即在各个野战医院推广这个办法，收到很好的效果。战争结束后，美国的医生们开始认真地研究音乐对人的健康究竟起着什么作用?于是音乐治疗作为一门新兴的学科诞生了。 音乐治疗在某些方面的奇效，近似神话。一位心理学家对这一奇迹讲道：“音乐能够渗透到病人难以打开的知觉中去，并使之与外部世界沟通。” 2.音乐治疗的方法 （一）、听 与聆听相关的音乐治疗方法主要为接受式的音乐治疗方法。利用声音和音乐情绪的各种形式，以及不同的聆听方式达到计顶的目的。 促进听觉能力：包括注意力、持续度、记忆力、感受力、辨认能力〈强弱、快慢、音色、音高等〉 引导与刺激想象力 音乐放松 主要为接受式音乐治疗
细胞生物学研究技术答案
第四章细胞生物学研究技术 一、填空 C-四-1.一般观察培养的活细胞用相差显微镜，各种细胞工程中显微操作时用激光扫描共焦显微镜、分辨干涉差显微镜，用荧光染料对细胞结构标记后观察用荧光显微镜。 C-四-2.由起始实验材料所进行的细胞培养叫原代培养，对已有细胞进行的继续培养叫传代培养。 C-四-3.由单一类型的细胞所组成的细胞系称为细胞株。 C-四-4.处于对数生长期的细胞群体，当它的细胞数量增加一倍所需要的时间称为群体倍增时间。 C-四-5.两个或两个以上细胞相互接触并合并而形成一个细胞的现象称为细胞融合。 D-四-1.激光扫描共聚焦显微镜的主要用途有：①荧光检测；②细胞结构的三维重现；③显微操作。 D-四-2.细胞器和大分子的离心分离方法常用有：①差速离心；②密度梯度离心。 D-四-3.常用的离心分离方法包括：①差速离心；②密度梯度离心。 D-四-4.双向电泳的操作可以分成两部分，第一步是等电聚焦，第二步是SDS-PAGE 。 二、单项选择 A-四-1.下列显微镜中，可以对活细胞进行观察的是（ C ）。 A 普通光学显微镜 B 荧光显微镜 C 相差显微镜 D 电子显微镜 A-四-2.下列显微镜中，可以用于细胞工程中显微操作的是（ C ）。 A 普通光学显微镜 B 荧光显微镜
C 微分干涉显微镜 D 电子显微镜 A-四-3.下列显微镜中，用于荧光染料标记细胞结构后观察的是（ A ）。 A 荧光显微镜 B 普通光学显微镜 C 相差显微镜 D 电子显微镜 A-四-4.冷冻蚀刻技术是（ B ）样品制备的一种方法。 A 普通光镜 B 透射电镜 C 暗视野显微镜 D 相差显微镜 A-四-5.群体倍增时间越短，表明细胞的增殖速度（ A ）。 A 越快 B 越慢 C 维持不变 D 无关 A-四-6.如果一种细胞在体外不能传代，或者只能传少数几代，就可以将其称为（ A ）。 A 有限性细胞系 B 永生性细胞系 C 转化性细胞系 D 细胞株 A-四-7.如果一种细胞在体外能无限的传代，永远的活下去，就可以将其称为（ B ）。 A 有限性细胞系 B 永生性细胞系 C 转化性细胞系 D 细胞株 B-四-1.有关体外培养细胞，下列说法不正确的是（ D ）。 A 可根据需要人为地建立培养条件，来观察和研究细胞生命活动的规律 B 通过传代培养可获得研究所需要的细胞量 C 可摆脱活体组织的复杂背景 D 可获得与其在活体组织中完全相同的实验结果 B-四-2.在制备单克隆抗体的过程中，使得与骨髓瘤细胞发生融合的细胞是（ A ）。 A B淋巴细胞 B T淋巴细胞 C 巨噬细胞 D 粒细胞 B-四-3.要探知细胞内某一蛋白质的表达水平，可以通过（ C ）技术实现。 A Southern blot B Northern blot C Western blot D 原位分子杂交 DNA印迹技术由Southern于1975年创建，称为Southern印迹技术，RNA印
血液系统肿瘤的细胞治疗研究进展
血液系统肿瘤的细胞治疗研究进展 随着经济发展与环境改变，肿瘤发病率增高，威胁着人们的健康。血液系统是机体的重要构成部分，该系统的肿瘤发生率有逐年上升的趋势。传统的药物治疗、手术治疗等方式为挽救患者的生命、提高其生活质量、提供了更好的選择。但是，该疾病存在复发率较高等现象，亟待开发更有效的治疗方法。细胞治疗为血液肿瘤患者提供了副作用更低的治疗手段，延长患者的生存期，提高了生活质量。基于细胞的治疗策略，可提高对血液肿瘤的治疗效果。本文对血液系统肿瘤的细胞治疗研究进行综述，以期为该疾病的临床治疗提供参考。 Abstract：With the economic development and environmental changes，the incidence of cancer increases，threatening people’s health. The blood system is an important part of the body.The incidence of tumors in this system has increased year by year.Traditional medical treatment，surgical treatment and other methods provide better options for saving the lives of patients and improving their quality of life.However，there is a high rate of recurrence of this disease，and it is urgent to develop more effective treatments.Cellular therapy provides patients with blood tumor with less side-effects，prolongs their survival and improves their quality of life.Cell-based therapeutic strategies can increase the therapeutic effect on blood tumors.This article reviews the research on cell therapy of blood system tumors in order to provide reference for the clinical treatment of the disease. Key words：Blood system；Tumor；Cell therapy 近年来，血液系统肿瘤发病率呈上升的态势，放化疗、外科手术等传统的治疗方式可给部分患者带来一定的益处，然而，诸如高复发、难治愈之类的情况广泛存在，血液系统肿瘤治疗面临很大挑战。随着生物治疗技术的快速发展，细胞治疗法给血液系统肿瘤治疗提高了有力的手段[1]。细胞免疫治疗，是在体外诱导、增殖免疫细胞，又回输到机体，达到提高机体免疫力、抗击肿瘤细胞，治疗肿瘤的作用[2]。免疫系统对肿瘤的发生、转移等起着重要作用，以细胞免疫疗法是当前研究的热点。下文对血液系统肿瘤的细胞治疗研究进行综述，以期为该疾病的临床治疗提供参考。 1 T淋巴细胞治疗 骨髓中存在一种多能干细胞，当它迁移至胸腺的时候，可被诱导分化成T 淋巴细胞，从而具备了免疫作用。T细胞的表面有复杂的抗原与受体。T细胞在血液循环中有机会接触多种入侵机体的抗原，提高免疫应答作用。T淋巴细胞治疗可以分为两种类型：①非特异抗原刺激制备的淋巴因子激活的杀伤细胞（LAK 细胞）、自体细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK细胞）等；②转基因技术制备的细胞毒性T淋巴细胞（CTL细胞）、CAR-T细胞等。不同类型T细胞的疗效有别、不良反应发生率不同，对其进行深入了解，有助于在血液系统肿瘤治疗中选择适宜的治疗方法，提高患者的疗效，改善预后。
细胞衰老与肿瘤的发生的研究进展
细胞衰老与肿瘤的发生的研究进展 广东药科大学公共卫生学院卫生检验与检疫15 戚嘉铭 【摘要】近几年，细胞衰老成为一种针对癌细胞永久性生长的治疗肿瘤新途径，一直是细胞生物学家的研究重点。研究发现，细胞衰老可以作为阻碍癌细胞致癌的抑制机制。原因在于癌基因诱导具有双向性，癌基因的活化可以诱导细胞衰老。但研究发现，细胞衰老同样可能促使癌细胞的增值。 【关键词】细胞衰老肿瘤癌细胞 细胞衰老是生物体中普遍存在的一种永久性生长抑制现象，能够防止老化的或非正常细胞的进一步生长，对抗细胞的无限增殖能力而对机体起到保护作用。因此，死亡的细胞衰老与无限增殖的癌细胞一直都是细胞生物学家们致力研究的重点。本文主要是描述探究决定细胞走向衰老还是转为癌细胞的因素的相关研究进展。 1、细胞衰老:一种阻碍癌细胞致癌的机制 在多种衰老细胞中,某些抑癌基因的过表达会引起细胞进入衰老程序,细胞绕过衰老途径是其永生化及癌变的必要条件,因而细胞复制性衰老是抑制肿瘤的一种可能机制.这样对衰老细胞的研究将为肿瘤的预防和治疗方法提供新的策略[12]。细胞衰老是人体防癌的机制之一,研究细胞衰老对于抗肿瘤是很有意义的,同时为打开抗肿瘤药物治疗和新药的研发提供了依据。 1961年,Hayflick在体外培养成纤维细胞的研究中发现,正常二倍体细胞在体外条件下增殖分裂50~70代即进入一种衰老的状态,无法进一步传代培养,但仍然存活.正常的动物细胞无论是在体内生长还是在体外生长,其分裂次数总存在一个"极限值",此值被称为"Hayflick"极限,亦称最大分裂次数[11].研究表明，恶性肿瘤细胞系会发生自发性老化,其程度与细胞系种类有关.短期饥饿培养会明显增加老化细胞所占的比率,提示饥饿诱发细胞老化可能是抗肿瘤治疗的又一快速、简单且有效的途径[13]。 2、癌基因诱导的双向性 在人部分的肿瘤中都发现有癌基因的活化，癌基因的活化被认为是导致肿瘤发生的重要原因。然而，在野生型细胞内，癌基因的活化可以诱导细胞衰老，称为癌基因诱导的细胞衰老(oncogene-induced senescence, OIS)[1]。癌基因诱导的衰老( OIS)是指癌基因突变所产生的异常增殖信号，通过MAPK和PI3 K信号通路，使细胞处于生长停
音乐治疗的现状及未来展望
音乐治疗的现状及未来展望 音乐治疗是一门古老而又崭新的学科，它建立在众多学科的理论与实践基础上，诸如音乐，美学，心理学，医学，精神病学等等，同时它又是一门临床应用性很强的实用学科。音乐治疗作为心理治疗的方法之一，其应用范围在未来不一定仅仅局限于心理治疗方面。 通过对音乐治疗的现状研究，了解音乐治疗的产生、发展及其在发展中的不足、各学派之间的学术差异以及中外的差别等方面的内容。它作为一门有效的辅助治疗手段，在未来的应用肯定会越来越广，通过研究来展望音乐治疗在未来的应用等方面的内容。 1.1 问题提出 音乐治疗是一门比较年轻的学科，涉及到的内容很广泛，应用的领域也非常的多，各流派之间的差异也较为明显，所以想要深刻研究音乐治疗，对音乐治疗现状的了解是必不可少的。现状研究有利于进一步的发现问题，也是问题解决的基础。 随着时代的进步，音乐治疗的发展也越来越快，音乐治疗专业的逐渐成熟，这也为音乐治疗的发展提供了广阔的基础。基于对对现状进行研究，从而对音乐治疗的未来进行展望。 1.2 研究意义 据史料记载，音乐治疗早已出现，但这一学科的确立又是比较晚的，它的建立是基于很多学科的基础之上，包括理论与实践这两个部分，它的临床应用性也很强。音乐治疗作为心理治疗的方法之一，其应用范围在未来不一定仅仅局限于心理治疗方面，在某些躯体疾病恢复也可能会产生一些作用。通过对音乐治疗的现状研究，了解到其在发展中的不足，并通过未来展望促进音乐治疗的多方面发展。 本文通过对音乐治疗的研究，总结了音乐治疗的现状及展望，并提出了自己的见解，对音乐治疗的研究方面有一定的创新作用和指导意义。 1.3 研究方法 文献调研、采访相关的国内专家 通过文献资料的研究对音乐治疗的发展现状进行研究，包括一些专著，文章一级期刊上的文献进行研究。在了解现状的基础上，采访国内的相关专家，
肿瘤的发生与发展
肿瘤的发生与发展 肿瘤的定义：肿瘤是机体在各种致瘤因素作用下，局部组织的细胞在基因水平上失去对其生长的正常调控，导致克隆性异常增生而形成的新生物，常表现为局部肿块。 过程：局部组织的细胞—基因突变—细胞异常增生—新生物—局部肿块 发病机制：肿瘤的发病是一个多因素、多步骤参与的过程。 恶性肿瘤的病因（尚未完全了解）， 1.环境因素：化学，物理，生物因素 2.机体因素 化学致癌 化学致癌物：目前认为凡接触引起人或动物形成肿瘤的化学物质，称为化学致癌物（chemical carcinogen）。目前发现对动物有致癌作用的化学物质已达2000余种，其中有些可能和人类肿瘤的形成有关 分类：1。作用分式：直接致癌物，间接致癌物，促癌物 2.与肿瘤的关系：肯定致癌物，可疑致癌物，潜在致癌物 ? 1.直接致癌物：进入机体后与细胞直接作用，诱导细胞癌变的化学物质。 ? 2.间接致癌物：进入体内经微粒体氧化酶活化，变成具有致癌作用的化学物质 ? 3.促癌物：能促进其他致癌物诱发肿瘤形成的化学物质 ? 4.肯定致癌物（defined carcinogen）经流行病学调查确定，临床医师和科学工 作者都承认对人和动物有致癌作用，其致癌作用具有剂量反应关系的化学致癌物。 ? 5.可疑致癌物（suspected carcinogen）具有体外转化能力，而且接触时间和发 病率相关，动物致癌实验阳性，结果不恒定，且缺乏流行病学方面的证据。 ? 6.潜在致癌物（potential carcinogen）是在动物实验中可获得某些阳性结果， 但在人群中尚无资料证明对人具有致癌性的物质。 １、化学致癌物的作用点：为细胞的癌基因和抑癌基因 ２、作用：使癌基因激活，抑癌基因失活。 １、累积作用:(summation effect) 是指两种或多种致癌物同时或相继作用于机体，其复合效应等于单独作用之和２、协同作用:(synergistiic effect) 机体同时暴露于几种致癌物中其致癌作用高于个单独致癌物作用之和 常见的化学致癌物：多环芳香烃类，芳香胺与偶氮染料，亚硝胺类 化学致癌例子。苯胺染料：膀胱癌，烟草：肺癌，黄曲霉素：肝癌 物理致癌 1.电离辐射是最主要的物理性致癌因素 2.放射性同位素：镭、铀、氡等放射性同位素 3.紫外线：皮肤癌，着色性干皮病 病毒致癌 1/3为DNA病毒，2/3为RNA病毒 ?一、乳头状瘤病毒与宫颈癌（HPV） ?二、乙型肝炎病毒与肝癌（HBV） ?三、EB病毒与鼻咽癌和Burkit肉瘤（EBV） ?四、HTL V与人类T细胞白血病（HTL V） 致瘤性DNA病毒
干细胞研究的历史、现状与未来
干细胞研究的历史、进展与未来 中国科学技术大学生命科学学院2004级胡文宝 干细胞是尚未分化发育的，能生成各种器官组织的全能细胞。它是具有自我更新、高度增殖和多向分化潜能的细胞群体，即这些细胞可以通过细胞维持自身细胞群大小，同时又可以进一步分化成为各种不同的组织细胞，从而构成机体各种复杂的组织和器官。干细胞可以来自胚胎、胎儿或成体。根据其来源不同，干细胞可分胚胎干细胞和成体干细胞。胚胎干细胞的分化和增殖构成动物发育的基础，即由单个受精卵发育成为具有各种组织器官的个体，成体干细胞的进一步分化则是成年动物体内组织和器官修复再生的基础。 干细胞研究的历史： 1959年，美国首次报道了通过体外受精（IVF）动物。 60年代，几个近亲种系的小鼠睾丸畸胎瘤的研究表明其来源于胚胎生殖细胞（embryonic germ cells, EG细胞）,此工作确立了胚胎癌细胞（embryonic carcinoma cells, EC细胞）是一种干细胞。 1968年，Edwards 和Bavister 在体外获得了第一个人卵子。 70年代，EC细胞注入小鼠胚泡产生杂合小鼠。培养的SC细胞作为胚胎发育的模型，虽然其染色体的数目属于异常。 1978年，第一个试管婴儿，Louise Brown 在英国诞生。 1981年，Evan, Kaufman 和Martin从小鼠胚泡内细胞群分离出小鼠ES细胞。他们建立了小鼠ES细胞体外培养条件。由这些细胞产生的细胞系有正常的二倍型，像原生殖细胞一样产生三个胚层的衍生物。将ES细胞注入上鼠，能诱导形成畸胎瘤。 1984—1988年，Anderews 等人从人睾丸畸胎瘤细胞系Tera-2中产生出多能的、可鉴定的（克隆化的）细胞，称之为胚胎癌细胞（embryonic carcinoma cells, EC细胞）。克隆的人EC细胞在视黄酸的作用下分化形成神经元样细胞和其他类型的细胞。 1989年，Pera 等分离了一个人EC细胞系，此细胞系能产生出三个胚层的组织。这些细胞是非整倍体的（比正常细胞染色体多或少），他们在体外的分化潜能是有限的。 1994年，通过体外授精和病人捐献的人胚泡处于2-原核期。胚泡内细胞群在培养中得以保存其周边有滋养层细胞聚集，ES样细胞位于中央。 1998年，Thomoson等从治疗不育症的夫妇捐献的正常人胚泡中分离得到内细胞群。细胞经培养可多次传代，保持正常核型，具有高水平的端粒酶活性，表达人ES细胞而灵长类ES细胞的特征。当将几种非克隆化细胞系的细胞注入免疫缺陷小鼠内后可形成畸胎瘤。畸胎瘤含有来源于原始胚层的多种细胞类型，这证明了人ES细胞的多能性。 2000年，由Pera、 Trounson 和 Bongso 领导的新加坡和澳大利亚科学家从治疗不育症的夫妇捐赠的胚泡内细胞群中分离得到人ES细胞，这些细胞体外增殖，保持正常的核型，自发分化形成来源于三个胚层的体细胞系。将其注入免疫缺陷小鼠错开内产生畸胎瘤。 2003，建立了人类皮肤细胞与兔子卵细胞种间融合的方法，为人胚胎干细胞研究提供了新的途径。 2004年，Massachusetts Advanced Cell Technology 报道克隆小鼠的干细胞可以通过形成细小血管的心肌细胞修复心衰小鼠的心肌损伤。这种克隆细胞比来源于骨髓的成体干细胞修复作用更快、更有效，可以取代40%的瘢痕组织和恢复心肌功能。这是首次显示克隆干细胞在活体动物体内修复受损组织。 干细胞研究的进展： 1.干细胞的来源 胚胎干细胞主要来源于胚胎组织，而用于治疗的应该是人的胚胎干胚胎干细胞，由于人
近十年来音乐治疗在我国的研究回顾与展望
云南社会主义学院学报 2012年第6期 NO.6,2012 云南社会主义学院学报 J O U R N A L O F Y U N N A N I N S T I T U T E O F S O C I A L I S M 288 近十年来音乐治疗在我国的研究回顾与展望 王小露 （南京邮电大学 教育科学与技术学院，江苏 南京 210023） 摘 要：本文通过对国内近十年音乐治疗的理论研究和临床应用等方面的相关文献进行了回顾与分析，指出目前我国在音乐治疗研究中存在的不足，提出音乐治疗学队伍专业化、效果评价体系标准化、中国传统音乐治疗本土化的观点，为我国音乐治疗学科建设和发展提供新动力。 关键词：音乐治疗；研究回顾；展望 中图分类号：J618.9 文献标志码：A 文章编号：1671-2811（2012）06-0288-2 自古以来就有记载，音乐对人类生理和心理产生积极 K、B、S 为检索工具，在文献标题栏输入“音乐治疗（或的实践研究论文依然很多，占文献总数的74%，特殊儿童教育、其他人群、大学生的心理健康问题等领域的实践研究其次，尤其是特殊儿童教育音乐治疗领域。同时应用领域不断延伸，从临床科室到社区，应用对象从特殊人群发展到普通人群。 二、音乐治疗文献内容分析 国内音乐治疗研究内容大体分为理论研究和临床应用两类。 （一）理论研究 丰富，是一门年轻的新兴的边缘交叉应用学科。不同国家、不同民族的音乐治疗师，受多方面因素的影响，加上各国专家开展音乐治疗的领域及治疗方法的不同，产生了不一致的定义。 我国音乐治疗研究者张鸿懿则认为音乐治疗更倾向 于是心理治疗的一种方法，将音乐治疗定义为：“以心理治疗的理论和方法为基础，运用音乐特有的生理、心理效应，使求治者在音乐治疗师的共同参与下，通过各种专门 设计的音乐行为，经历音乐体验，达到消除心理障碍，恢 作者简介：王小露，南京邮电大学 教育科学与技术学院。 基金项目：1、江苏省教育科学“十二五”规划课题青年专项《音乐治疗在自闭症儿童语言障碍的干预研究》 （Ca/2011/01/25）；2、江苏省高校哲学社会科学研究指导项目《基于音乐治疗学视角下的大学生心理健康 教育模式研究》（2012SJDFDY059）。 网络出版时间：2013-02-21 08:24 网络出版地址：https://www.wendangku.net/doc/e210596856.html,/kcms/detail/53.1133.D.20130221.0824.161.html
造血干细胞的研究现状
造血干细胞的研究现状 造血干细胞的研究现状简介 造血干细胞（Hematopoietic Stem Cell ，HSC）是一种成体干细胞，是具有高度自我更新能力和多向分化潜能的造血前体细胞，属于多能干细胞。造血干细胞主要来源于三个渠道: 骨髓、外周血和脐带血。一般可将血细胞的生成过程划分为三个阶段: 造血干细胞、造血祖细胞和在形态上可以辨认的各种幼稚血细胞。造血干细胞采用不对称的分裂方式，平均每57 天分裂一次。它一方面可以再生，另一方面可以分化成髓红系干细胞和淋巴系干细胞，后两者又能分别分化成红细胞、巨核细胞、淋巴细胞、树突状细胞、NK细胞、粒细胞等一系列血细胞。造血系统不同阶段受不同基因表达调控，造血分化也受到若干个随机细胞因子的调控。 造血干细胞的生物学特征?:（一）自我更新和自我维持能力: 正常情况下，造血干细胞经过不对称有丝分裂形成两个子代细胞，其中一个仍保持造血干细胞的全部特征，这称为造血干细胞的自我更新或自我维持。自我更新使造血干细胞的数量和质量维持不变。另一个子细胞在有丝分裂过程中特征发生改变，逐渐走向分化的途径，维持循环的各种血细胞的数量。（二）高度增殖潜能: 在骨髓中，造血干细胞大约仅占骨髓0.05%，且大多数处于G0期。由于放、化疗造成造血细胞明显减少或在某些动员剂的作用下，造血干细胞能大量分裂，从而有更多的造血干细胞进入分裂周期。（三）多向分化潜能: 造血干细胞不仅能分化为各系统的血细胞系，还具有可塑性，可向某些非造血细胞转化，如神经细胞、骨骼肌细胞、肝脏细胞、血管内皮细胞以及多种组织的上皮细胞等。造血干细胞的表面标志主要有 CD34抗原、 CD38抗原、CD90抗原、CD117抗原、Sca1抗原和AC133抗原等，其中CD34是分离纯化造血干细胞的主要标志。利用这些表面标志，可将造血干细胞从造血组织中分离出来，进行研究。