免疫荧光操作步骤(漂片,冰冻切片)

免疫荧光操作步骤（漂片，冰冻切片）

免疫组化步骤：

1.将脑片放到，6孔板（或12孔板），按照二抗说明书，加3%双氧水封闭10min （如果是从切片保护液取出，则要用PBS洗一遍）；（二抗不同，操作步骤有差别），本实验室使用的二抗试剂盒为中杉金桥超敏二步法试剂盒；

2.吸去双氧水，PBS洗两遍，将脑片周围的水用吸水纸或卫生纸擦净，注意不要碰到脑片；

3.然后按照一抗说明书，将一抗按比例稀释，加入稀释后的一抗，一般，大鼠脑片一张需50微升一抗稀释液，小鼠脑片为30微升；注意不要让液体流到边上；如果流到边上，要重新加或者加大量，使脑片完全浸入液体；

4.然后，4℃，过夜（18h或者24h），不建议使用37℃；

5.然后，PBS洗净两遍；剩下步骤见二抗试剂盒说明书。

6.DAB配方为：10mg DAB固体加到20ml 0.01MPBS，临用时加100-200微升30%双氧水，注意避光。

7.显色10min，看片子染色深浅情况适当调整显色时间。一般3分钟显色就比较明显，如果20分钟仍未显色，则看下面的参考。

8.然后PBS洗两遍，转移到载玻片，自然晾干。干燥天气2-3h，潮湿天气3-4h。

9.脱水：70%酒精3min，95%酒精3min，100%酒精3min，100%酒精2min，二甲苯2min，二甲苯3-5min。如果片子上盐分较多，在70%酒精前在双蒸水1min。

免疫荧光步骤及注意事项：

1，将脑片放到6空板的山羊血清封闭液中，封闭20-40min；（如果是从切片保护液取出，则要用PBS洗一遍）

2，吸去山羊血清，PBS洗两遍，将脑片周围的水用吸水纸或卫生纸擦净，注意不要碰到脑片；

3，然后按照一抗说明书，将一抗按比例稀释，加入PBS稀释后的一抗，一般，大鼠脑片一张需50微升一抗稀释液，小鼠脑片为30微升；注意不要让液体流到边上；如果流到边上，要重新加或者加大量，使脑片完全浸入液体；4，4℃，过夜（18h或者24h），不建议使用37℃，如果荧光亮度不强，可以延长孵育时间到48或72小时；

5，然后，PBS洗净两——三遍，按照二抗说明书稀释的荧光二抗，室温孵育2小时。注意避光操作。

6，0.01M PBS洗两遍，转移到载玻片上，避光自然晾干；

7，滴加防淬灭剂后，盖上盖玻片镜下观察。

常见问题：

1，荧光太暗：可能蛋白表达少；可能一抗孵育时间短；二抗孵育时间短；清洗次数过多；溶液pH不合适；荧光萃灭；一抗浓度过低或过高；二抗浓度过低或过高；激发波长不在抗体适用波段。

2，背景荧光太深：一抗浓度过高，清洗不彻底；二抗浓度过高，清洗不彻底；

封闭时间过短，非特异性过强；一抗非特异性过强；二抗非特异性过强；显微镜荧光强度过强。

总之实验是喜欢强阳性，不喜欢假阴性，呵呵。任何实验都需要花时间摸索才

能找到其最佳的工作条件。

熟能生巧，边学习边练习边思考方能学好。有不足之处，敬请各位老师同学批评指正，以使该实验更加臻美。若有不解之处，请询冯展波139********，或者免疫学技术交流群：85460640。QQ:929108912谢谢。

祝实验顺利！

另附免疫组化常见问题解析。原理是相同的，只是最后的显色方法不一样，有些问题有启发作用。

免疫组织化学

1.边缘效应?

原因: 1）组织边缘与玻片粘贴不牢，边缘组织松脱漂浮在液体中，每次清洗不易将组织下面试剂洗尽所致. 解决办法：制备优质的胶片（APES或多聚赖氨酸），切出尽量薄的组织切片，不厚于4微米，组织的前期处理应规范，尽量避免选用坏死较多的组织。

2）切片上滴加的试剂未充分覆盖组织，边缘的试剂容易首先变干，浓度较中心组织高而致染色深。解决办法：试剂要充分覆盖组织，应超出组织边缘2mm。用组化笔画圈时，为了避免油剂的影响，画圈应距组织边缘3-4mm。

2.产生组织切片非特异性染色的原因有哪些？如何解决？

1. 抗体孵育时间过长、抗体浓度高易增加背景着色。

解决办法:这可通过缩短一抗/二抗孵育时间、稀释抗体来控制。这是最重要的一条。

2. 一抗用多克隆抗体易出现非特异性着色，建议试用单克隆抗体看看。

3. 内源性过氧化物酶和生物素在肝脏、肾脏等组织含量很高（含血细胞多的组织），需要通过延长

灭活时间和增加灭活剂浓度来降低背景染色；

4. 非特异性组分与抗体结合，这需要通过延长二抗来源的动物免疫血清封闭时间和适当增加浓度

来加强封闭效果；

5. DAB孵育时间过长或浓度过高；

6. PBS冲洗不充分，残留抗体结果增强着色，在一抗、二抗或SP孵育之后的浸洗尤为重要；

7. 标本染色过程中经常出现干片，这容易增强非特异性着色。

3. 免疫组化染色呈阴性结果的原因有哪些？

1、抗体浓度和质量问题以及抗体来源选择错误。不知抗体是进口的还是国产的工作液，怎么这么高

稀释度也没能做出阳性结果？另外，不是抗体浓度越高就越易出现阳性结果，抗原抗体反应有前

带和后带效应，必须摸索最佳浓度。

2、抗原修复不全，对于甲醛固定的组织必须用充分抗原修复来打开抗原表位，以利于与

抗体结合;建议微波修复用高火4次*6min试试。有人做过实验，这是最佳的时间和次数。

若不行，还可高压修复。

3、组织切片本身这种抗原含量低；

4、血清封闭时间过长。

5、DAB孵育时间过短。

6、细胞通透不全，抗体未能充分进入胞内参与反应。

7、开始做免疫组化，我建议你一定要首先做个阳性对照片，排除抗体等外的方法问题。

4.背景强的原因?

1, 考虑一抗浓度高；

2,然后调整DAB孵育时间；

3,也要考虑血清封闭时间是否过短

4,适当增加抗体孵育后的浸洗次数和延长浸洗时间等。

5. DAB显色真的需要3-10分钟吗？我之前做的显色40秒就够了，再多本底就太深，现在做另一个显色3分钟也不出，真的有必要延长显色时间吗？

1. DAB显色时间不是固定的，主要由显微镜下控制显色时间，到出现浅棕色本底时即

可冲洗；

2. DAB显色时间很短（如几秒或几十秒）就出现很深的棕褐色，这很可能说明你的抗

体浓度过高或抗体孵育时间过长，需要下调抗体浓度或缩短你的抗体孵育时间；

3. 此外，若很短时间就出现背景很深，还有可能你前面的封闭非特异性蛋白不全，需

要延长封闭时间；

4. DAB显色时间很长（如超过十几分钟）才出现阳性染色，一方面可能说明你的抗体

浓度过低或孵育时间过短（最好一抗4度过夜）；另一方面就是封闭时间过长。

6 .石蜡切片在染色过程中出现脱片现象？，

1烤片时间不够，或温度不够，可以延长烤片时间和提高烤片温度

二，用含有多聚赖氨酸的玻片，可以购买到或这自己做

三，有些组织本身就容易掉片，如骨组织等，操作时冲PBS不要直接冲到组织上，冲到组织上方，

让它流下冲洗组织，四，用高温修复时，温度骤冷也可能引起。

7.年前爬的细胞片在-20度放了半年（保鲜膜密封），现在取出来再作，做了两次，步骤均是按以前的作的，但今天做时，原来显色很强的片子现在显色很弱了，问什么呢？是不是片子放的时间太长了？抗体在4度放的时间也不长而且这次浓度比以前做的还高?

1. 首先，抗体浓度和孵育时间在免疫组化中至关重要。在抗原抗体反应并非抗体浓度越高，反应越强烈，这叫前带现象。所以选择最佳的一抗浓度和孵育条件也是十分重要的，其实抗体浓度过高或过低均会引起阴性。

2. 我到认为你这片子的影响可能更大。尽管在-20度保存，但是时间一般超过3个月就不能保证其中抗原的丢失，建议可以重新爬片，以排除方法和抗原的原因。

3. 你说抗体放在4度保存是指未稀释还是稀释后抗体，存放多长时间？一般稀释后抗体不能保存很长时间的。

8. 为什么切片倾斜，抗体分布不均匀，就会造成一半阳性，一半阴性？我认为，即使切片倾斜，抗体覆盖少的那部分组织和其他部分抗体的浓度是一样的，只是抗体体积的大小差异！如果说抗体倾斜没覆盖好的地方是阴性，那为什么不是干片所导致的非特异性高背景的染色呢？

当切片倾斜到有一半甚至都没液体时，就会出现阴阳脸样的着色。你认为呢？

9.高温抗原修复后就没必要灭火内源性过氧化物酶?

经过高温POD 已经灭活了，不错POD 是被被灭活了，但它仍有还原能力，仍能跟DAB

发生氧化还原反应，使DAB 显色，我们用双氧水是耗竭POD 的还原能力，使之不能在跟DAB反应。所以无论修复与否都应该灭活POD，尽可能消除非特异性着色。

10.冰冻切片有时会有小洞?

冰冻切片有时会发现切片上会有空洞，这是因为组织在冰冻过程中形成冰晶，形成冰晶的原因一是组织冰冻时间太慢，或者冰冻的温度不够低，慢慢形成冰晶，二是有些组织在冰冻之前需要做适当的固定，如脑组织，然后放入30%的蔗糖4度冰箱过夜以减少冰晶形成，并且能最大程度保持组织细胞形态。另外在切片是组织块复温要在37度速融，否则易造成组织块的破坏。

11.常用免疫组化结果分析方法?

1. 阳性着色细胞计数法。在40*光镜下，随机选择不重叠的10个视野，人工或机器计

数阳性着色细胞，每组3~6张不同动物组织切片，然后进行组间比较即可。

2. 灰密度分析法。通过在不同组别和不同动物组织切片上选择相同区域、相同条件下

用image j进行灰密度分析，然后进行统计分析即可。

3. 评分法。通过在光学显微镜下对组织切片分别按染色程度（0~3分为阴性着色、淡

黄色、浅褐色、深褐色）、阳性范围进行评分（1~4分为0~25%、26~50%、51~75%、76~100%），最终可以分数相加，再进行比较。

对于以上这几种方法，各有利弊，请细心选择。要想得到正确结果的前提是你要做出着色均匀、背景很浅的高质量切片。

12. DAB呈色后到底什么样染色是特异性染色？

阳性标记可以从色度特征，阳性标记细胞学特征来进行基本的判断。

色度特征：一般而言，抗原含量越多，分布密度越高，标记方法越敏感，阳性结果显色则越强。根据阳性标记的显色程度分为：淡黄色，提示为弱抗原；棕黄色，提示为中等度抗原；棕黑色，示为强抗原。在结果判断中，后两者较有意义，可作为判断依据。

细胞学特征：

阳性表达必须在细胞特定的抗原部位，若不在抗原所在部位的阳性表达即使阳性也不应作为判断依据。一般分为胞膜型，胞核型，胞质型，微绒毛型,复合型几种。这是需要结合背景知识的。

同样，非特异性染色也有一定的特点：它首先是指抗原无明确定位，各种细胞累及一片，色度无深浅之分，这种标记组织片不能作为免疫组织标记结果判断的依据，造成非选民性染色的原因常为组织标本固定不佳，抗体质量问题或稀释度不合理及操作方法不规范等。因此，免疫组化特异性染色定位非常重要，一般情况下，阳性细胞与阴性细胞相互交杂，阳性染色强度深浅不一。如果缺乏细胞音的不均一性染色，即或呈阳性染色，常提示为非特异性染色。另外，组织片边缘反应和出血坏死灶周围阳笥反应不能作为诊断依据。

13. 1. 石蜡切片在染色过程中出现脱片现象？我用组织芯片和普通切片在多种条件下进行

了抗原修复实验，发现在热修复后，组织脱片最主要原因是组织脱水不良，肿瘤组织黏附性差在小块组织时也容易撕脱（减小热修复加热器功率，PBS冲洗时不要直对组织冲洗、可以有效防范）。

2. DAB显色后发现切片着色不均匀：如一片着色，一片不着色或染色浅？这就是免疫

组化染色的阴阳脸，免疫组化实验是环环相扣的实验，任何一步试剂孵育不全（没有均匀的在组织上孵育）都可能导致这样的结果。

3. 免疫组化结果老是出现阴性结果？那就要考虑真阴性还是假阴性！假阴性是你操作

不当或者试剂质量的问题了。

4. 切片染色后背景太深，不易区分特异性与非特异性着色？你的抗体是否特异，孵育

时间温度浓度是否过长！

5. 一抗从4度拿出后，为什么有人说要37度复温，目的是什么？我没遇到这样的说法，

是否是想加速复温？还有我不知道国内的院校为什么对37℃孵育如此感兴趣，在你们买国外抗体时，他们的说明书上除了酶修复要37℃外，其他步骤中均没有说要在37℃中孵育。

6. 免疫组化中抗原修复的最佳条件是什么？尤其是微波修复。抗原修复没有什么最佳

条件，只有可能管用的修复条件。

7. 有人在一抗孵育前用tritonX100来通透细胞，对石蜡切片需要否？tritonX100是脂

质溶解剂，做免疫细胞化学时细胞膜是完整的半透膜，孵育的抗体要自由的通过细胞膜就要用tritonX100来破膜。石蜡切片细胞多数是切开状态了。但是脂质有时会吸附抗体，含脂质高的组织也可以用triton。

8. 苏木素复染的时间应该是多少？复染过度咋办？要看你是用什么苏木素，免疫组化

复染，不比我们平常的HE，它只要一般的轻微染色就够了，染过了就凑合着看，或者试试1％盐酸酒精。

9. 抗原修复应在灭活POD之前还是之后？看过国外文献说是要在抗原修复之前修复内

源性过氧化物酶，还用CD3来说事，当初刚到病理科也傻乎乎的进行验证了，没有发现老外所说的情况，写信质问，可能是他看不懂我的英文，没回复。

10. DAB显色时间到底多少为最佳？一定要是3~10分钟吗？最佳显色时间应该镜下观

察，但是平时片子太多没法一一看过，就大致订个时间。

11. DAB呈色后到底什么样染色是特异性染色？这是到如何阅片的内容，不是三言两语

可以说清的。

熟能生巧，边学习边练习边思考方能学好。有不足之处，敬请各位老师同学批评指正，以使该实验更加臻美。若有不解之处，请询冯展波139********，或者免疫学技术交流群：85460640。QQ:929108912谢谢。