常用的半抗原与蛋白偶联方法简介
常用的半抗原与蛋白偶联方法简介
（一）分子中含有羧基或可羧化的半抗原的偶联）
1、混合酸酐法，也称氯甲酸异丁酯法（isobutyl chloroformate method）
偶联时，半抗原分子中的羧基可与氯甲酸异丁酯在有机溶剂中形成混合酸酐(mixed acid anhydride),然后与蛋白分子中的氨基形成肽键。
氨甲喋呤（MIT）与β-半乳糖苷酶偶联的混合酐法
1、5．8mg MIT用二甲基甲酰胺溶解，冷却至10度，加2ul氯甲酸异丁酯，10度搅拌反应30分钟。
2、酶用2ml 50 m mol/L Na2CO3溶解。
3、10度反应4小时（必要时加NaOH,以维持溶液的pH为，q然后4度过夜。
4、过sephadex G-25层析柱，柱用含NaCl 100m mol/L、MgCl2 10 m mol/L、2-巯基乙醇10 m mol/L的50m mol/L Tris-醋酸缓冲液平衡和洗脱，合并含酶的洗脱管内液体，进一步纯化后，保存于含BSA ％（w/v）、NaN3 %(w/v)的缓冲液中。
碳化二亚胺法制备3,3`,5-三碘甲腺氨酸-血蓝蛋白免疫原的操作步骤
1、??取EDC 100mg , 用的10 m mol/L PBS液使之充分溶解（I液）
2、??取3，3`,5-三碘甲腺原氨酸25mg , 用L NaOH 溶液2ml 溶解(II液)
3、??取血蓝蛋白(lemocyanin) 25mg, 溶于10mmol/L PBS （）液中（III液）
4、??将II液与III液混合，在磁力搅拌下逐滴加入I液（余下）
5、??室温下避光搅拌1小时，逐滴加入余下的I液
6、??4度搅拌12小时
7、??静置10小时（4度）
8、??有蒸馏水使之充分透析（约48小时），得免疫原。
孕酮与与β-半乳糖苷酶偶联的N-羟琥珀酰亚胺酯法
1、??用二垩烷(dioxane)溶解孕酮-11-半琥珀酸酯，配成浓度为100m mol/L的溶液。
2、??加羟琥珀酰亚胺(N-hydroxysuccinimide) 100 m mol/L 和DCC（二环已基碳化二亚胺），200 m mol/L, 4度反应16小时。
3、??用簿层扫描方法纯化(氯仿：水=9：1)
4、??按孕酮/酶摩尔浓度比约为10的比例，将上述溶液加入到酶液（用，浓度50 m mol/L 的磷酸缓冲液溶解）中。
5、??
（二）含有氨基或可还原硝基半抗原的偶联
芳香胺类半抗原与蛋白质重氮化偶联的操作步骤
1、??用mol/L HCl溶液配制4 m mol/L浓度的半抗原。
2、??滴加1％NaNO2(过量)，4度持续搅拌。NaNO2的加入量可用淀粉-碘化物试纸或在白色磁砖上加1％淀粉和50m mol/L KI进行监控。游离亚硝酸可将氧化物氧化成碘，碘再与淀粉反应变成蓝黑色。
3、??溶液变成蓝黑色后，继续反应15分钟。
4、??用、浓度为200m mol/L的硼酸或碳酸缓冲液溶解蛋白。
5、??边搅拌，边加入重氮化的半抗原（防止局部发生酸过量现象），调节pH到。
6、??冰箱中搅拌反应2小时，不断调节pH到。
7、??用PBS透析2天
8、??-20度保存（浓度为20mg/mL）
双功能的酰亚胺酯(imidate esters)可以氨基反应，形成脒。例如：用二甲基已二酰亚胺酯(dimethyladipimide)将去甲基三正喋呤(desmethylmortriptyline)与β-半乳糖苷酶偶联。
应用双功能酰亚胺酯（imidate esters）制备去甲基三正喋呤-与β-半乳糖苷酶标记特的操作步骤
1、??用含5％（W/V）N-乙基吗啉的无水甲醇,在室温下溶解570ug去甲基三正喋呤和488ug 二甲基已二酰亚胺酯(dimethyladipimide)(A液)
2、??取与β-半乳糖苷酶100 ug, 溶于的100 m mol/L碳酸缓冲液（含MgCl2 10m mol/L,2-巯基乙醇10 m mol/L (B液)
3、??将A液倒入B液。
4、??20度反应90分钟后，加含NaCl 100 m mol/L, MgCl2 10 m mol/L和2-巯基乙醇10 m mol/L、的Tris-醋酸缓冲液(50m mol/L) 1ml, 终止反应。
5、??过sephadex G-25, 去除小分子物质，得酶标记物（约75％的酶与半抗原结合，但用三正喋呤代替去甲三正喋呤(demethylmortriptyline )进行偶联，则只有15％的酶与之结合。
（三）含巯基半抗原的偶联
可用马来酰亚胺方法与蛋白偶联。此外，将载体蛋白用溴乙酰胺(bromoacetamide)激活。或将载体蛋白与半抗原在的醋酸缓冲液中，通过过氧化氢的作用形成二硫键，也可以将半抗原连接到蛋白质分子上。
（四）含羟基的半抗原偶联
醇类羟基通过形成半琥珀酸酯转化为羧基的操作步骤
1、??15g 2,2,2-三氯乙醇（2,2,2-trichloroethanol）,12g 琥珀酸酐(succinic anhydride)和三乙基胺(triethylamime)用100 ml乙酰乙酯溶解。
2、??加热回流1小时。
3、??减压蒸馏去溶剂，,残余物用5% NaHCO3水溶液溶解。
4、??用乙醚洗涤两次，然后用H2SO4进行s酸化（pH到）.
5、??用水洗涤固形物（为三氯乙基半琥珀酸酯）两次，用氯仿-已烷使其结晶（产量约75％，熔点88-89度）
6、??取半琥珀酸酯溶于亚硫酰氯(thionyl chloride)中，65度加热30分钟。
7、??减压蒸发，干燥1小时（高度真空条件下）。
8、??将上述产生（2，2，2-三氯忆基琥珀酰氯）溶于15ml N,N-二甲基-乙酸乙酰胺(N,N-dimethylethylacetamide)中，室温搅拌反应2小时。
9、??65度真空蒸发后，用异丙醇使结晶析出来（得盐酸化的结晶---5`-酯约84％，熔点160度）。
10、用溶于二甲基甲酰胺中的锌和醋酸解离三氯乙酯，得f半抗原-半琥珀酸酯，这样引和的羧基可与蛋白质偶联（如用碳化二亚胺化）。
半抗原用NaIO4氧化其中的糖苷醇后再与蛋白质偶联的操作步骤
1、??20mg 腺苷溶于1ml 100m mol/L NaIO4溶液中，4度避光反应30分钟。
2、??加1滴乙二醇(得A液)
3、??将A液加入到β-半乳糖苷酶液（20mg/ml,用150m mol/L NaCl,10m mol/L MgCl2水溶液溶解，用3％K2CO3调节pH至）中
4、??4度反应2小时，期间不断调节
5、??加入临时配制的50 mg/ml NaBO4溶液，用量为反应体积的1/10。4度反应过夜。
6、??用含有MgCl2 10m mol/L,2-巯基乙醇10 m mol/L、NaCl 100 m mol/L的50 m mol/L磷酸缓冲液透析(更换透析液数次)
（五）含酮基或酮基半抗原的偶联
是将酮基经羟胺类化合物处理变成肟类化合物，再进一步将肟类化合物中的羟基，衍变成羧基化合物，再进一步进行含羧基半抗原的偶联操作。这类羟胺类化合物主要有：氨氧乙酸aminoxy acetic acid 或羧甲氧胺carboxymethoxyl amine 或者盐酸羟胺酮基的类固醇分子中引入羧基的操作步骤
1、??在200ml 乙醇中，加入O-(羧甲基)羟胺（O-(carboxyl)hydroxylamine）和酮基半抗原，使其浓度分别为10m mol/L 和4m mol/L
2、??加热回流90分钟
3、??旋转蒸发，减少容积，然后加水至40ml，用乙醚抽提
4、??用水洗涤乙醚抽提物，用Na2SO4干燥成白色粉末。
（六）、其他半抗原的偶联
虽含有游离基团，但因这些基团对于维其生物活性十分重要，因些不能直接用来与载体蛋白偶联。
制备雌二醇-6-肟的操作步骤
a、??雌二醇二醋酸盐的制备
1、??1g雌二醇溶于14ml 吡啶及醋酐中
2、??加热回流1小时，冷却后倾入冰水中。
3、??收集白色晶体，得产物约（熔点126到127度）
b、??雌二醇-6-酮-二醋酸盐的制备
4、雌二醇二醋酸盐，滴加冰醋酸溶解后加含CrO3的含水冰醋酸(H2O:Hac=:
5、室温搅拌1小时，静置24小时
6、用水稀释，用乙醚提取4次
7、用蒸馏水洗2次
8、减压蒸馏，得结晶油状渣物。
9、用90度烘干20分钟，得粗制品约500mg
10、用11ml 无水乙醇溶解粗制品，再加冰醋酸及吉纳你特T试剂(Girad T)，回流1小时。
11、冷却后，用冰致冷的蒸馏水稀释，用LNaOH调节pH至
12、用乙醚抽提3次，弃去乙醚。
13、水层用浓盐酸酸化（盐酸终浓度为1mol/L).
14、室温静置2小时。
15、用乙醚抽提3次。
16、合并乙醚抽提液，用L碳酸钠溶液洗1次，用蒸馏水洗3次。
17、用无水硫酸钠脱水，蒸干。
18、加7ml 醋酐，回流20分钟。
19、冷却后倾入用冰致冷的蒸馏水中，然后过滤、干燥得产物约176mg (熔点为162-166度)
c、??二醇-6-酮的制备
20、用20％的氢氧化钾-甲醇溶液(W/V)溶解雌二醇-6-酮-二醋酸盐（176mg）,在室温下于氮气中水解24小时。
21、加蒸馏水稀释，用乙醚抽提3次。
22、在乙醚提取液中无水硫酸钠进行脱水，蒸发干燥，得产物约60mg(熔点为278-282度)
d、??雌二醇-6-肟的制备
23、取雌二醇-6-酮50mg ,盐酸羧甲基羧胺50mg,溶于20％含水甲醇(V/V)7ml 和1mol/L醋酸钠4ml中，回流小时。
24、减压、蒸馏、浓缩后，加蒸馏水20ml
25、用2 mol/L NaOH调节pH至。
26、用醋酸乙酯抽提4次
27、水层用1 mol/L盐酸酸化至。
28、用醋酸乙酯抽提4次
29、合并抽提液，蒸干，得产物约100mg(结晶熔点约186-188度)
其他半抗原如：青霉素、生物素、地高辛、荧光素等半抗原交联。
解偶联蛋白2的功能调控方式
解偶联蛋白2的功能调控方式 解偶联蛋白（uncoupling protein，UCP）是线粒体内膜的一类线粒体载体蛋白。大量的研究结果显示，UCP功能的异常与多种疾病关系密切。UCP2是UCP的一种重要类型，现综述概括UCP2的主要功能调控方式以及这些调控的生理意义。 肥胖、动脉粥样硬化、糖尿病、免疫失调等慢性疾病是严重影响人民群众身心健康的重要公共卫生问题。深入探讨这些疾病发生的分子机制并在此基础上探索有效的防护措施具有重要的意义。解偶联蛋白（uncoupling protein，UCP）属于一类存在于线粒体内膜的线粒体离子转运体家族成员。近年的研究发现解偶联蛋白在前述多种慢性疾病的发生发展过程中发挥着重要作用。而其本身的功能又受到多种机制的调控，现对这方面的进展进行综述。 1 解偶联蛋白概述 线粒体是真核细胞内主要的供能细胞器，通过对底物的降解反应产生ATP。在这个过程中，通过质子电化学梯度将底物的氧化与A TP合成偶联起来。但这种偶联并不是绝对的，质子可以通过线粒体内膜漏出（质子漏）而不引起A TP的产生，这个过程中一部分氧化产生的能量最后以热量的形式被消耗掉。质子漏与解偶联蛋白相关联，通过允许质子进入线粒体基质的方式，解偶联蛋白使质子梯度下将，从而导致氧化呼吸链的解偶联以及热量的产生[1]。最具特征性的解偶联蛋白为UCP1，UCP1在1978年被鉴定并在1988年被首次克隆。UCP1表达于棕色组织，在寒冷和食物所导致的非寒战性产热过程中发挥重要作用[2]。1997年，2种与UCP1相似的基因被克隆并分别命名为UCP2和UCP3。随后又筛选出2种新的UCP1相似物，并被分别命名为UCP4和UCP5/BMCP[3]。在各种UCP中，UCP2的组织分布最为广泛。 2 UCP2功能概述 人类的UCP2基因定位于11号染色体，主要表达于脂肪组织、骨骼肌、脾、肺、胰腺的β细胞以及巨噬细胞。虽然结构与UCP1相似，但是干扰、抑制UCP2的表达不会导致肥胖以及对寒冷敏感性的升高[4]。关于UCP2是否参与对寒冷应答的研究结果不尽一致，一般认为它不是主要的产热调控因子。但当特定的效应因子激活时，UCP2同样可以发挥促进产热的作用。由于对偶联过程、活性氧产物（ROS）产生以及脂肪酸代谢等多方面都有着广泛的影响，UCP2已经被发现参与多种生理、病理过程，如糖尿病、肥胖、动脉粥样硬化、感染、衰老、肿瘤发生等。例如UCP2能够抑制β细胞分泌胰岛素，从而与Ⅱ型糖尿病有关[5]。UCP2诱导质子漏的一个重要作用是减少线粒体ROS的产生。UCP2的高表达可预防氧化损伤，而抑制UCP2的表达则可在多种细胞类型中促进氧化损伤[6]。此外，UCP2还通过缓解氧化应激抑制结肠癌以及动脉粥样硬化的发生[7]。 3 UCP2功能调控 3.1 遗传多态性在加拿大魁北克开展的一项人群研究发现UCP2基因的3个微随体与能量消耗有关[8]。此外，UCP2启动子866有一个G/A单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）。而该SNP被证实与血液三酰甘油、总胆固醇以及低密度脂蛋白（low-density lipoprotein，LDL）胆固醇水平有关[9]。在Ⅱ型糖尿病患者，866-A等位基因携带者的胰岛素分泌能力比G等位基因携带者要低得多[10]。在德国的高加索人中，携带同样等位基因的糖尿病患者神经病变发生危险性显著降低[11]。而在中国人、马来人以及印度人，携带同样等位基因者拥有更高的腰/臀比，同时代谢性综合征的危险性也增高[12]。虽然在女性韩国人866-G等位基因携带者UCP2的表达和转录水平都显著降低，同时具有更高的体重指数（body mass index，BMI）以及脂肪量[13]，拥有866-G等位基因的澳大利亚高加索人却拥有较低的血清三酰甘油以及较高的胰岛素敏感性水平[14]。另外，UCP2基因4号
关于半抗原制备的小结
关于半抗原制备的小结 小分子抗原现在做的最多的是农药和兽药，这方面的文献也很多。以前查过一些材料，作者觉得小分子抗原能否制备出高性能的单克隆抗体主要以下几点决定。 1、对于半抗原结构的选择，如果待测物本身含有NH ，COOH，OH等活性基团， 2 可以利用待测物活性基团加入间隔臂，然后联入载体蛋白就可以成功合成人工抗原，制备特异性良好的抗体。但大部分待测物上并不含有活性基团或活性基团对药物的特异性和极性影响很大，所以大部分用于人工抗原合成的半抗原要经过改造或从头合成。例如在关于有机磷农药倍硫磷的免疫检测方法的研究中，半抗原物的获得采用的合成方法并不是从倍硫磷开始合成，而是采用另一途径，从起始物重新合成，这样反而能取得较好的效果，这一点对于制备具有多残留检测能力的抗体来说更为重要，只需合成出几种待测药物共有的结构就有可能制备出具有多残留检测能力的抗体。 2、待测物本身的结构有时对建立方法的性能有很重要的影响，在分子量在111－1202Da的化合物制备的单克隆抗体的亲和系数的试验中，半抗原的分子量在334–374Da之间时，制备的单克隆抗体具有很高的亲和系数。但当要检测的小分子化合物的分子量小于300Da时，产生具有良好灵敏度和特异性单克隆抗体的可能性下降。这说明药物的分子量是影响抗体性能的重要因素。同时待测物的结构对于制备人工抗原的难易程度有重要影响，有些半抗原经过理论分析能制备出高质量的抗体，但从化学合成的角度，这些化合物可能是合成不出来的或工艺过于复杂，所以半抗原结构能否合成出来，也是半抗原结构设计过程中要考虑的问题。 3、如果待测物结构过于简单，可能也是不能建立免疫检测方法的。待测物的结构最好含有特征性的环状结构或侧链结构，甚至含有杂原子，都能够增加制备出高质量抗体的可能性。在对脂肪酸类物质制备抗体的试验中，对于脂肪酸类物质来说，如果含有两个以上的羰基，及与蛋白偶联之后还有多余的羰基增强亲水性，同时酰基的不饱和双键和极性的头部结构都可以做为B细胞的抗原决定簇，可以将其他抗原性很弱的部分变成强抗原性。再者如果脂肪酸含有平面结构，也可以作为抗原决定表位，使产生特异性的抗体。这说明小分子的极性以及不饱和键，
如何用碳二亚胺法将半抗原偶联到蛋白上
如何用碳二亚胺法将半抗原偶联到 【摘要】用碳二亚胺（EDC）法将14位羟基修饰的雷公藤内酯醇(TP)和不同的蛋白载体（阳离子化牛血清白蛋白、鸡卵清蛋白）偶联合成TP的人工免疫抗原和检测抗原，紫外光谱鉴定偶联效果，计算偶联率。利用免疫抗原免疫小鼠，制备小鼠多克隆抗体，用检测抗原分析血清抗体效价，利用抗原竞争ELISA分析抗体特异性，为进一步研究TP的分子作用机理以及制备TP的单克隆抗体奠定基础。 【关键词】雷公藤内酯醇；14位羟基修饰；人工抗原；多克隆抗体 雷公藤内酯醇（triptolide，TP）分子式C20H24O6，分子结构如图1，相对分子质量360.41，为二萜类三环氧内酯化合物，是从植物雷公藤（Tripterygium Wilfordii Hook.f.）中提取的有效成分里活性最强的部分，具有消炎散结、清热解毒、抗菌、免疫抑制以及抗生育等功效。长期以来，TP作为临床上公认的免疫抑制剂，主要用于各种自身免疫性疾病，如类风湿性关节炎以及器官移植排斥反应的治疗。近年来研究发现，该药对多种肿瘤细胞有诱导凋亡的作用，与化疗药物联合应用能协同杀伤肿瘤细胞或逆转肿瘤耐药，说明它具有抗肿瘤效果，因此在肿瘤治疗方面的应用也日益受到人们的关注。除此以外，它还对细胞发育增殖、细胞周期等有调控作用。近年来，国内外对TP具有如此广泛作用的分子机理产生了越来越浓厚的兴趣，从多个不同的角度进行了研究。但是，由于缺少方便快捷的TP检测手段，长期以来对TP直接作用位点的研究一直十分困难，对TP作用的靶蛋白和作用途径知之甚少。细胞免疫化学是追踪分子在细胞内作用过程的有力工具，如果能够得到TP的抗体，就为利用细胞免疫化学研究TP的作用靶点和在细胞内的定位等提供了分子探针，为最终研究TP作用机制和寻找其靶蛋白提供了可能。作为小分子半抗原，TP需要和大分子蛋白载体偶联才能成为能够诱导产生抗体的免疫原。为了不影响小分子的生物活性，提高偶联效率，我们需要选择合适的反应基团。已有的TP结构 活性研究显示，TP的不同生物效应依赖于不同的功能基团。研究证实，对于12，13位环氧进行开环反应所获得的稳定的衍生物雷公藤内酯三醇（triptriolide）会丧失免疫抑制和抗炎的生物活性。14位羟基是TP最容易被改造修饰的基团，研究表明，14位羟基被改造为水溶性的基团作为前药能极大改善小分子的水溶性，促进体内代谢，降低毒性，甚至能改善TP在体内的免疫抑制活性和抗肿瘤活性［1 2］。 综合考虑，TP的14位羟基是最合适的偶联基团。TP的水溶性不理想，且14位羟基不容易在温和条件下和蛋白载体反应，我们首先对14位羟基进行结构修饰，改造为水溶性的羧基，利用缩合反应偶联阳离子化牛血清白蛋白（cationized BSA，cBSA）和鸡卵清蛋白（OVA），合成TP的免疫抗原TP cBSA和检测抗原TP OVA。用免疫抗原免疫小鼠，顺利得到了TP的多抗。 1 实验部分 1.1 试剂和仪器 TP（购自SIGMA公司），cBSA（购自PIERCE公司），OVA，1 乙基 （3 二甲基氨
名词解释
固定相和流动相： 层析系统中的两个互不相溶的相：一是固定相（固体或吸附在固体上的液体），一是流动相（液体或气体）。 级联放大作用： 由于酶的共价修饰反应是酶促反应，只要有少量的信号分子（如激素）存在，即可通过加速这种酶促反应，而使大量的另一种酶发生化学修饰，从而获得放大效应，这种调节方式快速，效率极高。 蛋白质超二级结构： 在蛋白质分子中，特别是球状蛋白质中，由若干相邻的二级结构单元（即α-螺旋，β-折叠片和β-转角等）彼此相互作用组合在一起，形成有规则、在空间上能辨认的二级结构组合体，充当三级结构的构件单元，称超二级结构。 肽平面： 组成肽键的四个原子及与之相连的两个α-碳原子都处在同一个平面内，这个刚性平面称为肽平面。 酶的国际单位： 1个酶活力单位是指在特定条件下，在1min内能转化1u mol底物的酶量。测定条件为250C 和其他最适条件，该单位为国际单位。 PCR： 聚合酶链式反应，又称体外基因扩增。该法模拟体内DNA的复制过程，首先使DNA变性，两条链分开，然后是引物模板退火，二者碱基配对，DNA聚合酶随即以4种dNTP为底物，在引物的引导下合成与模板互补的DNA新链。重复此过程，DNA以指数方式扩增。引物为特定引物。 RAPD： 随机扩增多态性。其方法是用一个随机核苷酸序列为引物对基因组DNA进行PCR扩增，产生不连续的DNA产物，再通过凝胶电泳来观察扩增片段的多态性，获得特异分子标记。RFLP 限制性片段多态性，由限制性内切酶把很大的DNA分子降解成许多长短不同的较小片段，其数目和长度反映了限制性内切酶的切点在DNA分子上的分布，它能作为某DNA或含这种DNA生物所特有的“指纹”，不同个体的等位基因之间碱基代换、重排、插入、缺失等都会引起这种“指纹”的多态性。 AFLP： 扩增片段长度多态性。是RFLP和PCR技术相结合产生的一项新技术，用限制性内切酶消化基因组DNA，由于不同材料的DNA的酶切片段存在差异，用特定引物选择性的扩增基因组限制性酶切片段，再用凝胶电泳分离就可以观察基因组DNA的多态性 拓扑异构酶 通过切断DNA的一条或两条链中的磷酸二脂键，然后重新纠缠和封口来改变DNA连环数的酶。 DNA拓扑异构体：
G蛋白偶联受体
G蛋白偶联受体标准化管理处编码[BBX968T-XBB8968-NNJ668-MM9N]
：G-protein coupled receptor 一种与三聚体G蛋白偶联的细胞表面受体。含有7个穿膜区，是迄今发现的最大的受体超家族，其成员有1000多个。与配体结合后通过激活所偶联的G蛋白，启动不同的信号转导通路并导致各种生物效应。 G蛋白偶联型受体是具有七个跨膜螺旋的受体，在结构上面它包括七个跨膜区段，它们与配体结合后，通过与受体偶联的G蛋白的介导，使第二信使物质增多或减少，转而改变膜上的离子通道，引起膜电位发生变化。其作用比离子通道型受体缓慢，这类受体与G蛋白之间的偶联关系也颇为复杂；一种受体可以和多种G蛋白偶联，激活多种效应系统；也可同时和几种受体偶联或几种G蛋白与一种效应系统联系而使来自不同受体的信息集中于同一效应系统。与G蛋白偶联受体有关的信号通路有：腺苷酸环化酶系统（AC系统），磷酸肌醇系统，视网膜光电信号传递系统，与嗅觉相关的信号传导系统，一氧化氮系统等。三聚体GTP结合调节蛋白（trimeric GTP-binding regulatory protein）简称G蛋白，位于质膜胞质侧，由α、β、γ三个亚基组成，α 和γ亚基通过共价结合的脂肪酸链尾结合在膜上，G 蛋白在信号转导过程中起着分子开关的作用，当α亚基与GDP结合时处于关闭状态，与GTP结合时处于开启状态，α亚基具有GTP酶活性，能催化所结合的，恢复无活性的三聚体状态，其GTP酶的活性能被RGS（regulator of G protein signaling）增强。RGS也属于GAP（GTPase activating protein）。G蛋白耦联型受体为7次跨膜蛋白，受体胞外结构域识别胞外信号分子并与之结合，胞内结构域与G蛋白耦联。通过与G蛋白耦联，调节相关酶活性，在细胞内产生第二信使，从而将胞外信号跨膜传递到胞内。G蛋白耦联型受体包括多种神经递质、肽类激素和趋化因子的受体，在味觉、视觉和嗅觉中接受外源理化因素的受体亦属G蛋白耦联型受体。由G蛋白耦联受体所介导的细胞信号通路主要包括：和磷脂酰肌醇信号通路。（一）cAMP信号途径在cAMP信号途径中，细胞外信号与相应受体结合，调节腺苷酸环化酶活性，通过第二信使cAMP水平的变化，将细胞外信号转变为细胞内信号。 1、cAMP信号的组分①.激活型激素受体（Rs）或抑制型激素受体（Ri）；②.活化型调节蛋白（Gs）或抑制型调节蛋白（Gi）；③.腺苷酸环化酶
兽药人工抗原的合成方法
兽药人工抗原的合成方法 1 兽药人工抗原的合成方法 兽药人工抗原合成的基本方法为兽药半抗原与载体蛋白质的偶联。 1.1 半抗原的合成大多数的兽药小分子不具有直接与载体蛋白质交联的功能团（羧基和氨基），需要通过化学合成或衍生的方法首先制备出具有活性交联功能团的相应半抗原。理想的半抗原（合成或衍生后的半抗原）应具有待测物（待测的半抗原原型）的特征结构，且与载体连接后应保持该特征结构能在最大程度为免疫细胞识别和结合（能将该基团暴露）。兽药半抗原活性基团种类主要有-NH2、 -COOH、-OH、-SH，在与载体偶联制备人工抗原时，有些活性基团还需要先进行选择性保护和去保护，如阿维菌素半抗原的合成(李俊锁等，1999)。不同的兽药有不同的半抗原活化方法，目前获得半抗原常用的方法有：对药物分子进行改造使之产生活性基团；在药物分子内部引入活泼卤元素，达到所需反应的目的；利用原形药物的代谢产物作为活泼半抗原；利用化学合成的方法合成有活性功能团的半抗原；直接购买与半抗原结构相似的有活性基团的商品化学试剂。 1.2 兽药人工抗原合成常用的载体常用于兽药人工抗原合成的载体蛋白质包括牛血清蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)、人血清蛋白(HSA)及钥孔血蓝蛋白(KLH)，其中又以牛血清蛋白最为常用。因为BSA理化稳定，经济易得，分子内自由氨基多，与半抗原偶联率高，并且具有在不同pH值和离于强度下以及在含有某些有机溶剂状态下都能保持较大的溶解度。近年来，国内外都有文献介绍以人工合成的多聚肽做载体(常用多聚L赖较氨酸)，自身免疫原性很差但可以增加半抗原的免疫性，有利于机体产生特异性更高的抗体，且具有比BSA更多的自由氨基(与BSA相当分子量的多聚赖氨酸的自由氨基数约是BSA所含数目的10倍)，可以大大提高载体蛋白质与半抗原的偶联率。以多聚赖氨酸做载体来制备兽药人工抗原尚未见报道，这应该是一个值得探讨的方向。 1.3 兽药抗原的偶联方法活化的半抗原与载体偶联应根据半抗原功能团的不同，选用不同的偶联剂和不同的偶联方法。人工抗原合成的传统方法有：混合酸酐法、活泼酯法及碳二亚胺法，用于羧基半抗原与载体的偶联；戊二醛法或重氮化法用于氨基半抗原与载体的偶联；氨基氧乙酸化用于酮基半抗原与载体的偶联；丁二酸酐衍生化用于羟基半抗原与载体的偶联。人工抗原合成的基因工程方法：利用基因工程技术表达特定抗原蛋白或通过核苷酸序列推导合成相应编码的蛋白质抗原肽段，得到目的抗原。 2 影响兽药人工抗原质量的因素 人工抗原的质量好坏指其免疫原性的优劣，受多种因素的影响。不同药物的质量影响因素也不尽相同，一方面取决于人工抗原本身的性质，另一方面取决于接受该抗原刺激的机体的反应性。概括起来主要有以下几个方面。 2.1 抗原分子特性免疫学理论认为抗原物质除了要求具有一定的分子质量(10ku)外，其表面还必须有一定的化学组成和结构，分子结构和空间结构越复杂、支链越多，免疫原性越强，越易于诱导机体产生抗体。对于具有多个载体偶联位点的兽药半抗原，以不同位点相偶联制备的抗原，其相应的特异性、亲和性、效价也都不相同，即由于不同偶联位点制备的抗原的空间结构不同所致。所以，当一个兽药分子内部有多个不同的结合位点时，要尽可能多合成不同的人工抗原，然后通过比较筛选出最好的抗原用于抗
第3节：G蛋白偶联受体介导的信号转导
途径一：激活离子通道的G 蛋白偶联受体所介导的信号通路 G 蛋白偶联受体介导的信号转导受体：G 蛋白 结构三个亚基组成 G α：分子开关锚定在膜上 G β、G γ：二聚体形式，锚定在膜上 7次跨膜α螺旋（右图上） N 端在胞外、C 端在胞内激活的普遍机制（右图下） 根据效应蛋白分类 1、激活离子通道的G 蛋白偶联受体 2、激活或抑制腺苷酸环化酶，以cAMP 为第二信使的G 蛋白偶联受体 3、激活磷脂酶C ，以IP 3和DGA 作为双信使的G 蛋白偶联受体 三类方式比较典型例子心肌细胞M 乙酰胆碱受体激活G 蛋白开启K +通道附图p168（下图⑤）Gt 蛋白偶联的光敏感受体的活化诱 发cGMP 门控阳离子通道的关闭 附图p168（下图⑥） 第二信使：cGMP
图⑤ 图⑥ 途径二：激活或抑制腺苷酸环化酶的G 蛋白偶联受体 腺苷酸环化酶的G 蛋白偶联受体 刺激AC 的物质 肾上腺素、胰高血糖素、促肾上腺皮质激素受体：刺激性激素受体（Rs ），Gs α抑制AC 的物质前列腺素、腺苷 受体：抑制性激素受体（Ri ），Gi αAC AC 结构12次跨膜蛋白C 端与N 端均在细胞内胞质侧有两个大的相似的结构域，跨膜区有两个整合结构域 AC 功能在Mg 2+或Mn 2+存在下，催化ATP 生成cAMP 蛋白激酶A （PKA ）未激活状态2个调节亚基与2个催化亚基结合激活状态激活物：cAMP 调节亚基与催化亚基分开作用底物特点磷酸化基序：X-Arg-(Arg/Lys)-X-(Ser/Thr)-Φ（X ：任意AA ，Φ：疏水AA ）cAMP 与PKA 的结合协同方式（类似血红蛋白结合氧） cAMP 的降解环腺苷酸磷酸二酯酶（PED ）降解cAMP 生成5'-AMP 信号通路模式图p169（图⑦）cAMP-PKA 信号通道对肝细胞和肌细胞糖原代谢的调节p171（下图⑧）、对真核细胞基因表达的调控p171（下图⑨）
抗原偶联选择方法
抗原偶联选择方法-CAL-FENGHAI.-(YICAI)-Company One1
载体的选择： 1.载体表面应首先应具有化学活性基团，这些基团可以直接与抗生素或农药分子偶联， 这是化学偶联制备抗原的前提； 2.其次,载体应具备一定的容量,可以偶联足够的分子； 3.载体还应该是惰性的,不应干扰偶联分子的功能； 4.而且载体应具有足够的稳定性,且应该是廉价易得的. 载体蛋白质有牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OA)、钥孔血蓝蛋白(KLH)、人血清白蛋白(HSA)及人工合成的多聚赖氨酸(PLL)等 这些蛋白质分子中的α和ε-氨基（等电点8和10）、苯酚基、巯基（等电点为9）、咪唑基（等电点为7）、羧基（等电点2～4,大部分来自天冬氨酸或谷氨酸的β-和γ-羧基）等在等电点pH条件下,一部分成为质子,另一部分未质子化的亲核基团则具有反应活性,可与半抗原中的对应基团结合.当然,这些基团的反应性也取决于蛋白质各种氨基酸残基的微环境.牛血清白蛋白（BSA）和人血清白蛋白（HAS）分子中含有大量的赖氨酸,故有许多自由氨基存在,且在不同pH 和离子强度下能保持较大的溶解度.此外,这些蛋白质在用有机溶剂（如吡啶、二甲基甲酰胺）溶解时,其活性基团仍呈可溶状态,因此,这两种蛋白质是最常用的载体蛋白质.近年来,有研究报道用人工合成的多聚肽(最常用的是多聚赖氨酸)作载体,表现出能增加半抗原的免疫原性,从而使产生征对半抗原的特异性抗体可能性增加,被广泛应用。 人工抗原合成方法： 小分子半抗原与载体蛋白偶联效果会到偶联物的浓度及其相对比例、偶联剂的有效浓度及其相对量、缓冲液成分及其纯度和离子强度、pH以及半抗原的稳定性、可溶性和理化特性等因素的影响.通常是在条件温和的水溶液中将半抗原与载体蛋白共价结合,不宜在高温、低温、强碱、强酸条件下进行.一般是由半抗原上的活性基团决定偶联合成的方法,常用的方法如下： 分子中含有羧基或者可羧化的半抗原的偶联 1）混合酸酐法（mixed anhydride method）：也称氯甲酸异丁酯法。偶联时，半抗原分子中的羧基可与氯甲酸异丁酯在有机溶剂中形成混合酸酐(mixedacidanhydride)，然后与蛋白分子中的氨基形成肽键。 2）碳二亚胺法（CDI）：碳二亚胺(EDC)使羟基和氨基间脱水形成酰胺键,半抗原上的羧基先与EDC反应生成一个中间物,然后再与蛋白质上的氨基反应,形成半抗原与蛋白质的结合物（见图）.EDC被称作零长度交联剂之一,因为它作为酰胺键的形成介质并没有形成手臂分子. 此连接方法十分简便,只需将载体蛋白质和抗原按一定比例混合在适当的溶液中,然后加入水溶性碳化二亚胺,搅拌1～2h,置室温24h,再经透析即可。如果半抗原分子中不含羧基,可通过某些化学反应引入羧基.在引入羧基后,也可用上述方法进行偶联。 含有氨基或可还原硝基半抗原的偶联 1）戊二醛法：双功能试剂戊二醛的两个醛基分别与半抗原和蛋白质上的氨基形成schiff键(-N=C<，在半抗原和蛋白质间引入一个5碳桥。这一反应条件温和，可在4～40℃及～内进行，操作亦简便，因此应用广泛。戊二醛受到光照、温度和碱性的影响，可能发生自我聚合，减弱其交联作用，因此最好使用新鲜的戊二醛。
名词解释
1.必需氨基酸（essential amino acid）:指人（或其它脊椎动物）（赖氨酸，苏氨酸等）自己不能合成，需要从食 物中获得的氨基酸。 2.非必需氨基酸（nonessential amino acid）:指人（或其它脊椎动物）自己能由简单的前体合成不需要从食物中 获得的氨基酸。 3.等电点（pI,isoelectric point）:使分子处于兼性分子状态，在电场中不迁移（分子的静电荷为的0）的pH值。 4.蛋白质一级结构（primary structure）:指蛋白质中共价连接的氨基酸残基的排列顺序。 5.蛋白质二级结构（protein在蛋白质分子中的局布区域内氨基酸残基的有规则的排列。常见的有二级结构有 α-螺旋和β-折叠。二级结构是通过骨架上的羰基和酰胺基团之间形成的氢键维持的。 6.α-螺旋（α-heliv）:蛋白质中常见的二级结构，肽链主链绕假想的中心轴盘绕成螺旋状，一般都是右手螺 旋结构，螺旋是靠链内氢键维持的。每个氨基酸残基（第n个）的羰基与多肽链C端方向的第4个残基（第4+n个）的酰胺氮形成氢键。在古典的右手α-螺旋结构中，螺距为0.54nm，每一圈含有3.6个氨基酸残基，每个残基沿着螺旋的长轴上升0.15nm. 7.结构域（domain）:在蛋白质的三级结构内的独立折叠单元。结构域通常都是几个超二级结构单元的组合。 8.蛋白质变性（denaturation）:生物大分子的天然构象遭到破坏导致其生物活性丧失的现象。蛋白质在受到光 照，热，有机溶济以及一些变性济的作用时，次级键受到破坏，导致天然构象的破坏，使蛋白质的生物活性丧失。 9.别构效应（allosteric effect）:又称为变构效应，是寡聚蛋白与配基结合改变蛋白质的构象，导致蛋白质生物 活性丧失的现象。 10.米氏常数（Michaelis constant）:对于一个给定的反应，异至酶促反应的起始速度（υ0）达到最大反应速度 （υmax）一半时的底物浓度。 11.酶原（zymogen）:通过有限蛋白水解，能够由无活性变成具有催化活性的酶前体。 12.调节酶（regulatory enzyme）:位于一个或多个代谢途径内的一个关键部位的酶，它的活性根据代谢的需要而 增加或降低。 13.别构酶（allosteric enzyme）:活性受结合在活性部位以外的部位的其它分子调节的酶。 14.维生素（vitamin）:是一类动物本身不能合成，但对动物生长和健康又是必需的有机物，所以必需从食物中 获得。许多辅酶都是由维生素衍生的。 15.辅酶（conzyme）:某些酶在发挥催化作用时所需的一类辅助因子，其成分中往往含有维生素。辅酶与酶结合 松散，可以通过透析除去。 16.辅基（prosthetic group）:是与酶蛋白质共价结合的金属离子或一类有机化合物，用透析法不能除去。辅基在 整个酶促反应过程中始终与酶的特定部位结合。 17.饱和脂肪酸（saturated fatty acid）:不含有-C=C-双键的脂肪酸。 18.不饱和脂肪酸（unsaturated fatty acid）:至少含有-C=C-双键的脂肪酸。 19.脂质体（liposome）:是由包围水相空间的磷脂双层形成的囊泡（小泡）。 20.cAMP(cycle AMP):3ˊ,5ˊ-环腺苷酸，是细胞内的第二信使，由于某些激素或其它分子信号刺激激活腺苷酸 环化酶催化A TP环化形成的。 21.熔解温度（melting temperature,Tm）:双链DNA熔解彻底变成单链DNA的温度范围的中点温度。 22.增色效应（hyperchromic effect）:当双螺旋DNA熔解（解链）时，260nm处紫外吸收增加的现象。 23.核酸内切酶（exonuclease）: 核糖核酸酶和脱氧核糖核酸酶中能够水解核酸分子内磷酸二酯键的酶。 24.核酸外切酶（exonuclease）:从核酸链的一端逐个水解核甘酸的酶。 25.分解代谢反应（catabolic reaction）:降解复杂分子为生物体提供小的构件分子和能量的代谢反应。 26.合成代谢反应（anablic reaction）:合成用于细胞维持和生长所需分子的代谢反应。 27.底物水平磷酸化（substrate phosphorlation）:ADP或某些其它的核苷-5′-二磷酸的磷酸化是通过来自一个非 核苷酸底物的磷酰基的转移实现的。这种磷酸化与电子的转递链无关。 28.乙醛酸循环（glyoxylate cycle）:是某些植物，细菌和酵母中柠檬酸循环的修改形式，通过该循环可以收乙乙 酰CoA经草酰乙酸净生成葡萄糖。乙醛酸循环绕过了柠檬酸循环中生成两个CO2的步骤。 29.戊糖磷酸途径（pentose phosphare parhway）:那称为磷酸已糖支路。是一个葡萄糖-6-磷酸经代谢产生NADPH 和核糖-5-磷酸的途径。该途径包括氧化和非氧化两个阶段，在氧化阶段，葡萄糖-6-磷酸转化为核酮糖-5-磷酸和CO2，并生成两分子NADPH；在非氧化阶段，核酮糖-5-磷酸异构化生成核糖-5-磷酸或转化为酵解的 两个中间代谢物果糖-6-磷酸和甘油醛-3-磷酸。 30.糖异生作用（gluconenogenesis）:由简单的非糖前体转变为糖的过程。糖异生不是糖酵解的简单逆转。虽然 由丙酮酸开始的糖异生利用了糖酵解中的七步进似平衡反应的逆反应，但还必需利用另外四步酵解中不曾出现的酶促反应，绕过酵解过程中不可逆的三个反应。 31.呼吸电子传递链（respiratory electron-transport chain）:由一系列可作为电子载体的酶复合体和辅助因子构成， 可将来自还原型辅酶或底物的电子传递给有氧代谢的最终的电子受体分子氧（o2） 32.氧化磷酸化（oxidative phosphorylation）:电子从一个底物传递给分子氧的氧化与酶催化的由adp和pi生成 atp与磷酸化相偶联的过程。 33.化学渗透理论（chemiosnotic theory）:一种学说，主要论点是底物氧化期间建立的质子浓度梯度提供了驱动 adp和atp和pi形成atp的能量。 34.解偶联剂（uncoupling agent）:一种使电子传递与adp磷酸化之间的的紧密偶联关系解除的化合物，eg2,4－ 二硝基苯酚。 35.生酮氨基酸（acetonegenic amino acid）:降解可生成乙酰CoA或酮体的氨侉酸。 36.酰基载体蛋白（ACP）:通过硫脂键结合脂肪酸合成的中间代谢物的蛋白质（原核生物）或蛋白质的结构域 （真核生物）。 37.生糖氨基酸（glucongenic amino acid）:降解可生成能作为糖异生前体的分子，例如丙酮酸或柠檬酸循环中间 代谢物的氨基酸。 38.酮体（acetone body）:在肝脏中由乙酰CoA合成的燃料分子（β羟基丁酸，乙酰乙酸和丙酮）。在饥饿期间 酮体是包括脑在内的许多组织的燃料，酮体过多会导致中毒。 39.多酶体系：在完整细胞内的某一代谢过程中，由几种不同酶联合组成的一个结构和功能的整体，催化一组连 续的密切相关的反应。 40.同工酶：催化相同的化学反应，但其蛋白质分子结构、理化性质和免疫性能等方面都存在明显差异的一组酶。 41.新陈代谢：营养物质在生物体内所经历的一切化学变化的总称。 42.代谢中间产物：在代谢过程中连续转变的酶促产物。 43.两用代谢途径：既可用于分解代谢又可用于合成代谢的代谢途径。 44.in vivo：①用生物整体进行的研究，称为体内研究。②用整体器官或微生物细胞群进行研究 45.①用器官组织制成切片、匀浆或提取液作为材料进行研究。②在体外或者在试管内进行体外研究。 46.高能键: 水解时能释放5000cal以上自由能的键。 47.磷酸原：在生物体内，特别是肌肉中，通过A TP/ADP系统供给高能磷酸键，同时又经同一系统而贮藏高能 磷酸键。 48.糖酵解：在无氧条件下，葡萄糖进行分解，形成2分子的丙酮酸并提供能量。 49.激酶：能够在A TP和任何一种底物之间起催化作用，转移磷酸基团的一类酶。 50.生物氧化：生物氧化是在生物体内，从代谢物脱下的氢及电子﹐通过一系列酶促反应与氧化合成水﹐并释放 能量的过程。也指物质在生物体内的一系列氧化过程。主要为机体提供可利用的能量。 51.A TP合成的结合变化机制：氧化还原回路机制和质子泵机制 52.甘油醛-3-磷酸穿梭：以三磷酸甘油和磷酸二羧丙酮为载体，在两种不同的α-磷酸甘油脱氢酶的催化下，将 胞液中NADH的氢原子带入线粒体中，交给FAD,再沿琥珀酸氧化呼吸链进行氧化磷酸化。 53.苹果酸-天冬氨酸穿梭：以苹果酸和天冬氨酸为载体，在苹果酸脱氢酶和各种转氨酶的催化下，将胞液中的 NADH的氢原子带入线粒体NAD+,再沿NADH氧化呼吸链进行氧化磷酸化。 54.呼吸控制：ADP作为关键物质对氧化磷酸化作用的调节。 55.可立氏循环：肌肉细胞内的乳酸扩散到血液并随着血液进入肝脏细胞，在肝脏细胞内通过糖异生途径转变为 葡萄糖，又回到血液随供应肌肉和脑对葡萄糖的需求。 56.一碳单位：具有一个碳原子的基团。 57.代谢缺陷症：氨基酸代谢中缺乏某一种酶引起的疾病。
常用的半抗原与蛋白偶联方法简介
常用的半抗原与蛋白偶联方法简介 （一）分子中含有羧基或可羧化的半抗原的偶联） 1、混合酸酐法，也称氯甲酸异丁酯法（isobutyl chloroformate method） 偶联时，半抗原分子中的羧基可与氯甲酸异丁酯在有机溶剂中形成混合酸酐(mixed acid anhydride),然后与蛋白分子中的氨基形成肽键。 氨甲喋呤（MIT）与β-半乳糖苷酶偶联的混合酐法 1、5．8mg MIT用0.1ml二甲基甲酰胺溶解，冷却至10度，加2ul氯甲酸异丁酯，10度搅拌反应30分钟。 2、1.5mg酶用2ml 50 m mol/L Na2CO3溶解。 3、10度反应4小时（必要时加NaOH,以维持溶液的pH为9.0，q然后4度过夜。 4、过sephadex G-25层析柱，柱用含NaCl 100m mol/L、MgCl2 10 m mol/L、2-巯基乙醇10 m mol/L的50m mol/L Tris-醋酸缓冲液(pH7.5)平衡和洗脱，合并含酶的洗脱管内液体，进一步纯化后，保存于含BSA 0.1％（w/v）、NaN3 0.02%(w/v)的缓冲液中。 碳化二亚胺法制备3,3`,5-三碘甲腺氨酸-血蓝蛋白免疫原的操作步骤 1、取EDC 100mg , 用pH8.0的10 m mol/L PBS液2.5ml使之充分溶解（I液） 2、取3，3`,5-三碘甲腺原氨酸25mg , 用0.2mol/L NaOH 溶液2ml 溶解(II液) 3、取血蓝蛋白(lemocyanin) 25mg, 溶于10mmol/L PBS （pH8.0）液中（III液） 4、将II液与III液混合，在磁力搅拌下逐滴加入I液（余下0.5ml） 5、室温下避光搅拌1小时，逐滴加入余下的I液 6、 4度搅拌12小时 7、静置10小时（4度） 8、有蒸馏水使之充分透析（约48小时），得免疫原。 孕酮与与β-半乳糖苷酶偶联的N-羟琥珀酰亚胺酯法 1、用二垩烷(dioxane)溶解孕酮-11-半琥珀酸酯，配成浓度为100m mol/L的溶液。 2、加羟琥珀酰亚胺(N-hydroxysuccinimide) 100 m mol/L 和DCC（二环已基碳化二亚胺），200 m mol/L, 4度反应16小时。 3、用簿层扫描方法纯化(氯仿：水=9：1) 4、按孕酮/酶摩尔浓度比约为10的比例，将上述溶液加入到酶液（用pH7.4，浓度50 m mol/L 的磷酸缓冲液溶解）中。 5、 （二）含有氨基或可还原硝基半抗原的偶联 芳香胺类半抗原与蛋白质重氮化偶联的操作步骤 1、用0.1 mol/L HCl溶液配制4 m mol/L浓度的半抗原。 2、滴加1％NaNO2(过量)，4度持续搅拌。NaNO2的加入量可用淀粉-碘化物试纸或在白色磁砖上加1％淀粉和50m mol/L KI进行监控。游离亚硝酸可将氧化物氧化成碘，碘再与淀粉反应变成蓝黑色。 3、溶液变成蓝黑色后，继续反应15分钟。 4、用pH9.0、浓度为200m mol/L的硼酸或碳酸缓冲液溶解蛋白。 5、边搅拌，边加入重氮化的半抗原（防止局部发生酸过量现象），调节pH到9.5。
G蛋白偶联受体介导
G蛋白偶联受体介导的跨膜信号转导 1去甲肾上腺素作用于心肌细胞β 1 受体激活G蛋白启动腺苷酸环化酶将ATP转变成环磷酸腺苷作用于PKA使钙离子通道打开，钾离子通道抑制，使心肌收缩加快变强。 2乙酰胆碱作用于心肌细胞Μ2受体激活G蛋白启动腺苷酸环化酶将GTP转变成环鸟嘌呤腺苷作用于PKA使钙离子通道关闭，钾离子通道开放，使心肌舒张。 3乙酰胆碱作用于心肌细胞Μ2受体激活G蛋白打开乙酰胆碱化学门控钾离子通道，使心肌收缩变弱减慢。 4乙酰胆碱作用于胃肠平滑肌细胞Μ3受体激活G蛋白启动PLC使PIP2分解成为IP3和DG，使钙离子进入发生一系列反应，使肌肉收缩。 5去甲肾上腺素作用于胃肠平滑肌细胞β2受体激活相关的G蛋白启动，经过一系列作反应用降低了环磷酸腺苷浓度，进而抑制了胃肠平滑肌的收缩。 6去甲肾上腺素作用于血管内皮上的α1受体激活G蛋白启动PLC使PIP2分解成为IP3和DG，使钙离子进入发生一系列反应，使内皮源因子产生，作用于平滑肌促进血管的收缩。
7乙酰胆碱作用于血管内皮上的Μ3受体激活G蛋白启动PLC 使PIP2分解成为IP3和DG，使钙离子进入发生一系列反应，使内皮源舒张因子产生，释放NO, 作用于平滑肌促进血管的舒张。 8乙酰胆碱作用于唾液腺细胞Μ3受体激活G蛋白启动PLC 使PIP2分解成为IP3和DG，使钙离子进入发生一系列反应，使细胞发生分泌的指令，产生大量的稀唾液。 9去甲肾上腺素作用于唾液腺细胞α1受体激活G蛋白启动腺苷酸环化酶将ATP转变成环磷酸腺苷作用于PKA使蛋白质水平磷酸化，进而促使细胞分泌少量浓稠的唾液。 10嗅细胞受体接受到外来气体的刺激激活G蛋白启动腺苷酸环化酶将ATP转变成环磷酸腺苷，作用于钠离子依赖性通道产生去极化进而兴奋。 11心房钠尿肽与受体结合刺激激活G蛋白启动鸟苷酸环化酶将GTP转变成环鸟嘌呤腺苷作用于PKG使蛋白质磷酸化引起C 内生物学效应，实现排钠、排水、血管舒张。 12.胰高血糖素与受体结合刺激激活G蛋白启动腺苷酸环化酶将ATP转变成环磷酸腺苷作用于PKA，引起蛋白质磷酸化，引起C内生物学效应，然后完成信号传导，实现功能。 13.催乳素与受体结合刺激激活G蛋白启动使GTP变为GDP激活PLC使PIP2分解成为IP3和DG，使钙离子进入发生一系
常用的半抗原与蛋白偶联方法简介
常用的半抗原与蛋白偶联 方法简介 Last revision date: 13 December 2020.
常用的半抗原与蛋白偶联方法简介 （一）分子中含有羧基或可羧化的半抗原的偶联） 1、混合酸酐法，也称氯甲酸异丁酯法（isobutyl chloroformate method） 偶联时，半抗原分子中的羧基可与氯甲酸异丁酯在有机溶剂中形成混合酸酐(mixed acid anhydride),然后与蛋白分子中的氨基形成肽键。 氨甲喋呤（MIT）与β-半乳糖苷酶偶联的混合酐法 1、5．8mg MIT用二甲基甲酰胺溶解，冷却至10度，加2ul氯甲酸异丁酯，10度搅拌反应30分钟。 2、酶用2ml 50 m mol/L Na2CO3溶解。 3、10度反应4小时（必要时加NaOH,以维持溶液的pH为，q然后4度过夜。 4、过sephadex G-25层析柱，柱用含NaCl 100m mol/L、MgCl2 10 m mol/L、2-巯基乙醇10 m mol/L的50m mol/L Tris-醋酸缓冲液平衡和洗脱，合并含酶的洗脱管内液体，进一步纯化后，保存于含BSA ％（w/v）、NaN3 %(w/v)的缓冲液中。 碳化二亚胺法制备3,3`,5-三碘甲腺氨酸-血蓝蛋白免疫原的操作步骤 1、取EDC 100mg , 用的10 m mol/L PBS液使之充分溶解（I液） 2、取3，3`,5-三碘甲腺原氨酸 25mg , 用L NaOH 溶液2ml 溶解(II液) 3、取血蓝蛋白(lemocyanin) 25mg, 溶于10mmol/L PBS （）液中（III液） 4、将II液与III液混合，在磁力搅拌下逐滴加入I液（余下） 5、室温下避光搅拌1小时，逐滴加入余下的I液 6、4度搅拌12小时 7、静置10小时（4度） 8、有蒸馏水使之充分透析（约48小时），得免疫原。 孕酮与与β-半乳糖苷酶偶联的N-羟琥珀酰亚胺酯法 1、用二垩烷(dioxane)溶解孕酮-11-半琥珀酸酯，配成浓度为100m mol/L的溶液。 2、加羟琥珀酰亚胺(N-hydroxysuccinimide) 100 m mol/L 和 DCC（二环已基碳化二亚胺），200 m mol/L, 4度反应16小时。 3、用簿层扫描方法纯化(氯仿：水=9：1) 4、按孕酮/酶摩尔浓度比约为10的比例，将上述溶液加入到酶液（用，浓度50 m mol/L的磷酸缓冲液溶解）中。 5、 （二）含有氨基或可还原硝基半抗原的偶联 芳香胺类半抗原与蛋白质重氮化偶联的操作步骤 1、用 mol/L HCl溶液配制 4 m mol/L浓度的半抗原。 2、滴加1％NaNO2(过量)，4度持续搅拌。NaNO2的加入量可用淀粉-碘化物试纸或在白色磁砖上加1％淀粉和50m mol/L KI进行监控。游离亚硝酸可将氧化物氧化成碘，碘再与淀粉反应变成蓝黑色。 3、溶液变成蓝黑色后，继续反应15分钟。
解偶联蛋白2与2型糖尿病
?综述与讲座?解偶联蛋白2与2型糖尿病 杨璐 2型糖尿病发病的中心环节之一是胰腺β细胞功能衰竭,其表现为胰岛素分泌功能进行性降低。最近,一种参与下调胰岛素分泌的线粒体上的蛋白质———解偶联蛋白(un2 coupling protein,Ucp)引起普遍关注。其中Ucp2在胰岛素分泌过程中究竟起什么作用,它与2型糖尿病的关系又如何呢?现就线粒体内膜上的Ucp2与2型糖尿病的发病及相关研究进展作一综述。 一、Ucp2的结构和功能 最先,Ucp1的发现是在棕色脂肪,其作用是产热,并能减少A TP的产生,与能量供给作用以及与哺乳动物的体重调节有关。但是成人棕色脂肪含量太少,Ucp1似乎不能起到调节体重的作用,因此相关的研究减少了许多。直到1997年,Ucp2和Ucp3的发现使解偶联蛋白再次成为焦点。研究[1]发现了Ucp2基因,其定位于人类染色体11q13,全长8.7kb,分子质量为33098u,编码308个氨基酸,由8个外显子和7个内含子组成。Ucp2和Ucp3定位的染色体11q13被认为是与人类肥胖相关的候选基因。在植物和啮齿类动物体内都发现Ucp,在啮齿类动物至少已有5种(Ucp1～Ucp5)并被克隆,亚细胞定位均在线粒体内膜,各成员间序列同源性较高,组织分布有一定特异性。Ucp2是该家族中分布最广的成员,在体内分布广泛,脂肪、胎盘、骨骼肌、心脏、脾脏、肾脏、淋巴结以及中枢神经系统都有存在,其中在胰腺中的分布是Ucp2特异表达。 二、Ucp2在β细胞的基本功能 1.Ucp2是胰岛素分泌的负性调节因子:线粒体氧化磷酸化是葡萄糖代谢胰岛β细胞分泌过程的一个重要环节。Ucp2通过使细胞线粒体的氧化磷酸化过程解偶联,降低A TP产生,A TP/ADP比值下降,来减少A TP敏感的钾离子通道的关闭,进而影响细胞除极。使电压依赖性的钙离子通道开放迟缓或幅度减低,钙离子内流抑制,含有胰岛素的颗粒细胞不能释放,胰岛素分泌减少[2]。机体为此所必须付出的代价是能量通过Ucp的作用以热能的形式被消耗,而不是以A TP形式被储存,Ucp2的这种质子传递作用能被细胞内的ADP抑制。 2.抑制活性氧簇(ROS),减少氧化损伤:在Ucp2含量丰富的巨噬细胞中发现,把Ucp2敲除则巨噬细胞内ROS含量增加,表明Ucp2能抑制ROS的生成[3]。活性氧是细胞氧化损伤的主要来源,损伤的后果是加重疾病和老化。ROS 在线粒体中的产生来源于呼吸链产物中一部分氧经单电子 作者单位:524000湛江,广东医学院附属医院内分泌科 还原为水的过程中经过呼吸链复合体Ⅰ、Ⅲ形成,包括超氧阴离子、过氧化氢、羟自由基等。当线粒体内的抗氧化防御系统如谷胱甘肽、MnSOD、CoQ及维生素E不能有效清除超氧化物时,ROS积聚会引发膜磷脂过氧化,蛋白质DNA的损伤激发级联反应最终导致线粒体破坏和细胞凋亡。 三、影响Ucp2mRNA表达的因素 1.脂肪酸的影响:脂肪酸对非胰岛组织Ucp2的诱导作用已经得到证实[4],用250μm油脂酸培养12～16h能使肝细胞内Ucp2的表达增加8倍以上。高脂饮食喂养2d就能明显上调A/J大鼠棕色脂肪组织中Ucp2mRNA的表达。Vettor等[5]发现用脂肪乳剂持续24h灌注能明显增加大鼠心脏和骨骼肌中Ucp2的表达,同时胰岛素调节的葡萄糖转运被抑制。同样游离脂肪酸对胰腺组织中Ucp2上调的影响也被许多实验证实。Tokuyuki等[6]通过将脂肪形成的关键转录因子即固醇调节元件结合蛋白(Sreb-1c)的腺病毒插入胰岛细胞,使细胞内脂肪酸合成大大增加,甘油三酯含量随之增加,Ucp2表达增加。另一项研究是应用高脂高糖和普通饲料喂养GK大鼠,观察其对β细胞胰岛素分泌功能的不同影响发现,高脂高糖能增加胰岛细胞内甘油三酯含量并且影响GK大鼠的胰岛素分泌,而且Ucp2蛋白表达水平增加,这些作用通过胰岛素治疗得到改善,表明Ucp2是β细胞胰岛素分泌的重要负性调节因子[7]。Joseph等[8]通过对Ucp2基因敲除小鼠和野生性小鼠胰岛细胞分别在体外用软脂酸培养48h后观察并比较细胞内甘油三酯含量和软脂酸代谢速率发现,Ucp2基因敲除鼠的β细胞游离脂肪酸的代谢速率提高,避免了甘油三酯细胞内堆积,从而避免脂毒性对β细胞损伤,这可能就是Ucp2表达过度损伤胰岛细胞功能的机制之一。 2.高血糖:高血糖对Ucp2mRNA表达的影响研究结果不尽相同,但多数研究[9-10]表明,高血糖能上调胰岛细胞线粒体的Ucp2表达,而且ROS的产生增加,进而抑制胰岛素的分泌,在协同高脂的环境下,ROS生成的增多有诱导Ucp2的表达增多,表明Ucp2活性增加对胰岛素分泌产生不利作用。同样在Ucp2基因敲除小鼠中发现其β细胞数量增加但在高脂高糖环境中仍能维持一定的胰岛素分泌功能。 3.其他因素:脂联素能减少A Y/a肥胖小鼠的内脏脂肪,可能与上调解偶联蛋白在棕色脂肪、白色脂肪以及骨骼肌中的表达有关[11]。瘦素通过提高白色脂肪中Ucp2的表达来加强或激活脂肪酸类代谢和利用[12]。甲状腺素能增加心脏、骨骼肌以及脂肪组织中Ucp2的mRNA表达。选择性β-3肾上腺素能激动剂能降低肥胖KK小鼠体重,可能是通