酸性成纤维细胞生长因子对顺铂肾损害
酸性成纤维细胞生长因子对庆大霉素和顺铂所致肾小
管上皮细胞损伤的保护作用
刘华钢1△黄巨恩2 刘丽敏1 王慧杰2胡文娟2李校堃3肖健3
（1广西医科大学药学院广西南宁530021；2广西医科大学组织学与胚胎学教研室；3温州医学院生物与天然药物研究院
浙江温州325027）
摘要：目的研究酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)对庆大霉素（GM）和顺铂(DDP)引起的体外培养肾小管上皮细胞损害的保护作用。方法大鼠肾皮质经研磨、过网、胰蛋白酶消化，进行肾小管上皮细胞的体外培养。经Cytokeratin 18抗体进行鉴定后，用GM、DDP建立损伤模型，观察aFGF对损伤的肾小管上皮细胞的保护作用。结果①经形态学观察、GM或DDP组与对照组比较，CAT、SOD、GSH-Px、Na＋－K＋－ATP酶活性下降，而NAG活性和NO、MDA升高（(P<0.01或P<0.05)，提示肾小管上皮细胞的培养和GM、DDP损伤的建模成功。②aFGF+GM或DDP组与GM组或DDP组比较，大多数生化和酶学指标有显著或非常显著性差异(P<0.05或P<0.01)；而aFGF+GM或DDP组与对照组比较，CAT、NAG、GSH-Px 、Na ＋－K＋－ATP酶活性无显著性差异，但SOD活性下降、NO、MDA升高尚有显著性差异(P<0.05)。结论aFGF对GM、DDP 损伤的肾小管上皮细胞有明显的保护作用。
关键词：酸性成纤维细胞生长因子；顺铂；肾小管上皮细胞；细胞培养；
中图分类号：R-332 R322.61文献标识码：A 文章编号：16673-6273（2008）
Protective Effects of afgf on Renal Tubular Epithelial Cells Injured by
Gentamicin and Cisplatin in Vitro*
LIU Hua-gang1△, HUANG Ju-en2,LIU Li-min1,WANG Hui-jie2,HU Wen-juan2,LI Xiao-kun3,XIAO Jian3
(1 Pharmacy college of Guang Xi Medical University, 530021, Nanning, China ; 2 Dept. of Histology and Embryology, Guang Xi Medical University, 530021, Nanning, China; 3 Institute of Biology and Nature Medicine,Wenzhou Medical Coleg,325027,Wenzhou
China)
ABSTRACT: Objective To investigate the protective effects of aFGF on the cultured renal tubular epithelial cells injured by Gm and DDP. Methods Renal tubular epithelial cells of SD rats were cultured after its renal cortices were grounded, filtered and digested with 0.25%trypsin. The cell types of epithelial cells were identified by Cytokeratin 18 immunocytochemistry. The injuried model of renal tubular epithelial cells were established by treating with Gentamicin or Cisplatin and the protective effects of aFGF on injured renal tubular epithelial cells were observed. Results ①By observing the morphology of the renal epithelial cells and comparing GM and DDP group with control group, the activities of CAT, SOD, GSH-Px and Na+-K+-ATP enzyme decreased, while *基金项目：国家重点基础发展规划项目（973项目）（G199954204）
作者简介：刘华钢（1956-），女，博士生导师，教授，主要研究方向：中药新剂型、新制剂及药理作用机制
△通讯作者：刘华钢，电话：0771-*******，E-mail: hgliu@https://www.wendangku.net/doc/ed11636599.html,。
（收稿日期：2007-07-18 接受日期：2007-08-12）
NAG activity and NO?MDA level increased (P<0.01 or P<0.05). These results indicated the success of the culture of renal tubular epithelial cells and foundation of the model injured by GM and DDP. ②Comparing aFGF+GM or DDP group with GM or DDP group, most indices of biochemistry and enzymology of the culture contents had significant or high significant differences (P<0.05 or P<0.01); however, the differences of the CA T, NAG, GSH-Px and Na+-K+-ATP enzyme activities between the aFGF+GM, DDP group and control group were non-significant, while SOD activity and NO?MDA were still significant(P<0.05). Conclusion aFGF had protective effects on renal tubular epithelial cells injured by GM and DDP.
Key words:aFGF; cisplatin; Renal tubular epithelial cell; Cell culture
Chinese Library Classification:R-332, R322.61 Document code : A
Article ID: 16673-6273(2008)
前言
以庆大霉素(Gentamicin, GM)为代表的氨基糖甙类抗生素主要作用于革兰氏阴性细菌，因其抗菌谱广、疗效价且费用低廉而广泛应用于临床，但由于血清有效浓度与毒性浓度相近，毒性作用的发生率高；而顺式二氯二氨铂或简称顺铂(Cisplatin, DDP或CDDP)是一种广谱、有效的抗癌药物，其疗效与用药剂量成正比。尽管GM 和DDP在分子结构、作用机理和临床适应症等方面都存在很大的差异，但在副作用方面却很相似，即过量使用都会引起严重的肾毒性和耳毒性，这也是它们临床应用受限的主要原因[1-2]。本研究用原代培养的大鼠肾小管上皮细胞制作GM、DDP肾损伤模型，观察aFGF的作用，并探讨其可能的机制，为临床应用提供依据。
1 材料与方法
1.1实验动物和试剂
实验使用SD大鼠40只，体重约50 g，由广西医科大学实验动物中心提供。新生小牛血清由杭州四季青公司提供；DMEM培养基由Gibco公司提供；胰蛋白酶由Sigma公司提供；抗细胞角质素(Cytokeratin 18)抗体、SABC、DAB试剂盒由武汉博士德公司提供；硫酸庆大霉素由广西南宁市百合药业集团有限公司产品（批号0504004）；DDP为江苏豪森药业股份有限公司产品（批号051003）；基因重组人酸性成纤维细胞生长因子(rh-aFGF)由暨南大学生物工程研究所提供（批号20050618）；丙二醛(MDA)测定试剂盒、过氧化氢酶测定试剂盒、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH - Px)试剂盒、N-乙酰氨基-β-D葡萄糖苷酶(NAG)测定试剂盒、A TP酶测定试剂盒为南京建成生物工程研究所产品。
1. 2 实验方法和步骤
1.2.1 肾小管节段的分离、消化断头处死大鼠，无菌条件下取肾，将肾皮质分离后洗净剪碎，用PBS平衡盐溶液清洗几次。将洗净的肾皮质剪成1～2 mm 大小的组织块，用0.25 %胰蛋白酶37℃消化10 min，消化后的细胞悬液800 r·min- 1离心5 min。弃上清液，将沉淀再消化20 min。显微镜下观察直至肾小管节段变成松
散、粘稠状，并且颜色略变为白色为止。其悬液用200目的尼龙细筛过滤, 滤去较大的组织块。滤液1000 r·min- 1离心5min，弃上清液。将沉淀重悬于DMEM培养液中，800 r·min- 1离心 5 min，洗涤3 次，所得沉淀即为分离的肾小管上皮细胞。
1.2.2 肾小管上皮细胞的培养加入5 ml含有10%新生小牛血清的DMEM 培养液，充分吹打直到肾小管节段分散为细胞悬液为止。调整细胞密度为1×104个/ml，将细胞悬液移入96孔细胞培养板，37 ℃，5% CO2培养箱培养。24ｈ后首次换液，倒置相差显微镜观察，围绕肾小管节段有卵圆型上皮样细胞长出，呈岛屿状向四周逐渐扩增，细胞形态呈鹅卵石样。以后视细胞生长情况于48或72h后再次换液。细胞于72至120h 处于对数生长期，可用于实验。
1.2.3 肾小管上皮细胞的鉴定采用Cytokeratin 18免疫细胞化学方法鉴定，一抗为1：400 Cytokeratin l 8抗体，二抗为1:100的山羊抗小鼠。阴性对照则用PBS代替一抗，其余步骤相同。
1.2.4 aFGF对肾小管上皮细胞的保护作用实验分3组（GM实验n=6，DDP实验n=10）：①对照组(未加处理因素)：即在含10 %新生小牛血清的DMEM培养液中培养的细胞；②损伤组(GM或DDP组):即在含0.8 mmol.L-1GM或12.5 μg.L-1DDP和10 %新生小牛血清的DMEM培养液中培养的细胞；③细胞因子组(aFGF+GM或DDP组):即在加入GM或DDP的10 %新生小牛血清的DMEM培养液中培养12 h后再加aFGF4.5 μg.L-1（GM实验）或0.45 μg.L-1（DDP实验）培养的细胞。以上各组均取原代培养3 d的细胞。给药48 h（DDP 实验）或72 h（GM实验）后检测细胞的酶和生化指标：① MDA含量测定采用TBA法；② NO的测定采用硝酸还原酶法；③SOD活性的测定采用黄嘌呤氧化酶法；④NAG活性测定采用对硝基酚比色法；⑤Na＋-K＋-ATP酶活性是在660 nm处测定OD值；⑥GSH-Px活性是在412 nm处测定OD值。以上各项检测均严格按照试剂盒操作。
1.3统计学分析各分组所得计量数据采用均数±标准差(X±S)表示，用SPSS10.0软件处理数据，两组间均数比较用t检验。检验水准α=0.05，p<0.05有统计学意义。
2 结果
2.1 原代培养细胞生长观察
正常培养（对照组）96-120h的细胞，细胞形态为多边鹅卵石样，独立生长或以组织块为中心分裂增殖生长，镜下透明度及折光性强（图1）；加入GM12h或DDP48h后均可见细胞明显肿胀、边界消失，出现多个细胞融合成团块状的现象，培养液中多见细胞碎片（图2、图3）；其中加入DDP作用12 h后再加aFGF培养48 h，可见细胞肿胀程度减轻，轮廓清晰，细胞融合成团不明显（图4）。
图 1 培养4 d生长良好的肾小管上皮细胞(200×)
Fig. 1 Renal tubular epithelial cell cultivated for four days (200×)
2.2 肾小管上皮细胞的鉴定
Cytokerafin 18免疫细胞化学反应显色3~4 min，光镜下可见阳性细胞呈现细胞核中空而胞浆染色的细胞形态，胞浆内可见不均匀、散在分布、强度不一的棕褐色颗粒状或点状染色(图5)，并与阴性细胞间杂分布。
图5肾小管上皮细胞Cytokeratin18免疫细胞化学染色(200×)
Fig. 5 Renal tubular epithelial cell stained by Cytokeratin18 immunocytochemicamisty (200×) 为了解Cytokeratin 18 阳性细胞的分布情况，我们对Cytokeratin 18免疫细胞化学染色呈阳性反应的10张细胞培养染色标本，每张各取5个视野在100×光镜下，用方格微尺进行阳性和阴性细胞记数，结果表明：Cytokeratin 18阳性细胞约占94.2％。
2.3 给药72h或48h后，肾小管上皮细胞的酶学和生化指标的检测
给药72h（GM实验）或48 h（DDP实验）后，各组肾小管上皮细胞的酶学和生化指标的检测分别（表1、表2）。结果表明：GM的毒性作用可使培养的肾小管上皮细胞SOD，CAT，Na+-K+-ATP酶活性下降，MDA、NAG水平升高，DDP的毒性作用可使培养的肾小管上皮细胞SOD、GSH-Px酶活性下降，MDA、NO水平升高，而aFGF则表现出一定的保护作用。
表1 给GM 72h后CA T、SOD、NAG、Na＋-K＋-ATP酶活性以及MDA变化(X±s)
Table 1 CAT, SOD, NAG, Na＋-K＋-A TP enzyme activity and MDA changes after treated with GM for72h
Group CA T(U/g) NAG(U/g) SOD Na＋-K＋-A TP enzyme MDA
(U . mg-1. prot-1) (μmolpi.mg-1.pr-1.10min-1) (nmol.mg-1. pr-1) Control group 144.11±2.12 76.65±1.24 79.12±3.56 40.06±0.98 7.49±1.23 (aFGF + GM) group 143.45.32±2.15●74.89±1.57●78.23±1.56● #41.12±0.88●8.10±0.08● # Note : ▲P＜0.05 GM group compared with control group；●P＜0.05 (aFGF + GM) group compared with GM group；#P＜0.05 (aFGF+DDP) group compared with control group.
表2 给DDP 48h后SOD、GSH-Px酶活性以及NO、MDA变化(X±s)
Table 2 SOD, GSH-Px enzyme activity and MDA, NO changes after treated with DDP for 48h
Group SOD GSH-Px MDA NO
（U.ml-1）（U.ml-1）(nmol.mg-1.prot-1) （μmol.g-1.prot-1）
Control group 76.71±5.84 51.32±3.83 7.23±1.42 0.11±0.04
DDP group 42.61±6.79▲24.67±2.87▲12.81±2.46▲0.29±0.11▲
(aFGF+DDP) group 69.52±10.53●46.88±5.79●10.17±1.85#0.19±0.07#
Note : ▲P＜0.05 DDP group compared with control group；●P＜0.05 (aFGF + DDP) group compared with DDP group；#P＜0.05 (aFGF+DDP) group compared with control group.
3 讨论
目前的研究表明：氨基糖甙类抗生素是通过一种称为GP330(glycoprotein 330) 的膜蛋白受体介导的阳离子蛋白或受体内吞饮作用而进入肾小管上皮细胞(尤其是近端小管上皮细胞)，形成的囊泡与初级溶酶体结合为次级溶酶体，使溶酶体膜通透性增加，溶酶体酶大量漏出，继而损害线粒体等细胞内结构，细胞出现变性、坏死[3-4]。而DDP肾毒性的病理机制有两种[5]：一是DDP可引起肾血管收缩，使肾血流量及肾小球滤过率下降，从而引起蛋白尿、肾功能损伤等症状；二是DDP可引起近端肾小管上皮细胞缺血、缺氧，甚至坏死，其早期往往首先损害肾近曲小管，尤其是近曲小管直段细胞，导致肾小管细胞结构和功能紊乱，表现为肾小管重吸收功能与尿浓缩稀释能力降低，尿钠排出增多及对ADH的反应异常等。从细胞生物学机制上来看，与氧化应激有关的氧化性损伤可能是DDP引起肾功能损害的主要原因。
酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)是一种促有丝分裂的小蛋白质分子，等电点5～7，分子量16.5KD，大约由154个氨基酸组成。aFGF具有两大类型的活性：其一，促有丝分裂活性，可促进组织细胞分裂、增殖；其二，非促有丝分裂活性，包括舒张血管、神经保护、心肌保护和局部缺血保护等[6-7]。我们在前期研究中，已观察到aFGF对肾缺血-再灌注损伤有良好的拮抗效应[8]，并且在体外培养条件下可促进肾小管上皮细胞存活与增殖，但aFGF是否对GM和DDP诱导的分离培养的肾小管上皮细胞损伤具有保护作用，以及机制如何，尚不清楚。本研究结果表明：aFGF明显拮抗GM对肾小管上皮细胞毒性损伤后所造成的酶活性和生化指标的改变。其中，aFGF+GM组的CAT、NAG、Na＋-K＋-ATP酶活性三项指标都与未施加任何影响因素的对照组处于同一水平；SOD活性下降和MDA水平升高虽然与对照组仍有显著性差异(P<0.05)，但却明显优于GM组。而aFGF也明显拮抗DDP对肾小管上皮细胞毒性损伤后所造成的细胞肿胀、SOD、GSH-Px酶活性下降和MDA、NO水平升高。其中，aFGF+DDP组的GSH-Px、SOD两项指标也与未施加任何影响因素的对照组处于同一水平；MDA、NO水平虽然比对照组水平偏高，但却仍然明显低于DDP组。这些结果与我们所
用bFGF拮抗GM对体外培养肾小管上皮细胞的毒性作用的实验研究[9]颇相似，使我们有理由相信：aFGF、bFGF对GM和DDP导致的肾小管上皮细胞毒性损伤的保护作用机理，直接或间接与拮抗自由基的产生、加强其清除和保护抗氧化酶活性有关。
从传统中医学的理论来看，肾虚往往会导致头昏、眼花、耳鸣；而从西医学的角度，尽管GM和DDP 在分子结构、作用机理和临床适应症等有很大差异，但在副作用方面却很相似，即过量使用都会引起严重的肾毒性和耳毒性，而且往往肾毒性在先，耳毒性在后，中西医理论在此似乎得到奇妙的交融。我们的理解是：人类的肾脏组织与内耳组织可能均对某些化学物质存在相同或相似的特异性受体，只是在量、敏感度以及代谢过程等方面的不同使得损伤情况有所差异。本实验结果提示DDP肾毒性并非仅仅使肾血管收缩导致缺血性肾损伤，而且可能还同时存在一种直接的毒性作用。
参考文献(References)
[1] Huang Ju-en, Xu Zhi-wen, Chen Yu, et al. Progress in the study on toxic effect, prevention and cure of gentamycin[J]. Medical
Recapitulate, 2002, 8(9):555-557
[2] Robson H, Meyer S, Shalet SM, et al. Platinum agents in the treatment of osteosarcoma: efficacy of cisplatin vs. carboplatin in
human osteosarcoma cell lines [J].Med Pediatr Oncol , 2002, 39: 573-580
[3] He Ya-ni, Liao Li-shen, Jiang Jian-xin. Study of gentamicin-induced mitochondrial and lysosomal damages in renal cortex in rats[J]
Acta Academiae Medicinae Militaris Tertiae, 1996, 18(3): 243-245
[4] Decorti G,Malusa N, Furlan G, et al. Endocytosis Of gentamicin in a proximal tubular renal cell line[J].Life sci, 1999,
65(11):1115-1118
[5] Zhou Dong, Sun Wei. Progress in the study on pathogenesy, prevention and cure of cisplatin nephrotoxicity[J]. Chinese Journal of
Integrated Traditional and Western Nephrology, 2004, 5(10):617-618
[6] Y u Ying,Cai Shao-xi, Xia Y u-xian,et al. Progress in the study on structure and functions of acidic fibroblast growth factor[J].
Chinese Pharmacological Bulletin, 2002, 18(2): 125-128
[7] 王慧杰, 黄巨恩. 酸性成纤维细胞生长因子的基础与应用研究[J]. 解剖学研究, 2005, 27(7) : 308-311
Wang Hui-jie,Huang Juen. Basic and Applicative Studies of Acidic Fibroblast Growth Factor [J]. Anat Res, 2005, 2(5): 308-311(In Chinese)
[8] 胡文娟,黄巨恩,李校堃,等.酸性成纤维细胞生长因子对大鼠肾缺血再灌注损伤的保护作用[J].解剖学研究,
2006,28(3):172-175
Hu Wen-juan, Huang Juen, Li Xiao-kun, et a1. Protective effects of acidic fibroblast growth factor on rats' renal ischemia/reperfusion injuries [J]. Anat Res, 2006, 28(3): 172-175(In Chinese)
[9] Huang Ju-en, Huang Quan-yong, Chen Wei-ping, et a1. Protective effects of bFGF on rats’renal tubular epithelial cells damaged
by gentamicin in vitro [J]. Chinese Pharmacological Bulletin. 2005, 21(2): 232-235