双歧杆菌的完整肽聚糖对实验性大肠癌MAPK和AP_1的影响
#细菌学#
双歧杆菌的完整肽聚糖对实验性大肠癌MAPK 和AP -1的影响
王立生 朱惠明 潘令嘉 王玉林 罗伟香 马晓东 张亚历 周殿元
=摘要> 目的 探索双歧双歧杆菌(Bi f idobacterium bi f idum )的完整肽聚糖(WPG)的抑瘤机制。方法 以激光共聚焦显微镜检测大肠癌裸鼠移植瘤丝裂原活化的蛋白激酶家系中的ERK1P 2、J NK 和p38以及激活蛋白1的主要组分c -fos 和c -jun 的含量。结果 WPG 注射组大肠癌组织的ERK1P 2和c -jun 的平均荧光强度均明显低于肿瘤对照组(P <0.01);而J NK 、p38和c -fos 的平均荧光强度在两组间差异则无显著性(P >0.05)。结论 双歧双歧杆菌的WPG 体内能降低大肠癌ERK1P 2的活性以及c -jun 的表达,这可能是其抑瘤途径之一。
=关键词> 双歧杆菌;完整肽聚糖;大肠癌;丝裂原活化的蛋白激酶;激活蛋白1
Influence of pan -peptidoglycan of bifidobacteria on MAPK and AP -1of experimental large bowel carcinoma
WANG Li -sheng *
,Z H U H ui -ming ,PAN Ling -j ia,WANG Yu -lin,LUO Wei -xian g ,MA Xiao -don g ,Z HANG
Ya -li,Z H OU Dian -yan.*
The Second Aff iliated H osp ital,Ji c nan Un iversity of Medic ine,Shen zhen 518020,China Corres ponding author :WANG Li -sheng,E -mail:wan gls2001@https://www.wendangku.net/doc/e911645882.html,
=Abstract > Objective To explore the antitumor mechanisms of pan -pep tidoglycan (WPG)of Bi f idobac -te riu m bi f idum .Methods The content of ERK1P 2,JNK ,p38,c -fos and c -jun of transplantation tumors of large bowel carcinoma of nude mice was detected by laser scanning confocal microscopy.ERK1P 2,JNK and p38was be -longing to mitogen -acti vated protein kinase family.c -fos and c -jun were the main compositions of activator protein 1.Results The average fluorescent strength of ERK1P 2and c -jun of the large bowel carcinoma tissues in WPG injection group was si gni ficantly lower than that in control group (P <0.01).The average fluorescent strength of JNK,p38,c -fos was not markedly different in both groups (P >0.05).Conclusion WPG of B .bi fidum could decrease ERK1P 2activi ty and c -jun expression of large bowel carci noma in vivo .It was one of the antitumor path -ways of WPG possi bly.
=Key w ords > Bi fidobacterium ;Pan -pep tidoglycan;Large bowel carcinoma;Mitogen -acti vated protein k-i nase;Activator protein 1
基金项目:广东省自然科学基金资助项目(994066)
作者单位:暨南大学医学院第二附属医院深圳市人民医院消化内科(王立生,朱惠明,王玉林,罗伟香);第一军医大学基础部中心实验室(马晓东);第一军医大学南方医院全军消化内科研究所(潘令嘉,张亚历,周殿元)
通讯作者:王立生,518020深圳,暨南大学医学院第二附属医院消化内科(E -mail:wangls2001@https://www.wendangku.net/doc/e911645882.html,)
双歧杆菌是机体肠道内最主要的生理性优势常住菌,在体内发挥着免疫赋活、抗感染、延缓衰老以及抗肿瘤等多种生理功能112
。完整肽聚糖(whole peptidoglycan,WPG)为双歧杆菌细胞壁中多糖和肽聚糖的聚合物,并保持了全菌的一些重要的生物学特性。已知双歧双歧杆菌(B .Bi f idum )的WPG 体内能明显阻抑大肠癌的生长,其确切的抑瘤途径尚未完全阐明122
。我们以大肠癌裸鼠移植瘤为模型,用激光共聚焦显微镜观察了B .bi f idum 的WPG 对大肠癌组织丝裂原活化的蛋白激酶家系(mitogen -activated protein kinase,MAPK)和激活蛋白1(activator protein
1,AP -1)活性的影响,以进一步探索它的抑瘤机理。
材料与方法
实验动物:BALB P c 小鼠,雄性,6~8周龄,体重
约18~22g,购于第一军医大学实验动物中心,饲养于SPF 级动物室。
W PG :按Sekine 介绍的方法从B .bifidum 细胞壁中提取而成,并经过鉴定122
。重庆医科大学检验系胡宏教授惠赠。
大肠癌细胞株:Lovo 细胞株为人未分化结肠癌细胞,引自第一军医大学病理教研室。按常规传代于含10%小牛血清的RPMI 1640培养液中,生长至单层后,以0.25%胰蛋白酶消化贴壁的细胞,调细胞数为107
P ml 。
大肠癌裸鼠移植瘤模型的建立及W PG 的抑瘤试验:动物分为2组,肿瘤对照组:20只裸鼠,实验的第1天于裸鼠的左前肢背部皮下接种Lovo 细胞2@
表1 大肠癌组织ERK1P 2、JNK 、p38、c -fos 和c -jun 的检测结果(平均荧光强度, x ?s )
Table 1.Detection of ERK1P 2,JNK,p38,c -fos and c -jun (average fluorescence stroug th, x ?s )
Groups n ERK1P 2JN K p38c -fos c -jun WPG injection
group
20780.35?62.18902.84?73.591312.44?90.831037.52?82.60847.16?82.60Tumor control
20
1641.70?119.22*
991.76?68.50*
*
1268.12?66.21*
*
1149.80?87.93*
*
1794.26?131.24*
*P <0.01,**P >0.05,compared with WPG i njec tion group
106
(0.2ml),第2天起于腹腔注射PBS 液0.2ml,每天1次,连续5d;WPG 注射组:20只裸鼠,实验第1天接种Lovo 细胞的数量、部位及程序均同肿瘤对照组,第2天起向裸鼠腹腔注射W PG 0.25mg (相当于109
个双歧杆菌),每天1次,连续5d 。于实验的第21天处死动物,剥离瘤体,将新鲜肿瘤组织固定于10%中性福尔马林溶液中,常规石蜡包埋制片,行HE 染色,组织学证实为未分化结肠癌。
大肠癌组织ERK1P 2、JNK 和p38活性以及c -fos 、c -jun 表达的检测:采用激光共聚焦显微镜定量测定,具体操作步骤为:(1)切片常规脱蜡至水,0.3%H 2O 2甲醇封闭内源性过氧化物酶活性;(2)0.01mol P L PBS(pH7.2)液洗涤,3次@5min;(3)滴加10%非特异性牛血清白蛋白,室温孵育10min;(4)0.01mol P L PBS(pH7.2)液洗涤,3次@5min;(5)分别滴加p42P p44MAPK(ERK1P 2,Thr202P Tyr204)、抗磷酸化JNK 和抗磷酸化p38抗体(购自Ne w England Biolab 公司),兔抗人c -fos 和c -jun 单抗(Santa Cruz 公司产品)各100L l,工作浓度均为1B 200,37e ,温育60min;(6)0.01mol P L PBS(pH7.2)液洗涤,3次@5min;(7)滴加1B 100的FITC 标记羊抗兔IgG 100L l,37e 温育30min;(8)0.01mol P L PB S(pH7.2)液充分洗涤,5次@5min;(9)以无荧光缓冲甘油封片,盖玻片周围以指甲油封固;(10)用激光共聚焦显微镜逐个测定大肠癌细胞的荧光强度。测定时选取激发波长为488nm,发射波长为475nm,每张玻片于不同视野测定100个细胞以上,取其平均荧光值作为定量参数。
统计学处理:各组间差异采用t 检验。
结
果
11大肠癌组织ERK1P 2、JNK 和p38活性的检测结果:实验所用的一抗为p42P p44MAPK 、抗磷酸化
JNK 和抗磷酸化p38抗体,因而检测的结果反映了ERK1P 2、JNK 和p38的活性。实验结果中,WPG 注射组大肠癌移植瘤组织ERK1P 2的平均荧光强度明显低于肿瘤对照组(P <0.01);而JNK 和p38的平均荧光强度在两组间差异无显著性(P >0.05)。具体
见表1和图1、2。
图1 WPG 注射组大肠癌ERK 荧光图象(@400)Fig 1.Fluorescent image for large bowel carcinoma ERK in WPG injection group (@400)
图2 肿瘤对照组大肠癌ERK 荧光图象(@200)
Fig 2.Fluorescent image for large bowel carcinoma ERK in tumor control group (@200)
21W PG 对大肠癌c -fos 和c -jun 表达的影响:以激光共聚焦显微镜定量检测大肠癌组织c -fos 和c -jun 的表达,结果显示大肠癌荷瘤鼠经W PG 处理后,其c -jun 的平均荧光强度显著低于肿瘤对照组(P <0.01),而c -fos 的平均荧光强度在两组间无明显变
化(P >0.05)。具体见表1和图3、4
。图3 WPG 注射组大肠癌c -jun 荧光图象(@200)Fig 3.Fluorescent image for large bowel carcinoma c -jun in WPG injection group (@
200)
图4 肿瘤对照组大肠癌c -jun 荧光图象(@100)Fig 4.Fluorescent image for large bowel carcinoma c -jun in tumor control group (@100)
讨论
已知生长因子与结肠癌细胞表面具有酪氨酸激酶活性的表皮生长因子受体结合后,可诱发受体胞浆中的酪氨酸残基自身磷酸化,导致受体二聚体化与活化,进而通过Ras y Ra-f 1y ME KK y ME K1P 2y
ERK1P 2这一途径将信号传导至核内,最终激活AP -1,促进细胞的增殖和转化。
MAPK 是一组丝P 苏氨酸磷酸化激酶,包括细胞外信号调节激酶(extracellular signal regulated kinase,ERK)、c -JUN 氨基端蛋白激酶(c -JUN NH 2-terminal protein kinase,JNK)和p38等。ERK 通路主要促进细胞增殖和生长,而JNK 及p38则诱导细胞凋亡,因
而MAPK 通路同时具有转导增殖信号和凋亡信号的双重功能,在肿瘤的发生与发展过程中起重要作用142
。
已知人多种恶性肿瘤细胞内存在MAPK 的持续
激活,如肺癌、卵巢癌、胰腺癌和前列腺癌等。此外,结肠癌细胞中也发现ERK 和JNK 的过度活化152
。高活性的MAPK 通过上调细胞周期素D1和VEGF 表达以及磷酸化微管相关蛋白等途径促进肿瘤的生长和侵袭162
。因此,阻断MAPK 系统中的某些传导通路是治疗肿瘤的途径之一。Nishio 等
172
证实抗癌
药paclitaxel 通过抑制肺癌细胞E RK1P 2和cdc2激酶的活化,影响细胞骨架相关蛋白的磷酸化,从而抑制肿瘤细胞的过度增殖。Rice 等
182
也发现Sulfide (舒
林酸衍生物)体外能显著抑制人结肠癌细胞HC T
116的生长,同时诱导其凋亡,其机制主要是阻断ERK1和ERK2的磷酸化。本文结果中,W PG 注射组大肠癌移植瘤ERK1P 2的平均荧光强度明显低于肿瘤对照组,而JNK 和p38的平均荧光强度在两组间差异无显著性,提示B .bi f idum 的WPG 能显著抑制大肠癌组织的ERK1P 2的活化,对JNK 和p38的活性无明显影响。
AP -1是一类由早期反应基因编码的核转录因子,由c -jun 和c -fos 组成,通过亮氨酸拉链结构与DNA 结合,调控基因的转录。目前,体内外的实验已证实AP -1的活化参与了细胞的增殖和转化19,102
。(1)c -fos 和c -jun 过表达时,细胞的恶变潜能剧增;(2)向细胞内注射c -jun 和c -fos 抗体或转染c -jun P c -fos 反义寡核苷酸,可抑制DNA 的合成及细胞增殖;(3)AP -1可上调细胞周期素D 和E 、增殖细胞核抗原、基质金属蛋白酶和VE GF 等基因的表达。因此,干预AP -1的表达和活性可望成为某些肿瘤的治疗方法之一。Park 等1112
报道了二氢愈创木脂酸(DH -GA)体外抑制结肠癌、肺癌以及淋巴癌生长的途径主要是阻抑AP -1和DNA 的结合。此外,丁酸钠体外均能明显抑制人结肠癌细胞HT -29的生长,其机制主要是降低AP -1的活性,进而抑制其增殖1122
。本文结果显示大肠癌移植瘤被WPG 处理后,其c -jun 的平均荧光强度明显低于肿瘤对照组,而两组c -fos 的平均荧光强度则无统计学差异,提示B .bi f i -dum 的W PG 体内能阻抑大肠癌c -jun 的表达,而不影响c -fos 的表达。
WPG 体内能明显抑制多种肿瘤的生长,如结肠癌、肝癌、S180肉瘤、恶性黑色素瘤和Meth A 纤维肉
瘤等122
。目前认为其抑瘤途径主要是降低肿瘤细胞
的增殖活性,同时诱导其凋亡;此外,也能激活巨噬细胞以及增强其杀瘤活性113-152。由于MAPK和AP-1的异常活化参与了肿瘤的发生和演进,结合本文实验结果,我们认为WPG抑制MAPK家系中E RK1P2的活化以及降低AP-1中c-jun的表达是其抑瘤的另一途径。
参考文献
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(收稿日期:2002-06-16)
±±±±±±±±±±±±±±±±±±±±5中华微生物学和免疫学杂志62003年征订启事
5中华微生物学和免疫学杂志6为中华医学会主办。1981年创刊,主要报道医学微生物学和免疫学方面的研究论文、简报、评论、综述、国内外学术动态、书评及消息等。
本刊辟有:细菌学、病毒学、分子微生物学、临床微生物学、疫苗学、感染免疫、基础免疫学、临床免疫学、分子免疫学、免疫遗传学、肿瘤免疫学、中药与免疫、免疫学技术、检测技术等栏目。
本刊为基础医学、生物学两学科的核心期刊,是中国科学引文数据库、中国学术期刊综合评价数据、中国医学生物学文献数据(英文版)、中国学术期刊文摘、中国医学文摘等的来源期刊。被美国化学文摘(CA)、生物学文摘(BA)、荷兰医学文摘(E M)、Medline等国外著名检索期刊收录。
读者对象:医学微生物学和免疫学专业的科研人员、教师及有关的中、高级卫生、防疫、检验工作者。
本刊为月刊,大16开,每期80页,每册定价10100元,于每年11月开始征订,国内由全国各地邮电局发行。国外由中国国际图书贸易公司(中国国际书店)发行。如错过邮局征订,亦可直接向编辑部订购(款从邮局寄本刊编辑部,邮政编码:100024,电话:010-********。E-mail:cj mib@https://www.wendangku.net/doc/e911645882.html,)。
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