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基于核基因和线粒体基因的哺乳动物物种鉴定

涂飞云1,欧阳晓芳2,王通1,韩卫杰1,黄晓凤1★

(1.江西省林业科学院,江西南昌330013;2.江西省林业人才服务中心,江西南昌330038)

摘要：2018年7月,江西野生动植物司法鉴定中心收到森林公安局查获的哺乳动物检材1份。根据被查方的供述,该检材为自行购买的驴肉。为了查明检材物种种类,森林公安委托我中心对检材进行物种鉴定。利用哺乳动物线粒体Cytb通用引物对检材样品的Cytb基因进行了扩增、测序,将Cytb测序结果与NCBI数据库中的在线Blast检索比对后,初步确认检材为马(Equus caballus)。由于线粒体基因为母系遗传,因此不排除该检材为马骡的可能。为了进一步确定检材是否为马或马骡,本研究同时测定了检材样品的肌酸激酶肌肉(creatine kinase muscle,CKM)核基因序列,同时下载了马和家驴(Equus asinus)的CKM基因序列,构建NJ系统发生树,结果显示本次测定的核基因序列与马的CKM 基因聚为一支,而不是与家驴序列聚为一支。综合核基因和线粒体系统树的结果,确认送检检材为马。本案例表明综合线粒体Cytb、CKM基因序列结果可实现对马、驴、马骡或驴骡动物样品的物种鉴定。

关键词：Cytb基因;CKM基因;物种鉴定

中图分类号：Q959.843文献标识码：A文章编号：2095-9818(2019)02-0062-03

DOI编码:10.16259/https://www.wendangku.net/doc/e012302355.html,ki.36-1342/s.2019.02.014

Mammal species identification based on mitochondrial and nuclear

genes

Tu Feiyun1,Ouyang Xiaofang2,Wang Tong1,Han Weijie1,Huang Xiaofeng1★

(1.Jiangxi Academy of Forestry,Nanchang Jiangxi330013,China;2.Jiangxi Forestry Talent S ervice Center,Nanchang Jiangxi330038,China)

Abstract:In July2018,Jiangxi Wildlife Judicial Identification Center received a mammal sample,which was seized by the Forest Public Security Bureau.According to the confession of the suspect,the sample is ass meat which purchased alone.In order to ascertain the species of the sample,species identification was entrusted by forest police.Mitochondrial Cytb gene sequence was determined using the Cytb universal primers,and the Blast search was conducted using Cytb gene sequence.It was preliminary identified as Equus caballus.However,the mitochondrial gene is maternally inherited,species of the sample might be mule.In order to determine whether the species is horse or mule,the present study simultaneously sequenced the creatine kinase muscle (CKM)nuclear gene sequence,and also downloaded the CKM gene sequences of related species to construct a NJ phylogenetic tree.The NJ phylogenetic tree showed that the nuclear gene sequence was clustered with horse sequences instead of that of ass. Based on results of phylogenetic trees using Cytb and CKM genes,it was identified as E.caballus.This case demonstrates that the integrated mitochondrial Cytb and CKM genes can be useful for species identification of domestic animals(e.g.horse,ass,mule and hinny).

Key words:Cytb gene;CKM gene;species identification

线粒体DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)是存在于细胞质内的环状DNA。线粒体基因细胞色素b （Cytochrome，Cytb）是mtDNA的重要组成的蛋白编码基因，且在动物物种鉴定方面均是很好的分子标记物[1-3]。线粒体DNA属母系遗传，仅能检测动物的母

系遗传特征，只有同时使用核基因和线粒体基因才能全面检测动物的遗传背景。核基因肌型肌酸激酶（creatine kinase muscle，CKM)基因具有高度保守性[4-6]，可用于具有不同遗传背景的动物物种鉴定。

2018年7月，江西野生动植物司法鉴定中心

收第47卷第2期

2019年4月

Vol.47,No.2

Apr.,2019

收稿日期：2019-02-20

基金项目：江西省科研院所基础设施配套项目(项目编号:20151BBA13037);江西省林业科学院青年科技人才培养项目(项目编号:2018521602)作者简介：涂飞云,男,副研究员,博士,主要从事野生动植物保护。E-mail:feiyuntu@https://www.wendangku.net/doc/e012302355.html,

★通信作者院黄晓凤,女,研究员,博士,主要从事野生动植物保护。E-mail:446846232@https://www.wendangku.net/doc/e012302355.html,

人类线粒体基因组与疾病

人类线粒体基因组与疾病 1、线粒体基因及基因组介绍人类线粒体DNA（mtDNA），共包含37个基因，这37个基因中有22个编码转移核糖核酸（tRNA）、2个编码核糖体核糖核酸（12S和16S rRNA)，13个编码多肽。 2、线粒体基因及基因组分析的现状和临床意义对于可疑线粒体病的患者来说，理想的遗传学诊断方法是发现导致线粒体结构和功能缺陷的相关基因突变。这些基因突变可能在mtDNA上，也可能发生在核基因上，线粒体的遗传方式可能为常染色体隐形遗传、X-连锁遗传、母系遗传，有些还是新突变。由于线粒体病涉及基因众多，目前临床只能选择少数常见的线粒体基因位点进行突变和缺失筛查，阳性率很低，大多数患者难以获得准确的病因诊断。 3、线粒体基因及基因组分析测定（1）13个编码多肽的基因编码产物基因分析基因变异对应的常见线粒体病种类 NADH dehydrogenase (complex I)MT-ND1Leber遗传性视神经病 MT-ND2心肌线粒体病，Leber遗传性视神经病 MT-ND3进肌阵挛，癫痫，视神经萎缩MT-ND4 Leber遗传性视神经病，线粒体肌病，Leber遗传性视神经病，张力障碍 MT-

ND4L Leber遗传性视神经病 MT-ND5Leigh综合征，线粒体脑肌病伴乳酸中毒及中风样发作综合症 MT-ND6Leber遗传性视神经病，线粒体脑肌病伴乳酸中毒及中风样发作综合症，糖尿病，肌张力障碍 coenzyme Q-cytochrome c reductase/Cytochrome b(complex III)MT-Cytb 慢性游走性红斑，Leber遗传性视神经病，线粒体肌病，心肌线粒体病，线粒体脑肌病伴乳酸中毒及中风样发作综合症，帕金森病 cytochrome c oxidase(complex IV)MT- COX1 肌红蛋白尿运动神经元疾病，铁粒幼细胞贫血 MT- COX2 线粒体肌病，线粒体多系统疾病，线粒体脑肌病 MT- COX3 Leigh综合征，慢性游走性红斑，骨骼肌溶解症 ATP synthase MT- ATP6 共济失调并发色素性视网膜炎，母系遗传Leigh综合征，家族性双侧纹状体坏死 MT- ATP8 共济失调并发色素性视网膜炎，母系遗传Leigh综合征，家族性双侧纹状体坏死（2）22个编码tRNA的基因 Alanine MT-TA进行性眼外肌麻痹Arginine MT-TR

植物基因克隆技术的研究进展

植物基因克隆技术的研究进展随着科学技术的不断发展，人类基因组计划的不断实施，世界生命科技工作者对于植物基因克隆技术的研究不断进步，近年来，我国在基因克隆技术领域也有了长足的进步，在玉米，小麦，大豆，水稻，拟南芥等植物中，已经克隆了许许多多与植物的产量、品质、抗性及农艺性状等相关的基因。文章主要从基因芯片技术，功能克隆、定位克隆、同源序列克隆、PCR擴增技术分别介绍基因克隆技术的现状以及研究进展。标签：植物；基因克隆技术；研究植物基因克隆技术在生命科学技术中扮演着越来越重要的角色，而植物基因克隆技术从传统意义上来讲可分为两种不同的方式。正向以及反向的遗传学方式，正向遗传学途径是一种很早的经典的克隆方法，通过研究突变表型性状进行克隆，包括了功能以及表型克隆等较为基本的克隆的方式；反向遗传学途径和正向遗传学途径截然不同，它是通过一些特殊的方法，获得遗传基因片段，然后经过一系列的定位，将之后所研究的基因逆向研究。如定位克隆，同源序列克隆等。除了这两种克隆技术外，随着社会发展，也有一些新的克隆技术产生。 1 基因芯片技术基因芯片技术是电子克隆技术的典型代表，基因芯片又称DNA芯片、DNA 微阵列，是以预先设计的方式将大量的基因探针固定在玻片、硅片等固相载体上组成的密集分子阵列。基因芯片技术类似于计算机的电子芯片技术，其具有高通量、微型化、连续化、自动化、快速和准确等特点。是一种随着人类基因组计划的进行而发展出的产物，这一发展使得人类对越来越多的微生物和动植物基因组取得了更长远的认识，对其的研究，是全人类对于基因组认识做出的不断地努力的成果，其中不乏许多典型的实例，用cDNA芯片技术对草莓、矮牵牛其基因是如何进行表达的进行研究，进而实现对转基因植物进行形状的观察及控制，可以更好的获悉分子对于基因表达是如何作用以及影响的也有利于获得更为优异更为良好的作物[1]。基因芯片技术是一种新型的克隆技术，是科技创新和生命科学的很好的结合，代表着人类在基因的克隆方面进展和成就，解决了很多传统克隆不能解决的问题，也讲基因克隆技术引向一种新的思维模式。 2 功能克隆功能克隆是人类采用最早的基因克隆策略，功能克隆技术从已知蛋白质的功能着手进行研究，其方法原理是先测知基因的编码蛋白质，利用它的信使RNA 进行反转录成cRNA，再利用cDNA做探针，从基因组中获取基因本身，进而完成克隆。

原核生物基因表达与调控

第八章原核生物基因表达与调控一、教学目的和要求：掌握原核生物基因表达及调控机制二、教学重点：１、乳糖操纵子调控机制 2、半乳糖操纵子调控机制 3、色氨酸衰减子调控机制三、教学难点： 1、半乳糖操纵子调控机制 2、色氨酸衰减子调控机制四、教学方法：面授并辅以多媒体教学五、教学内容生物体的每个活细胞都含有相同的一整套基因。基因表达具有高度的时空专一化：如肌红蛋白基因（肌细胞）基因表达的调控：生物有机体对其基因表达的时空程序、表达速率等所进行的调节和控制。本底水平表达：调控处于关闭状态，只翻译极少量的蛋白质。第一节原核生物基因的转录和翻译原核生物的DNA：单个裸露的DNA 不编码占5% 转录和翻译同一时间，地点进行转录水平调控(主) ，兼有翻译水平调控 ?根据基因表达产物可划分：组成型蛋白：基因表达不受时期、部位、环境影响——组成型表达。 /适应型蛋白：基因表达受时期、部位、环境影响——非组成型表达。?一种生物的整套遗传密码可以比作一本密码字典,该种生物的每个细胞中都有这本字典。为什么基因只有在它应该发挥作用的细胞内和应该发挥作用的时间才能呈现活化状态? ?结论：必然有一个基因调控系统在发挥作用。 ?基因调控主要在三个水平上进行: ?①. DNA水平 ?②. 转录水平 ?③. 翻译水平 ?一、转录的起始转录是原核生物基因表达的主要调控点，主要涉及两个方面：1、RNA合成的酶系；2、RNA合成起始和终止信号，即DNA分子上的特定序列。通过RNA聚合酶、转录因子和启动子的相互作用实现转录调控，改变细胞的表型，从而实现细胞生理状态和环境的变化。

植物基因克隆实验指导

植物基因克隆实验规则一、植物基因克隆实验课的目标根据基因克隆实验操作的整体性和连贯性特点, 将该实验设计为综合性实验课程，实验内容设计上完全抛弃了原来分散的、孤立的单纯学习某一实验技术的缺陷, 将单个实验综合为系统的、连贯的系列型大实验，注重科研成果在教学中的应用，我们从以往的科研项目中选取了部分研究内容用于学生的综合性实验教学，这是基于教学实验与实际科学研究实验之间的新的实验教学模式。整套实验围绕洋甘菊倍半萜生物合成途径中关键酶基因HMGR的克隆这一研究课题进行操作, 设计的实验内容具有极强的连续性和综合性，让学生在独立实践操作中学习基因克隆的基本研究方法和体会科学研究的严密逻辑和培养科研理念。我们将实验内容设置为8个部分, 实验内容前后衔接紧密, 环环相扣, 不可分割, 前一个实验的结果是下一个实验的材料。该课程使学生获得了整个类似科研实践过程的训练和体验, 学习了从事科研工作的基本功, 对完成自己的毕业论文及将来从事生命科学研究奠定了科研基础。二、实验的进行程序和要求 1、预习学生在课前应认真预习实验指导以及教材有关章节，必须对该次实验的目的要求、实验内容、基本原理和操作方法有一定的了解。 2、讲解教师对该实验内容的安排及注意事项进行讲解，让学生有充分的时间按实验指导的要求进行独立操作与观察。 3、独立操作与观察除个别实验分组进行外，一般由学生个人独立进行操作和观察。在实验中要按实验指导认真操作，仔细观察，作好记录。有关基本技能的训练，要按操作程序反复练习，以达到一定的熟练程度。

4、演示每次的实验都备有演示内容，其目的是帮助学生了解某些实验中的难点，扩大在实验课有限时间内获得更多感性知识的机会。 5、作业实验报告参照硕士毕业论文的格式写，必须强调科学性，实事求是地记录、分析、综合。在实验结束时呈交。 6、小结每次实验结束后，由师生共同小结本次实验的主要收获及今后应注意的问题。三、实验规则和注意事项 1、每次上课前，必须认真阅读实验指导，明确本次实验的目的要求、实验原理和注意事项，熟悉实验内容、方法和步骤。 2、上实验课时必须携带实验指导、记录本及文具等。进入实验室要按规定座位入座。 3、实验时要遵守纪律，听从教师指导，保持肃静。有问题时举手提问，严禁彼此谈笑喧或随意走动，也不得私自进行其他活动。 4、实验时要遵守实验操作规程，严格按照教师的安排和实验指导的要求进行。操作观察要认真仔细，边做、边看、边想，认真做好实验记录。 5、要爱护仪器和器材设备，注意节约实验材料、药品和水电。如有损坏器材应立即报告并主动登记、说明情况。 6、实验结束后，应清理实验台面，认真清理好仪器、药品及其他用品，放回原处，放好凳子，方可离开实验室。值日生要负责清扫地面，收拾实验用品，处理垃圾，关好水、电、门窗后再离开。

4植物基因克隆的策略与方法

4植物基因克隆的策略与方法基因的克隆确实是利用体外重组技术,将特定的基因和其它DNA顺序插入到载体分子中。基因克隆的要紧目标是识不、分离特异基因并获得基因的完整的全序列,确定染色体定位,阐明基因的生化功能,明确其对特定性状的遗传操纵关系。通过几十年的努力由于植物发育,生理生化,分子遗传等学科的迅速进展,使人们把握了大量有关植物优良性状基因的生物学和遗传学知识,再运用先进的酶学和生物学技术差不多克隆出了与植物抗病、抗虫、抗除草剂、抗逆,育性、高蛋白质及与植物发育有关的许多基因。我们实验室对天麻抗真菌蛋白基因作了功能克隆的研究(舒群芳等,1995;舒群芳等,19 97),为了克隆植物基因也探讨了其它克隆方法,本文论述基因克隆的策略、方法及取得的一些进展。 1功能克隆(functional Cloning) 功能克隆确实是按照性状的差不多生化特性这一功能信息,在鉴定和已知基因的功能后克隆(Collis,1995)。其具体作法是:在纯化相应的编码蛋白后构建cDNA文库或基因组文库,DNA文库中基因的选择按照情形要紧可用二种方法进行,(1)将纯化的蛋白质进行氨基酸测序,据此合成寡核苷酸探针从cDNA库或基因组文库中选择编码基因,(2)将相应的编码蛋白制成相应抗体探针,从cDNA入载体表达库中选择相应克隆。功能克隆是一种经典的基因克隆策略,专门多基因的分离利用这种策略。 Hain等从葡萄中克隆了两个编码白藜芦醇合成的二苯乙烯合成酶基因(Vst1和Vst2),葡萄中抗菌化合物白藜芦醇的存在,能够提升对灰质葡萄孢(B otrytis cinerce)的抗性,在烟草和其它一些植物中无二苯乙烯合成酶,因此克隆该基因通过转基因后,对有些植物产生对灰质葡萄孢的抗性专门有意义(H ain等,1985)。Kondo等1989年对编码水稻巯基蛋白酶抑制剂的基因组DN A做了克隆和序列分析(Kondo等,1989)。周兆斓等构建了水稻cDNA文库,分离了编码水稻巯基蛋白酶抑制剂的cDNA(周兆斓等,1996)。植物蛋白酶抑制剂是一类天然的抗虫物质,它可抑制摄食害虫对蛋白质的消化,使害虫因缺乏所需氨基酸而导致非正常发育或死亡。胡天华等人从烟草中分离出流行于我国的黄瓜花叶病毒(Cucumber Mosaic virus)(CMV),并克隆了编码该

敲基因小鼠鼠尾基因鉴定实验报告

碱法提取小鼠总DNA及基因鉴定：一、实验器材：加样枪（1ml、200ul、20ul、10ul）、枪头（大中小一套）、EP管（20ul、1.5ml、 10ml）、试管架、浮标、温度计、胶布、手套、记号笔、锥形瓶、称量匙、冰盒二、实验试剂：A液、B液、引物、mix、双蒸水、三蒸水、琼脂糖、TBE（5x、1x、回收液）、核苷酸染料、Marker 三、母液配置： 1.10M NaOH:NaOH 40g加双蒸水至90ml，待NaOH完全溶解冷却后定容至100ml 2.0.5M EDTA：EDTA.Na2盐18.61g, NaOH 1.5g, 加双蒸水至80ml,逐滴加入10M NaOH 至EDTA完全溶解后加双蒸水定容至100ml 3.1M TrisHCl（pH8.0）：Tris碱12.1g，加水至70ml，边搅拌边加入浓盐酸4ml，然后边逐滴加入1M HCl边测PH值，直至PH升至8.0（+\-0.05），定容至100ml（pH=8.8 的TrisHCl中边加入浓盐酸边测PH值至PH=8.0（+\-0.05）为止）四、实验步骤： 1.剪取鼠尾（约芝麻大小）储存于-20度冰箱（-20度冰箱，主要是防止DNA降解，4度不行） 2.提取DNA： 1)配置工作液——20ml体系液：50ul 10M NaOH 加双蒸水至20ml 8ul 0.5M EDTA B液：800ul 1M TrisHCl（pH8.0）加双蒸水至20ml 2)加150ulA液（液体应完全浸没标本），95度水浴锅煮1.5h（将EP管插入浮标中后用胶布缠好防止EP管在加热过程中爆开） 3)加150ulB液，混匀（上下颠倒3-5下） 4)12000r/min 4度离心5分钟（可储存于-20度冰箱） 3.PCR（冰上操作）：P1 0.5ul（P为AC3I，G为AAA） 1)配置PCR体系——15ul体系P2 0.5ul Mix 7.5ul 三蒸水4.5ul DNA 2ul 2)加2ul上述离心后的上清液至PCR体系，瞬离 3)PCR仪扩增，参数设定：预变性：94度——3min 变性：94度——30s 退火：55度——30s 30个循环延伸：72度——24s 72度——5min 4度——∞ 4.琼脂糖凝胶电泳： 1)制胶——2%琼脂糖凝胶配方：总体积（ml）20 30 40 50 60 120 琼脂糖（g）0.4 0.6 0.8 1 1.2 2.4 TBE 1x（ml）20 30 40 50 60 120 Tris-base 13.6g TBE 5x配方：硼酸 6.56g EDTA 0.73g

原核表达的详细步骤

原核表达详细步骤 PartⅠ选择表达的目的基因一、基因序列 1. 得到靶基因DNA（cDNA）序列，有几种方式寻找正确的读码顺序: ①利用生物信息学在NCBI上blast同源基因，找到同源蛋白，再在DNA的ORF中找到正确的读码。 ②实验方法，即得到蛋白，进行测序，然后在DNA上找到正确的读码。 ③利用mRNA的特征，找到启动子，编码区，终止子。在编码区中找到翻译起始密码子与终止密码子（cDNA）。 2. 注意事项： ①区别ORF和CDS→ORF一般在DNA上的定义，寻找原则是翻译起始密码子和终止密码子；CDS可以是DNA上的定义，也可以是mRNA上的定义，分为complete CDS 和partial CDS,是从第一个核酸开始读，连续读下去，complete CDS读码是“M、、、、、、、、、＊”，partial CDS的读码是相应的AA ②在进行试验设计时，充分利用生物信息学的信息后，在进行试验设计。二、抗原决定簇的预测 1、原理：蛋白质表面部分可以使免疫系统产生抗体的区域叫抗原决定簇。一般抗原决定簇是由6－12 氨基酸或碳水基团组成，它可以是由连续序列（蛋白质一级结构）组成或由不连续的蛋白质三维结构组成。变性蛋白只是天然蛋白伸直的了产物，用来免疫动物具有更强的抗原性。只是天然蛋白中被包在内部的抗原决定簇也会暴露出来，如果用该变性抗原制备的抗体来检测变性抗原是可以的，如果用来检测天然蛋白，可能会有假阳性。做单抗也可以，同样道理，筛选出的单抗可能对抗的抗原决定簇处于天然抗原的内部，是否能用还要看将来该单抗用来干什么。 2、选择原则：（1）、亲水性：大部分抗原决定簇是亲水性的。（2）、处于结构表面：大部分抗体只与蛋白质表面部分结合。（3）、有弹性：许多已知的抗原决定簇是在自由活动区域。所以一般来说蛋白质的N 端及C 端是很好的抗原决定簇区域。 3、选定抗原决定簇的步骤：（1）预测：如软件预测DNAstar（Protean）预测，Dnaman。在线网站预测（https://www.wendangku.net/doc/e012302355.html,/molbio/hla_bind/index.shtml and http://www.imtech.res.in/raghava/propred/algorithm.html）（2）选定：接近N、C端；选取在此区间内，（Antigenic Index）Jameson-wolf 抗原决定簇选正分高处；（Hydrophilicity plot）Kyte-Doolittle预测亲水性强的区域。同时符合以上3点的区域较好（命名为多肽片断A）。注：如果设计的多肽是跨膜蛋白，请尽量回避选择蛋白的跨膜区，即头端信号肽所在的区域（3）NCBI（BlastP）比对：将多肽片断A放入blastp进行同源性比对。如果制备某一动物种属的抗体，该区必须与该动物的氨基酸序列没有较高的同源性。注：这一步往往容易漏掉，所以学会应用生物信息学，可以减少走弯路！！！（4）抗原合成： ①原核表达：

课题-基因敲除小鼠的pcr鉴定

一、技术介绍与研究进展转基因、基因敲入/敲除动物技术已经成为现代生命科学基础研究和药物研发领域不可或缺的重要技术，该技术从上世纪七八十年代诞生以来，至今已有近四十年的历史，经典技术如DNA原核显微注射、胚胎干细胞显微注射技术一直以来经久不衰，在小鼠模型构建方面日趋完善，并且如同剪切酶和抗体等常规分子生物学试剂的制备技术一样，逐渐从基础研究实验室转向商业模式，成为一项高度标准化的新兴产业，催生了数以百计的创新药物和数以千计的优秀文章。尽管如此，传统技术仍然存在一些难以克服的缺陷，如步骤繁琐、周期漫长、成功率低、费用高昂等，而ZFN和TALEN 等新技术的出现，或有可能将这一局面彻底改变。二、同源重组技术原理基因敲除鼠技术是上世纪80年代中后期基于DNA同源重组的原理发展起来的，Capecchi和Smithies在1987年根据同源重组（homologous recombination）的原理，首次实现了ES的外源基因的定点整合（targeted integration），这一技术称为"基因打靶"（gene targeting）或"基因敲除"

（gene knockout），利用这种ES的显微注射就可以制作出基因敲出小鼠（KO Mice: knockout mice）;由于这一工作，Capecchi和Smithies于2007年与Evans分享了诺贝尔医学奖。同源重组（homologous recombination）定义：是指发生在姐妹染色单体（sister chromatin) 之间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合。在基因敲除小鼠制作过程中，需要针对目的基因两端特异性片段设计带有相同片段的重组载体，将重组载体导入到胚胎干细胞后外源的重组载体与胚胎干细胞中相同的片段会发生同源重组，如图1所示：图1.基因敲除鼠制作同源重组原理示意图三、制作流程

植物基因的克隆｜植物基因克隆的基本步骤

植物基因的克隆 08医用二班姚桂鹏0807508245 简介克隆（clone）是指一个细胞或一个生物个体无性繁殖所产生的后代群体。通常所说的基因克隆是指基于大肠埃希菌的DNA片段（或基因）的扩增，主要过程包括目标DNA的获取、重组载体的构建、受体细胞的转化以及重组细胞的筛选和繁殖等。本文主要介绍植物基因的特点、基因克隆的载体、基因克隆的工具酶、基因克隆的策略以及植物目的基因的分离克隆方法等内容。关键词植物基因基因克隆载体工具酶克隆策略分离克隆方法 Plant gene cloning Introduction Cloning (clone) refers to a cell or an individual organisms asexual reproduction produced offspring. Usually said cloning genes means

based on escherichia coli segment of DNA (or genes), including the main course target DNA, restructuring of the carrier, transformation of receptor cells and reorganization of screening and reproductive cells. This paper mainly introduces the characteristics of plant gene and gene cloning and carrier, gene clone tool enzyme, gene cloning and plant gene strategy of separation cloning method, etc. Keywords Plant gene cloning tool enzyme gene cloning vector method of separation of cloning strategy 一、植物基因的结构和功能基因（gene）是核酸分子中包含了遗传信息的遗传单位。一般来说，植物基因都可分为转录区和非转录的调控区两部分。（一）植物基因的启动子启动子（promoter）是指在位于结构基因上游决定基因转录起始的区域，植物积阴德启动子包括三个较重要的区域，一时转录起始位点，而是转录起始位点上游25~40bp的区域，三是转录起始位点上游-75bp处或更远些的区域。（二）植物基因的增强子序列

植物基因克隆

来自dxy 22003luocong 植物基因全长克隆几种方法的比较基因是遗传物质基本的功能单位，分离和克隆目的基因是研究基因结构、揭示基因功能及表达的基础，因此，克隆某个功能基因是生物工程及分子生物学研究的一个重点。经典克隆未知基因的方法比如通过筛选文库等有个共同的弊病, 即实验操作繁琐, 周期较长、工作量繁重,且不易得到全长序列。又由于在不同植物中目的基因mRNA丰度不同，所以获得目的基因的难易程度又不一样，特别是对于丰度比较低的目的基因即使使用不用的方法也不一定能获得成功。近年来随着PCR技术的快速发展和成熟.已经有多种方法可以获得基因的全长序列, 比如经典的RACE技术，染色体步移法和同源克隆法等，本文主要综述几种重要的克隆方法的原理和运用，并且比较分析这几种方法的优缺点，为你的实验节约时间和成本。 1 RACE技术 1985年由美国PE-Cetus公司的科学家Mulis等[1]发明的PCR技术使生命科学得到了飞跃性的发展。1988年Frohman等[2] 在PCR技术的基础上发明了一项新技术, 即cDNA末端快速扩增技术( rapid amplification of cDNA ends, RACE), 其实质是长距PCR( long distance, PCR)。通过PCR由已知的部分cDNA 序列, 获得5′端和3′端完整的cDNA, 该方法也被称为锚定PCR ( anchored PCR) [3] 和单边PCR( one-sidePCR) [4]。RACE技术又分为3?RACE和5?端RACE。3′RACE 的原理是利用mRNA 的3′端天然的poly(A) 尾巴作为一个引物结合位点进行PCR, 以Oligo( dT) 和一个接头组成的接头引物( adaptor primer, AP)反转录mRNA得到加接头的第一链cDNA。然后用一个正向的基因特异性引物( gene-specific primer, GSP) 和一个含有接头序列的引物分别与已知序列区和poly(A) 尾区退火, 经PCR扩增位于已知序列区域和poly( A) 尾区之间的未知序列，若为了防止非特异性条带的产生, 可采用巢式引物( nested primer) 进行第二轮扩增, 即巢式PCR( nested PCR) [5，6]。5?RACE 跟3?RACE原理基本一样，但是相对于3?RACE来说难度较大。 5'-RACE受到诸多因素的影响而常常不能获取全长，因此研究者都着手改进它。这些措施主要是通过逆转录酶、5'接头引物等的改变来实现的，因此出现了包括基于“模板跳转反转录”的SMART RACE技术( switching mechanism at 5′ end of RNA transcript) [7] , 基于5′脱帽和RNA酶连接技术的RLM-RACE技术(RNA ligase mediated RACE)[8], 利用RNA连接酶为cDNA第一链接上寡聚核苷酸接头的SLC RACE技术(single strand ligation to single-stranded cDNA)[9] , 以及以内部环化的cDNA第一链为模板进行扩增的自连接或环化RACE技术(self-ligation RACE or circular RACE)[10]，和通过末端脱氧核苷酸转移酶( TdT)加尾后引入锚定引物的锚定RACE技术( anchored RACE)[11]。笔者主要介绍两种比较新的RACE技术，基于…模板跳转?的SMART RACE 技术和末端脱氧核苷酸转移酶( TdT)加尾技术。 1.1基于‘模板跳转’的SMART RACE技术[7，12]

基因敲除小鼠的PCR鉴定

基因敲除小鼠的PCR鉴定一、实验目的：通过PCR扩增程序及琼脂糖凝胶电泳方法鉴定凝血因子IX基因敲除小鼠的基因型。二、实验原理：真核生物的一切有核细胞（包括培养细胞）都能用来制备基因DNA。真核生物的DNA是以染色体的形式存在于细胞核内，因此，制备DNA的原则是既要将DNA与蛋白质、脂类和糖类等分离，又要保持DNA分子的完整。提取DNA的一般过程是将分散好的组织细胞在含SDS（十二烷基硫酸钠）和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白质，再用酚和氯仿/异戊醇抽提分离蛋白质，得到的DNA溶液经乙醇沉淀使DNA从溶液中析出。 1.PCR原理： PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成： 1) 模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备； 2) 模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合； 3) 引物的延伸：DNA模板-引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍 2.琼脂糖凝胶电泳原理：在pH8.0~8.3的缓冲液中，核酸分子带负电荷，向正极移动。由于不同大小和构象的核酸分子电荷密度大致相同，因此在自由泳动时，各种核酸分子的迁移率相似，无法分开。然而，在浓度适当的凝胶中，由于分子筛效应，使大小和构象不同的核酸迁移率出现差异，从而把它们分开。核酸在凝胶中的迁移率取决于其分子大小、高级结构、胶浓度和电场强度，与分子的碱基组成及电泳温度（4~30℃之间）无明显关系。一般说，同样构象的分子迁移率与分子量对数及胶浓度成反比，与电场强度（小于5V/cm）成正比。三、实验操作 1.获取鼠尾组织剪鼠尾0.5cm置于试管中，加入500ul裂解液和10ul蛋白酶K(20mg/ml)，55℃水浴过夜，至鼠尾溶解 2.提取基因组DNA 1) 试管中加入300ul饱和NaCl，充分混匀，12500rpm 离心20min

11个石蛃样本的线粒体基因组研究

11个石蛃样本的线粒体基因组研究石炳目在昆虫纲的系统发生关系分析中处于基部,是最早分支出来的原始类群,是一种不被人们熟知的无翅类昆虫。目前,关于石蛃目的系统发生地位及单系性已经得到普遍证实,但是关于石蛃目昆虫内部各科、各亚科、各属之间的系统发生关系及系统地理研究一直存在着争议,有待更多的分子数据对其进行深入的研究。因此本研究是在本实验室原有研究的基础上通过增加石蛃目昆虫样本数量,对其内部系统发生关系进行更深入地研究并对中国石蛃目昆虫的扩散机制进行初步探讨。本研究包括石蛃目昆虫中的2亚科4属的11个样本,分别是:石蛃亚科(Machilinae)中的辽宁弓长岭的高丽韩蛃Coreamachiliscoreanus、山西衡山的高丽韩蛃 Coreamachiliscoreanu、新疆喀纳斯异蛃 Allopsontus(Allopsontinus)kanasiensis、新疆新源异蛃 Allopsontus(Allopsontinus)xinyuanensis、新疆玛纳斯希蛃Silvestrichilis manasiensis;新蛃亚科(Petrobiinae)中的河北承德的希氏跳蛃Pedetontus silvstri、辽宁凤城的希氏跳蛃Pedetontussilvestri、太姥山跳蛃Pedetontustaimushanensis、霸王岭跳蛃Pedetontusbawanglingensis、大陈岛跳蛃Pedetontus dachendaoensis、重庆跳蛃Pedetontus chongqingensis。 11个石蛃样本的线粒体基因组信息全部成功获得,其基因组的长度分别是:高丽韩蛃(弓长岭)Coreamachilis coreanus 15579 bp、高丽韩蛃(衡山)Coreamachilis coreanus 15574 bp、喀纳斯异蛃 Allopsontus(Allopsontinus)kanasiensis 15628 bp、新源异蛃 Allopsontus(Allopsontinus)xinyuanensis 15518 bp、玛纳斯希蛃

原核生物基因表达调控概述

原核生物基因表达调控概述基因表达调控是生物体内基因表达调节控制机制，使细胞中基因表达的过程在时间，空间上处于有序状态，并对环境条件的变化做出适当的反应复杂过程。 1.基因表达调控意义在生命活动中并不是所有的基因都同时表达，代谢过程中所需各种酶和蛋白质基因以及构成细胞化学成分的各种编码基因，正常情况下是经常表达的，而与生物发育过程有关的基因则需在特定的时空才表达，还有许多基因被暂时的或永久的关闭而不来表达。 2.原核基因表达调控特点原核生物基因表达调控存在于转录和翻译的起始、延伸和终止的每一步骤中。这种调控多以操纵子为单位进行，将功能相关的基因组织在一起，同时开启或关闭基因表达即经济又有效，保证其生命活动的需要。调控主要发生在转录水平，有正、负调控两种机制在转录水平上对基因表达的调控决定于DNA的结构，RNA 聚合酶的功能、蛋白质因子及其他小分子配基的相互作用。细菌的转录和翻译过程几乎在同一时间内相互偶联。细胞要控制各种蛋白质在不同时期的表达水平，有两条途径：（1）细胞控制从其DNA模板上转录其特异的mRNA的速度，这是一条经济的途径，可减少从mRNA合成蛋白质的小分子物质消耗，这是生物长期进化过程中自然选择的结果，这种控制称为转录水平调控。（2）在mRNA合成后，控制从mRNA翻译肽链速度，包括一些与翻译有关的酶及其复合体分子缔合的装配速度等过程。这种蛋白质合成及其基因表达的控制称为翻译水平的调控。二.原核生物表达调控的概念（1）细菌细胞对营养的适应

细菌必须能够广泛适应变化的环境条件。这些条件包括营养、水分、溶液浓度、温度，pH等。而这些条件须通过细胞内的各种生化反应途径，为细胞生长的繁荣提供能量和构建细胞组分所需的小分子化合物。（2）顺式作用元件和反式作用元件基因活性的调节主要通过反式作用因子与顺式作用元件的相互作用而实现。反式作用因子的编码基因与其识别或结合的靶核苷酸序列在同一个DNA分子上。RNA聚合酶是典型的反式作用因子。顺式作用元件是指对基因表达有调节活性的DNA序列，其活性只影响与其自身同处于一个DNA分子上的基因；这种基因DNA序列通常不编码蛋白质，多位于基因旁侧或内含子中。位于转录单位开始和结束位置上启动子和终止子，都是典型的顺式作用元件。（3）结构基因和调节基因结构基因是编码蛋白或RNA基因。细菌的结构基因一般成簇排列，多个结构基因受单一启动子共同控制，使整套基因或者都不表达。结构基因编码大量功能各异的蛋白质，其中有组成细胞核组织器官基本成分的结构蛋白，有催化活性的酶和各种调节蛋白等。调节基因是编码合成那些参与基因表达调控的RNA和蛋白质的特异性DNA序列。调节基因编码的调节物通过与DNA上的特定位点结合控制转录是调控关键。（4）操纵基因和阻遏蛋白操纵基因是操纵子中的控制基因，在操纵子上一般与启动子相邻，通常处于开放状态，使RNA聚合酶能够通过并作用于启动子启动转录，阻遏蛋白是负调控系统中由调节基因编码的调节蛋白，它本身或与辅阻遏蛋白物一起合成于操纵基因，阻遏蛋白操纵因子结构基因的转变，阻遏蛋白可被诱导物变构失活，从而导致不可阻遏或去阻遏。

植物基因克隆的策略与方法

植物基因克隆的策略与方法基因的克隆就是利用体外重组技术,将特定的基因和其它DNA顺序插入到载体分子中。基因克隆的主要目标是识别、分离特异基因并获得基因的完整的全序列,确定染色体定位,阐明基因的生化功能,明确其对特定性状的遗传控制关系。通过几十年的努力由于植物发育,生理生化,分子遗传等学科的迅速发展,使人们掌握了大量有关植物优良性状基因的生物学和遗传学知识,再运用先进的酶学和生物学技术已经克隆出了与植物抗病、抗虫、抗除草剂、抗逆,育性、高蛋白质及与植物发育有关的许多基因。我们实验室对天麻抗真菌蛋白基因作了功能克隆的研究(舒群芳等,1995;舒群芳等,1997),为了克隆植物基因也探讨了其它克隆方法,本文论述基因克隆的策略、方法及取得的一些进展。 1 功能克隆(functional Cloning) 功能克隆就是根据性状的基本生化特性这一功能信息,在鉴定和已知基因的功能后克隆(Collis,1995)。其具体作法是:在纯化相应的编码蛋白后构建cDNA文库或基因组文库,DNA文库中基因的筛选根据情况主要可用二种办法进行,(1)将纯化的蛋白质进行氨基酸测序,据此合成寡核苷酸探针从cDNA库或基因组文库中筛选编码基因,(2)将相应的编码蛋白制成相应抗体探针,从cDNA入载体表达库中筛选相应克隆。功能克隆是一种经典的基因克隆策略,很多基因的分离利用这种策略。 Hain等从葡萄中克隆了两个编码白藜芦醇合成的二苯乙烯合成酶基因(Vst1和Vst2),葡萄中抗菌化合物白藜芦醇的存在,可以提高对灰质葡萄孢(Botrytis cinerce)的抗性,在烟草和其它一些植物中无二苯乙烯合成酶,因此

课题_基因敲除小鼠的pcr鉴定

利用这种ES的显微注射就可以制作出基因敲出小鼠（KO Mice: knockout mice）;由于这一工作，Capecchi和Smithies于2007年与Evans分享了诺贝尔医学奖。同源重组（homologous recombination）定义：是指发生在姐妹染色单体（sister chromatin) 之间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合。在基因敲除小鼠制作过程中，需要针对目的基因两端特异性片段设计带有相同片段的重组载体，将重组载体导入到胚胎干细胞后外源的重组载体与胚胎干细胞中相同的片段会发生同源重组，如图1所示：图1.基因敲除鼠制作同源重组原理示意图三、制作流程

植物基因克隆技术及其发展方向

植物基因克隆技术及其发展方向摘要：基因是染色体上具有一定座位的遗传单位，是DNA分子中一定长度的核苷酸序列。植物的生长发育是在多种代谢和生理过程基础上所发生的基因在时空上表达的综合现象，开发和分离潜在的各种有价值的基因并深入研究其表达机理，对作物品种的改良具有重要意义。因此对植物基因的克隆并发展与之相关的技术已引起人们的日益关注和投入，近年来其研究方法不断改进，新技术不断涌现，这为进一步研究诸如各种调节植物生长发育的基因、逆境与防御反应的基因、植物细胞凋亡的基因等提供了新的途径。关键词：植物基因克隆基因植物基因转化正文: 植物基因的克隆技术是生命科学研究的重要组成部分,是现代生命科学技术中最核心的内容,它是随着20世纪70年代初DNA体外重组技术的发明而发展起来的,其目标是识别和分离特异基因并获得基因完整序列,确定其在染色体上的位置,阐明其生化功能,并利用生物工程手段应用到生产实践中。一、常用的目的基因克隆技术 1、1、通过已知基因产物的分析和鉴定这类技术主要通过生物化学和病理学研究分离鉴定有关基因的蛋白产物，并对蛋白质氨基酸顺序进行分析，推断出编码该蛋白质的基因序列，然后通过抗体、寡聚核苷酸探针或PCR制备的探针对文库进行筛选来分离目的基因。如植物抗病虫基因工程中常用的苏云金杆菌杀虫晶体蛋白基因（Bt基因）、豇豆胰蛋白酶抑制基因（CpTI 基因）、病毒外壳蛋白基因（CP基因）等。当其他植物的同类基因已分离到并且核苷酸序列保守性较高时，也可直接用这些已知的基因片段作探针对未克隆到该基因的植物基因文库进行筛选，也可分离到未知的新基因。 2、通过遗传表型分析（1）基因标鉴法。该法是利用转座子或T-DNA插入植物的基因组中引起某一基因失活产生一些突变体，然后用相应转座子或T-DNA 对突变体文库进行筛选，以选到的阳性克隆片段为探针，再筛选野生型植物因文库分离目的基因。如将一株带有功能的转位因子系统的植物与另一株在遗传上有差异的同种植物杂交，在杂交后代中筛选由于转位因子插入到某一特定基因序列中导致表型破坏或改变的突变株，用该纯合突变株构建基因文库，然后将转位因子用同位素标记作探针，从该文库中筛选出带有同源转位因子的目的基因。该法主要限于

PCR方法在ApoE基因敲除小鼠基因型鉴定中的应用

PCR方法在ApoE基因敲除小鼠基因型鉴定中的应用摘要目的为ApoE基因敲除鼠探索快速、简单的基因型PCR检测方法。方法设计两对引物扩增野生型ApoE基因和ApoE缺陷突变基因的DNA片段，用PCR仪梯度方案测试最佳退火温度，然后用PCR鉴定方案检测小鼠基因型并将所得基因型结果与已经过经典的Southern blot方法检测得到的基因型结果比较。结果野生型仅在155 bp处有一条条带，突变纯舍子仅在245 bp处有一条条带，杂合子则在155和245bp处出现两条条带。用PCR方法获得的ApoE基因分析结果与经典的Southern blot方法获得的结果完全一致。结论用PCR方法分析ApoE基因敲除鼠的基因型具有快速、简单、廉价和适用的特点。关键词聚合酶链反应基因型基因打靶载脂蛋白E Genotype identification of ApoE Gene Knockout Mice with Polymerase Chain Reaction Objective This study was to explore a simple and quick polymerase chain reaction（PCR）method for genotyping of ApoE knockout mice.Method Two pairs of primers were designed to amplify genomic DNA fragment of wild-type ApoE gene and the same region on ApoE targeting veceor respectively.A gradient PCR strategy was used to test the best annealing temperature. Results A 155bp band was found in wild-type ApoE mice,a 245 bp band in homozygous mutated ApoE mice and both bands in hetemzygous mice.The genotyping results were completely coincided with those from typical Southern blot. Conclusion PCR is a simple,fast and practical method for the genotyping of ApoE gene knockout mice. Key words Poiymerase Chain Reaction genotype gene targeting ApoE 载脂蛋白(apolipoprotein，ApoE)是清除乳糜微粒和极低密度脂蛋白的受体的配体，因此，缺乏ApoE则会导致血液循环中富含胆同醇的物质积累而更加容易引起动脉粥样硬化