细胞生物学实验指导书样本
实验一普通光学显微镜的结构及其使用
一、实验目的
1、了解普通光学显微镜的工作原理, 掌握光学显微镜的使用方法。
2、熟悉光学显微镜细胞的形态与结构。
二、实验用品
普通光学显微镜、生物制片标本、擦镜纸。
三、实验原理和方法
1、普通光学显微镜的构造
从构造上, 主要分三部分:
①光学放大系统, 为两组玻璃透镜: 目镜和物镜;
②照明系统: 光源、折光镜和聚光镜, 有时另加各种滤光片以控制光的波长范围;
③机械和支架系统: 主要保证光学系统的准确配制和灵活调控。
显微镜的质量主要取决于物镜, 物镜是显微镜最主要的光学部件。物镜的种类很多。
2、显微镜的能力
显微镜的能力是质量和性能的标志。能力包括分辨率、放大率、焦点深度和视场宽度等, 其中最重要的是分辨率。
物镜分辨力是指分辨被检样品微细结构的能力。一般以能清晰地分辨两个物体点的最短距离来表示。其公式如下: R=0.61λ/N.A.
R: 分辨率( 两点的最短距离)
λ: 照明光线波长
N.A.: 物镜数值孔径
分辨率以分辨两个点的最短距离表示, R值愈小, 分辨能力愈大。物镜的分辨率与照明光线的波长成反比, 与物镜的数值孔径成正比。
3、显微镜的使用
①聚光器的调节
②光阑的调节
③工作距离
④油镜的使用
4、观察标本
注意观察下列结构:
①细胞核及核仁: 不同细胞的核及核仁――蚕豆根尖切片、兔肝切片( Unna试
剂染色) 多核及多核仁现象――蛙卵切片、肌肉切片
染色体――蚕豆根尖切片、玉米花粉母细胞切片( Giemsa,地衣
红或洋红染色) 。
②中心体: 蝗虫精巢切片( 巴西木素染色) 。
③线粒体: 蚕豆根尖切片、兔肝切片。
④高尔基体: 兔肝切片、蚕豆根尖切片( 硝酸银或四氧化锇染色) 。
四、实验结果
简述显微镜的主要结构和操作要领; 绘制细胞显微结构图。
实验二线粒体和液泡系的超活染色与观察
一、实验目的
1、观察植物活细胞内线粒体、液泡系的形态、数量与分布。
2、学习一些细胞器的超活染色技术。
二、实验原理
活体染色是指对生活有机体的细胞或组织能着色但又无毒害的一种染色方法。它的目的是显示生活细胞内的某些结构, 而不影响细胞的生命活动和产生任何物理、化学变化以致引起细胞的死亡。活染技术可用来研究生活状态下的细胞形态结构和生理、病理状态。
詹纳斯绿B和中性红两种碱性染料是活体染色剂中最重要的染料, 对于线粒体和液泡系的染色各有专一性。
三、实验用品
1、器材
显微镜、恒温水浴锅、镊子、双面刀片、载玻片、盖玻片、吸管、吸水纸
2、试剂
①Ringer溶液
氯化钠 0.85g
氯化钾 0.25g
氯化钙 0.03g
蒸馏水 100ml
②1％、 1／3000中性红溶液
称取0.5g中性红溶于50ml Ringer溶液, 稍加热( 30～40℃) 使之很快溶解, 用滤纸过滤, 装入棕色瓶于暗处保存, 否则易氧化沉淀, 失去染色能力。
临用前, 取已配制的1％中性红溶液1ml, 加入29mlRinger溶液混匀, 装入棕色瓶备用。
③1％、 1／5000詹纳斯绿B溶液
称取50mg詹纳斯绿B溶于5ml Ringer溶液中, 稍加热( 30～40℃) 使之溶解, 用滤纸过滤后, 即为1％原液。取1％原液1ml加入49mlRinger溶液, 即为1／5000工作液,装入瓶中备用。最好现用现配, 以保持它的充分氧化能力。
3、材料
洋葱鳞茎内表皮细胞、黄豆幼根根尖。
四、实验方法
1、洋葱鳞茎内表皮细胞线粒体的超活染色观察
线粒体是细胞进行呼吸作用的场所, 其形态和数量随不同物种、不同组织
器官和不同的生理状态而发生变化。
詹纳斯绿B是毒性较小的碱性染料, 可专一性地对线粒体进行超活染色, 这是由于线粒体内的细胞色素氧化酶系的作用, 使染料始终保持氧化状态( 即有色状态) , 显蓝绿色; 而线粒体周围的细胞质中, 这些染料被还原为无色的色基( 即无色状态) 。
①用吸管吸取1／5000詹纳斯绿B染液, 滴一滴于干净的载玻片上, 然后撕取一小块洋葱鳞茎内表皮, 置于染液中, 染色10～15分钟。
②用吸管系去染液, 加一滴Ringer液, 注意使内表皮组织展平, 盖上盖玻片进行观察。
③在高倍镜下可见洋葱表皮细胞中央被一大液泡所占据, 细胞核被挤至一侧贴细胞壁处。仔细观察细胞质中线粒体的形态与分布。
2、黄豆根尖细胞液泡系的中性红超活染色与观察
中性红为弱碱性染料, 对液泡系( 即高尔基体) 的染色有专一性, 只将活细胞中的液泡系染成红色, 细胞核与细胞质完全不着色, 这可能是与液泡中某些蛋白质有关。
①实验前, 把黄豆培养在培养皿内潮湿的滤上, 使其发芽, 胚根伸长到
1cm以上。
②用双面刀片把初生的黄豆幼苗根尖( 约1～2cm长) 小心切一纵切面, 放入载玻片上的1／3000中性红染液滴中, 染色5～10分钟。
③吸去染液, 滴一滴Ringer液, 盖上盖玻片, 并用镊子轻轻地压盖玻片, 使根尖压扁, 利于观察。
④在高倍镜下, 先观察根尖部分的生长点的细胞, 可见细胞质中散在很多大小不等的染成玫瑰红色的圆形小泡, 这是初生的幼小液泡。然后, 由生长点向伸长区观察, 在一些已分化长大的细胞内, 液泡染色较浅, 体积较大, 数目变少。在成熟区细胞中, 一般只有一个淡红色的巨大液泡, 占据细胞的绝大部分,
将细胞挤到细胞一侧贴近细胞壁处。
五、实验结果
实验三植物细胞骨架的光学显微镜观察
一、实验目的
观察植物细胞骨架的形态。
二、实验原理
当用适当浓度的TritonX—100处理时, 可将细胞蛋白质破坏, 但细胞骨架系统的蛋白质却被保存, 后者用考马斯亮蓝R250染色, 可在光学显微镜下观察到细胞骨架的网状结构。
二、实验用品
1、材料
洋葱鳞茎
2、器材
显微镜, 50ml烧杯, 玻璃滴管, 容量瓶, 试剂瓶, 载玻片, 盖玻片, 镊子
三、试剂
1、 M—缓冲液: 50m mol/L咪唑、 50m mol/L KCl、 0.5m mol/L MgCl
2、 1m mol/L EGTA[乙二醇双( α-氨基乙基) 醚四乙酸]、 0.1m mol/L EDTA、 1m mol/L巯基乙醇或DTT( 二硫苏糖醇) 。
2、 6m mol/L pH6.8磷酸缓冲液( 用NaHCO3调pH) 。
3、 1﹪Triton－X100, 用M－缓冲液配制。
4、 0.2﹪考马斯亮蓝R250, 其溶剂是: 甲醇46.5ml、冰醋酸7ml、蒸馏水46.5ml。
5、 3﹪戊二醛, 用2液配制。
四、实验方法
1、撕取洋葱鳞茎内的表皮细胞( 约1c㎡大小若干片) 置于装有pH6.8磷酸缓冲液的50 ml烧杯中, 使其下沉。
2、吸去磷酸缓冲液, 用1﹪Triton－X100处理20～30分钟。
3、吸去1﹪Triton－X100, 用M－缓冲液洗三次, , 每次10分钟。
4、 3﹪戊二醛固定0.5～1小时。
5、 pH6.8磷酸缓冲液洗三次, 每次10分钟。
6、 0.2﹪考马斯亮蓝R250染色20～30分钟。
7、用蒸馏水洗1～2次, 细胞置于载玻片上, 加盖玻片, 于普通光学显微镜下观察。
五、实验结果
实验四叶绿体的分离与荧光观察