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蛋白酶活力测定法

蛋白酶活力测定法
蛋白酶活力测定法

蛋白酶活力测定法

中华人民共和国专业标准

蛋白酶活力测定法SB/T 10317-1999

Measurement of proteinase activity

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本方法适用于酿造酱油时在制品菌种、成曲的蛋白酶活力测定。

1 福林法

1.1 试剂及溶液: 以下试剂都为分析纯

1.1.1 福林试剂(Folin试剂):于2000mL磨口回流装置内,加入钨酸钠(Na2WO4·2H2O) 100g,钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)25g,蒸馏水700mL,85%磷酸50mL,浓盐酸100mL,文火回流10h。

取去冷凝器,加入硫酸锂(Li2SO4)50g,蒸馏水50mL,混匀,加入几滴液体溴,再煮沸

15min,

以驱逐残溴及除去颜色,溶液应呈黄色而非绿色。若溶液仍有绿色,需要再加几滴溴液,再煮沸除去之。冷却后,定容至1000mL,用细菌漏斗(No4~5)过滤,置于棕色瓶中保存。此溶

液使用时加2倍蒸馏水稀释。即成已稀释的福林试剂。

1.1.2 0.4mol碳酸钠溶液: 称取无水碳酸钠(Na2CO3)4

2.4g,定容至1000mL。

1.1.3 0.4mol三氯乙酸(T C A)溶液: 称取三氯乙酸(CCL3COOH)65.4g,定容至

1000mL。

1.1.4 pH7.2磷酸盐缓冲液:称取磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H2O)31.2g,定容至1000mL,

成0.2mol溶液(A液)。称取磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)71.63g,定容至1000mL,即成

0.2mol溶液(B液)。

取A 液28mL 和B 液72mL,再用蒸馏水稀释1倍,即成0.1mol pH7.2的磷酸盐缓冲液。

1.1.5 2%酪蛋白溶液:准确称取干酪素2g,称准至0.002g,加入0.1N氢氧化钠10mL,在水浴中加热使溶解(必要时用小火加热煮沸),然后用pH7.2磷酸盐缓冲液定容至100mL 即

成。配制后应及时使用或放入冰箱内保存,否则极易繁殖细菌,引起变质。

1.1.6 100μg/mL酪氨酸溶液:精确称取在105℃烘箱中烘至恒重的酪氨酸0.1000g,逐步加入6mL 1N盐酸使溶解,用0.2N盐酸定容至100mL,其浓度为1000μg/mL,再吸取此液10

mL,以0.2N盐酸定容至100mL,即配成100μg/mL的酪氨酸溶液。此溶液配成后也应及时使

用或放入冰箱内保存,以免繁殖细菌而变质。

1.2 仪器

a. 分析天平: 感量0.1mg;

b. 581-G型光电比色计或72型分光光度计;

c. 水浴锅;

d. 1、2、5、10mL移液管等。

1.3 操作

1.3.1 标准曲线的绘制

1.3.1.1 按下表配制各种不同浓度的酪氨酸溶液(表1)。

表1 配制各种不同浓度的酪氨酸溶液

━━━━━━━━━━━┳━━━━━━━━━━━━━━━━━━

┃管号

试剂┣━━┳━━┳━━┳━━┳━━┳━━━

┃1 ┃2 ┃3 ┃4 ┃5 ┃6

━━━━━━━━━━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━━

蒸馏水,mL ┃10 ┃8 ┃6 ┃4 ┃2 ┃0

100μg/mL酪氨酸,mL ┃0 ┃2 ┃4 ┃6 ┃8 ┃10

酪氨酸最终浓度,μg/ml ┃0 ┃20 ┃40 ┃60 ┃80 ┃100

━━━━━━━━━━━┻━━┻━━┻━━┻━━┻━━┻━━━

1.3.1.2 测定步骤:取6支试管编号按表1分别吸取不同浓度酪氨酸1mL,各加入0.4mol 碳酸钠5mL,再各加入已稀释的福林试剂1mL。摇匀置于水浴锅中。40℃保温发色

20min在

581-G型光电比色计上分别测定光密度(OD) (滤色片用65**#)或用72型分光光度计进行

测定(波长660nm)。一般测三次,取平均值。将1~6号管所测得的光密度(OD)减去1号管(

蒸馏水空白试验)所测得的光密度为净OD数。

为了清楚起见。再列出表格如下(表2)。

表2

━━━━━━━━━━━━━━━┳━━━━━━━━━━━━━━━━━━

┃管号

试剂┣━━┳━━┳━━┳━━┳━━┳━━━

┃1 ┃2 ┃3 ┃4 ┃5 ┃6

━━━━━━━━━━━━━━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━━

按表1制备的不同浓度酪氨酸,mL┃1 ┃1 ┃1 ┃1 ┃1 ┃1

━━━━━━━━━━━━━━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━━

0.4mol/L Na2CO3,mL ┃5 ┃5 ┃5 ┃5 ┃5 ┃5

━━━━━━━━━━━━━━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━━

福林试剂,mL ┃1 ┃1 ┃1 ┃1 ┃1 ┃1

━━━━━━━━━━┳━━━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━━

┃1 ┃┃┃┃┃┃

┣━━━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━━

┃2 ┃┃┃┃┃┃

O D值┣━━━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━━

┃3 ┃┃┃┃┃┃

┣━━━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━━

┃平均┃┃┃┃┃┃

━━━━━━━━━━┻━━━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━━

净O D值┃0 ┃┃┃┃┃

━━━━━━━━━━━━━━━┻━━┻━━┻━━┻━━┻━━┻━━━

以净O D值为横坐标,酪氨酸的浓度为纵坐标,绘制成标准曲线(或可求出每度OD所相

当的酪氨酸量K)。

1.3.2 样品稀释液的制备。

1.3.

2.1 测定酶制剂: 称取酶粉0.100g,加入pH7.2磷酸盐缓冲液定容至100mL,吸取此液5mL,再用缓冲液稀释至25mL,即成5000倍的酶粉稀释液。

1.3.

2.2 测定成曲酶: 称取充分研细的成曲5g,加水至100mL,在40℃水浴内间断搅拌1h,过滤,滤液用0.1mol pH 7.2磷酸盐缓冲液稀释到一定倍数(估计酶活力而定)。1.

3.3 样品测定: 取15×100mm试管3支,编号1、2、3(做2只也可),每管内加入样品稀释液1mL,置于40℃水浴中预热2min,再各加入经同样预热的酪蛋白1mL,精确保温10min,

时间到后,立即再各加入0.4mol三氯乙酸2mL,以终止反应,继续置于水浴中保温20min,使

残余蛋白质沉淀后离心或过滤,然后另取15×150mm试管3支,编号1、2、3,每管内加入滤

液1mL,再加0.4mol碳酸钠5mL,已稀释的福林试剂1mL,摇匀,40℃保温发色20min 后进行光

密度(OD)测定。

空白试验也取试管3支,编号(1)、(2)、(3),测定方法同上,唯在加酪蛋白之前先加

0.4mol三氯乙酸2mL,使酶失活,再加入酪蛋白。

为了清楚起见,分别列出表格于下(见表3及表4)。

表3

━━━━━━━━━━┳━━━━━┳━━━━━━━━━━┳━━━━━━━━

┃管号┃试剂┃管号

试剂┣━┳━┳━┫┣━━┳━━┳━━

┃1 ┃2 ┃3 ┃┃(1) ┃(2) ┃(3)

━━━━━━━━━━╋━╋━╋━╋━━━━━━━━━━╋━━╋━━╋━━

预热酶液, mL ┃1 ┃1 ┃1 ┃预热酶液, mL ┃1 ┃1 ┃1

━━━━━━━━━━╋━╋━╋━╋━━━━━━━━━━╋━━╋━━╋━━

预热2%酪蛋白, mL ┃1 ┃1 ┃1 ┃0.4mol三氯乙酸, mL ┃2 ┃2 ┃2 ━━━━━━━━━━┻━┻━┻━╋━━━━━━━━━━╋━━╋━━┻━━

作用10min (精确计时) ┃作用10min (精确计时)┃┃

━━━━━━━━━━┳━┳━┳━╋━━━━━━━━━━╋━━╋━━┳━━

0.4mol三氯乙酸, mL ┃2 ┃2 ┃2 ┃预热2%酪蛋白, mL ┃1 ┃1 ┃1 ━━━━━━━━━━┻━┻━┻━┻━━━━━━━━━━┻━━┻━━┻━━

表4

━━━━━━━━━━┳━━━━━━━━━━━━━━━━

┃管号

试剂┣━┳━┳━━┳━━┳━━┳━━━

┃1 ┃2┃3 ┃(1) ┃(2) ┃(3)

━━━━━━━━━━╋━╋━╋━━╋━━╋━━╋━━━

滤液, mL ┃1 ┃1┃1 ┃1 ┃1 ┃1

━━━━━━━━━━╋━╋━╋━━╋━━╋━━╋━━━

0.4mol Na2CO3,mL ┃5 ┃5┃5 ┃5 ┃5 ┃5

━━━━━━━━━━╋━╋━╋━━╋━━╋━━╋━━━

福林试剂, mL ┃1 ┃1┃1 ┃1 ┃1 ┃1

━━━━━━━━━━╋━╋━╋━━╋━━╋━━╋━━━

O D值┃┃┃┃┃┃

━━━━━━━━━━╋━┻━┻━━╋━━┻━━┻━━━

平均O D值┃┃

━━━━━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━━━━

净O D值┃┃0

━━━━━━━━━━┻━━━━━━┻━━━━━━━━━

样品的平均光密度(O D)一空白的平均光密度(OD)=净OD值。

1.4 计算

在40℃下每分钟水解酪蛋白产生1μg酪氨酸,定义为1个蛋白酶活力单位。

A 1

样品蛋白酶活力单位(干基)=━━×4×N×━━━ (1)

10 1 - W

式中:A——由样品测得OD值,查标准曲线得相当的酪氨酸微克数(或OD值×K); 4——4毫升反应液取出1 mL测定(即4倍);

N——酶液稀释的倍数;

10——反应10min;

W——样品水分百分含量。

1.5 注意事项

以上介绍的方法用于测定中性蛋白酶(pH7.2)。若要测定酸性蛋白酶或碱性蛋白酶,

则把配制酪蛋白溶液和稀释酶液用的pH缓冲液换成相应pH缓冲液即可。现把几种常用pH

缓冲液配方提供如下:

1.5.1 pH7.5磷酸盐缓冲液(0.02mol/L)

称取磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)6.02g和磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H2O)0.5g以蒸

馏水溶解定容至1000mL。

1.5.2 pH

2.5乳酸-乳酸钠缓冲液(0.05mol)

A 液: 称取80%~90%乳酸10.6g,加蒸馏水稀释定容至1000mL。

B 液: 称取70%乳酸钠16g,加水稀释定容至1000mL。

取A 液16mL与B 液1mL混合稀释一倍即成。

1.5.3 pH 3.0乳酸-乳酸钠缓冲液(0.05mol)

A 液: 称取80%~90%乳酸10.6g,以水定容至1000mL。

B 液: 称取70%乳酸钠16g,蒸馏水溶解定容至1000mL。

取A 液8mL与B 液1mL,混合稀释一倍即成。

1.5.4 pH 10硼砂-氢氧化钠缓冲液

A 液: 称取硼砂19.08g,用蒸馏水溶解定容至1000mL (0.05mol)。

B 液: 称取氢氧化钠8g,用蒸馏水溶解定容至1000mL (0.2N)。

取A 液250mL,B 液215mL混合,用蒸馏水稀释定容至1000mL即成。

1.5.5 pH 11.0硼砂-氢氧化钠缓冲液

A 液: 称取硼砂19.08g,用蒸馏水定容至1000mL 。

B 液: 称取氢氧化钠4g,用蒸馏水定容至1000mL 。

取A 液与B 液等量混合。

1.5.6 2%酪蛋白溶液配成酸性时,须先加数滴浓乳酸,使之湿润以加速其溶解。

2 甲醛法

成曲蛋白酶活力的测定,如用福林法测定确有困难时,可用甲醛法测定作过渡。

2.1 仪器

a. 分析天平:感量0.01g;

b. 水浴锅;

c. 电烘箱;

d. 容量瓶、吸管、滴定管等。

2.2 试剂与溶液

a. 1%酚酞指示剂;

b. 0.1%麝香草酚蓝;

c. 0.1N氢氧化钠液、甲醛(试剂配制法同氨基态氮的测定,见ZB X 66038—87《氨

基态氮测定法》)。

2.3 操作

2.3.1 目测法

称取研细均匀的成曲样品10g,放入250mL锥形瓶中,加55℃温水80mL,充分摇匀,置于55℃水浴锅中保温3h,取出后加热煮沸以破坏酶活力,冷却后定容至100mL,充分摇匀后以

脱脂棉过滤,吸取滤液10mL,移至150mL锥形瓶中,加水50mL, 1%酚酞指示剂0.2mL,以0.1N

氢氧化钠标准溶液滴定至刚显微红色(pH 8.2),记下滴定数作为总酸,继续加甲醛10mL,用

0.1N氢氧化钠液滴定至深红色(pH 8.5)为终点,若再加麝香草酚蓝1mL作指示剂,则滴

至紫

红色为终点。记下滴定数,减去空白数后计算成氨基态氮。另称取曲10g做水分,再折算成

干基数。

2.3.2 酸度计法

所用仪器、药品、操作方法等与氨基态氮测定法同(见ZB X 66038-87)。

2.4 计算

蛋白酶活力(克氨基态氮/100g)(干基)

(V-***Vo)×N×0.014 100

=━━━━━━━━━━×━━━ (2)

10 1 -W

10×━━━

100

式中:V——加入甲醛后氢氧化钠标准液滴定数, mL;

***Vo——甲醛空白滴定数, mL;

W——曲水分,%;

N——氢氧化钠标准溶液的当量数,N;

0.014——氮的毫克当量数。

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附加说明:

本标准由商业部副食品局提出。

本标准由上海市酿造科学研究所起草。

本标准主要起草人须凤高。

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*本法实质上是在一定温度下、一定时间内,成曲利用自身的蛋白酶把自身原料中的蛋白质水解成氨基酸。以测定氨基态氮的量来衡量蛋白酶活力的数值。在培养和堆放过程, 环境温度和自身含有水分,故已有少量氨基酸生成。为了能和福林法的酶活力进行对照, 可用空白试验以扣除此误差,方法是另取一曲样于开始时即将成曲酶活杀灭,其余操作步骤完全相同。杀酶的方法是把已煮沸的蒸馏水70mL倾入10g成曲中,并马上继续把成曲液

煮沸几分钟,其余操作与样品同,成曲和甲醛的空白一起算成Vo。

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中华人民共和国商业部1987-11-20批准1988-07-01实施

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木瓜蛋白酶活力测定方法

木瓜蛋白酶活力测定方法 分别精密量取酪蛋白溶液5ml,置3支具塞试管中,置40℃水浴中保温10分钟,各精密加入供试品溶液2ml,摇匀,置40℃水浴中,开始记时,准确反应1小时,立即精密加入三氯醋酸溶液5ml,强力振摇混匀,置40℃水浴中放置30~40分钟,使沉淀的蛋白质完全凝固,滤过,滤液作为供试品溶液。精密量取酪蛋白溶液5ml置另一具试管,于40℃水浴中保温1小时,精密加入三氯醋酸溶液5ml,强力振摇混匀,精密加入供试品溶液2ml,置40℃水浴中放置30~40分钟,滤过,滤液作为空白溶液。照分光光度法(中国药典2000年版二部附录IV A),以0.1mol/L 盐酸溶液为空白,在275nm的波长处测定空白溶液、供试品溶液和对照品溶液的吸收度,按下式计算: 效价(单位/mg)=A/As*Cs*12/2*稀释倍数/W 式中A为供试品溶液的吸收度减去空白溶液的吸收度: As为酪氨酸对照品溶液的吸收度: Cs为酪氨酸对照品溶液的浓度, ug/ml W为供试品重量,mg; 在上述条件下,释放1ug的酪氨酸的酶量为一个活力单位。 试剂酪蛋白溶液:取酪蛋白1g,加0.05mol/L磷酸氢二钠溶液50ml,置沸水浴中煮30分钟,时时搅拌,冷至室温,加0.05mol/L枸椽酸溶液调节PH至6.0±0.1,并迅速搅拌,防止酪蛋白沉淀,用水稀释至100ml(临用新配)。酶稀释液:取无水磷酸氢二钠3.55g,加水400ml溶解,加乙二胺四醋酸二钠1.1g和盐酸半胱氨酸2.74g,振摇溶解,用1mol/L盐酸或1mol/L氢氧化钠溶液调节PH6.5±0.1,用水稀释至500ml,混匀(临用新配)三氯醋酸溶液:取三氯醋酸17.99g,加醋酸钠29.94g和冰醋酸18.9ml,加适量水溶解后,加水使成1000ml,摇匀。 酶活力测定对照品溶液的制备:精密称取已105℃干燥至恒重的酪氨酸对照品适量,用0.1mol/L盐酸溶液制成每1ml中约含40ug的溶液。供试品溶液的制备:取本品适量(约相当于木瓜酶活力120万单位),精密称定,加酶稀释液振摇,制成每1ml中含200~300单位的溶液,摇匀。 淀粉酶活力测定 实验技术 2008-05-27 18:01:29 阅读213 评论0字号:大中小 一、目的 淀粉是葡萄糖以α-1,4糖苷键及α-1,6 糖苷键连结的高分子多糖,是人类和动物的重要食物,也是食品、发酵、酿造、医药、 纺织工业的基本原料。 淀粉酶是加水分解淀粉的酶的总称,淀粉酶对淀粉的分解作用是工业上利用淀粉的依 据,也是生物体利用淀粉进行代谢的初级反应。小麦成熟期如遇阴雨天气,有的品种会发生

03 实验三 碱性蛋白酶活力测定

实验三. 碱性蛋白酶活力测定 【实验目的】 1. 掌握测定碱性蛋白酶活力的原理和酶活力的计算方法。 2. 学习测定酶促反应速度的方法和基本操作。 【实验原理】 酶活力是指酶催化某些化学反应的能力。酶活力的大小可以用在一定条件下它所催化的某一化学反应的速度来表示。测定酶活力实际就是测定被酶所催化的化学反应的速度。 酶促反应的速度可以用单位时间内反应底物的减少量或产物的增加量来表示,为了灵敏起见,通常是测定单位时间内产物的生成量。由于酶促反应速度可随时间的推移而逐渐降低其增加值,所以,为了正确测得酶活力,就必须测定酶促反应的初速度。 碱性蛋白酶在碱性条件下,可以催化酪蛋白水解生成酪氨酸。酪氨酸为含有酚羟基的氨基酸,可与福林试剂(磷钨酸与磷钼酸的混合物)发生福林酚反应。(福林酚反应:福林试剂在碱性条件下极其不稳定,容易定量地被酚类化合物还原,生成钨蓝和钼蓝的混合物,而呈现出不同深浅的蓝色。)利用比色法即可测定酪氨酸的生成量,用碱性蛋白酶在单位时间内水解酪蛋白产生的酪氨酸的量来表示酶活力。 【实验材料】 1.实验器材 电热恒温水浴槽;分析天平;容量瓶;移液管;721分光光度计 2.实验试剂 (1)福林试剂:在1L容积的磨口回流瓶中加入50g钨酸钠(Na2WO4·2H2O)、125g钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)、350ml蒸馏水、25ml 85%磷酸及50ml浓盐酸,充分混匀后回流10h。回流完毕,再加25g硫酸锂、25ml蒸馏水及数滴液体溴,开口继续沸腾15分钟,以便驱除过量的溴,冷却后定容到500ml。过滤,置于棕色瓶中暗处保存。使用前加4倍蒸馏水稀释。 (2)1%酪蛋白溶液:称取酪蛋白1克于研钵中,先用少量蒸馏水湿润后,慢慢加入0.2mol/L NaOH 4ml,充分研磨,用蒸馏水洗入100ml容量瓶中,放入水浴中煮沸15分钟,溶解后冷却,定容至100ml,保存于冰箱内。 (3)pH10缓冲溶液: 甲液(0.05mol/L硼砂溶液):取硼砂(Na2B4O7·10H2O) 19克,用蒸馏水溶解并定容至1000ml。 乙液:0.2mol/L氢氧化钠溶液 配制pH10硼砂氢氧化钠溶液:吸取甲液50ml,再加入乙液21ml,用蒸馏水定容至200ml。 (4)标准酪氨酸溶液:精确称取酪氨酸50mg,加入1ml 1mol/L盐酸溶解后用蒸馏水定容至50ml,即得1mg/ml酪氨酸标准溶液。 (5)0.4mol/L碳酸钠溶液,0.4mol/L三氯醋酸溶液。 【实验操作】 1.制备酪氨酸标准曲线 (1) 取7支试管,编号,按下表配制不同含量的酪氨酸溶液。(见下页) (2) 在上述7支试管中,分别加入1%酪蛋白溶液1ml,于40℃水浴中保温15分钟,取出后,加入0.4mol/L三氯醋酸3ml,充分摇匀,各管分别用滤纸过滤。 (3)分别吸取滤液1ml放入另7支试管中,加入0.4mol/L碳酸钠溶液5ml,福林试剂1ml,充分摇匀,于40℃水浴中保温15分钟,然后于每管中各加入3ml蒸馏水,充分摇匀。 (4) 用721型分光光度计,以0号管作对照,在680nm处测定光密度。

胰蛋白酶活性测定

实验一胰蛋白酶活性测定 实验目的:掌握测定胰蛋白酶浓度、活性、比活的原理与方法。 实验原理:胰蛋白酶相对分子量23.7 KD,主要水解肽链中碱性氨基酸与其它氨基酸相连接的肽键,此外还能水解碱性氨基酸形成的酯键,如把人工合成的N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯(N-benzuyl-L-argine ethyl ester, BAEE)水解为H-苯甲酰-L-精氨酸(BA)。 胰蛋白酶所催化的上述反应中,产物BA对253 nm 的光吸收远大于BAEE,因此可以在实验起始点把253 nm 的消光值调为零,然后记录反应体系对253 nm 的消光值的增量,并把这个增量作为测定胰蛋白酶的活性指标。 酶活单位定义:在底物BAEE浓度1m mol/L,光程1 cm,波长253nm,温度25 0C,测量体积3mL,.条件下吸光值每分钟递增0.001(A/min=0.001)为1个BAEE酶活单位。 胰蛋白酶制剂中蛋白质浓度含义: 胰蛋白酶含量一般E1%表达。这个值的含义是:浓度为1% 酶蛋白,在1cm光径下,对紫外280nm 的消光值。不同厂家、不同产品的E1%值有很大差别。E1% 值越高,表明酶制剂中酶蛋白含量越高。 由于酶制剂中蛋白质含量各不相同,所以用酶制剂配制E1%的蛋白质溶液时,按照厂家对产品的E1% 的测定值配制溶液。 在本实验中,胰蛋白酶酶蛋白样品采用SIGMA 公司生产的产品,生产公司对展品的描述是对280nm紫外吸收值15.3,配制胰蛋白酶标准溶液可根据厂家的这个说明。 器材以试剂:器材,电子天平,紫外分光光度计,微量加样器。试剂:标准胰蛋白酶,N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯,HCI, Tris。 1.胰蛋白酶活性测定: 1)配制E1%的胰蛋白酶溶液

测定蛋白酶活力实验

测定蛋白酶活力实验 一、实验目的 1.加深了解酶活力的概念。 2.学习掌握测定蛋白酶活力的方法。 二、实验原理 酶活力指酶催化某一特定反应的能力。其大小可用在一定条件下酶催化反应进行一定时间后,反应体系中底物的减少量或产物的生成量来表示。 酶活力单位是表示酶活力大小的重要指标。本实验规定酶活力单位(U)为一定条件下每分钟分解1μg 酪氨酸所需的酶量。 实验选用枯草杆菌蛋白酶水解酪蛋白产生酪氨酸的反应体系。产物酪氨酸在碱性条件下与Folin-酚试剂反应生成蓝色化合物,该蓝色化合物在680nm 处有最大光吸收,其吸光值与酪氨酸含量呈正比。 因此通过测定一定条件下产物酪氨酸的含量变化,可计算出蛋白酶的活力。 三、仪器和试剂 仪器: 恒温水浴锅、分光光度计、试管及试管架、干燥滤纸、玻璃漏斗。原料 枯草杆菌蛋白酶:称取1g 枯草杆菌蛋白酶粉,用少量L,磷酸缓冲液溶解并定容至100mL,震荡15分钟,使充分溶解,干纱布过滤,取滤液冰箱备用。使用时视酶活力高低用缓冲液适当稀释。

试剂 1. Folin-酚试剂: 在2L 磨口回流瓶中加入钨酸钠(Na2WoO4. 2H2O)100g,钼酸钠(Na2WoO4. 2H2O)25g,蒸馏水700mL,85%磷酸50mL 以及浓盐酸100mL,充分混匀后,微火回流加热10小时。再加入硫酸锂150g,蒸馏水50mL 和液溴数滴,摇匀后开口继续煮沸15min,以驱赶过剩的溴。冷却后加蒸馏水定容至1000mL,过滤,溶液呈黄绿色,置于棕色试剂瓶中暗处贮藏。使用前用标准NaOH 溶液、酚酞为指示剂标定酸度(约为2mol/L),然后加水稀释至1mol/L,即可使用。 2. 0.2mol/L 盐酸溶液 3. L 氢氧化钠溶液 4. L 碳酸钠溶液 5. 10%三氯乙酸溶液 6. 磷酸缓冲液: 称取磷酸氢二钠(Na2HPO4 . 12H2O)7.16g,用水定容至100mL(A 液);称取磷酸二氢钠(Na2HPO4.12H2O)3.12g,用水定容至100mL(B 液)。取A 液84mL,B 液16mL 混合后,得到磷酸缓冲液,可长期存放。临用时稀释10倍即可。 7. 标准酪氨酸溶液(50μg/mL):称取以烘干至恒重的酪氨酸,用L 盐酸约30mL 溶解后,蒸馏水定容至250mL。 8. 酪蛋白溶液%):称取1.25g 酪蛋白,用L 氢氧化钠溶液(20mL)溶解,再用磷酸缓冲液定容到250mL。

蛋白酶测定方法

蛋白酶活性测定方法 一蛋白酶活力单位定义 1g 固体酶粉(或1mL液体酶),在一定温度和pH值条件下,1min水解酪素产生1μg酪氨酸为一个活力单位,以u/g(u/mL)表示。 二测定原理 蛋白酶在一定的温度与pH条件下,水解酪素底物,然后加人三氯乙酸终止酶反应,并使未水解的酪素沉淀除去,滤液对紫外光有吸收,可用紫外分光光度法测定。根据吸光度计算其酶活力。 三应用范围 本法适用于各种含有酸性蛋白酶的复合酶和液体酶及单酶的测定。 四测定条件 4.1 底物:酪蛋白 4.2 pH: 3.00 4.3 温度: 40℃±0.5℃ 4.4 保温时间: 10min 五仪器 5.1 紫外分光光度计 5.2 超级恒温水浴40±0.2℃ 5.3 秒表 5.4 分析天平:感量0.0001g 六试剂和溶液 6.1.2 碳酸钠溶液c(Na2CO3)=0.4 mol/L 称取无水碳酸钠(Na2CO3)42.4 g ,用水溶解并定容至1000 mL。 6.1.3 三氯乙酸c(CCI3·COOH)=0.4 mol/L 称取三氯乙酸65.4 g ,用水溶解并定容至1000 mL。 6.1.4 氢氧化钠溶液c(NaOH)=0.5mol/L 按GB 601配制。 6.1.5 盐酸溶液c(HCl)=1 mol/L及0.1 mol/L 按GB 601配制。 6.1.6 缓冲溶液 a.磷酸缓冲液(pH=7.5),适用于中性蛋白酶 称取磷酸氢二钠(Na2HP04·12H20)6.02 g和磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H20)0.5 g,加水溶解并定容至1000 mL。 b.乳酸缓冲液(pH=3.0 ) 适用于酸性蛋白酶 甲液称取乳酸(80%~90%)10.6 g,加水溶解并定容至1000 mL。 乙液称取乳酸钠(70%)16 g,加水溶解并定容至1000 mL。 使用溶液取甲液8 mL,加乙液1 mL,混匀,稀释一倍,即成0.05mol/L乳酸缓冲溶液。 c.硼酸缓冲溶液(pH= 10.5) 适用于碱性蛋白酶 甲液称取硼酸钠(硼砂)19.08 g,加水溶解并定容至1000 mL。 乙液称取氢氧化钠4.0 g,加水溶解并定容至1000 mL。 使用溶液取甲液500 mL、乙液400 mL混匀,用水稀释至1000 mL, 上述各种缓冲溶液,均须用pH计校正。 6.1.7 l0 g/L酪素溶液 称取酪素1.000 g,精确至0.001 g,用少量0.5 mol/L氢氧化钠溶液(若酸性蛋白酶则用浓乳酸2~3滴)湿润后,加人适量的各种适宜pH的缓冲溶液约80 mL,在沸水浴中边加热边搅拌,直至完全溶解,冷却后,转入100 mL容量瓶中,用适宜的pH缓冲溶液稀释至刻度。此溶液在冰箱内贮存,有效期为三天。 注:3 )酪素采用上海化学试剂采购供应站经销的试剂。 6.1.8 l00μg/mL L-酪氨酸4)标准溶液

蛋白酶活力的测定

实验三蛋白酶活力的测定 一、目的 掌握用分光光度计法测定蛋白酶活力的原理与操作技术。 二、原理 蛋白酶水解酪蛋白,其产物酪氨酸能在碱性条件下使福林——酚试剂还原,生成鉬蓝与钨蓝,以比色法测定。 三、试剂及仪器 1.福林—酚试剂 称取50g钨酸钠(Na2WO4?2H2O),12.5g钼酸钠(Na2MoO4?2H2O),置入1000mL原底烧瓶中,加350mL水,25mL85%磷酸,50mL浓盐酸,文火微沸回流10h,取下回流冷凝器,加50g硫酸锂(Li2SO4)和25mL水,混匀后,加溴水脱色,直至溶液呈金黄色,再微沸15min,驱除残余的溴,冷却,用4号耐酸玻璃过滤器抽滤,滤液用水稀释至500mL。 使用时用2倍体积的水稀释。 2.0.4mol/L碳酸钠溶液:称取42.4g碳酸钠,用水溶解并定容至1000mL。 3.0.4mol/L三氯乙酸溶液:称取65.5g三氯乙酸,用水溶解并定容至1000mL。 4.2%酪蛋白溶液 称取2.00g酪蛋白(又名干酪素),加约40mL水和2~3滴浓氨水,于沸水浴中加热溶解,冷却后,用pH7.2磷酸缓冲溶液稀释定容至100mL,贮存于冰箱中。 5.pH7.2磷酸缓冲液 0.2mol/L 磷酸二氢钠溶液:称取31.2g磷酸二氢钠(NaH2PO4?2H2O),用水溶解稀释至1000mL; 0.2mol/L 磷酸氢二钠溶液:称取71.6g磷酸氢二钠(Na2HPO4?12H2O),用水溶解稀释至1000mL; pH7.2磷酸缓冲溶液:取28mL 0.2mol/L磷酸二氢钠溶液和72mL 0.2mol/L磷酸氢二钠溶液,用水稀释至1000mL。 6.标准酪氨酸溶液: 准确称取0.1g DL-酪氨酸,加少量0.2mol/L盐酸溶液(取1.7mL浓盐酸,用水稀释至100mL),加热溶解,用水定容至1000mL,每毫升含DL-酪氨酸100微克。 7.仪器:分光光度计、试管 四、操作步骤 1.标准曲线绘制 在上述各管中各取1mL,分别加入5mL 0.4mol/L碳酸钠溶液,1mL福林—酚试剂,于400C水浴显色20min,在680nm波长下测吸光度,绘制标准曲线,在标准曲线上求得吸光度

分光光度法测定蛋白酶酶活

分光光度法测定蛋白酶酶活 1适用范围 本方法适用于中性蛋白酶、酸性蛋白酶酶活的测定。 2测定原理 蛋白酶在一定的温度与pH条件下,水解酪素(酪蛋白)底物,产生含有酚基的氨基酸(如:酪氨酸、色氨酸等),在碱性条件下,将福林试剂(Folin)还原,生产钼蓝和钨蓝,用分光光度计于波长680nm下测定溶液吸光度。酶活力与吸光度成正比,由此可以计算产品的酶活力。 酶活单位的定义:每1mL粗酶液,在一定温度和pH值条件下,10min水解酪素产生1μg酪氨酸为一个酶活力单位,以(u/mL)表示。 3仪器和设备 3.1分析天平:精度为0.0001g。 3.2紫外分光光度计。 3.3恒温水浴锅:精度±0.2℃。 3.4PH计:精度为0.01PH单位。 4试剂和溶液 除非另有说明,在分析中仅使用分析纯试剂和蒸馏水。 4.1福林(Folin)试剂 市售分析纯福林试剂。 4.2福林使用溶液 一份福林试剂与两份水混合,摇匀。 4.3碳酸钠溶液(42.4g/L) 称取无水碳酸钠(Na2CO3)42.4g,用水溶解并定容至1000ml。 4.4三氯乙酸c(CCl3COOH)=0.4mol/L 称取三氯乙酸65.4g,用水溶解并定容至1000 mL。 4.5氢氧化钠溶液c(NaOH)=0.5mol/L 称取氢氧化钠片剂20.0g,加水900ml并搅拌溶解,待溶液到室温后加水定容至1000ml,摇匀。 4.6盐酸溶液c(HCL)=1 mol/L及0.1 mol/L

1 mol/L HCL:取90mL浓盐酸溶解于蒸馏水中,定容至1000mL。 0.1 mol/L HCL:取9mL浓盐酸溶解于蒸馏水中,定容至1000mL。 4.7缓冲溶液 4.7.1磷酸缓冲液(pH=7.5,适用于中性蛋白酶) 称取磷酸氢二钠(Na2HPO4?12H2O)6.02g和磷酸二氢钠(NaH2PO4?12H2O)0.5g,加水溶解并定容至1000mL。 4.7.2乳酸缓冲液(pH=3.0,适用于酸性蛋白酶) 甲液:称取乳酸(80%~90%)10.6g,加水溶解并定容至1000 mL。 乙液:称取乳酸钠(70%)16g,加水溶解并定容至1000 mL。 使用溶液:取甲液8 mL,加乙液1 mL,混匀,稀释一倍,即成0.05mol/L乳酸缓冲溶液。4.810g/L酪素溶液 称取酪素(固定厂家生产,不同厂家产品对实验结果有影响)1.000g,精确至0.001g,用少量0.5mol/L氢氧化钠溶液(若酸性蛋白酶则用浓乳酸2~3滴)湿润后,加入适量的缓冲溶液(测中性蛋白酶加磷酸缓冲液,测酸性蛋白酶加乳酸缓冲液)约80 mL,在沸水浴中边加热边搅拌,直到完全溶解,冷却后,转入100 mL容量瓶中,用适宜的pH缓冲溶液稀释至刻度。此溶液在冰箱内贮存,有效期为三天。 4.9L-酪氨酸标准溶液(100μg/mL) 称取预先于105℃干燥至恒重的L-酪氨酸0.1000g,精确至0.0002g,用1mol/L盐酸60 mL 溶解后再用蒸馏水定容至100 mL,即为1mg/mL酪氨酸标准溶液。 吸取1mg/ mL酪氨酸标准溶液10.00 mL,用0.1mol/L盐酸定容至100 mL,即得到100ug/ mL L-酪氨酸标准溶液。此溶液在冰箱内贮存或立即使用。 5分析步骤 5.1标准曲线的绘制 5.1.1L—酪氨酸标准溶液:按表1配置。L—酪氨酸稀释液应在稀释后立即进行测定。 表1

蛋白酶活力测定方法

酸性蛋白酶产品概述: 蛋白质由氨基酸组成,是自然界中发现的最复杂的有机化合物之一。由盐酸和蛋白酶分解成易被高等动物的肠道和微生物有机体的细胞膜吸收的氨基酸。包括人类在内的每种动物,必须要有足够的蛋白质来维持自身生长,来生成每个细胞所必需的氨基酸,一些特种蛋白质还是某些特殊细胞、腺体分泌物、酶和激素的功能性组成元素。蛋白酶是指一些有催化功能的酶,能够水解(断裂)蛋白质,因此也被称为蛋白水解酶。蛋白水解酶在许多的生理和病理过程中发挥着重要作用,在食品和乳品加工业也有着广泛应用。工作机理 蛋白水解酶制剂本产品能在酸性条件下水解蛋白质食品中的缩氨酸键,释放氨基酸或者多肽。在酒精、葡萄酒、果汁、啤酒、黄油和酱油生产中,添加酸性蛋白酶可澄清发酵液中的雾气。酵母在发酵阶段的生长可以通过悬浮蛋白质转化的氨基酸来加以促进,从而加速发酵并提高产量。本产品是一种酸性蛋白酶制剂,在酸性条件下具有较高活性,由酸性蛋白酶高产菌株——曲霉菌深层发酵而成。它广泛应用于饲料、纺织、废水处理和果汁提纯方面。 酸性蛋白酶(Acid protease )是指蛋白酶具有较低的最适pH,而不是指酸性基团存在于酶的活性部位,酸性蛋白酶的最适PH从2左右(胃蛋白酶)到4左右。从酶的活力-PH曲线分析,在酶的活性部位中含有一个或更多的羟基。这一类蛋白酶中研究最彻底的是胃蛋白酶。(酸性蛋白酶537容易失活)

简介:酸性蛋白酶是由隆科特黑曲霉优良菌种经发酵精制提炼而成,它能在低PH条件下,有效水解蛋白质,广泛应用于酒精、白酒、啤酒、酿造、食品加工、饲料添加、皮革加工等行业。 1、产品规格:,规格有5万u/g~10万u/g 液体型为黑褐色液体,规格有50000u/ml~10000u/ml. 2、酶活力定义:一个酶活力单位是1g酶粉或1ml酶液在40℃,PH3.0条件下,1分钟水解酪素产生1ug酪氨酸为一个酶活力单位(u/g或u/ml) 特性1、温度范围为:最适温度范围为40℃-50℃2、PH为:最适PH范围为2.5~3.5 使用方法 1、白酒工业: 本品用以淀粉为原料的生产酒精及白酒行业,提高出酒率0.25%个酒分,提高发酵速度。 2、食品工业: 食品上用以淀粉改良,提高食品风味、改良品质,因能提高氨基酸含量 3、啤酒生产: 能有效阻断双乙酰生成,缩短啤酒成熟期。 4 饲料添加剂:提高饲料利用率。 5、毛皮软化: 提高上色率,手感丰满,增加毛皮光泽。

蛋白酶提取、活力测定实验总结

发酵实验总结 生物技术1002 1610100311 刘小波 摘要: 1、实验目的:通过本次实验,学习用选择平板从自然界中分离胞外蛋白酶产生菌的方法,学习并掌握细菌菌株的药瓶液体发酵技术,了解碱性蛋白酶活力测定的原理,掌握碱性蛋白酶活力测定的方法。 2、实验方法:从玉米黄顶菊混种土壤中筛选蛋白酶,之后经液体发酵扩大培养,挑选出活力较强的菌落,通过碱性蛋白酶活力测定的方法测出蛋白酶活力的大小。 3、实验结果: 实验原理: 1、能够产生胞外蛋白酶的菌株在平板上生长后,其菌落周围可形成明显的蛋白水解圈。水解圈与菌落直径的比值常被作为判断该菌株蛋白酶产生能力的筛选依据。 2、蛋白酶在一定条件下不仅能够水解蛋白质中的肽键,也能够水解酰胺键和酯键,因此可以利用蛋白质或人工合成的酰胺及酯类化合物作为底物来测定蛋白酶的活力。本实验选用酪蛋白为底物,测定微生物蛋白酶水解肽键的活力。酪蛋白经蛋白酶作用后,降解成相对分子质量较小的肽和氨基酸,在反应混合物中加入三氯醋酸溶液,相对分子质量较大的蛋白质和肽就沉淀下来,先对分子质量较小的仍留在溶液中,溶解于三氯醋酸溶液中的肽的数量正比于酶的数量和反应时间。在280nm 波长下测定溶液吸光度的增加,就可以计算酶的活力。 实验材料: 玉米黄顶菊混种土样、酪蛋白、牛肉膏、磷酸氢二钠、氯化钠、琼脂、蒸馏水、0.02mol/l磷酸盐缓冲液(ph7.5)、1%酪蛋白溶液、5%三氯醋酸(TCA)溶液、烧杯、试管、容量瓶、量筒、玻璃棒、移液枪、电子秤、高温高压灭菌锅、恒温培养箱、离心机、水浴锅、紫外线分光光度计等。实验方法: 蛋白酶的筛选: 1、准确称取玉米黄顶菊混种土样10g,放入装有90mL无菌水的250mL三角瓶中,用手震荡20min,使微生物细胞分散,静置20~30s,即成10-1稀释液;再用1mL无菌吸管,吸取10-1稀释液1mL,移入装有9mL无菌水的试管中,吹吸3次,让菌液混合均匀,即成10-2稀释液;再换一支无菌吸管,吸取10-2稀释液1mL,移入装有9mL无菌水的试管中,也吹吸3次,成10-3稀释液;以此类推,连续稀释,制成10-4、10-5、10-6、10-7、10-8一系列稀释菌液。 2、配酪素培养基(加琼脂),高压灭菌,倒平板,编号1、2、3。另外配不加琼脂的液体培养基,

分光光度法测定蛋白酶酶活知识讲解

分光光度法测定蛋白 酶酶活

分光光度法测定蛋白酶酶活 1适用范围 本方法适用于中性蛋白酶、酸性蛋白酶酶活的测定。 2测定原理 蛋白酶在一定的温度与pH条件下,水解酪素(酪蛋白)底物,产生含有酚基的氨基酸(如:酪氨酸、色氨酸等),在碱性条件下,将福林试剂(Folin)还原,生产钼蓝和钨蓝,用分光光度计于波长680nm下测定溶液吸光度。酶活力与吸光度成正比,由此可以计算产品的酶活力。 酶活单位的定义:每1mL粗酶液,在一定温度和pH值条件下,10min水解酪素产生1μg酪氨酸为一个酶活力单位,以(u/mL)表示。 3仪器和设备 3.1分析天平:精度为0.0001g。 3.2紫外分光光度计。 3.3恒温水浴锅:精度±0.2℃。 3.4PH计:精度为0.01PH单位。 4试剂和溶液 除非另有说明,在分析中仅使用分析纯试剂和蒸馏水。 4.1福林(Folin)试剂 市售分析纯福林试剂。 4.2福林使用溶液 一份福林试剂与两份水混合,摇匀。 4.3碳酸钠溶液(42.4g/L) 称取无水碳酸钠(Na 2CO 3 )42.4g,用水溶解并定容至1000ml。 4.4三氯乙酸c(CCl 3 COOH)=0.4mol/L 称取三氯乙酸65.4g,用水溶解并定容至1000 mL。 4.5氢氧化钠溶液c(NaOH)=0.5mol/L 称取氢氧化钠片剂20.0g,加水900ml并搅拌溶解,待溶液到室温后加水定容至1000ml,摇匀。

4.6盐酸溶液c(HCL)=1 mol/L及0.1 mol/L 1 mol/L HCL:取90mL浓盐酸溶解于蒸馏水中,定容至1000mL。 0.1 mol/L HCL:取9mL浓盐酸溶解于蒸馏水中,定容至1000mL。 4.7缓冲溶液 4.7.1磷酸缓冲液(pH=7.5,适用于中性蛋白酶) 称取磷酸氢二钠(Na2HPO4?12H2O)6.02g和磷酸二氢钠(NaH2PO4?12H2O) 0.5g,加水溶解并定容至1000mL。 4.7.2乳酸缓冲液(pH=3.0,适用于酸性蛋白酶) 甲液:称取乳酸(80%~90%)10.6g,加水溶解并定容至1000 mL。 乙液:称取乳酸钠(70%)16g,加水溶解并定容至1000 mL。 使用溶液:取甲液8 mL,加乙液1 mL,混匀,稀释一倍,即成0.05mol/L乳酸缓冲溶液。 4.810g/L酪素溶液 称取酪素(固定厂家生产,不同厂家产品对实验结果有影响)1.000g,精确至0.001g,用少量0.5mol/L氢氧化钠溶液(若酸性蛋白酶则用浓乳酸2~3滴)湿润后,加入适量的缓冲溶液(测中性蛋白酶加磷酸缓冲液,测酸性蛋白酶加乳酸缓冲液)约80 mL,在沸水浴中边加热边搅拌,直到完全溶解,冷却后,转入100 mL容量瓶中,用适宜的pH缓冲溶液稀释至刻度。此溶液在冰箱内贮存,有效期为三天。 4.9L-酪氨酸标准溶液(100μg/mL) 称取预先于105℃干燥至恒重的L-酪氨酸0.1000g,精确至0.0002g,用 1mol/L盐酸60 mL溶解后再用蒸馏水定容至100 mL,即为1mg/mL酪氨酸标准溶液。 吸取1mg/ mL酪氨酸标准溶液10.00 mL,用0.1mol/L盐酸定容至100 mL,即得到100ug/ mL L-酪氨酸标准溶液。此溶液在冰箱内贮存或立即使用。 5分析步骤 5.1标准曲线的绘制 5.1.1L—酪氨酸标准溶液:按表1配置。L—酪氨酸稀释液应在稀释后立即进行测 定。

蛋白酶的发酵及酶活力测定实验报告

蛋白酶的发酵及酶活力测定实验报告 学院:生物科学与工程学院 专业:生物技术 班级: 1班 姓名: 学号:

摘要:蛋白酶是一类重要的工业用酶,广泛应用于食品、医药、洗涤剂、皮革、酿酒等行业。当前,食品工业用酶主要来自微生物,尤其是蛋白酶的应用最为广泛。作为一种生物催化剂,它具有催化反应速度快,无工业污染,催化反应条件适应性宽等的性质和优点。由于从植物和动物中生产蛋白酶具有的局限性,为了满足当今世界市场的需要,人们越来越多地把目光投到微生物蛋白酶上[2] 。微生物由于具有生长速度快、所需生长空间小、广泛的生化多样性及其遗传可操作性等特点,因而备受人们青睐。本文主要进行了菌种的生长曲线的绘制与菌种最佳发酵产酶时间等方面的研究。 关键字:蛋白酶生长曲线酶活力

第一章前言 1.1研究的目的与意义 蛋白酶是工业酶中用得最多的一种酶,是催化蛋白质肽键水解的一类酶,它作用于蛋白质,将其分解为蛋白胨、多肽及游离氨基酸[1] ,约占酶总量的 60%,其中碱性蛋白酶就占25%。有调查显示,酶制剂市场量最大的是洗涤剂用酶,第二位是淀粉加工用酶,以后依次为乳制品加工业、制酒工业、纺织工业和饮料加工业等用酶[2]。与动、植物来源的蛋白酶相比,利用微生物产的蛋白酶有易于培养、生长快、产量高、易于提取,适于大规模工业化生产,培养基的成本相对较低等优点,使微生物成为生产蛋白酶的重要来源和首选材料。 1.2 国内外研究概况 1.2.1 微生物蛋白酶的分类 由于从植物和动物中生产蛋白酶具有的局限性,为了满足当今世界市场的需要,人们越来越多地把目光投到微生物蛋白酶上[3]。当前工业用酶主要来源于微生物,微生物来源的蛋白酶按其作用的 pH 值的不同可分为三类,即碱性蛋白酶、中性蛋白酶及酸性蛋白酶,它们作用的最适 pH 值分别为碱性、中性及酸性。 1.2.2在食品工业中的应用 蛋白酶在食品工业上的应用主要是用在制干酪,蛋白质水解调味液,烤焙食品,肉类嫩化,功能性低聚肽和阿斯巴甜的合成等。食品加工使用的蛋白酶通常来自于枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、米曲霉和黑曲霉等。 随着社会发展和生活水平不断提高,人们对肉类的需求量日益增长的同时,对肉的品质也提出了更高要求。微生物蛋白酶肉类嫩化剂是一种专门用于嫩化肉类的生物制剂,在适当温度下,可以断裂蛋白质中的某些肽键,提高肉的嫩度,使肉变得多汁、柔软、易于咀嚼,提高了肉的成品率、保质期和经济效益,因此十分经济且便于生产,并能取得显著效果。面包制作过程中,面粉中含有的不溶解性谷蛋白可以通过碱性蛋白酶限制性降解来修饰。用米曲霉蛋白酶和肽酶对面筋蛋白作有限的水解,可改善面团操作性能和机械性能,以适应不同制品的需要。酶处理后的面团其韧性和机械强度都有所增加。过量使用蛋白酶能减少面团的混合时间和增加面包产量。使用细菌蛋白酶可以增加面团的延展性[4]。

2020年测定蛋白酶活力实验(课件)

2020年测定蛋白酶活力实验 (课件) 测定蛋白酶活力实验 一、实验目的?1.加深了解酶活力的概念.?2。学习掌握测定蛋白酶活力的方法。 二、实验原理?酶活力指酶催化某一特定反应的能力。其大小可用在一定条件下酶催化反应进行一定时间后,反应体系中底物的减少量或产物的生成量来表示。 酶活力单位是表示酶活力大小的重要指标。本实验规定酶活力单位(U)为一定条件下每分钟分解1μg酪氨酸所需的酶量。实验选用枯草杆菌蛋白酶水解酪蛋白产生酪氨酸的反应体系。产物酪氨酸在碱性条件下与Folin-酚试剂反应生成蓝色化合物,该蓝色化合物在680nm 处有最大光吸收,其吸光值与酪氨酸含量呈正比. 因此通过测定一定条件下产物酪氨酸的含量变化,可计算出蛋白酶的活力. 三、仪器和试剂?仪器:?恒温水浴锅、分光光度计、试管及试管架、干燥滤纸、玻璃漏斗。?原料?枯草杆菌蛋白酶:称取1g 枯草杆菌蛋白酶粉,用少量0.02mol/L,pH7.5磷酸缓冲液溶解并定容至100mL,震荡15分

钟,使充分溶解,干纱布过滤,取滤液冰箱备用。使用时视酶活力高低用缓冲液适当稀释.?试剂?1. Folin-酚试剂:?在2L 磨口回流瓶中加入钨酸钠(Na2WoO4 . 2H2O)100g,钼酸钠(Na2WoO4. 2H2O)25g,蒸馏水700mL,85%磷酸50mL 以及浓盐酸100mL,充分混匀后,微火回流加热10小时。再加入硫酸锂150g,蒸馏水50mL 和液溴数滴,摇匀后开口继续煮沸15min,以驱赶过剩的溴。冷却后加蒸馏水定容至1000mL,过滤,溶液呈黄绿色,置于棕色试剂瓶中暗处贮藏。使用前用标准NaOH 溶液、酚酞为指示剂标定酸度(约为2mol/L),然后加水稀释至1mol/L,即可使用.?2.0.2mol/L 盐酸溶液3.0.04mol/L 氢氧化钠溶液?4.0。55mol/L 碳 10%三氯乙酸溶液酸钠溶液?5 . 6. 0.02mol/LpH7。5磷酸缓冲液:称取磷酸氢二钠(Na2HPO4 . 12H2O)7。16g,用水定容至100mL(A 液);称取磷酸二氢钠(Na2HPO4 .12H2O)3.12g,用水定容至100mL(B 液)。取 A 液84mL,B液16mL 混合后,得到0.2mol/LpH 7.5磷酸缓冲液,可长期 7。标准酪氨酸溶液存放。临用时稀释10倍即可。? (50μg/mL):称取12.5mg 以烘干至恒重的酪氨酸,用0.2mol/L 盐酸约30mL溶解后,蒸馏水定容至250mL。

蛋白酶活性的测定

实验四蛋白酶活力的测定 一、实验目的 1、了解蛋白酶活力测定的原理; 2、掌握蛋白酶活力测定的方法。 二、实验原理 蛋白酶在一定条件下不仅能够水解蛋白质中的肽键,也能够水解酰胺键和酯键,因此可用蛋白质或人工合成的酰胺及酯类化合物作为底物来测定蛋白酶的活力。 本实验选用酪蛋白为底物,测定微生物蛋白酶水解肽键的活力。酪蛋白经蛋白酶作用后,降解成相对分子质量较小的肽和氨基酸,在反应混合物中加入三氯醋酸溶液,相对分子质量较大的蛋白质和肽就沉淀下来,相对分子质量较小的肽和氨基酸仍留在溶液中,溶解于三氯醋酸溶液中的肽的数量正比于酶的数量和反应时间。在280nm波长下测定溶液吸光度的增加,就可计算酶的活力。 三、实验试剂 ①微生物蛋白酶萃取液(ml):称取酶制剂,加100ml蒸馏水搅拌30min,在4℃下离心分离后,将上层清夜置于冰箱中保存,使用前稀释一定倍数; ②L磷酸盐缓冲液(); ③1%酪蛋白溶液:取酪蛋白,加100ml L磷酸盐缓冲液(),加热并搅拌使它完全分散,然后置于冰箱中保存; ④5%三氯醋酸(TCA)溶液。 四、实验步骤 1、将5%TCA溶液和1%酪蛋白溶液在37℃下保温。 2、取四支15ml具塞试管,分别标上记号A1、A0、B1和B0。在A1和A0试管中各吸入酶液,在B1和B0试管中各吸入酶液,分别用L磷酸盐缓冲液定容至。在

A0和B0试管中各吸入%三氯醋酸溶液,上述四支试管都置于37℃水浴中保温。 3、在各试管中吸入 1%酪蛋白溶液,在37℃下保温10min(准确计时)后,再向A1和B1试管中吸入%三氯醋酸溶液。 4、将试管从水浴中取出,在室温下放置1h,用少量上清液润湿滤纸后过滤,保留滤出液。 5、在280nm波长下,分别以A0和B0滤液为空白,测定A1和B1滤液的吸光度。 五、计算 1、在规定的实验条件下,以每分钟增加吸光度定义为一个酶单位。 2、每克酶制剂中酶活力的计算: ?A ×1000 / (t ×w) 酶活力单位/克酶制剂 式中,?A——样品与空白吸光度差值(即A1和B1的吸光值);t ——酶作用时间(本实验为10min);w——反应中酶的用量,g 六、说明 1、微生物蛋白酶粗提取液在较宽广的PH范围表现出活力,但是在接近中性条件下最有最高活力。 2、微生物蛋白酶在45℃以下可保持较长时间的稳定性。 七、思考题 1、蛋白酶有哪几类 2、影响酶活力的因素有哪些 3、使用紫外分光光度计时应注意哪些问题 六、数据记录与处理 A1 = B1 = 酶含量为 ml 酶活力1 = ?A × 1000 / (t × w) = ×1000/10/=×105酶活力单位/克酶制剂

胰蛋白酶活性测定教学资料

胰蛋白酶活性测定

实验一胰蛋白酶活性测定 实验目的:掌握测定胰蛋白酶浓度、活性、比活的原理与方法。 实验原理:胰蛋白酶相对分子量23.7 KD,主要水解肽链中碱性氨基酸与其它氨基酸相连接的肽键,此外还能水解碱性氨基酸形成的酯键,如把人工合成的N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯(N-benzuyl-L-argine ethyl ester, BAEE)水解为H-苯甲酰-L-精氨酸(BA)。 胰蛋白酶所催化的上述反应中,产物BA对253 nm 的光吸收远大于BAEE,因此可以在实验起始点把253 nm 的消光值调为零,然后记录反应体系对253 nm 的消光值的增量,并把这个增量作为测定胰蛋白酶的活性指标。 酶活单位定义:在底物BAEE浓度1m mol/L,光程1 cm,波长253nm,温度25 0C,测量体积3mL,.条件下吸光值每分钟递增0.001( A/min=0.001)为1个BAEE 酶活单位。 胰蛋白酶制剂中蛋白质浓度含义: 胰蛋白酶含量一般E1%表达。这个值的含义是:浓度为1% 酶蛋白,在1cm光径下,对紫外280nm的消光值。不同厂家、不同产品的E1%值有很大差别。E1% 值越高,表明酶制剂中酶蛋白含量越高。

由于酶制剂中蛋白质含量各不相同,所以用酶制剂配制E1%的蛋白质溶液时,按照厂家对产品的E1% 的测定值配制溶液。 在本实验中,胰蛋白酶酶蛋白样品采用SIGMA 公司生产的产品,生产公司对展品 的描述是对280nm紫外吸收值15.3,配制胰蛋白酶标准溶液可根据厂家的这个说明。 器材以试剂:器材,电子天平,紫外分光光度计,微量加样器。试剂:标准胰蛋 白酶,N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯,HCI, Tris。 1.胰蛋白酶活性测定: 1)配制E1%的胰蛋白酶溶液 每组取E1%=15.3的胰蛋白酶样品10mg 放到1ml去离子水中,充分溶解后,放入冰中保存。 2)按照表1 的要求配制试验体系所需其它各种溶液. 3)按照表1的顺序进行测定标准胰蛋白酶的活性。 表1 胰蛋白酶活性测定加样顺序 试剂步骤1:空白调零步骤2:样品测定 0.1 mol/L Tris-HCl 缓冲液,pH 8.0 , 1.5 mL 1.5 mL 2.0 m mol/L BAEE 1.5 mL 1.5 mL 250C预热5min 250C预热5min 胰蛋白酶:10mg/mL 0 μL 10 μL 蒸馏水10 μL 0 μL 充分摇匀充分摇匀 步骤1:?A253 nm/min 调0 ----------- 步骤2:?A253-nm/min -------------- 记录 在步骤2样品测定中,加入酶液后立即盖上盖迅速混匀计时,每半分钟读数一次,共读3~4min。测得的结果要使△A253nm/min控制在0.05~0.100之间为宜,若偏离此范围则要适当增减酶量(5μL -20μL之间,空白试验相应增减等体积水)后重新测定,一直到△A253nm/min值落在0.05~0.100之间为止。

各种酶活力测定方法及注意事项

碱性蛋白酶及各种蛋白酶活力测定方法及测定有感 因长期测定碱性蛋白酶酶活力与角蛋白酶活力与胶原酶活力和弹性蛋白酶活力,碱性蛋白酶活力测定还好,因有国家标准,测定按照国标来便可大大减少误差。其余酶活力测定过程中因无统一标准且底物差异大,导致长期酶活力测定的混乱,各种酶活力测定方法与各种试剂添加,最后实际测定的酶活力只能仅作参考。 以下是各种蛋白酶活力测定方法及标曲绘制: 碱性蛋白酶测定方法 根据国标GB/T 23527-2009 附录B 蛋白酶活力测定福林法 以下是方法

碱性蛋白酶的测定方法参考 GB/T 23527-2009 附录 B 中福林酚法进行,即 1 个酶活力单位(U/mL)定义为 1 mL 酶液在 40℃、pH= 10.5 条件下反应 1 min 水解酪蛋白产生 1 μg 酪氨酸所需要的酶量,主要步骤如下。 2.2.6.1 标准曲线的绘制 (1)L-酪氨酸标准溶液:按表 2-6 配制。 表 2-6 L-酪氨酸标准溶液配置表 Table 2-6 L-Tyrosine standard solution form 管号酪氨酸标准溶液的浓度/ (μg/mL) 取 100 μg/mL 酪氨酸标准 溶液的体积/(mL) 取水的体积/ (mL)

0 0 0 10 1 10 1 9 2 20 2 8 3 30 3 7 4 40 4 6 5 50 5 5 (2)分别取上述溶液各 1.00 mL,各加 0.4 mol/L 碳酸钠溶液 5.0 mL,福林试剂使用 液 1.00 mL,置于 40 ℃±0.2 ℃水浴锅中显色 20 min,用分光光度计于波长 680 nm,10 mm 比色皿,以不含酪氨酸的反应管作为空白,分别测定其吸光度值,以吸光度值 A 为纵坐标,酪氨酸浓度 C 为横坐标,绘制 L-酪氨酸标准曲线。 图 2-1 L-酪氨酸标准曲线 Fig. 2-1 L-tyrosine standard curve 根据作图或用回归方程计算出当吸光度为 1 时的酪氨酸的量(μg),既为吸光度常数 K 值。其 K 值应在 95-100 范围内。上图所示标准曲线符合要求,可用于下一步实验。 2.2.6.2 测定方法 (1)计算方法 X = A × K × 4 / 10 × n = 2 / 5 × A × K × n 式(2-1) 式中,X —样品的酶活力,μ/g; A —样品平行实验的平均吸光度; K —吸光常数; 4 —反应试剂的总体积,mL; 10—反应时间 10 min,以 1 min 计; n —稀释倍数。 (2)测定方法 ①先将干酪素溶液放入 40 ℃±0.2 ℃恒温水浴中,预热 5 min。 ②按下列程序操作,进行测定。 于 680 nm 波长,用 10 mm 比色皿测其吸光度。

紫外分光光度法测蛋白酶酶活-2013

2013/05/13 紫外分光光度法测蛋白酶酶活 1、原理 蛋白酶在一定的温度与pH条件下,水解酪素底物,然后加入三氯乙酸终止酶反应,并使未水解的酪素沉淀除去,滤液对紫外光有吸收,可用紫外分光光度法测定。根据吸光度计算其酶活力。酶活单位的定义:每1mL粗酶液,在一定温度和pH值条件下,1min水解酪素产生1ug酪氨酸为一个酶活力单位,以(u/mL)表示。 2、试剂和溶液 三氯乙酸、氢氧化钠、盐酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、乳酸、乳酸钠、硼酸钠(硼砂)均为分析纯,酪素、酪氨酸为生化试剂。 2.1 三氯乙酸c(CCL3·COOH)=0.4mol/L 称取三氯乙酸65.4g,用水溶解并定容至1000 mL。 2.2 氢氧化钠溶液c(NaOH)=0.5mol/L 按GB601配制。 2.3 盐酸溶液c(HCL)=1 mol/L及0.1 mol/L 1 mol/L HCL:取90mL浓盐酸溶解于去离子水中,定容至1000mL。 0.1 mol/L HCL:取9mL浓盐酸溶解于去离子水中,定容至1000mL。 2.4 缓冲溶液 a、磷酸缓冲液(pH=7.5)适用于中性蛋白酶 称取磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)6.02g和磷酸二氢钠(NaH2PO4·12H2O)0.5g,加水溶解并定容至1000mL。 b、乳酸缓冲液(pH=3.0)适用于酸性蛋白酶 甲液称取乳酸(80%~90%)10.6g,加水溶解并定容至1000 mL。 乙液称取乳酸钠(70%)16g,加水溶解并定容至1000 mL。 使用溶液取甲液8 mL,加乙液1 mL,混匀,稀释一倍,即成0.05moi/L乳酸缓冲溶液。 c、硼酸缓冲溶液(pH=10.5)适用于碱性蛋白酶 甲液称取硼酸钠(硼砂)19.08g,加水溶解并定容至1000 mL。 乙液称取氢氧化钠4.0g,加水溶解并定容至1000 mL。 使用溶液取甲液500 mL、乙液400 mL混匀,用水稀释至1000mL。 上述各种缓冲溶液,均须用pH计校正。

蛋白酶活性的测定

. 实验四蛋白酶活力的测定 一、实验目的 1、了解蛋白酶活力测定的原理; 2、掌握蛋白酶活力测定的方法。 二、实验原理 蛋白酶在一定条件下不仅能够水解蛋白质中的肽键,也能够水解酰胺键和酯键,因此可用蛋白质或人工合成的酰胺及酯类化合物作为底物来测定蛋白酶的活力。本实验选用酪蛋白为底物,测定微生物蛋白酶水解肽键的活力。酪蛋白经蛋白酶作用后,降解成相对分子质量较小的肽和氨基酸,在反应混合物中加入三氯醋酸溶液,相对分子质量较大的蛋白质和肽就沉淀下来,相对分子质量较小的肽和氨基酸仍留在溶液中,溶解于三氯醋酸溶液中的肽的数量正比于酶的数量和反应时间。在280nm波长下测定溶液吸光度的增加,就可计算酶的活力。 三、实验试剂 ①微生物蛋白酶萃取液(0.01g/ml):称取1.0g酶制剂,加100ml蒸馏水搅拌30min,在4℃下离心分离后,将上层清夜置于冰箱中保存,使用前稀释一定倍数; ②0.02mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.5); ③1%酪蛋白溶液:取1.0g酪蛋白,加100ml 0.2mol/L磷酸盐缓冲液(PH7.5),加热并搅拌使它完全分散,然后置于冰箱中保存; ④5%三氯醋酸(TCA)溶液。 四、实验步骤 1、将5%TCA溶液和1%酪蛋白溶液在37℃下保温。 2、取四支15ml具塞试管,分别标上记号A1、A0、B1和B0。在A1和A0试管中各吸入0.20ml酶液,在B1和B0试管中各吸入0.40ml酶液,分别用0.2mol/L 磷酸盐缓冲液定容至2.00ml。在A0和B0试管中各吸入6.00ml5%三氯醋酸溶液,上述四支试管都置于37℃水浴中保温。 1 / 4 . (准确计时)10min37℃下保温3、在各试管中吸入2.00ml 1%酪蛋白溶液,在三氯醋酸溶液。试管中吸入6.00ml5%后,再向A1和B1,用少量上清液润湿滤纸后过滤,保1h4、将试管从水浴中取出,在室温下放置留滤出液。滤液的吸光和B1和B0滤液为空白,测定A15、在280nm波长下,分别以A0 度。 五、计算0.001吸光度定义为一个酶单位。1、在规定的实验条件下,以每分钟增加2、每克酶制剂中酶活力的计算:克酶制剂酶活力单位/×1000 / (t ×w) A ?酶作用t ——和B1的吸光值);A1 式中,?A——样品与空白吸光度差值(即g w——反应中酶的用量,时间(本实验为10min); 六、说明范围表现出活力,但是在接近中性条、微生物蛋白酶粗提取液在较宽广的PH 1 件下最有最高活力。℃以下可保持较长时间的稳定性。2、微生物蛋白酶在45

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