Southern blot实验方法与步骤
Southern blot实验方法与步骤
用于检测重组DNA，也可分析DNA样品中是否有与探针序列同源的DNA片段。用于基因诊断，也可验证检测片段的分子量大小。将基因组DNA经限制性内切酶酶切，进行琼脂糖电泳，把分离后定位在凝胶上的不同分子量的DNA经碱变性处理，将凝胶中变性的DNA转移至一固相支持滤膜。利用标记的某一DNA、RNA或寡核苷酸与固着于滤膜上的DNA发生同源性杂交，利用放射自显影（化学发光法或显色法）检测。
（一）器材：台式离心机，恒温水浴锅，电泳仪，水平电泳槽，杂交炉，杂交袋，尼龙膜或硝酸纤维素膜，转印迹装置，滤纸，吸水纸，紫外交联仪或80℃烤箱，摇床，X线胶片。（二）试剂：限制性内切酶，DNA加样缓冲液，DNA Ladder Marker，0.25M HCl，变性液（0.5M NaOH，1.5M NaCl），中和液（0.5M Tris- HCl PH7.5，3M NaCl）, 转印迹液20?wSSC （3M NaCl，0.3M柠檬酸钠，PH7.0），标记探针， 2?wSSC，预杂交液和杂交液，2×洗液（2×SSC,0.1%SDS）,0.5×洗液(0.5×SSC,0.1%SDS),1×缓冲洗液（0.1M马来酸，0.15M NaCl ,PH7.5,0.3%Tween20）,1×封阻液[1％(W/V)封阻剂溶于1×马来酸溶液（0.1M马来酸，0.15M NaCl ,PH7.5）]，1×检测液（0.1M Tris- HCl,0.1M NaCl,PH7.5），抗－地高辛－碱性磷酸酶。
注意：若基因组DNA过低，要以较大体积进行限制酶消化，消化完毕后，可以通过乙醇沉淀、浓缩DNA片段，加少量DNA加样缓冲液点样。
2、消化好的样品点样于0.7％琼脂糖凝胶进行电泳；
注意：为保证DNA均匀分散于加样孔，应缓慢将样品加至加样孔。
3、电泳结束后，将凝胶依次用如下试剂处理进行碱变性，室温下轻轻摇动确保溶液覆盖凝胶 0.25M HCl 10－15 min
蒸馏水摇洗 5 min
变性液 40 min
蒸馏水摇洗 5 min
中和液 15 min，2次；
4、在凝胶碱变性的同时，制备转印迹装置。Southern blot转膜技术有三种：1），毛细管转移法；2），电转移法；3），真空转移法。这里介绍最经典的毛细管转移法（向上转移），在转印迹槽中，倒入20?wSSC溶液，槽中置一固相支持物，在固相支持物上从下向上依次置入：两张与凝胶等宽的滤纸，将滤纸纵向自固相支持物垂于转印迹槽中（简称“桥”），底面在上的凝胶，滤膜（与凝胶等大），滤纸（与凝胶等大），吸水纸（略小于滤纸，5－8cm高），400－800g重物。凝胶四周用Parafilm膜包围防止短路。滤膜事先用2?wSSC 浸湿至少5 min。滤纸事先用20?wSSC浸湿。转膜4－18小时；
注意：转膜装置中各层滤纸和膜之间要将气泡赶净。一旦建立转膜系统后，要防止滤膜和凝胶错位。防止吸水纸倒塌和完全湿透，要及时更换吸水纸。
5、转膜结束后，取出滤膜，边角剪一小角做标记。滤膜于2?wSSC摇洗5min，用滤纸吸干；
6、用紫外交联照射（正面朝上）或于80℃烤箱烘烤0.5－2小时；
7、膜可立即进行预杂交和杂交，或保存于4℃待以后应用；
8、预杂交和杂交
1）将杂交膜浸湿于6?wSSC 2min，同时预热预杂交液和杂交炉至预杂交温度；
2）杂交膜封于杂交袋，按0.2ml/cm2膜面积加入预杂交液，预杂交至少1小时；
3）用于southern blot的探针可分为DNA探针、RNA探针和寡核苷酸探针。对探针的标记方法又可以分为放射性标记和非放射性标记。这里主要介绍非放射性地高辛标记探针的杂交
方法。杂交时各种探针的用量：DNA探针，5－25ng/ml；RNA探针，100ng/ml；寡核苷酸探针，0.1－10pmol/ml。双链DNA探针提前100℃变性10min后迅速冰浴，单链探针无需变性。将处理后的探针加入杂交液温浴至杂交温度。杂交温度的选择根据杂交液的不同而不同；注意：应用寡核苷酸探针时，杂交温度的选择。Tm＝4?w(G C) 2?w(A T),杂交温度比Tm 低约10℃。
4）弃去预杂交液，将含探针的杂交液注入杂交袋，至少3.5ml/10?w1℃m，置入杂交炉滚动；
9、杂交后的洗膜处理过程，顺序如下：
2×洗液2×15min
0.5×洗液2×15min
1×缓冲洗液1×3min
1×封阻液1×60min
抗体液* 1×30min
1×缓冲洗液2×15min
1×检测液1×5min
* 抗－地高辛－碱性磷酸酶用1×封阻液稀释10，000倍（若用显色法稀释5000倍；若用CDP-Star检测用20，000倍稀释）；
10、将膜浸于CSPD液（CSPD用1×检测液稀释100倍，CDP-Star也用1× 检测液稀释100倍）室温避光静置 5min；回收剩余的CSPD液或CDP-Star液避光保存于4℃可反复应用3－5次；
11、将膜上残液吸净，用保鲜膜封好于37℃反应15min，然后将膜固定于压片夹，进行曝光。注意：若用显色剂检测，新鲜配置显色剂（45μlNBT和35μl BCIP溶于10ml 1×检测液），将膜浸于显色剂中避光反应4－16小时，反应期间不要移动膜。
1. Run the gel as normal. Often for genomic southerns it is desirable to run long gels (18cm) over 4-6hrs.
2. Photograph the gel with a ruler adjacent to the molecular weight markers as a reference.
3. Alkali transfer buffer = 0.5M NaOH (20g/lt), 1.5M NaCl (87.66g/lt). Prepare 1 litre for one gel and another 750ml for each additional gel. BEWARE This buffer is very dangerous, capable of causing severe eye damage. Use the large volumes in volved in this procedure with care and wear protective glasses.
4. Add the gel to 250ml alkali transfer buffer, plus 125ml for each additional gel.
5. Place gel on rocker with buffer solution for 20mins. NOTE low % agarose gels must be agitated slowly to prevent tearing.
6. Keep remaining 500ml for the transfer tank.
Wear gloves for the following steps
7. Cut 2 pieces of large 3MM paper (wicks) and 2 pieces about 2mm smaller than the gel on each edge and one piece of nylon (Hybond N , Amersham) the same size as the gel.
Large gel (HFI) Medium gel Mini gel
2 (14 x 19cm) 2 (15.2 x 10) 2 (9 x 5.2)
2 (14 x 32cm) 2 (15.2 x 32) 2 (18.5 x 5.2)
Cut a stack of paper toweling about 2mm smaller than the gel. The stack needs to be
about 6cm thick.
8. Prewet nylon in DDW, then soak in alkali transfer buffer.
9. Add buffer to transfer tank to the level of the platform. Wet the long wicks in transfer buffer and place in the tank.
10. Place gel on platform and spoon on transfer buffer. Add the Nylon and smooth out any bubbles with the back of your finger.
11. Add the 2 slightly smaller 3MM filters, the first prewetted, the second dry.
12. Add the stack of paper towels. NOTE it is very important that the edges of the towel do not touch the wicks that the gel is sitting on or the transfer will be " shortcircuited".
13. Top the stack with a glass or plastic plate and a weight (a bottle with about
200-300ml H2O is ideal). Too much weight compresses the gel and terminates the transfer early.
14. Allow to transfer o/n and then remove the stack carefully. Mark the position of the wells on the filter with a biro (and note position of well #1) before removing the filter. Soak the filter in 0.5M Tris pH 7.5, 1.5M NaCl for 5min. after removal from the gel.
15. Add filter to 200ml 2 X SSC and allow to soak without agitation for 5'.
16. Remove filter and blot dry and bake at 80? for 2hr or place in autoclave for 10' when not operating but warm.
17. Prehybridize with 10ml Aqua. hyb. (Reagents), 1% SDS and 100ug/ml boiled herring sperm DNA for 20-30 minutes (cloned DNA southern) to several hrs (genomic southern).
18. Boil probe for 3' and add to 3ml of fresh hyb solution/SDS/Herring DNA. Squeeze prehyb from the bag and add probe. Seal, avoiding air bubbles and distribute the probe well. Incubate for 4-6hr (cloned DNA) to 16-20hr (genomic southern). Washes are performed in 2 to 0.2X SSC, 0.1% SDS depending on homology of probe to target
westernblot详细图解
Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测的方法。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。 与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。 经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以
检测电泳分离的特异性目的基因表 达的蛋白成分。该技术也广泛应用 于检测蛋白水平的表达。 实验材料蛋白质样品 试剂、试剂盒丙烯酰胺SDS Tris-HCl β-巯基乙醇 ddH2O 甘氨酸Tris 甲醇PBS NaCl KCl Na2HPO4 KH2PO4 ddH2O 考马斯亮兰乙酸脱脂奶粉硫酸镍胺H2O2 DAB试剂盒 仪器、耗材 电泳仪电泳槽离心机离心管硝酸纤维素 膜匀浆器剪刀移液枪刮棒 实验步骤一、试剂准备 1. SDS-PAGE试剂：见聚丙烯酰胺凝胶电泳实验。 2. 匀浆缓冲液：1.0 M Tris-HCl(pH 6.8) 1.0 ml；10%SDS 6.0 ml；β-巯基乙醇0.2 ml；ddH2O 2.8 ml。 3. 转膜缓冲液：甘氨酸2.9 g；Tris 5.8 g；SDS 0.37 g；甲醇200 ml；加ddH2O定容至1000 ml。
坍落度与扩展度试验方法
依据标准GB50080-2002《普通混凝土拌合物性能试验方法标准》进行： 3.1坍落度与坍落扩展度法 3.1.1本方法适用于骨料最大粒径不大于40mm、坍落度不小于10mm的混凝土拌合物稠度测定。 3.1.2坍落度与坍落扩展度试验所用的混凝土坍落度仪应符合《混凝土坍落度仪》JG 3021中有关技术要求的规定。 3.1.3坍落度与坍落扩展度试验应按下列步骤进行: 1 湿润坍落度筒及底板，在坍落度筒内壁和底板上应无明水。底板应放置在坚实水平面上，并把筒放在底板中心，然后用脚踩住二边的脚踏板，坍落度筒在装料时应保持固定的位置。 2 把按要求取得的混凝土试样用小铲分三层均匀地装人筒内，使捣实后每层高度为筒高的三分之一左右。每层用捣棒插捣25次。插捣应沿螺旋方向由外向中心进行，各次插捣应在截面上均匀分布。插捣筒边混凝土时，捣棒可以稍稍倾斜。插捣底层时，捣棒应贯穿整个深度，插捣第二层和顶层时，捣棒应插透本层至下一层的表面;浇灌顶层时，混凝土应灌到高出筒口。插捣过程中，如混凝土沉落到低于筒口，则应随时添加。顶层插捣完后，刮去多余的混凝土，并用抹刀抹平。 3清除筒边底板上的混凝土后，垂直平稳地提起坍落度筒。坍落度筒的提离过程应在5一lOs内完成;从开始装料到提坍落度筒的整个过程应不间断地进行，并应在150s内完成。 4提起坍落度筒后，测量筒高与坍落后混凝土试体最高点之间的高度差，即为该混凝土拌合物的坍落度值;坍落度筒提离后，如混凝土发生崩坍或一边剪坏现象，则应重新取样另行测 定;如第二次试验仍出现上述现象，则表示该混凝土和易性不好，应予记录备查。 5 观察坍落后的混凝土试体的豁聚性及保水性。勃聚性的检查方法是用捣捧在已坍落的混凝土锥体侧面轻轻敲打，此时如果锥体逐渐下沉，则表示戮聚性良好，如果锥体倒塌、部分崩裂 或出现离析现象，则表示豁聚性不好。保水性以混凝土拌合物稀浆析出的程度来评定，坍落度筒提起后如有较多的稀浆从底部析出，锥体部分的混凝土也因失浆而骨料外露，则表明此混凝土拌 合物的保水性能不好;如坍落度筒提起后无稀浆或仅有少量稀浆自底部析出，则表示此混凝土拌合物保水性良好。 6当混凝土拌合物的坍落度大于220mm时，用钢尺测量混凝土扩展后最终的最大直径和最小直径，在这两个直径之差小于50mm的条件下，用其算术平均值作为坍落扩展度值;否则，此次试验无效。
WB实验步骤
Western blotting实验步骤 1．蛋白质的样品制备： 取心肌组织50mg，待组织块自行溶解，用滤纸吸去其表面水分，将组织块放入玻璃匀浆器球状部位，用组织剪尽量将其剪碎，将剪碎的心肌组织放入玻璃匀浆器的杆状部，按1mlRIPA+10ulPMSF/100mg心肌组织的比例加入RIPA和PMSF（先加RIPA再加PMSF），将玻璃匀浆器插入冰中，匀浆约30分钟。 将心肌组织匀浆转移到离心管中，4℃12000g离心5分钟，收集上清（如有粘稠物进一步用超声处理），样品分装冻存于-20℃备用。 2 .测定蛋白浓度： 2.1 按50：1配置BCA工作液。 2.2 10ulC液（蛋白标准）+90ulPBS液稀释成0.5mg/ml的蛋白标准液。 2.3 分别以0、1、2、4、8、12、16、20ul将蛋白标准液加入96孔板的第1~8标准孔中，在其他样品孔中加入10ul待测样品。 2.4 分别加PBS定容至20ul。 2.5 各孔中加入200ulBCA工作液，室温放置2小时。 2.6 用酶标仪测定蛋白浓度：测定A562，依标准曲线算出蛋白浓度。 3 SDS-PAGE电泳： 3.1 制胶: 按比例配制分离胶，缓缓地摇动溶液，使激活剂混合均匀，将凝胶溶液平缓地注入两层玻璃极中，再在液面上小心注入一层水，以阻止氧气进入凝胶溶液中，静置40min。同前按比例配制浓缩胶，但混匀溶液时不要过于剧烈以免引入过多地氧气。吸去不连续系统中下层分离胶上的水分，连续
平稳的注入凝胶溶液，然后小心插入梳子并注意不得在齿尖留有气泡，静制60min以上以保证完全聚合。 3.2 预电泳：将聚合好的凝胶安置于电泳槽中，小心拔去梳子，加入电泳缓冲液后低电压10-20V的预电泳20-30min。（目的是清除凝胶内的杂质，疏通凝胶孔径以保证电泳过程中电泳的畅通）。 3.3 样品准备：首先计算上样体积，然后按样品：上样buffer=4：1的比例加入上样bufer混匀，沸水煮10分钟，冰上5分钟。 3.4 加样：预电泳后依次加入标准品（Marker）和待分析样品。（加样时间要尽量短，以免样品扩散，可在未加样的孔中加入等量的样品缓冲液避免边缘效应。每个泳道加5ul。 3.5 电泳：加样完毕，选择80V恒压进行电泳，电泳直至溴酚蓝染料前沿到达两胶交界处（一般约20分钟），更换至100V恒压电泳，电泳直至溴酚蓝染料前沿下至凝胶末端处，即停止电泳（一般约为1小时20分钟）。 4．转膜： 4.1 切胶：将电泳完毕的胶完整的放在盛有电转液的玻璃皿中，将目的蛋白所在区域切下来，测量其长宽，并记录。 4.2 剪膜和滤纸：按胶的尺寸剪膜和滤纸（滤纸长宽较凝胶小0.5~1mm，PVDF 膜长宽较凝胶大0.5~1mm），滤纸浸入盛有电转液的玻璃皿中10秒钟，膜放入盛有10%甲醇的玻璃皿中10秒钟，然后将两者都放入盛有去离子水的玻璃皿中3分钟，进一步放入盛有电转液的玻璃皿中3分钟。 4.3 向电转槽中倒入部分电转液，将海绵浸入。按如下顺序制作“三明治”（注意避免两边滤纸相互接触，以免发生短路）。从正极到负极按如下顺序排列：
westernblot实验详细步骤(1)
Western Blot实验技术一、制胶 SDS-PAGE分离胶配方表 1、检查制胶器是否漏水，吸干玻璃中水分
2、配置分离胶，加入玻璃板中（注意：不能有气泡和杂物），距离玻璃上口1.5mL停止加胶。 3、再加ddH2O或异丁醇水封除去气泡，凝胶后倒掉水，吸干水到浓缩胶插梳。 二、上样 1、先在内槽加满电泳液才可以拔梳子。 2、拔梳子时垂直向上拔出，不可左右摇晃梳子。 3、拔完梳子后观察梳子孔，是否有缺口和歪，用针头拨正。 4、上样时从左到右依次上样。 5、若上样组不多时，左右第一孔不加样。 6、要预留Marker的上样孔。 三、电泳 四、转膜
PVDF膜即聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride）是蛋白质印迹法中常用的一种固相支持物。PVDF膜是疏水性的，膜孔径有大有小，随着膜孔径的不断减小，膜对低分子量的蛋白结合就越牢固。 （转膜缓冲液：需4度预冷，现配现用，不能放太久。） 1、转印滤纸：全胶长8.5cm，宽5.5cm，需剪裁成7层滤纸，压平后约3mm。需在转膜缓冲液中平衡浸泡备用。 2、海绵垫：在转膜液中平衡浸泡备用。 3、PVDF膜：剪裁8.5cm*5.5cm ，需在甲醇中浸润2min（活化膜上正电基团），然后在转膜缓冲液中平衡浸泡备用。 4、凝胶：凝胶也需要在预冷的转膜转膜缓冲液中平衡浸泡3－5分钟。否则在转膜过程中会出现皱缩，导致出现转移的条带变形。 三明治夹心法：负极（黑）-海绵垫-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-海绵垫-正极（白） 转膜时间：通电恒流，60V，一个槽100mA左右，1h
（注意：在操作过程中用玻棒赶走气泡。 装置转膜仪时注意黑对黑（负对负），白对红（正对正）。 装置运行时需冰浴。） 五、封闭 在进行抗体杂交之前，需要先对转印膜进行封闭，以防止抗体对非转印蛋白区域的非特异性吸附。 封闭一般采用异源性蛋白质或去污剂，本实验室常用的有5%BSA，10%脱脂奶等，至于选择哪一类封闭液，首先应考虑与检测目的相适应（做l酪氨酸磷酸化时不推荐non-fat milk 封闭）。 1、将脱脂奶粉封闭液（1xTBST:脱脂奶粉=20mL：2g一块膜用量。牛血清蛋白、5%BSA 效果更好）倒好。 2、将PVDF膜取出放入封闭液中，盖子改好。 3、封膜一般常温1-2小时即可，也可4℃封闭过夜。 六、一抗 抗体反应主要采用间接法: 即先加入未标记特异性一抗与膜上抗原结合后，再加入标记的二抗进行杂交检测，标记二
Southern blot实验方法和操作步骤
Southern Blot原理及实验方法 Southern Blot原理及实验方法原理： 将待检测的DNA分子用/不用限制性内切酶消化后，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标记的DNA或RNA探针进行反应。如果待检物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补的原理进行结合，游离探针洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检测，从而显示出待检的片段及其相对大小。 用途：检测样品中的DNA及其含量，了解基因的状态, 如是否有点突变、扩增重排等。 试剂和器材 一、试剂 变性液：1.5mol/L NaCl，0.5mol/L NaOH。 中和液：0.5mol/L Tris-HCl (pH=7.5)，1.5mol/L NaCl。 20×SSC：3mol/L NaCl，0.3mol/L 柠檬酸钠。 以上溶液均在100Kpa灭菌20分钟。 2×SSC：用无菌移液管吸取20×SSC溶液5mL，加无菌水45mL。 6×SSC：用无菌移液管吸取20×SSC溶液15mL，加无菌水75mL。 二、器材 22cm×15cm瓷盘 操作方法 1. 在琼脂糖凝胶上电泳分离DNA。取出凝胶，切去边缘多于部分，EB染色，在紫外灯下照相（放一标尺，可从像片中读出DNA迁移的距离）。 2. 将凝胶置于200mL变性液中，浸泡45分钟，并温和地不断振荡，使凝胶上的ds-DNA转变为ss-DNA，然后用重蒸水冲洗凝胶几次。 3. 用中和液浸泡凝胶并不断地振荡45分钟，将凝胶中和至中性。防止凝胶的碱性破坏硝酸纤维膜。 4. 取一个瓷盘，在底部放一块玻璃板（或一块海绵）使盛器内的20倍SSC转移滤液低于玻板表面，在玻板表面盖一张3mm的二号滤纸，滤纸两边浸没于20倍SSC溶液中，在玻璃和滤纸之间，赶掉所有的气泡。
混凝土坍落度试验
建筑 混凝土坍落度试验 砼坍落度试验 1、试验步骤 （1）每次测定前，用湿布湿润坍落度筒、拌和钢板及其他用具，并把筒放在不吸水的刚性 水平底板上，然后用脚踩住 2个脚踏板，使坍落度筒在装料时保持位置固 定。 （2）取拌好的混凝土拌和物15L，用小铲分 3层均匀地装入筒内，使捣实后每层高度为筒 高的 1/3左右。每层用捣棒沿螺旋方向在截面上由外向中心均匀插捣25次。插捣筒边混凝 土时，捣棒可以稍稍倾斜。插捣底层时，捣棒应贯穿整个深度，插捣第二层和顶层时，捣棒 应插透本层至下一层的表面。浇灌顶层时，混凝土应灌到高出筒口，插捣过程中， 如混凝土沉落到低于筒口，则应随时加料，顶层插捣完毕后，刮去多余混凝土，并用镘刀抹平。 （3）清除筒边底板上的混凝土后，垂直平稳地提起坍落度筒。坍落度筒的提离过程应在5～10s内完成。从开始装料到提起坍落度筒的整个过程应不间断地进行，并应 150s内完成。2、试验结果确定与处理 （1）提起坍落度筒后，立即量测筒高与坍落后混凝土试体最高点之间的高度差，即 为该混凝土拌和物的坍落度值。混凝土拌和物坍落度以mm为单位，结果精确至 1mm。（2）坍落度筒提离后，如混凝土发生崩坍或一边剪坏现象，则应重新取样再测定。如第二 次试验仍出现上述现象，则表示该混凝土拌和物和易性不好，应予记录备查。 （3）观察坍落后的混凝土试体的粘聚性和保水性。粘聚性的检查方法是用捣棒在已坍落的 混凝土锥体侧面轻轻敲打，此时，如果锥体逐渐下沉，则表示粘聚性良好，如果锥体倒塌、 部分崩裂或出现离析现象，则表示粘聚性不好。保水性以混凝土拌和物中稀浆析出的程度来 评定。如坍落度筒提起后无稀浆或仅有少量稀浆自底部析出，则表示此混凝土拌和物保水性 良好；坍落度筒提起后如有较多的稀浆从底部析出且锥体部分的混凝土也因失浆而骨料外 露，则表明此混凝土拌和物的保水性能不好。 （4）和易性的调整 1）当坍落度低于设计要求时，可在保持水灰比不变的前提下，适当增加水泥浆量。 2）当坍落度高于设计要求时，可在保持砂率不变的条件下，增加集料的用量。 3）当出现含砂量不足，粘聚性、保水性不良时，可适当增加砂率，反之减小砂率。 混凝土坍落度试验 一、实验目的 混凝土由各组成材料按一定比例配合、搅拌而成。混凝土拌和物的和易性是一项综合性的 指标，它包括流动性、粘聚性和保水性等三方面的性能。由于它的内涵较为复杂，根据我国的现 行标准规定，采用“坍落度”和“维脖稠度”来测定混凝土拌和物的流动性。这里先进行“坍落 度”试验。（本试验适用于坍落度值不小于１０ mm，骨料粒径不大于４０mm混凝土伴和物）。 二、实验设备和仪器
Westernblot基本操作步骤
W e s t e r n b l o t基本操作步骤 一、细胞蛋白的提取 弃去培养基，加入预冷的PBS洗一遍，加入的RIPA裂解液（含1mM PMSF(100×)，每10ml加蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂各一片，六孔板每孔150-250μl，60mm×15mm 培养皿300-400μl，），于冰上裂解约5分钟，裂解总液12000rpm离心10 min。取上清，用BCA法测定蛋白浓度。用于western blot的蛋白样品取一定量加4×loading buffer，10×reducing，再用裂解液补齐到所需上样体积。离心，使蛋白沉底。将EP管于沸水中煮5min，变性，之后再离心后准备上样。 二、BCA法测蛋白浓度操作步骤 将蛋白标准配制溶液溶解蛋白标准（BSA），配制成5mg/ml的蛋白标准溶液，10μl 分装，-20℃冷冻保存。 完全溶解蛋白标准品，取10μl用PBS稀释至100μl，使终浓度为0.5mg/ml。 据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50:1)配制适量BCA工作液，充分混匀。BCA工作液室温24小时内稳定。 将标准品按0, 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20μl加到96孔板的标准品孔中，加稀释标准品的溶液补足到20μl。 加适当体积样品到96孔板的样品孔中（可以通过预实验摸索稀释倍数），加PBS 到20μl。 各孔加入100μl BCA工作液，37℃放置30分钟。 测定580nm条件下吸光度。根据标准曲线计算出蛋白浓度。 三、Western blot基本操作步骤 1、溶液配制： ①Runnig Buffer(1×)：SDS Runnig Buffer（20×）50mL，加MiliQ水至1L； ②Transfer Buffer(1×): Transfer Buffer(10×)100mL,甲醇200mL（20%，v/v），加MiliQ水至1L； ③TBST缓冲液 1M Tris·HCl（pH7.6）：60.5g Tris-base，加入约30ml浓盐酸，调PH至7.6，加MiliQ 水至500ml。 TBS缓冲液（10×）：1M Tris·HCl 100ml+80g NaCl加MiliQ水1L TBST缓冲液（1×）：TBS缓冲液（10×）100ml+0.5ml Tween-20（0.05%，v/v），加MiliQ水至1L。 ④封闭液：5% BSA（5g/100ml，称取1g BSA至20ml TBST，充分混匀溶解） 2、样品准备与加样 ①用4×SDS loading buffer, 10×reducing与蛋白质样品混合，并将此EP 管放在水浴锅中沸水煮5min，使蛋白质变性。 ②将预制胶固定到电泳装置中，并在装置中加满Runnig Buffer(1×)，内槽加入0.5mL 抗氧化剂，小心拔下梳子； ③向上样孔中加入一定体积的蛋白样品（总蛋白量20μg以上）。向marker孔中加入2.5μl marker（按照实验要求设定marker量），向空白孔中加入一定体积的加样缓冲液(loading buffer)。注意采用相同（或相近）的上样体积，以保证蛋白的各带宽度相同。防止体积较大的上样孔中的蛋白质将向相邻的泳道扩散。 3、电泳
Southern杂交实验
Southern 杂交实验 Southern 杂交的原理是将待检测的DNA分子用限制性内切酶消化，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按照其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其他标记物标记的DNA探针进行反应。如果待测物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补原理进行结合，游离的探针洗涤后用显影或其他合适的技术进行检测，从而显示出待检的片段及其相对大小。 一、溶液配制 (1)20 X SSC(1000 mL) : 组分浓度 3.0M的Nacl，0.3M的柠檬酸钠 NaCl 175.32g 柠檬酸钠88.26g NaOH调PH值到7.0，高温高压灭 (2)洗涤缓冲液Washing buffer 200ml 组分浓度：0.1M Maleic acid, 0.15M Nacl; pH 7.5(20℃); 0.3%(v/v) Tween20. Maleic acid：2.32g Nacl： 1.75g Tween20 0.6ml NaOH固体约1.7g调Ph值7.5 (3)马来酸缓冲液Maleic acid buffer 200ml 组分浓度：0.1M Maleic acid, 0.15M Nacl; pH 7.5 (20oC) Maleic acid：2.32g Nacl： 1.75g Tween20 0.6ml NaOH固体约1.7g调Ph值7.5 (4)检测缓冲液Detection buffer 100ml 组分浓度：0.1M Tris-HCl, 0.1M Nacl, pH 9.5(20oC) Tris 1.21g, NaCl 0.584g
普通混凝土坍落度试验步骤
普通混凝土坍落度试验步骤 混凝土坍落度主要是指混凝土的塑化性能和可泵性能，影响混凝土坍落度的因素主要有级配变化、含水量、衡器的称量偏差、外加剂的用量，容易被忽视的还有水泥的温度等。坍落度是指混凝土的和易性，具体来说就是保证施工的正常进行，其中包括混凝土的保水性，流动性和粘聚性。 和易性是指混凝土是否易于施工操作和均匀密实的性能，是一个很综合的性能其中包含流动性、粘聚性和保水性。影响和易性主要有用水量、水灰比、砂率以及包括水泥品种、骨料条件、时间和温度、外加剂等几个方面。 混凝土的坍落度，应根据建筑物的结构断面、钢筋含量、运输距离、浇注方法、运输方式、振捣能力和气候等条件决定，在选定配合比时应综合考虑，并宜采用较小的坍落度。 一、适用范围： 集料骨料最大粒径不大于40mm； 坍落度值不小于10mm的混凝土拌合物。 二、坍落度试验的试验设备应符合下列规定: 1、坍落度仪应符合现行行业标准《混凝土坍落度仪》JG/T248的规定； 2、应配备2把钢尺，钢尺的量程不应小于300mm,分度值不应大于1mm； 3、底板应采用平面尺寸不小于1500mmX1500mm、厚度不小于3mm的钢板，其最大挠度不应大于3mm。 三、主要试验设备： 试验室用混凝土小型搅拌机试验步骤： 1、坍落度筒内壁和底板应润湿无明水；底板应放置在坚实水平面上，并把坍落度筒放在底板中心，然后用脚踩住两边的脚踏板，坍落度筒在装料时应保持在固定的位置；
2、混凝土拌合物试样应分三层均匀地装人坍落度筒内，每装一层混凝土拌合物，应用捣棒由边缘到中心按螺旋形均匀插捣25次，捣实后每层混凝土拌合物试样高度约为筒高的三分之一； 3、插捣底层时，捣棒应贯穿整个深度，插捣第二层和顶层时，捣棒应插透本层至下一层的表面； 4、顶层混凝土拌合物装料应高出筒口，插捣过程中，混凝土拌合物低于筒口时，应随时添加； 5、顶层插捣完后，取下装料漏斗，应将多余混凝土拌合物刮去，并沿筒口抹平； 6、清除筒边底板上的混凝土后，应垂直平稳地提起坍落度筒，并轻放于试样旁边；当试样不再继续坍落或坍落时间达30s时，用钢尺测量出简高与坍落后混凝土试体最高点之间的高度差，作为该混凝土拌合物的坍落度值。点击添加图片描述（最多60个字）坍落度简的提离过程宜控制在3s~7s；从开始装料到提坍落度筒的整个过程应连续进行，并应在150s内完成。将坍落度简提起后混凝土发生一边崩坍或剪坏现象时，应重新取样另行测定；第二次试验仍出现一边崩坍或剪坏现象，应予记录说明。混凝土拌合物坍落度值测量应精确至1mm，结果应修约至5mm。 判断混凝土和易性 流动性：测量坍落度； 粘聚性：捣棒敲打锥体侧面； 保水性：观察稀浆程度。 坍落度的选择：
最详细的WesternBlot过程步骤详解
最详细的W e s t e r n B l o t 过程步骤详解
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Western Blot详解(原理、分类、试剂、步骤及问题解答) Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。 本文主要通过以下几个方面来详细地介绍一下Western Blot技术: 一、原理 二、分类 i.放射自显影 ii.底物化学发光ECL ECF iv.底物DAB呈色 三、主要试剂 四、主要步骤 五、实验常见的问题指南 1.参考书推荐 2.针对样品的常见问题 3.抗体 4.滤纸、胶和膜的问题 的相关疑问 6.染色的选择 7.参照的疑问
8.缓冲液配方的常见问题 9.条件的摸索 10.方法的介绍 11.结果分析 一、原理 与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。 二、分类 现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下（二抗用HRP标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。
Southern Blot操作流程
Southern Blot 操作流程 1、哺乳动物基因组DNA 的提取（或用OMEGA 试剂盒E.Z.N.A.TM Tissue DNA Kit ） 1、 取约30mg 样品，加入600 ul SNET ，再加入12 ul （20.2mg/ml ）的蛋白酶 K ，使蛋白酶K 的终浓度为400ug/ml ； 2、 55℃振荡过夜； 3、 加入0.6 ul RNaseA ，室温下孵育10 min ，后置于65℃ 10 min ； 4、 加入300 ul Tris 饱和酚，288 ul 氯仿和12 ul 异戊醇，室温下振荡30 min ； 5、 17,000 g 离心5min ，转移上层水相（600 ul ）至一新的离心管； 6、 加入等体积（600 ul ）的异丙醇沉淀DNA ，于4℃下13,250 g 离心15 min ； 7、 小心除去异丙醇，加入1 ml 70%的乙醇。离心5 min 后除去乙醇，室温下干 燥15~20 min ； 8、 加入100 ul TE ，使核酸沉淀溶解。 一、 酶切 1、 拷贝数的计算 哺乳动物基因组全长3.0×109个碱基对，按插入基因单拷贝计算如下： () g plasmid of mass bp bp DNA of Insertion μ10100.39 = ? 2、 酶切体系 基因组DNA 10 ug 10*Buffer 10 ul 酶(10U/ul) 10 ul Total 100 ul 3、 混合后置于适宜酶切温度进行酶切反应； 4、 对酶切产物进行纯化，用30 ul TE 洗脱； 5、 制备1%浓度的琼脂糖凝胶（不加EB ）； 6、 将纯化后的酶切产物敞开盖子于70℃放置15 min ，以除尽残留乙醇和消除
塌落度试验规范要求
塌落度试验规范要求 篇一：试块取样标准和制作方法及塌落度检测 试块取样标准和制作方法 （一）现场搅拌混凝土 根据《混凝土结构工程施工质量验收制约》（GB 50204-2002）和《混凝土强渡检验评定标准》（GBJ107－87）的规定，用于检查结构构件混凝土强渡的试件，应在混凝土的浇筑地点随机抽取。取样和试件留置应符合以下规定： 1、每拌制100盘但不超过100立方米的同配合比的混凝土，取样次数不得少于一次； 2、每工作班拌制的同一配合比的混凝土不足100盘时，其取样次数不得少于一次； 3、当一次连续浇筑超过1000立方米时，同一配合比的混凝土每200立方米取样不得少于一次； 4、同一楼层、同一配合比的混凝土，取样不得少于一次； 5、每次取样应至少留置一组标准养护试件，同条件养护试件的留置组数应根据实际需要确定。 （二）结构实体检验用同条件养护试件 根据《混凝土结构工程施工质量验收制约》的规定，结构实体检验用用同条件养护试件的留置方式和取样数量应符合以下规定：
1、对涉及混凝土结构安全的重要部位应举行结构实体检验，其内容包括混凝土强渡、钢筋保护层厚渡及工程合同约定的项目等。 2、同条件养护试件应由各方在混凝土浇筑进模处见证取样。 3、同一强渡等级的同条件养护试件的留置不宜少于10组，留置数量不应少于3组。 4、当试件达到等效养护龄期时，方可对同条件养护试件举行强渡试验。所谓等效养护龄期，就是逐日累计养护温渡达到600℃℃的环境中静置一昼夜至二昼夜，然后编号、拆模。拆模后应马上放进温渡为20±2℃，相对湿渡为95%以上的标准养护室中养护，或在温渡为20±2℃的不流动的氢氧化钙饱和溶液中养护。标准养护室内的试件应放在支架上，彼此间隔10～20mm，试件表面应保持潮湿，并不得被水直接冲淋。 混凝土坍落度简介 混凝土坍落度主要是指混凝土的塑化性能和可泵性能，影响混凝土坍落度主要有级配变化、含水量、衡器的称量偏差，外加剂的用量容易被忽视的还有水泥的温度几个方面。坍落度是指混凝土的和易性，具体来说就是保证施工的正常进行，其中包括混凝土的保水性，流动性和粘聚性。 和易性是指混凝土是否易于施工操作和均匀密实的性能，是一个很综合的性能其中包含流动性、粘聚性和保水性。影响和易性主要有用水量、水灰比、砂率以及包括水泥品种、骨料条件、时间和温度、外加剂等几个方面。
WB操作步骤-自己整理
Western Blot 相关实验方法与试剂（湿转法） 人工肝实验室学习姚瑶 （一）目的蛋白提取： （1）单层贴壁细胞总蛋白的提取： 1、倒掉细胞培养液，加入Hanks液洗涤一次后倒掉，根据所用细胞决定是否用胰酶消化，加入适量（约5ml）新鲜细胞培养液后，将贴壁细胞吹起，并转移至4支离心管内，配平后，1500转离心10min。 2、倒掉上清，用4度预冷PBS溶液洗涤沉淀，1500转离心10min。 共洗三次，每次十分钟。 3、倒掉上清，吸净，每管加入50ul 细胞裂解液RIPA，吹散，加入后由于DNA的释放可迅速变粘稠，故应尽快转移至1.5ml EP 管内，-20℃裂解30min。 4、超声波细胞裂解仪上将各管裂解15s。（可不做） 5、4℃，12000转离心10min。 6、将上清转移至0.5ml EP管中，每管100ul，冰浴待用。 （2）组织中总蛋白的提取： 1、取约100mg肝组织于研磨器内，加入500ul 细胞裂解液RIPA，研磨后吸出于1.5ml EP管内，再加入500ul RIPA，研磨后吸出于上EP管内。冰上裂解30min。
2、配平后，4℃，14000转离心10min。 3、将上清分装于0.5ml EP管内，每管100ul，冰浴待用（二）蛋白含量的测定： 1、稀释标准品：10ul标准品C液+90ul PBS溶液，混匀。 2、按0、1、2、4、8、12、16、20ul将稀释后的标准品加入于96孔板内，并用PBS将各孔补足20ul。 3、将第2、3排96孔板分别加入样品1ul、0.5ul，（可采用倍比稀释法），并用PBS将各孔补足20ul。 4、配制工作液：按A液：B液=50：1配制适量工作液，每孔加入200ul。 5、37℃水浴30min。 6、酶标仪测定各孔OD值（A570，Mode1）。 7、绘制标准曲线，计算样品蛋白浓度。 （三）SDS-PAGE电泳： （1）清洗玻璃板 （2）灌胶与上样： 1、配胶：根据目的蛋白的大小，决定分离胶的浓度。
SouthernBlot印记杂交常见问题解析
Southern Blot印记杂交常见问题解析 1、针对不同的实验材料，southern杂交实验难度有差异么？答：不同的实验材料，在进行试验过程中难度差异很大，例如玉米、 小麦、葡萄的Southern杂交检测难度要比普通的材料要大。 (1)、物种本身的基因组较大（例如小麦），检测操作难度大 (2)、材料本身含有高糖多酚（例如葡萄）严重影响酶切操作 (3)、物种品系复杂（例如玉米），在基因组信息研究层面还不透彻。 2、核酸质量对southern杂交实验的影响 答：核酸质量对实验的影响是直接的，既要求客户提供的总量足够——实验消耗（上样量），又要求保证质量——按要求准备材料。 上样量指的是基因组DNA酶切消化后，回收后的DNA片段的量。根据 不同物种的基因组大小不同，上样量也有所区别。基因组越大，上样 量越多。例如，拟南芥大概需要3ug ，酵母3ug，人8ug，小麦15ug。酶切消化之后不能直接上样，需要回收纯化。回收会有损失，最多能 损失一半，所以需要客户提供足够量的样品，一般要求至少20 ug的 基因组DNA。（以上上样量均为一个泳道） DNA 样品一般对 OD 值和浓度有如下要求：OD260/280=1.8～2.0， OD260/230＞2.0，浓度≥100 ng/ul 。同时，需要对 DNA 样品进行琼 脂糖凝胶电泳，电泳结果显示该 DNA 样品无蛋白质和 RNA 等物质污染，无降解弥散，条带清晰。（如图所示）
3、探针设计是怎么回事，有哪些原则？ 答：探针就是与待测目的基因序列同源的一段地高辛标记的DNA序列，可以和酶切后的基因组片段特异性的结合。探针设计有如下几个原则: (1)、长度适中。探针的片段长度一般控制在300-1000bp，探针太长时会导致非特异性结合的概率增加，探针太短时，探针结合的地高辛标 记物太少，会导致发光信号减弱。 (2)、特异性强。最佳的探针序列是仅与目的基因同源，与整个基因组 序列的同源片段低于30%。 (3)、ATGC含量均匀，无发卡结构和高度重复序列。
混凝土坍落度实验报告
混凝土 试验单位：云南工商学院建筑工程学院 试验班级：2012级土木工程5班 组号：第1组 组长：金端斌 成员：金端斌，陈飞，马伊帅，唐国银，柳帅，熊安林，李雄伟，饶启彬。 指导老师：肖松涛 一．混凝土坍落度。 混凝土坍落度主要是指混凝土的塑化性能和可泵性能，影响混凝土坍落度主要有级配变化、含水量、衡器的称量偏差，外加剂的用量容易被忽视的还有水泥的温度几个方面。坍落度是指混凝土的和易性，具体来说就是保证施工的正常进行，其中包括混凝土的保水性，流动性和粘聚性。 和易性是指混凝土是否易于施工操作和均匀密实的性能，是一个很综合的性能其中包含流动性、粘聚性和保水性。影响和易性主要有用水量、水灰比、砂率以及包括水泥品种、骨料条件、时间和温度、外加剂等几个方面。 混凝土的坍落度,应根据建筑物的结构断面、钢筋含量、运输距离、浇注方法、运输方式、振捣能力和气候等条件决定，在选定配合比时应综合考虑，并宜采用较小的坍落度。 二．实验目的。 混凝土由各组成材料按一定比例配合、搅拌而成。混凝土拌和物的和易性是一项综合性的指标，它包括流动性、粘聚性和保水性等三方面的性能。由于它的内涵较为复杂，根据我国的现行标准规定，采用“坍落度”和“维脖稠度”来测定混凝土拌和物的流动性。这里先进行“坍落度”试验。 试验设备和器材：坍落度筒和弹头型捣棒、铁锹、卷尺、镘刀、磅称等。 适用范围：适用于坍落度大于10mm，集料公称最大粒径不大于31.5mm水泥混凝土的坍落度。 三．试验步骤： 1．先用湿布抹湿坍落筒，铁锹，拌和板等用具。坍落筒为上口直径100mm，下口直径200mm，高300mm，呈喇叭状。 2．称量材料：
WB实验步骤
蛋白电泳（制胶、SDS-PAGE电泳） 实验材料： SDS-PAGE凝胶制备试剂盒、电泳缓冲液、提取的蛋白或全细胞裂解液、广谱彩虹预染中分子量蛋白Marker、SDS-PAGE Loading Buffer（还原，5×）、G250蛋白快速染色试剂、若干蒸馏水 实验仪器、耗材： 蛋白电泳仪、制胶仪、水平摇床、15ml离心管、5ml移液器、微量移液器、1.5ml离心管、塑料饭盒（可在微波炉里加热使用） 配制溶液： ●配制10%APS溶液：-20度保存 0.5g APS + 5ml蒸馏水、2.5g APS + 25ml蒸馏水 ●配制200 ml电泳缓冲液：CW0045 Tris-Glycine SDS（ph8.3,10×） 20 ml Tris-Glycine SDS + 180 ml 蒸馏水 ●配制1 ml loading buffer： 200 ul 5×loading buffer +800 ul蒸馏水 实验步骤： 一．制胶： 1.参照凝胶模具说明书，装配好凝胶模具。 2.根据分离蛋白的大小配制分离胶和浓缩胶。 3.配制10%分离胶： 将不同体积的30%Acr-Bis(29:1)、分离胶缓冲液和双蒸水在小烧杯或试管中混合。 加入10%APS和TEMED，轻轻搅拌使其混匀，避免产生气泡。 配制SDS-PAGE分离胶
4.待胶灌至距离玻璃板顶端1.5cm的时候停止灌胶，加入蒸馏水水封。静置40分钟 至1小时。 5.待分离胶凝固后（水层胶层中间出现折线），倒掉蒸馏水，用滤纸将水溶液吸干。 6.配制5%浓缩胶： 7.将浓缩胶溶液加至分离胶的上面，直至凝胶溶液到达前玻璃板的顶端。 注意：灌胶速度要快，防止凝胶。 8.将梳子插入凝胶内，避免产生气泡。静置20分钟，等待浓缩胶聚合。 9.待凝胶聚合后，小心地拔出梳子，以免破坏加样孔。赶走气泡。 二．SDS-PAGE电泳: 1. 在电泳槽的内外槽灌至电泳缓冲液。 2. 制备样品： 1）蛋白样品： 根据植物蛋白或动物组织蛋白定量结果，计算蛋白提取液加入量，制备上样溶液。 蛋白提取液+ 5×上样缓冲液+ 蒸馏水，上样量为40-60ug。 制备的样品，煮沸5分钟，12,000 rpm离心5分钟，取上清，上样。
southern blot 杂交
Sourthern 杂交 （1）DIG-DNA标记：a）取1 μg的模板DNA加入灭菌双蒸水至16 μL体积；b）将16 μL的模板DNA置于100℃水浴变性10 min，之后迅速置于冰上冷却；c）加入4 μL混匀后的DIG-High Primer，混合均匀后离心，置于37℃水浴20 h以上；d）65℃水浴10 min终止反应。 （2）基因组DNA的酶切消化、电泳以及变性：a）用限制性内切酶酶切基因组DNA（30~60 μg），点样跑胶以较低的电压3 v/cm电泳酶切样品；c）将凝胶转移至含1.5 mol/L NaCl，0.5 mol/L NaOH的变性液中，室温轻轻振荡30 min，使凝胶中的基因组DNA变性（注意中间可以换液1次）；d）倒去变性液，用去离子水清洗3次，然后加入0.5 mol/L Tris-HCl，1mol/L NaCl（pH8.0）的中和液室温轻轻摇动洗涤30 min。 （3）DNA转膜：a）将带电荷的尼龙膜漂浮于含去离子水的平皿中，直至尼龙膜完全浸湿，然后转移至碱性转膜缓冲液（0.4M NaOH, 1M NaCl）中浸没5 min；b）在水平玻璃板放一张厚的滤纸（20 cm × 20 cm）作为滤纸条，待完全湿润后，用玻璃棒轻轻滑动以赶走气泡；c）从转膜缓冲液中取出浸泡过的凝胶，置于滤纸条的中央，用玻璃棒轻轻滑动，使得凝胶与滤纸条之间没有气泡；d）用塑料薄膜封闭凝胶的边缘，确保尼龙膜的边缘不能与滤纸条接触，然后吸取转膜缓冲液将凝胶表明湿润，再将尼龙膜置于凝胶上面，确保尼龙膜与凝胶之间无气泡；e）再取两张与尼龙膜同等大小的厚的滤纸置于尼龙膜的上面，用玻璃棒轻轻滑动赶走气泡；f）剪取一叠同等大小的纸巾置于两张滤纸上，再在上面平放一玻璃板，用400 g砝码压平稳，静置转移约12~24 h，期间需要频繁更换纸巾数次；h）弃纸巾、凝胶以及滤纸，在尼龙膜上用铅笔标记加样孔的位置以及方向，然后浸没于中和缓冲液（0.5M Tris-HCl, 1M NaCl）中，达30min，注意中间换洗1次，然后在10× SSC溶液中浸泡5min；i）将尼龙膜置于1张干净的滤纸上，自然风干；j）将尼龙膜置于紫外交联仪（70000 μJ/cm2）照射，正面朝上，使得DNA固定交联到尼龙膜上。 （4）探针杂交过程：a）将含有靶DNA的尼龙膜浸于盛有6×SSC的平皿中，直至尼龙膜自上而下完全浸湿，浸泡2 min；b）用镊子将尼龙膜放入杂交管中，
混凝土坍落度试验
混凝土坍落度试验 LG GROUP system office room 【LGA16H-LGYY-LGUA8Q8-LGA162】
混凝土坍落度试验 砼坍落度试验 1、试验步骤 （1）每次测定前，用湿布湿润坍落度筒、拌和钢板及其他用具，并把筒放在不吸水的刚性水平底板上，然后用脚踩住2个脚踏板，使坍落度筒在装料时保持位置固定。 （2）取拌好的混凝土拌和物15L，用小铲分3层均匀地装入筒内，使捣实后每层高度为筒高的1/3左右。每层用捣棒沿螺旋方向在截面上由外向中心均匀插捣25次。插捣筒边混凝土时，捣棒可以稍稍倾斜。插捣底层时，捣棒应贯穿整个深度，插捣第二层和顶层时，捣棒应插透本层至下一层的表面。浇灌顶层时，混凝土应灌到高出筒口，插捣过程中，如混凝土沉落到低于筒口，则应随时加料，顶层插捣完毕后，刮去多余混凝土，并用镘刀抹平。 （3）清除筒边底板上的混凝土后，垂直平稳地提起坍落度筒。坍落度筒的提离过程应在5～10s内完成。从开始装料到提起坍落度筒的整个过程应不间断地进行，并应150s内完成。 2、试验结果确定与处理 （ 1）提起坍落度筒后，立即量测筒高与坍落后混凝土试体最高点之间的高度差，即为该混凝土拌和物的坍落度值。混凝土拌和物坍落度以mm为单位，结果精确至1mm。（2）坍落度筒提离后，如混凝土发生崩坍或一边剪坏现象，则应重新取样再测定。如第二次试验仍出现上述现象，则表示该混凝土拌和物和易性不好，应予记录备查。（3）观察坍落后的混凝土试体的粘聚性和保水性。粘聚性的检查方法是用捣棒在已坍落的混凝土锥体侧面轻轻敲打，此时，如果锥体逐渐下沉，则表示粘聚性良好，如果锥体倒塌、部分崩裂或出现离析现象，则表示粘聚性不好。保水性以混凝土拌和物中稀浆析出的程度来评定。如坍落度筒提起后无稀浆或仅有少量稀浆自底部析出，则表示此混凝土拌和物保水性良好；坍落度筒提起后如有较多的稀浆从底部析出且锥体部分的混凝土也因失浆而骨料外露，则表明此混凝土拌和物的保水性能不好。（4）和易性的调整 1）当坍落度低于设计要求时，可在保持水灰比不变的前提下，适当增加水泥浆量。 2）当坍落度高于设计要求时，可在保持砂率不变的条件下，增加集料的用量。 3）当出现含砂量不足，粘聚性、保水性不良时，可适当增加砂率，反之减小砂率。 混凝土坍落度试验 一、实验目的 混凝土由各组成材料按一定比例配合、搅拌而成。混凝土拌和物的和易性是一项综合性的指标，它包括流动性、粘聚性和保水性等三方面的性能。由于它的内涵较为复杂，根据我国的现行标准规定，采用“坍落度”和“维脖稠度”来测定混凝土拌和物的流动性。这里先进行“坍落度”试验。（本试验适用于坍落度值不小于１０mm，骨料粒径不大于４０mm混凝土伴和物）。
Western_Blot操作步骤
Western Blot操作步骤 一、 Western blot 实验步骤概述 1. 组织取材：组织块称重 2. 利用液氮、研钵粉碎组织块 3. 加入RIPA缓冲液(每克组织3 ml RIPA)，PMSF(每克组织30μl，10 mg/ml PMSF)，利用Polytron进一步匀浆(15,000转/分*1分钟)维持4℃ 4. 加入PMSF(每克组织30μl，10 mg/ml PMSF)，冰上孵育30分钟 5. 移入离心管4℃约20,000 g(约15,000转)15分钟 6. 上清液为细胞裂解液可分装-20℃保存 7. 进行Bradford比色法测定蛋白质浓度 8. 取相同质量的细胞裂解液(体积*蛋白质浓度)，并加等体积的2×电泳加样缓冲液 9. 沸水浴中3分钟 10. 上样 11. 电泳(浓缩胶20mA，分离胶35mA) 12. 电转膜仪转膜(100mA 40分钟) 13. 膜用丽春红染色，胶用考马斯亮蓝染色 14. Westernblot 试剂盒显色 15. 分析比较记录 二、 Western具体实验步骤 Western，也称Western blot、Western blotting、Western印迹，是用抗体检测蛋白的重要方法之一。Western可以参考如下步骤进行操作。 1.收集蛋白样品(Protein sample preparation):可以使用适当的裂解液裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品。对于某些特定的亚细胞组份蛋白，例如细胞核蛋白、细胞浆蛋白、线粒体蛋白等，可以参考相关文献提取这些亚细胞组份蛋白，也可以使用试剂盒进行抽提。收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。根据所使用的裂解液的不同，需要采用适当的蛋白浓度测定方法。因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。如果使用北京博奥森生物技术公司生产的WIP细胞裂解液，可以使用BCA蛋白浓度测定试剂盒。 2.电泳(Electrophoresis) (1) SDS-PAGE凝胶配制:SDS-PAGE凝胶可以参考一些文献资料进行配制，也可以使用博奥森生产的SDS-PAGE凝胶配制试剂盒。该试剂盒提供了除水和配胶器具外的所有试剂以及配制各种浓度SDS-PAGE的配方。