重组人血清白蛋白在毕赤酵母表达中的降解控制
第31卷第4期
2004年北京化工大学学报
JOURNAL OF BEI J IN G UN IV ERSIT Y OF CHEMICAL TECHNOLO GY
Vol.31,No.4
2004
重组人血清白蛋白在毕赤酵母表达中的降解控制
孙战胜 陈劲春3
(北京化工大学生命科学与技术学院,北京 100029)
摘 要:在利用转基因毕赤酵母发酵表达重组人血清白蛋白时,遇到了较为严重的蛋白降解;为了抑制蛋白的降解,分别研究了温度、p H 值和氮源的加入对降解的影响。结果表明,p H 值和氮源的加入对白蛋白的降解控制有显著的正面影响,而温度的变化对降解的影响不大。当控制p H 为710,添加酵母提取物和蛋白胨体积分数分别为
015%和1%时,白蛋白的降解得到了有效的控制,可得到质量分数为58%的完整白蛋白。
关键词:毕赤酵母;重组人血清白蛋白;蛋白降解;温度;氮源中图分类号:Q93919
收稿日期:2003211220
第一作者:男,1974年生,硕士生3通讯联系人
E 2mail :sunzs0927@https://www.wendangku.net/doc/e514161164.html,
引 言
毕赤酵母是一种能以甲醇为唯一碳源的真核生
物,如今已发展成为高效的外源基因表达系统。其具有表达量高、可以高密度培养、培养成本低、产物可以分泌到胞外、糖基化程度适中等优点。迄今为止已成功的表达了100多种外源蛋白[1]。国内外目前均有用毕赤酵母表达重组人血清白蛋白(rHSA )的报道,表达中遇到的主要问题之一是rHSA 出现了不同程度的降解[223]。
关于毕赤酵母对所表达目标蛋白的降解,有的研究者认为,其中一个重要原因是氮源的缺乏[2],本文考察了不同种氮源和氮源浓度对控制蛋白降解的作用。另外,毕赤酵母在表达其它一些蛋白时,也同样存在蛋白降解的问题,目前报道控制降解的主要措施有改变生长期的p H 值[4]、低温诱导[5]等。考虑到p H 值和温度是影响酵母蛋白酶活性的重要参数[6],并参考毕赤酵母的适宜生长温度和p H 值(温度20～31℃,p H310～710),本文对温度和p H 值对降解的影响进行了实验探索。
1 材料和方法
111 供试菌株
Pichia pastoris GS115/rHSA 为本室构建,为甲
醇利用缓慢型。
112 培养基
BM GY/BMM Y 培养基以及PTM 1配方均采用Invitrogen 公司提供的标准配方[7]。PBM 培养基的
成分为甘油40g/L ,H 3PO 4(85%)2617g/L ,CaSO 4?2H 2O 016g/L ,K 2SO 4915g/L ,MgSO 4?7H 2O 718g/L ,KOH 216g/L ,PTM 12mL/L ,Biotin 0100004g/L ,
硫胺0100019g/L ,浓氨水调节为所需p H 值。试剂均为国产生化试剂纯或分析纯。113 培养方法
培养时生长期温度为30℃,p H 值通过28%浓氨水调节为所需要的p H 值如310,410,510,610,710等,培养期间每4h 调节一次p H 值维持为原p H 值。待培养基中甘油耗尽时开始加入甲醇进行诱导培养,诱导期温度按实验要求分别保持为21,24,28或30℃,p H 值用氨水或磷酸维持为610。诱导过程中每12h 补加体积分数015%的纯甲醇。摇床转速180r/min ,摇瓶培养采用500mL 的底部有挡板三角瓶(baffled flask ),装液量为50mL 。114 分析方法
rHSA 的降解分析使用SDS 2PA GE 凝胶电泳及G elpro 311凝胶分析系统。
2 结果
211 r H SA 在BMG Y/BMMY 中的表达
BM GY /BMM Y 培养基营养丰富,常用来检验
外源基因能否在毕赤酵母中正确表达蛋白。然而即使在如此营养丰富的条件下,rHSA 还是出现了两条明显的降解谱带(图1),经G elpro 311分析,完整的rHSA 仅占总蛋白量的31%。可见,rHSA 在表
达的过程中是易于降解的。由于BM GY/BMM Y
的价格较贵,用廉价的工业基础盐培养基PBM 来探索降解的控制无疑更具有实际意义
。
1,2,3,4为GS115/rHSA 在BM GY/BMM Y 中诱导后24,48,72,96h 的电泳谱带;M 为标准HSA 蛋白(下同)。
图1 BM GY /BMM Y 中rHSA 表达电泳图谱
Fig.1 SDS 2PA GE result of rHSA expressed
in BM GY /BMM Y medium
212 氮源的添加对r H SA 的影响
为了验证氮源的缺乏导致了rHSA 的降解,本文首先在培养开始时加入不同浓度YP (Yeast ex 2tract ,peptone 二者质量比为1∶2),与不添加任何氮源进行了对比。结果表明(图2),YP
的加入确实可
1,2为不添加任何氮源时诱导48,72h 的谱带;3,4为添加0125%,Y ,0150%P 时48,72h 的谱带;5,6为添加0150%Y 和110%P 时48,72h 的谱带;7,8为添加110%Y 和210%P 时48,72h 的谱带,开始培养时加入;9,10的YP 添加量与7,8相同,开
始诱导时加入。
图2 YP 的添加量对rHSA 降解的影响
Fig.2 SDS 2PAGE analysis to investigate the effect of adding
YP on degradation of rHSA in PBM medium
以有效的控制rHSA 的降解,且随着培养基中YP 浓度的升高降解逐渐减少,但当YP 的质量浓度分别达到015g/L 和110g/L 时,YP 的添加对降解的控制已经没有明显的效果了。这说明培养时存在一定的氮源饥饿只是造成rHSA 降解的原因之一。同样,对开始培养时加入YP 和诱导开始后加入YP 对降解的影响效果对比表明,二者对降解的控制效果没有明显差异(完整rHSA 分别占27%和29%)。如果说生长期是氮源的缺乏导致了毕赤酵母胞内蛋
白酶的活化而使目标蛋白降解的话,那么诱导后加入YP 对rHSA 降解的控制效果理应差于生长期加入YP 的效果。所以这里所添加YP 的作用不仅在于补充氮源,而且在很大程度上作为水解的底物起到了竞争性抑制的作用。
在验证了氮源的加入对控制rHSA 降解有效的基础上,本文进一步研究了三种氮源的添加对rHSA 降解的抑制效果。图3的结果表明,添加2g/L 无机氮源(N H 4)2SO 4对降解的抑制效果要大大弱于两种有机氮源YP 和酪蛋白水解物。这也从另一
个方面说明有机氮源作为水解的底物减少了蛋白酶
对目标蛋白的攻击。在两种有机氮源中,YP 的效果要更好一些,灭菌处理也更方便一些,所以可以作为以后上罐发酵的氮源添加物
。
1,2,3为对数生长期时加入2g/L (NH )2SO 4诱导后24,48,72h
的电泳谱带;4,5,6为加入15g/L 酪蛋白水解物相应时间的谱带;7,8,9为加入YP 的添加量分别为0150%和110%时相应时间的谱带。
图3 不同种类氮源的添加对rHSA 降解的影响
Fig.3 E ffect of different nitrogen 2source
supplements on rHSA degradation
213 培养pH 值对r H SA 降解的影响
为了清楚地观察p H 值对rHSA 水解的影响,在PBM 培养基中已加入了015%和1%的YP 。图4表明,当p H 由3到7逐渐升高时,rHSA 的降解也越来越少,p H 值对降解的影响十分明显。这与To 2moshi 提到的高p H 值可以抑制毕赤酵母中的蛋白酶活性的结论相一致[8]。却与Mehmedalija [5]提到的低p H 值可以防止蛋白的降解的结论相反。其原因可能是降解不同目标蛋白的蛋白酶活性p H 值不同所致。214 诱导温度对r H SA 的影响
Mehmedalija 在用毕赤酵母表达融合蛋白时表明,低温可以降低目标蛋白的降解。同样,为了便于观察,PBM 培养基中已加入了015%和1%的YP 。本文的结果却表明,温度对降解没有显著的影响(图
?01?北京化工大学学报 2004年
1,2为p H310时诱导48,72h 时的谱带;3,4为p H510时相应时
间的谱带;5,6为p H610时相应时间的谱带;7,8为p H710时相应时间的谱带;9,10为p H410时相应时间的谱带。
图4 不同生长期时p H 对rHSA 降解的影响
Fig.4 E ffect of medium p H on rHSA degradation
5)。这或许是毕赤酵母中目标蛋白的降解是受多种
蛋白酶共同作用的结果,低温对影响rHSA 降解的一种或几种主要蛋白酶影响作用不同
。
1,2,3为21℃下诱导24,48,72h 时的谱带;4,5,6为24℃时相
应时间的谱带;7,8为28℃下48,72h 时的谱带;9,10为30℃下
48,72h 时的谱带。
图5 不同诱导温度下对rHSA 降解的影响
Fig.5 E ffect of induce 2temperature on rHSA degradation
3 结束语
本实验所探索的条件对降解的控制达到了比较满意的结果,PBM 培养基中完整的rHSA 占蛋白总
表达量的58%(图6),但还是和Kaoru 用蛋白酶缺陷型菌株所达到的90%以上有一定差距。所以进一步的工作还应该放在工程菌本身的改造上。目前对毕赤酵母的研究表明,毕赤酵母中主要存在三种蛋白酶,即蛋白酶A 、蛋白酶B 和羧肽酶Y ,通常它们被细胞内的抑制蛋白所抑制从而表现为无活性或者弱活性。其中蛋白酶A 可以自我活化,可以使无活性的羧肽酶Y 完全活化并使蛋白酶B 前体活化为活性提高2倍的蛋白酶B [9]。对于毕赤酵母中蛋白酶A 的编码基因pep4改造或清除,将是下一步的研究工作,目前本实验室正在设计筹划当中
。
1,2,3,4分别为诱导后24,48,72,96h 的谱带
图6 rHSA 在p H 710,YP 添加量分别为015%和
110%时表达图谱
Fig.6 Expression of rHSA in the optimal conditions
with p H 710and YP (015%,110%)
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(下转第15页)
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284,294
E ffect of m ass transfer behaviour on selective catalytic reduction
of N O x with NH 3over V 2O 5/TiO 2pallet catalyst
Qu Hong 2xia Zhong Qin
(School of Chemical Engineering ,Nanjing University of Science and Technology ,Nanjing 210094,China )
Abstract :V 2O 5/TiO 2catalysts ,which were applied to the selective catalytic reduction of NO x with N H 3in a fixed bed reactor ,were prepared by impregnating.Reaction of N H 3reduced to NO x is first order for the pallet catalyst ,and the internal diffusion significantly influences the reaction rate and NO x conversion.The overall NO x conversion can be expressed as an explicit function of the space velocity and other parameters ,and a simple analytic solution was given.A good agreement between the experiment and model results was obtained.It is shown that the model equation can successfully reflect the conversion trend ,and provides a theoretical basis for designing a catalytic reactor.
K ey w ords :denitrification ;pallet catalyst of V 2O 5/TiO 2;selective catalytic reduction ;mass transfer model
(责任编辑 云志学)
(上接第11页)
R epression of r H SA degradation during fermentation
with transgenic yeast pichia pastoris
Sun Zhan 2sheng Chen Jin 2chun
(College of Life Science and Technology ,Beijing University of Chemical Technology ,Beijing 100029,China )
Abstract :One obvious problem for overexpression recombinant human serum albumin (rHSA )with the trans 2genic yeast pichia pastoris is degradation of the purpose proteins during fermentation.Minimization of degrada 2tion was therefore investigated for improving the yield of intact rHSA.The results showed that an addition of
015%yeast extract and 1%peptone (YP )to the medium was effective to decrease the degradation of the rHSA.Culture condition of high p H was also substantially reduced the degradation.However there was little ef 2fect by changing the temperature during the methanol feeding phase.By combining the optimal p H of 710with the addition of YP (015%,110%),the 58%intact rHSA was achieved.
K ey w ords :pichia pastoris ;recombinant human serum albumin ;proteolytic degradation ;temperature ;nitro 2
gen source
(责任编辑 云志学)
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51?第4期 曲虹霞等:V 2O 5/TiO 2片状催化剂上NH 3选择性还原NO x 反应传质情况研究
毕赤酵母实验操作技巧介绍材料
毕赤酵母表达实验手册 大肠杆菌表达系统最突出的优点是工艺简单、产量高、生产成本低。然而，许多蛋白质在翻译后，需经过翻译后的修饰加工，如磷酸化、糖基化、酰胺化及蛋白酶水解等过程才能转化成活性形式。大肠杆菌缺少上述加工机制，不适合用于表达结构复杂的蛋白质。另外，蛋白质的活性还依赖于形成正确的二硫键并折叠成高级结构，在大肠杆菌中表达的蛋白质往往不能进行正确的折叠，是以包含体状态存在。包含体的形成虽然简化了产物的纯化，但不利于产物的活性，为了得到有活性的蛋白，就需要进行变性溶解及复性等操作，这一过程比较繁琐，同时增加了成本。 与大肠杆菌相比，酵母是低等真核生物，具有细胞生长快，易于培养，遗传操作简单等原核生物的特点，又具有真核生物时表达的蛋白质进行正确加工，修饰，合理的空间折叠等功能，非常有利于真核基因的表达，能有效克服大肠杆菌系统缺乏蛋白翻泽后加工、修饰的不足。因此酵母表达系统受到越来越多的重视和利用。 大肠杆菌是用得最多、研究最成熟的基因工程表达系统，当前已商业化的基因工程产品大多是通过大肠杆菌表达的，其主要优点是成本低、产量高、易于操作。但大肠杆菌是原核生物，不具有真核生物的基因表达调控机制和蛋白质的加工修饰能力，其产物往住形成没有活性的包涵体，需要经过变性、复性等处理，才能应用。近年来，以酵母作为工程菌表达外源蛋白日益引起重视，主更是因为酵母是单细胞真核生物，不但具有大肠杆菌易操作、繁殖快、易于工业化生产的特点，还具有真核生物表达系统基因表达调控和蛋白修饰功能，避免了产物活性低，包涵体变性、复性等等间题［1］。 与大肠杆菌相比，酵母是单细胞真核生物，具有比较完备的基因表达调控机制
重组融合人血清白蛋白-人白介素-2+C125A突变体在毕赤酵母中的表达
５９８食品与生物技术学报第２９卷 的产物，经ＥｃｏＲＩ和ＮｏｔＩ双酶切得到长约２．２ｋｂ 的插入片断和长约９．３ｋｂ的载体片断，表明融合基 因已经成功插入到载体ｐＰＩＣｇｋ中。质粒测序结果 显示，全部序列没有发生突变，与预期一致。 １．ＧｅｌｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｏｆＩＬ２ｍｌ２．ＧｅｌｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｏｆｐＢｌｕｅ／ ＨＳＡ，３．ＤｉｇｅｓｔｉｏｎｏｆｐＢＨＩｍｗｉｔｈＥｅｏＲＩ＃４．Ｄｏｕｂｌｅｄｉｇｅｓ— ｔｉｏｎｏｆｐＢＨＩｍｗｉｔｈＥｃｏＲｌ／Ｎｏｔｌ；Ｍ．ＸＤＮＡ／ＨｉｎｄⅢＭａｒｋｅｒ 圈１重组质粒ｐＢＨｌｍ的酶切分析 Ｆｉｇ．１Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄ ｐＢＨｌｍ ３．３阳性转化子的筛选及诱导产物的Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ鉴定 质粒ｐＰＨＩｍ经ＳａｌＩ酶切，回收线性化片断，电 击转化Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓＧＳｌｌ５感受态细胞。涂布ＭＤ 平板，３０℃培养４ｄ后共长出了约４００个转化子，挑 选其中２００个菌落进行初筛，选其中表达量较高的 １０株重组菌进行复筛验证，得到一株产量最高的重 组菌Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓＧＳｌｌ５／ｐＰＨＩｍ，诱导３ｄ后上清液 的ＳＤ§ＰＡＧＥ分析和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ结果如图３ 所示。 ３’ＡＩＬ２ｍ １．ＤｉｇｅｓｔｉｏｎｏｆｐＰＩＣ９ＫｗｉｔｈＥｃｏＲｌ；２．ＤｉｇｅｓｔｉｏｎｏｆｐＰＨＩｍｗｉｔｈ ＥｃｏＲＩ；３．ＤｏｕｂｌｅｄｉｇｅｓｔｉｏｎｏｆｐＰＨＩｍｗｉｔｈＥｃｏ—Ｒｌ／ＮｏｔＩ；Ｍ．）．ＤＮＡ／ＨｉｎｄⅢＭａｒｋｅｒ 图２重组质粒ｐＰＨＩｍ的物理图谱（Ａ）和酶切分析 （Ｂ） Ｆｉｇ．２ＰｈｙｓｉｃａｌｍａｐＩＡ）ａｎｄｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓ（Ｂ）ｏｆ ｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄｐＰＨｌｍ 研究发现，表达的蛋白质的相对分子质量约为８２０００，与理论计算ＨＳＡ－ＩＬ２ｍ的相对分子质量相 符，且这一位置的蛋白与１１．－２、ＨＳＡ的抗体都能发 生免疫反应，进一步证实酵母经诱导表达ＨＳＡ— ＩＬ２ｍ。但７００００和４５０００这两处的降解条带又都 可以与ＨＳＡ的抗体发生免疫反应，认为是融合蛋 白降解所产生的条带。经白蛋白测定试剂盒测得 其中白蛋白融合蛋白的量约为６０．２ｍｇ／Ｌ（以 ＨＳＡ—ＩＬ２ｍ计）。 ３．４诱导产物的活性测定 发酵液经脱盐处理后，冻干保存。取０．１ｍｇ冻干粉用２ｍＬＰＢＳ复溶后，离心取上清，测得其中 融合蛋白的量约为３００／－ｇ／ｍＬ。采用ＩＬ－２依赖细 胞株ＣＴＬＬ一２以标准品ＩＬ－２为对照，对上清液中的 融合蛋白的生物学活性进行了测定。标准品的活 性为２×１０５ＩＵ／ｍＬ，用ＲＰＭｌｌ６４０稀释到浓度为 ２００ＩＵ／ｍＬ。测定结果表明，上清液中的融合蛋白 可以有效的刺激ＣＴＬＬ－２细胞增殖。以标准品的 最高浓度ＯＤ啪值为１００ｏ／６，计算标准品、样品梯度 百分率。将百分率换算为概率单位，以概率单位为 纵坐标，以稀释度Ｘ的对数为横坐标，绘制直线回 归图（图４），通过计算得出融合蛋白粗蛋白的比活 性为１．５１×１０６ ＩＵ／ｍｇ。
酵母表达系统使用心得
Pichia酵母表达系统使用心得 甲醇酵母表达系统有不少优点，其中以Invitrogen公司的Pichia酵母表达系统最为人熟知，并广泛应用于外源蛋白的表达。虽然说酵母表达操作简单表达量高，但是在实际操作中，并不是每个外源基因都能顺利得到高表达的。不少人在操作中会遇到这样那样的问题，收集了部分用户在使用EasySelect Pichia Expression System这个被誉为最简单的毕赤酵母表达的经典试剂盒过程中的心得体会。其中Xiang Yang是来自美国乔治城大学（Georgetown University）Lombardi癌症中心（Lombardi Cancer Center），部分用户来自国内。 甲醇酵母部分优点： 1.属于真核表达系统，具有一定的蛋白质翻译后加工，有利于真核蛋白的表达； 2.AOX强效启动子，外源基因产物表达量高，表达产物可以达到每升数克的水平； 3.酵母培养、转化、高密度发酵等操作接近原核生物，远较真核系 统简单，非常适合大规模工业化生产； 4.可以诱导表达，也可以分泌表达，便于产物纯化； 5.可以甲醇代替IPTG作为诱导物，部分甲醇酵母更可以用工业甲醇替代葡萄糖作为碳源，生产成本低。 产品性能：优点——使用简单，表达量高，His-tag便于纯化；缺点——酵母表达蛋白有时会出现蛋白切割问题。 巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）是一种能高效表达重组蛋白的酵母品种，一方面由于其是属于真核生物，因此表达出来的蛋白可以进行糖基化修饰，另一方面毕赤酵母生长速度快，可以将表达的蛋白分泌到培养基中，方便蛋白纯化。 毕赤酵母表达载体pPICZ在多克隆位点（MCR）3'端带有his-tag和c-myc epitopes，这些tag有利于常规检测和纯化，而且在MCR5'端引入了alpha factor（α-factor）用以分泌表达，并且在表达后α-factor可以自动被切除。在进行克隆的时候，如果你选择的是EcoRI，那么只需在目标蛋白中增加两个氨基酸序列即可完成。另外pPICZ系列选用的是Zeocin抗生素作为筛选标记，而诱导表达的载体需要甲醇——甲醇比一般用于大肠杆菌表达诱导使用的IPTG便宜。 第一步——构建载体 Xiang Yang：pPICZ系列有许多克隆位点可供选择，同时也有三种读码框以便不用的用户需要。 红叶山庄：有关是选择pPIC9K还是pPICZ系列？pPIC9K属于穿梭质粒，也可以在原核表达，而pPICZ系列比较容易操作，大肠和毕赤酵母均用抗Zeocin筛选（PIC9K操作麻烦一点，大肠用amp抗性，而毕赤酵母先用His缺陷筛选阳性克隆，在利用G418筛选多拷贝），而且对于大小合适（30—50KD）的蛋白在产量上是pPIC9K无法比拟的。 leslie：要做毕赤酵母表达实验，首先当然就要了解这个可爱的酵母了（椭圆形，肥嘟嘟的，十分可爱），她和大肠杆菌长得有较大区别（大肠杆菌是杆状的），因此在培养的过程中要区别这两种菌体，除了气味，浓度，颜色以外，也可以取样到显微镜中观测。大家做毕赤表达的时候应该都遇过这种情况吧，表达过程中染菌（我们实验室曾经污染过各种颜色形状的细菌，那真是一段可怕的经历），如果在不知情的情况下继续做下去，那可以就是浪费大把的
毕赤酵母重组子的MDMM签定方法
培养基的配方： YPD完全培养基：酵母提取物10g/L ，蛋白胨20g/L ，葡萄糖20g/L，（固体培养基1.5%琼脂）； MM：13.4 g/L YNB，4x10-4 g/L 生物素，5 ml/L 甲醇，15 g/L 琼脂 MD：13.4g/L酵母基本氮源；0.4mg/L生物素；20g/L葡萄糖 操作方法： 用无菌牙签挑取his+转化子的单克隆并分别按先后顺序划到MM和MD平板上（不同的克隆需换牙签），30℃培养两天，观察平板。在MM和MD平板上均能正常生长的菌落表型为Mut+（Methanol utilization plus），在MD 平板上能正常生长但在MM 平板上生长相对缓慢或者不生长的菌落表型为Muts (Methanol utilization slow)。 用点MM、MD平板点方法。 准备几块MM、MD，平板用maker笔划小格子，标号，两种平板点标号要一一对应。准备无菌牙签，点取G418板上长出点菌落，先轻轻点MM平板（小格内），再点到MD平板相同标号点小格内。如此点约100个转化子，30℃培养2-5天，观察比较MM、MD上相同标号点菌落，MD平板上生长快，MM平板上生长缓慢或不生长点为Muts，生长速度一样点为Mut+。 原理是Mut+能够快速利用甲醇为碳源，而Muts则不能利用甲醇为碳源。所以Mut+能够在含甲醇（MM)平板也快速生长，而Muts只能在含葡萄糖（MD)平板快速生长。 MD培养基是怎么筛选酵母的?细菌在这种培养基上是不是不生长?MD （Minimal Dextrose Medium，最小葡萄糖培养基）组成如下：（YNB 13.4g/l、葡萄糖20g/l、生物素4×10-4g/l、若制平板加琼脂粉15g/l），它属于组氨酸缺陷型培养基，细菌能生长，配制完后仍需高压蒸气灭菌处理。 用于表达的毕赤酵母都属于组氨酸缺陷型的，只有染色体上成功整合入重组质粒载体基因的毕赤酵母菌株才能在组氨酸缺失的MD培养基生长，以此筛选出重组子。 酵母菌可以利用有机物和无机物作为氮源，有机氮源有酵母浸膏、蛋白胨、胰蛋白胨等，无机氮源有尿素、醋酸铵、硫酸铵、磷酸氢二铵等铵盐。
毕赤酵母手册
毕赤酵母表达实验手册 作者：Jnuxz 来源：丁香园时间：2007-9-5 大肠杆菌表达系统最突出的优点是工艺简单、产量高、周期短、生产成本低。然而，许多蛋白质在翻译后，需经过翻译后的修饰加工，如磷酸化、糖基化、酰胺化及蛋白酶水解等过程才能转化成活性形式。大肠杆菌缺少上述加工机制，不适合用于表达结构复杂的蛋白质。另外，蛋白质的活性还依赖于形成正确的二硫键并折叠成高级结构，在大肠杆菌中表达的蛋白质往往不能进行正确的折叠，是以包含体状态存在。包含体的形成虽然简化了产物的纯化，但不利于产物的活性，为了得到有活性的蛋白，就需要进行变性溶解及复性等操作，这一过程比较繁琐，同时增加了成本。 大肠杆菌是用得最多、研究最成熟的基因工程表达系统，当前已商业化的基因工程产品大多是通过大肠杆菌表达的，其主要优点是成本低、产量高、易于操作。但大肠杆菌是原核生物，不具有真核生物的基因表达调控机制和蛋白质的加工修饰能力，其产物往住形成没有活性的包涵体，需要经过变性、复性等处理，才能应用。近年来，以酵母作为工程菌表达外源蛋白日益引起重视，原因是与大肠杆菌相比，酵母是低等真核生物，除了具有细胞生长快，易于培养，遗传操作简单等原核生物的特点外，又具有真核生物时表达的蛋白质进行正确加工，修饰，合理的空间折叠等功能，非常有利于真核基因的表达，能有效克服大肠杆菌系统缺乏蛋白翻译后加工、修饰的不足。因此酵母表达系统受到越来越多的重视和利用。［1］。 同时与大肠杆菌相比，作为单细胞真核生物的酵母菌具有比较完备的基因表达调控机制和对表达产物的加工修饰能力。酿酒酵母（Saccharomyces.Cerevisiae）在分子遗传学方面被人们的认识最早，也是最先作为外源基因表达的酵母宿主。1981年酿酒酵母表达了第一个外源基因----干扰素基因［2］，随后又有一系列外源基因在该系统得到表达［3、4、5、6］。干扰素和胰岛素虽然已经利用酿酒酵母大量生产并被广泛应用，当利用酿酒酵母制备时，实验室的结果很令人鼓舞，但由实验室扩展到工业规模时，其产量迅速下降。原因是培养基中维特质粒高拷贝数的选择压力消失［7、8］，质粒变得不稳定，拷贝数下降。拷贝数是高效表达的必备因素，因此拷贝数下降，也直接导致外源基因表达量的下降。同时，实验室用培养基成分复杂且昂贵，当采用工业规模能够接受的培养基时，导致了产量的下降［9］。为克服酿酒酵母的局限，1983年美国Wegner等人最先发展了以甲基营养型酵母（methylotrophic yeast）为代表的第二代酵母表达系统［10］。 甲基营养型酵母包括：Pichia、Candida等．以Pichia.pastoris（毕赤巴斯德酵母）为宿主
关于重组人血白蛋白的系统性表述
关于重组人血白蛋白的系统性表述 人血白蛋白（HSA）作为一种重要的临床急救药物及重要的药物辅料，在医药，科研及化妆品生产等领域应用广泛。随着国内医疗水平及居民收入水平的提升和对血液制品认知度的提高，血液制品的临床使用量不断增加，市场容量不断增长，行业快速发展。根据国家医药管理局的报告，2010年全国16城市医院血液系统用药金额约62亿元，其中白蛋白类药物占据了血液制品的主要份额（大于50%）。但作为一种血液制品，HSA同时也面临原料短缺及病毒污染等缺陷的影响。 用基因工程重组人血清白蛋白（rHSA）替代HSA是国际上公认的最有前途的高新技术途径。 一．什么是重组人血白蛋白 1.定义 通过基因重组的技术将目的蛋白的基因克隆后，将该基因插入到某种生物（如细菌、酵母、植物，哺乳动物细胞等）中进行复制，然后收集的白蛋白称为重组人血白蛋白。 2.rHSA的等级分类 按不同的质量标准分为了培养基级、药用辅料级和药用注射级（药用级）三类，三类级别的重组人血白蛋白生产工艺相同，但最终控制参数不同，药用级白蛋白质量标准最高。 3.rHSA的表达系统分类 白蛋白(Human Serum Albumin,HSA)是一组复杂的大分子蛋白质，必须经过正确的折叠、组装和翻译后修饰，才能赋予其特定的结构和功能，表达系统是重组人血白蛋白生产过程中极其重要的环节。 （1）原核表达系统 HSA基因最早就是在原核生物大肠杆菌(E.coli)中表达成功的，Lawn等于1981
年首次报道了rHSA的cDNA序列并首次构建了第一个表达rHSA的表达载体pHSA，然后在E.coli中表达成功，表达量为细胞总蛋白的7%，但E.coli表达系统体外很难正确折叠和组装结构复杂的HAS，缺乏翻译后的修饰和加工，表达的蛋白多形成包涵体，且纯化较难，所以未能得到有生物功能的蛋白，细菌细胞壁脂多糖还会造成热反应。因为HSA在原核生物中表达量不高且分泌效果不够理想，所以研究的重点转向其在真核生物细胞中的表达。 （2）酵母表达系统 酵母作为单细胞真核生物，既具有原核生物的容易培养、生长繁殖快、相对易于进行基因工程操作等优点，还具有原核生物缺少的其他优点，如蛋白质翻译后修饰和加工以获得有生物活性的重组蛋白，表达量和分泌量较大，易于产业化培养，非常适合白蛋白及其他非糖基化血浆蛋白的大规模制备。 研究者们用到的酵母表达系统有毕赤酵母(Pichia pastoris)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、克鲁维氏酵母(Kluyveromyces lactis)等。在酿酒酵母中，Okabayashi等通过构建在染色体LEU2和HIS4位点上整合的质粒获得能连续分泌rHSA的稳定转化株，每升培养基达到85mg rHSA。 毕赤酵母表达量和分泌量高且稳定，自身分泌蛋白量小，作为基因表达系统研究和使用的最多，已基本掌握其生长规律及大规模高密度发酵技术，被认为是最有发展前景的蛋白质生产工具之一。毕赤酵母非常适合人血白蛋白等非糖基化血浆蛋白的大规模制备，成为目前rHSA的主要表达系统。 （3）其他表达系统 作为“生物反应器”的转基因动物自1987年以来就引起学者们广泛的关注。就生产rHSA来说，最理想的表达场所是乳腺，因为乳腺是外分泌器官从而不会影响转基因动物本身的生理，表达的蛋白能经过充分的翻译后修饰加工，组织细胞密度高从而分泌水平高，目标蛋白纯化相对容易。2000年黄淑帧等通过
毕赤酵母表达手册
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毕赤酵母多拷贝表达载体试剂盒 用于在含多拷贝基因的毕赤酵母菌中表达并分离重组蛋白 综述： 基本特征： 作为真核生物，毕赤酵母具有高等真核表达系统的许多优点：如蛋白加工、折叠、翻译后修饰等。不仅如此，操作时与E.coli及酿酒酵母同样简单。它比杆状病毒或哺乳动物组织培养等其它真核表达系统更快捷、简单、廉价，且表达水平更高。同为酵母，毕赤酵母具有与酿酒酵母相似的分子及遗传操作优点，且它的外源蛋白表达水平是后者的十倍以至百倍。这些使得毕赤酵母成为非常有用的蛋白表达系统。 与酿酒酵母相似技术： 许多技术可以通用： 互补转化基因置换基因破坏另外，在酿酒酵母中应用的术语也可用于毕赤酵母。例如：HIS4基因都编码组氨酸脱氢酶；两者中基因产物有交叉互补；酿酒酵母中的一些野生型基因与毕赤酵母中的突变基因相互补，如HIS4、LEU2、ARG4、TR11、URA3等基因在毕赤酵母中都有各自相互补的突变基因。 毕赤酵母是甲醇营养型酵母： 毕赤酵母是甲醇营养型酵母，可利用甲醇作为其唯一碳源。甲醇代谢的第一步是：醇氧化酶利用氧分子将甲醇氧化为甲醛，还有过氧化氢。为避免过氧化氢的毒性，甲醛代谢主要在一个特殊的细胞器－过氧化物酶体－里进行，使得有毒的副产物远离细胞其余组分。由于醇氧化酶与O2的结合率较低，因而毕赤酵母代偿性地产生大量的酶。而调控产生醇过氧化物酶的启动子也正是驱动外源基因在毕赤酵母中表达的启动子。 两种醇氧化酶蛋白： 毕赤酵母中有两个基因编码醇氧化酶－AOX1及AOX2。细胞中大多数的醇氧化酶是AOX1基因产物。甲醇可紧密调节、诱导AOX1基因的高水平表达，较典型的是占可溶性蛋白的30%以上。AOX1基因已被分离，含AOX1启动子的质粒可用来促进编码外源蛋白的目的基因的表达。AOX2基因与AOX1基因有97%的同源性，但在甲醇中带AOX2基因的菌株比带AOX1基因菌株慢得多，通过这种甲醇利用缓慢表型可分离Muts菌株。 表达： AOX1基因的表达在转录水平受调控。在甲醇中生长的细胞大约有5%的polyA+ RNA 来自AOX1基因。AOX1基因调控分两步：抑制/去抑制机制加诱导机制。简单来说，在含葡萄糖的培养基中，即使加入诱导物甲醇转录仍受抑制。为此，用甲醇进行优化诱导时，推荐在甘油培养基中培养。注意即使在甘油中生长（去抑制）时，仍不足以使AOX1基因达到最低水平的表达，诱导物甲醇是AOX1基因可辨表达水平所必需的。 AOX1突变表型： 缺失AOX1基因，会丧失大部分的醇氧化酶活性，产生一种表型为Muts的突变株（methanol utilization slow），过去称为Mut，而Muts可更精确地描述突变子的表型。结果细胞代谢甲醇的能力下降，因而在甲醇培养基中生长缓慢。Mut+（methanol utilization plus）指利用甲醇为唯一碳源的野生型菌株。这两种表型用来检测外源基因在毕赤酵母转化子中的整合方式。 蛋白胞内及分泌表达： 外源蛋白可在毕赤酵母胞内表达或分泌至胞外。分泌表达需要蛋白上的信号肽序列，将外源蛋白靶向分泌通路。几种不同的分泌信号序列已被成功应用，包括几种外源蛋白本身分 制作者：陈苗商汉桥
毕赤酵母表达体系中重组蛋白的分离纯化
生物技术通报 BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2009年第3期 ·综述与专论· 收稿日期：2008-09-01 基金项目：国家自然科学基金（30560184），国家“863”计划（2007AA02Z114），新世纪优秀人才支持计划（NCET -04-0837），海南省重点学科建 设项目专项与海南省教育厅高等学校科研项目（Hjkj200719） 作者简介：高炳淼（1982-），男，安徽明光人，硕士研究生，研究方向：海洋药物通讯作者：罗素兰，Tel ：0898-********，E -mail ：luosulan2003@https://www.wendangku.net/doc/e514161164.html, 从生物体中有效分离纯化基因重组蛋白质一直是个难题。对于基因重组蛋白纯化技术来说，选择合适的表达系统是相当重要的，因为表达系统决定了细胞培养过程中产物的性质以及可能产生的杂蛋白。毕赤酵母是近年来流行的原核和真核蛋白质的表达载体。毕赤酵母能使外源真核基因正确翻译和翻译后加工，并分泌多种蛋白质，使产物易于提纯。纯化重组蛋白质的主要目的是分离出目的蛋白，主要的方法有浓缩沉淀、离子交换、亲和层析、反相层析等。 1酵母表达体系 巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris ）是在酿酒酵母 表达体系的基础上，用其他的酵母菌株构建的、可高效稳定表达外源基因的新表达系统，即甲醇营养 型酵母（Methy -lotrophicyeast ）表达系统[1]。作为第2代酵母表达系统，它不仅克服了大肠杆菌表达系统不能表达结构复杂的蛋白质、表达的蛋白不能分泌到细胞外、背景蛋白多、表达水平低等缺点，并且弥补了哺乳类细胞、昆虫细胞表达系统操作复杂、表达水平低、产业化生产造价昂贵的不足，此外，还具有其他酵母表达系统无法比拟的优越之处[2]。 巴斯德毕赤酵母表达系统具有强有力的醇氧化酶基因启动子，可严格调控外源蛋白的表达；同时作为真核表达系统，可对表达的蛋白进行翻译后的加工与修饰，从而使表达出的蛋白具有生物活性[3]。另外，毕赤酵母菌营养要求低、生长快、培养基廉价，易于进行操作和培养；其高密度发酵技术业已成熟，便于工业化生产；表达量高，许多蛋白可达到 毕赤酵母表达体系中重组蛋白的分离纯化 高炳淼 长孙东亭罗素兰安婷婷 （热带生物资源教育部重点实验室海南大学海洋学院材料与化工学院海南大学生物技术实验中心，海口570228） 摘 要：随着基因重组技术的快速发展，基因工程产品的利用越来越广泛，但其分离纯化的成本约占总成本的 60%~70%。因此，探索一些简单有效的分离纯化方法尤为必要。简单介绍了目前较为流行的毕赤酵母表达体系，着重概述了重组蛋白分离纯化技术方法的应用情况。 关键词：毕赤酵母 重组蛋白质 分离 纯化 Study on Separation and Purification of Recombinant Proteins in Pichia pastoris Expression System Gao Bingmiao Zhangsun Dongting Luo Sulan An Tingting （Key Laboratory for Tropical Biological Resources ，Ministry of Education Ocean College College of Materials &Chemical Engineering Center for Experimental Biotechnology ，Hainan University ，Haikou 570228） Abstract ：Along with fast development of the gene recombinant technology ，the application of genetic engineering product is getting widespread ， but the cost of the separation and purification approximately have been being high.So it is essential to explore simple and effective separation and purification method to decrease the cost.This review focused on progress of Pichia pastoris yeast expression system ，the technique of separation and purification of the recombinant proteins recently. Key words ：Pichia pastoris R ecombinant protein Separation Purification
毕赤酵母表达操作手册(精译版)
毕赤酵母多拷贝表达载体试剂盒 用于在含多拷贝基因的毕赤酵母菌中表达并分离重组蛋白 综述： 基本特征： 作为真核生物，毕赤酵母具有高等真核表达系统的许多优点：如蛋白加工、折叠、翻译后修饰等。不仅如此，操作时与E.coli及酿酒酵母同样简单。它比杆状病毒或哺乳动物组织培养等其它真核表达系统更快捷、简单、廉价，且表达水平更高。同为酵母，毕赤酵母具有与酿酒酵母相似的分子及遗传操作优点，且它的外源蛋白表达水平是后者的十倍以至百倍。这些使得毕赤酵母成为非常有用的蛋白表达系统。 与酿酒酵母相似技术： 许多技术可以通用： 互补转化基因置换基因破坏另外，在酿酒酵母中应用的术语也可用于毕赤酵母。例如：HIS4基因都编码组氨酸脱氢酶；两者中基因产物有交叉互补；酿酒酵母中的一些野生型基因与毕赤酵母中的突变基因相互补，如HIS4、LEU2、ARG4、TR11、URA3等基因在毕赤酵母中都有各自相互补的突变基因。 毕赤酵母是甲醇营养型酵母： 毕赤酵母是甲醇营养型酵母，可利用甲醇作为其唯一碳源。甲醇代谢的第一步是：醇氧化酶利用氧分子将甲醇氧化为甲醛，还有过氧化氢。为避免过氧化氢的毒性，甲醛代谢主要在一个特殊的细胞器－过氧化物酶体－里进行，使得有毒的副产物远离细胞其余组分。由于醇氧化酶与O2的结合率较低，因而毕赤酵母代偿性地产生大量的酶。而调控产生醇过氧化物酶的启动子也正是驱动外源基因在毕赤酵母中表达的启动子。 两种醇氧化酶蛋白： 毕赤酵母中有两个基因编码醇氧化酶－AOX1及AOX2。细胞中大多数的醇氧化酶是AOX1基因产物。甲醇可紧密调节、诱导AOX1基因的高水平表达，较典型的是占可溶性蛋白的30%以上。AOX1基因已被分离，含AOX1启动子的质粒可用来促进编码外源蛋白的目的基因的表达。AOX2基因与AOX1基因有97%的同源性，但在甲醇中带AOX2基因的菌株比带AOX1基因菌株慢得多，通过这种甲醇利用缓慢表型可分离Muts菌株。 表达： AOX1基因的表达在转录水平受调控。在甲醇中生长的细胞大约有5%的polyA+ RNA 来自AOX1基因。AOX1基因调控分两步：抑制/去抑制机制加诱导机制。简单来说，在含葡萄糖的培养基中，即使加入诱导物甲醇转录仍受抑制。为此，用甲醇进行优化诱导时，推荐在甘油培养基中培养。注意即使在甘油中生长（去抑制）时，仍不足以使AOX1基因达到最低水平的表达，诱导物甲醇是AOX1基因可辨表达水平所必需的。 AOX1突变表型： 缺失AOX1基因，会丧失大部分的醇氧化酶活性，产生一种表型为Muts的突变株（methanol utilization slow），过去称为Mut，而Muts可更精确地描述突变子的表型。结果细胞代谢甲醇的能力下降，因而在甲醇培养基中生长缓慢。Mut+（methanol utilization plus）指利用甲醇为唯一碳源的野生型菌株。这两种表型用来检测外源基因在毕赤酵母转化子中的整合方式。 蛋白胞内及分泌表达： 外源蛋白可在毕赤酵母胞内表达或分泌至胞外。分泌表达需要蛋白上的信号肽序列，将外源蛋白靶向分泌通路。几种不同的分泌信号序列已被成功应用，包括几种外源蛋白本身分
毕赤酵母同源重组的原理及目的基因整合方式
毕赤酵母同源重组的原理及目的基因整合方式毕赤酵母同源重组的原理及目的基因整合方式通过转化DNA与毕赤酵母基因组中同源序列的同源重组，毕赤酵母与酿酒酵母一样可产生 稳定的阳性转化子。这些重组的菌株在无选择压力条件下，即使其携带的基因是多拷贝的， 也表现出极度稳定性。常用的表达载体都含有HIS4基因，编码组氨酸脱氢酶基因，这些载 体经限制性内切线性化以后，可在AOX1或his4位点进行同源重组，从而产生HIS+重组子。单交换插入比双交换（替换）要更容易发生，多拷贝事件自发发生的几率只有单交换几率的 1-10%。 1. 基因插入AOX1或aox1::AGR4位点 GS115 的AOX1或KM71 的aox1::AGR4 位点可以与载体上AOX1位点（AOX1 启动 子，AOX1 转录终止子TT或下游3’AOX1三个位点发生同源重组，这样就在AOX1 或 aox1::AGR4 基因的上游或下游插入一个或多个基因拷贝。因为插入的表达盒没有破坏 原有基因组中的AOX1，所以转化子在GS115 中为HIS+ Mut+表型，在KM71 中为HIS+ Muts表型。 2. 基因替换AOX1位点
在his4 菌株如GS115 中，载体及基因组中AOX1启动子及3’AOX1 区的双交 换事件(取 代)，结果AOX1 编码区全部被取代，产生HIS＋Muts 表型。以AOX1 位点由基 因替 代而产生的Muts表型作为指示，可很容易地筛选出HIS＋转化子的Mut 表 型。基因取 代的结果是缺失了AOX1 位点（Muts），增加了含有pAOX1、目的基因、HIS4 的表达 盒。基因取代（双交换事件）不如基因插入（单交换事件）发生得多。 3. 基 因插入His4位点 GS115（Mut+）或KM71（Muts）中，载体上HIS4 基因与染色体上his4 位点之 间发生 单交换事件，结果在his4位点插入一个或多个基因拷贝。由于基因组上AOX1 或 aox1::AGR4 位点未发生重组，这些His＋转化子的表型均与亲本菌株相同。 4. 多拷贝插入 尽管多拷贝事件自发发生的概率很低，但是通过在培养基中加入选择性标记， 还是很容 易在转化子中筛选到插入多拷贝的表达核的转化子。
CHO细胞表达系统与酵母细胞表达系统比较
CHO细胞表达系统与酵母细胞表达系统比较 CHO细胞表达系统与毕赤酵母表达系统是当前发展前景看好的两个表达系统，为了能够更加直观地对两个表达系统有一定的认识，特意在此篇中对两个表达系统作一定的比较，从而能够更进一步的对两个表达系统有更深的了解 1．CHO细胞表达系统 （1）优点 CHO细胞属于成纤维细胞，既可以贴壁生长。也可以悬浮生长。目前常用的CHO细胞包括原始CHO和二氢叶酸还原酶双倍体基因缺失型(DHFR-)突变株CHO。近年来，为降低生产成本和减少血制品带来的潜在危害性，动物细胞生产开始使用无血清培养基(SFM)，但SFM往往导致细胞活力差，贴壁性差，分泌外源蛋白的能力差等缺点。另有研究者尝试将类胰岛素生长因子IGF基因和转铁蛋白基因转入CHO细胞获得能自身分泌必需蛋白的“超级CHO”，无需在培养基中转铁蛋白和胰岛素，细胞可在SFM 中生长良好。与其他表达系统相比，CHO表达系统具有以下的优点： (1)具有准确的转录后修饰功能，表达的蛋白在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然蛋白分子； (2)既可贴壁生长，又可以悬浮培养，且有较高的耐受剪切力和渗透压能力； (3)具有重组基因的高效扩增和表达能力，外源蛋白的整合稳定； (4)具有产物胞外分泌功能，并且很少分泌自身的内源蛋白，便于下游产物分离纯化； (5)能以悬浮培养方式或在无血清培养基中达到高密度培养。且培养体积能达到1000L以上，可以大规模生产。 （2）存在的问题 在过去的几十年里，人类对动物细胞的培养技术进行了大量的研究开发，取得了很大进展，但是利用CHO细胞表达外源基因的技术水平尚不能满足生物药品的开发和生产的要求，目前上游工作中主要存在以下问题： ①构建的重组CHO细胞生产效率低，产物浓度亦低； ②某些糖基化表达产物不稳定，不易纯化； ③重组CHO细胞上游构建与下游分离纯化脱节，主要表现在上游构建时着重考虑它的高效表达，而对高教表达的产物是否能有效地提取出来，即分离纯化过程考虑较少； ④重组细胞培养费用昂贵，自动化水平低下。 2．毕赤酵母细胞表达系统 （1）特点 自1987年Gregg等首次在毕赤酵母中表达乙型肝炎表面抗原(HBsAg)到1995年，已有四十多种外源蛋白在毕赤酵母宿主菌中获得表达。而最近几年每年报道的在毕赤酵母中表达的外源基因就有几十种，且一年比一年多，与其它表达系统相比，毕赤酵母表达系统具有以下优势： 1）含有特有的强有力的AOX（醇氧化酶基因）启动子，用甲醇可严格地调控外源基因的表达； 2）表达水平高，即可在胞内表达，又可分泌型表达。毕赤酵母中，报道的最高表达量为破伤风毒素C为12g/l，一般大于1g/l。绝大多数外源基因比在细菌、酿酒酵母、动物细胞中表达水平高。一般毕赤酵母中外源基因都带有指导分泌的信号肽序列，使表达的外源目的蛋白分泌到发酵液中，有利于分离纯化； 3）发酵工艺成熟，易放大。已经有大规模工业化高密度生产的发酵工艺，且细胞干重达100g/l 以上，表达重组蛋白时，已成功放大到10000升； 4）培养成本低，产物易分离。毕赤酵母所用发酵培养基十分廉价，一般碳源为甘油或葡萄糖及甲
【CN109810185A】一种重组人血清白蛋白的分离纯化方法【专利】
(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910276004.5 (22)申请日 2019.04.08 (71)申请人 北京蛋白质组研究中心 地址 102206 北京市海淀区中关村生命科 学园生命园路38号 (72)发明人 钱小红 张养军 余谦 张普民 高方圆 焦丰龙 夏朝双 张汉卿 (74)专利代理机构 北京纪凯知识产权代理有限 公司 11245 代理人 关畅 (51)Int.Cl. C07K 14/765(2006.01) C07K 1/36(2006.01) C07K 1/18(2006.01) C07K 1/20(2006.01) C07K 1/30(2006.01) (54)发明名称 一种重组人血清白蛋白的分离纯化方法 (57)摘要 本发明公开了一种重组人血清白蛋白的分 离纯化方法。该方法首先采用热乙醇沉淀法从转 基因猪血浆中对重组人白蛋白进行粗提纯，再利 用两种色谱方法以串联方式进一步精纯化，即先 用阴离子交换色谱法进行第一步精纯化，再采用 反相色谱法或者凝胶色谱法进行二次精纯化。结 果表明，本发明能从转基因猪血浆中分离纯化出 高纯度的重组人血清白蛋白，并有望替代人血清 白蛋白用于临床用药和生化研究中。权利要求书2页 说明书5页 附图3页CN 109810185 A 2019.05.28 C N 109810185 A
权 利 要 求 书1/2页CN 109810185 A 1.一种对含有重组人血清白蛋白的血浆中的重组人血清白蛋白进行分离纯化方法，包括： 1)去除含有重组人血清白蛋白的血浆中的凝血因子和纤维蛋白原后，将所得血浆上清液用热乙醇沉淀法进行粗提纯，得到rHSA粗提取液； 2)将所述rHSA粗提取液脱盐浓缩后，用阴离子交换色谱柱洗脱，收集洗脱液即为第一步精纯化rHSA溶液； 3)将所述第一步精纯化rHSA溶液脱盐浓缩后，用反相色谱柱或凝胶色谱柱进行二次精纯化，即得到rHSA溶液，完成所述重组人血清白蛋白的分离纯化。 2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述含有重组人血清白蛋白的血浆按照如下步骤制得：对含有重组人血清白蛋白的血进行血浆抗凝处理后离心，收集上清液而得； 具体的，所述血浆抗凝处理步骤中，所用抗凝剂为柠檬酸钠水溶液；所述含有重组人血清白蛋白的血与抗凝剂的体积比为15:1～20:1；所述抗凝剂的浓度为70g/L～90g/L； 所述离心步骤中，离心力为1500-2500×g；具体为2000×g；时间为20-40min；具体为30min。 3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述步骤1)去除含有重组人血清白蛋白的血浆中的凝血因子和纤维蛋白原的方法包括：将所述含有重组人血清白蛋白的血浆冷冻沉淀，解冻后离心，收集上清液，即为所述血浆上清液； 具体的，所述冷冻沉淀步骤中，温度为-30--10℃；具体为-20℃； 所述解冻步骤中，温度为0-10℃；具体为4℃； 所述离心步骤中，离心力为4500-5500×g；具体为5000×g；时间为10-20min；具体为15min。 4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：所述步骤1)热乙醇沉淀法包括：将所述血浆上清液与由蛋白保护剂、变性剂、氯化钠和水组成的混合液混匀后，调节pH至 5.0～7.0，在55℃～80℃，恒温保持20～60min，冷却至室温后调节pH至4.0～5.0，静置，一次离心，收集上清，淋洗所得沉淀，再进行二次离心，收集上清，合并两次上清，即为所述rHSA粗提取液。 5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述蛋白保护剂为辛酸钠；所述辛酸钠在由蛋白保护剂、变性剂、氯化钠和水组成的混合液中的浓度为5～10g/L； 所述变性剂为有机溶剂；具体为乙醇；所述氯化钠在由蛋白保护剂、变性剂、氯化钠和水组成的混合液中的浓度为5～9g/L；所述由蛋白保护剂、变性剂、氯化钠和水组成的混合液的体积用量与所述血浆上清液相同； 所述变性剂的用量为所述血浆上清液体积的8％～12％； 所述静置步骤中，温度为室温；时间为1-3h；具体为2h； 所述淋洗步骤中，所用淋洗液为pH值为4.8的蒸馏水； 所述一次离心和二次离心步骤中，离心力为4500-5000×g；具体为5000×g；时间为50-70min；具体为60min。 6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于：所述步骤2)中，所用流动相A为0.02mol/L Tris-HCl，流动相B为0.02mol/L Tris-HCl+0.3mol/L NaCl； 所用阴离子交换色谱柱为DEAE弱阴离子交换色谱柱；流速为1mL/min；柱温为室温；检 2
转基因水稻大规模生产重组人血清白蛋白
转基因水稻大规模生产重组人血清白蛋白 由武汉大学生命科学院教授、武汉禾元生物科技有限公司董事长杨代常领衔的研发团队从2006年开始进行植物源替代血浆来源的医药蛋白的 研究与开发，现已取得突破性进展并已跨入规模化生产的阶段，填补了国际上此项技术空白。相关论文于2011年10月31日在线发表于《美国 科学院院报》。该论文在线之际，受到国外Scientist ，Nature news, The Australian, Thomson Reuters, Fox News, Agence France Presse (AFP法新社)等美国、英国、俄罗斯、德国、巴西、印度各专业杂志及媒体的广泛关注和报道。 该研究表明由转基因水稻种子生产的重组人血清白蛋白(OsrHSA)在生理生化性质、物理结构，生物学功能、免疫原性与血浆来源的人血清白 蛋白一致；并建立了大规模生产重组人血清白蛋白的生产工艺，获得了高纯度和高产量重组人血清白蛋白产品。利用大量数据证明了转基因 水稻种子可取代现有基于发酵的表达技术来生产重组蛋白质是经济有效的。正如PNAS 审稿人对该文章的评价：“这篇文章解决了在科学上振 奋人心、在经济上都非常重要的议题－－即用转基因植物生产血浆产品或其他蛋白产品的技术平台，可代替其他基于发酵的表达技术，其重 要性也不言而喻……这篇文章近乎完美地证实了植物生产的医药蛋白和批准临床使用的血浆来源医药蛋白是完全相同的，并提供了翔实数据 证明植物系统规模化容易和成本优势。” 目前，人血清白蛋白(human serum albumin)广泛应用于临床治疗和细胞培养领域。常见的人血清白蛋白大多数从人的血浆中提取，这样的生 产方式不仅受到血浆供应的限制，而且还具有携带病毒传播的高风险性。国际上以重组人血白蛋白替代血源产品的应用已成为趋势，国内市 场需求也逐年扩大，2010年已达150吨。尽管市场广阔，但高纯度重组人血白蛋白的规模化生产技术和质量控制技术却是世界性难题。武汉禾 元历经多年的技术攻关，利用水稻胚乳表达技术平台，研发出国际先进水平的重组人血白蛋白产品生产技术，并成功实现重组人血白蛋白规 模化和产业化，完全摆脱了相关制约，具有纯度更高、无动物组分、安全、高效、绿色环保、廉价、无限量供应等优势。随着植物源重组人 血清白蛋白的发展，我国人血清白蛋白日益紧张的局面必将得到缓解。
毕赤酵母产木聚糖酶实验方案(最终)
重组毕赤酵母产木聚糖酶摇瓶培养实验 一、实验目的 1)熟练摇瓶发酵的操作流程和无菌操作技术。 2)掌握细胞浓度、产物浓度的表征和测定方法。 3)熟悉测定生长曲线和产物生成曲线的方法。 二、毕赤酵母简介 甲醇营养型毕赤酵母(Pichia pastoris) 表达系统是80年代初被开发和研制的一种新型酵母表达系统。40年前，Ogata等人首次发现有些酵母能够利用甲醇作为唯一的碳源和能源进行生长。随后，甲醇营养酵母作为潜在的单细胞蛋白(single cell protein, SCP) 来源立即引起广泛关注，最初将其作为高蛋白的动物饲料在市场上销售。在20世纪70年代，Phillips Petroleum公司开发出毕赤酵母利用甲醇生长的培养基、发酵操作手册和高密度连续培养生产工艺。70年代的石油危机导致了甲烷价格的急剧上升，与此同时，动物饲料蛋白的主要替代源——大豆价格的下降，导致利用甲醇生产SCP在经济上已不再合适。在以后的10年中，PhiLLips PetroLeum公司与SIBIA公司合作开发利用毕赤酵母作为生物体表达外源蛋白的研究，研究人员分离了醇氧化酶(alcohol oxidase, AOX) 的基因和启动子，构建了表达载体和菌株，开发了毕赤酵母基因操作相关技术。成熟的SCP发酵方法的开发，加上醇氧化酶强启动子的可调控表达特性，极大地影响着外源蛋白在毕赤酵母中的高水平表达。1993年，Phillips Petroleum公司委托Invitrogen公司代理毕赤酵母表达系统产品。 毕赤酵母能在以甲醇为唯一碳源的培养基中快速生长，其中醇氧化酶AOX——甲醇代谢途径的关键酶可达细胞可溶性蛋白的30％。而在葡萄糖、甘油或乙醇作为碳源的培养细胞中则检测不到AOX。AOX的合成是在转录水平调控的。其基因启动子具有明显的调控功能，可用于调控外源基因的表达。此调控作用是由一般碳源抑制/解抑制及碳源特殊诱导机制控制的。外源基因在甲醇以外的碳源中处于非表达状态，而在培养液中加入甲醇后，外源基因即被诱导表达。巴斯德毕赤酵母中存在着一种称为微体的细胞器，其中大量合成过氧化物酶，因此也称为过氧化物酶体。