引物查询方法
引物查询方法
一共有两种查询引物的方法，包括primerbank和primer3，当我
们查到引物时，我们需要用Pubmed来验证。详细说明见下文。
1.Primerbank
用引物银行查询引物时，我们只需要输入引物的名称，种属
网址：https://www.wendangku.net/doc/ef15556739.html,/primerbank/
1.将search by 修改为
keyword
2.将species修改为您
所需要的种属，如
mouse
3.输入您所需查的基因
的名字，如atg5
4.点击submit
2.primer 3
使用这个工具之前您需要在Pubmed 中查到您的目的基因的序列，然后黏贴到primer3中，软件便会自动设计引物。
Pumed 的使用方法如下：
网址：https://www.wendangku.net/doc/ef15556739.html,/pubmed/
您将得到所需查的基因的引物的结果
点击这里，您将看到引物在编码序列中的位置
点击这里绿色的部分，您可以看到这个引物的Qpcr 的结果
修改为nucleotide
输入您的目
的基因，如
atg7
最后单击
search 点击这里选种属
筛选符合您需求的，我们是自噬相关的atg7，因此选这个
点击fasta选项
这就是您所要的序列，复制
Primer3
网址：
http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/
打开primer3的网址
选中pick left 和pick right
修改为您所需产物的大小范围
点击这个选项
修改为None 黏贴如在pubmed 中查到的基因序列
这就是结果的页面
这个是软件默认的最好的引物，下面还有其他引物
完成引物的设计后，我们可以用pubmedblast来验证引物
Blast
网址：https://www.wendangku.net/doc/ef15556739.html,/Blast.cgi
输入网址会显示以下页面，按照以下步骤便可验证
下拉页面，您将看到软件
对您的基因锁设计的全部
引物
.输入网址后选择网页下面的这个
地方，
primer blast
输入查得的上下游引物的序列
修改您所期望得到的扩增产物的大小，如qpcr 一般在200以内
修改种属
最后点击页面最下的此选项
点击这个紫色的，这是引物的一个编号，您会看到详细的介绍
大概就是这样，不足之处还望大家给予建议和谅解
这个页面有引物的位置
等信息
点击这里您会看到一些文献是使用过atg7的，但不一定是您所查的那一个
引物设计的原理与方法
引物设计的原理与方法 This model paper was revised by the Standardization Office on December 10, 2020
PCR引物设计的原理及方法 阎振鑫S111666(四川大学生命科学学院细胞生物学成都 610014) 摘要：自20世纪后期发展了PCR技术以来，PCR已经改变了整个生物学研究的进程。而PCR反应的第一步就是设计引物，引物设计的好坏直接关系到PCR的成败。PCR引物设计有许多的原则必须要遵循：引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构，引物与模板的序列要紧密互补。引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应等。另外，引物的设计方法也越来越多，出现了许多专门的设计软件和网站，如：PrimerPremier5.0等。 关键词：PCR 引物原理方法 NCBI PrimerPremier5.0 PCR primer design principle and method YanZhenxin (sichuan Univercity, Life science college cell biology chengdu 610014 ) Abstract: When PCR technology was find, PCR has changed all of the program in research of biology. The design of primer is the frist step of PCR. It is relation to the fate of PCR. There are some principals must be obey: dipolymer and hairpin structure must be avoid between different primers. The DNA polymerization reaction should not be triggered at the wrong site. Therefore, there are more and more methods of design primer, include the professional softwares and professional web site. Key word: PCR primer principle NCBI PrimerPremier5.0 聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction。PCR)是20世纪后期发展起来的 一种体外扩增特异DNA片断的技术。具有快速、简便及高度敏感等优点，能极大地缩短目的基因扩增时间[1]。因此，其一直是生物学者们致力于构建cDNA文库、基因克隆以及表达调控研究的必要前提和基础[2]。PCR的第一步就是引物设计。引物设计的好坏，直接影响了PCR的结果，因此这一步很关键。成功的PCR反应既要高效，又要特异性扩增产物，因此对引物设计提出了较高的要求。引物设计需要注意的地方很多，在大多数情况下，我们都是在知道已知模板序列时进行PCR扩增的。在某些情况比如构建文库的时候也会在不知道模板序列的情况下进行设计。这个时候随机核苷酸序列
引物设计基本方法
Primer 5.0搜索引物： 1.Primer Length我常设置在18－30bp,短了特异性不好，长了没有必要。当然有特殊要求的除外，如加个酶切位点什么的。 2.PCR Product size最好是100－500bp之间，小于100bp的PCR产物琼脂糖凝胶电泳出来，条带很模糊，不好看。至于上限倒也不必要求苛刻。 3.Search parameters还是选Manual吧，Search stringency应选High，GC含量一般是40－60％。其它参数默认就可以了。 4.搜索出来的引物，按Rating排序，逐个送Oligo软件里评估。当然，搜索出的引物，其扩增产物很短，你可以不选择它，或是引物3端≥2个A或T,或引物内部连续的G或C太多,或引物3端≥2个G或C，这样的引物应作为次选，没得选了就选它。对于这样的引物，如果其它各项指标还可以，我喜欢在引物末端去掉一个不满意的或加上一个碱基，看看引物的评估参数有没有变好点。 Oligo 6.0评估引物： 1.在analyze里,Duplex Formation不管是上游引物、下游引物还是上下游引物之间，The most stable 3’-Dimer绝对值应小于4.5kcal/mol, The most stable Dimer overall绝对值一般应小于多少kcal/mol跟PCR退火温度有关，我几次实验感觉在PCR退火温度在65°的时候，The most stable Dimer ove rall 6.7kcal/mol没有问题。 2.Hairpin Formation根据黄金法则 3.False priming sites: Primer的priming efficiency应该是错配地方的4倍左右，更多当然更好。 4.在PCR栏，个人感觉其所显示的optimal annealing temperature数值值得参考。在PCR摸索条件的时候，退火温度为其数值加减2的范围就可以了。 5.Internal stability很重要：我们希望引物的内部稳定性是中间高、两边低的弧形，最起码保证3端不要过于稳定。下图1引物3端过于稳定，很容易导致不适当扩增。△G参照黄金法则，这其实很好理解：把一滴水放到大海里，这滴水就会不停的扩散分布，扩散的越厉害越稳定，所以△G绝对值越大结构越稳定。 最后说一句，敢于尝试就会成功。 第二贴 －－科室工作很多，小医生了，没有办法，所以肯怕不能满足很多战友的要求（qq聊或帮助设计），在此表示抱歉。就楼上的问题我试着回答一下，不一定正确，供参考吧。 －－1、两个评价系统不一样，个人感觉oligo评价引物好点，primer出来的引物，我一般按效率排序，再结合退火温度和引物长度，选择引物到oligo测试。这是初步的选择，其实引物到了oligo里，退火温度也不一样。 －－2、3端的二聚体应该避免，这个要看你的退火温度决定，一个50°的退火温度肯定和65°对二聚体的影响不一样了，一般来讲尽量控制在－4.5kcal/mol以下（个人观点，很多东西真得还是需要自己摸索）。 －－3、个人感觉3端有A无A影响不大，3端有T的没有经验。有T是不是一定不行，个人感觉不见得。软件是评估，法则也不是没有例外，不是1＋1＝2那么确定。 －－4、错配和二聚体谁轻谁重，个人觉得“到致命的程度”谁都重要，我也说不好。我设计的时候，尽量两个都不得罪。 －－5、GC含量并非不重要，它直接影响引物各端稳定性，3端来两个G或C,稳定性就上去了，粘在模板上很牢。所以我设计的时候，尽量避免这样的情况出现。 谈一下我学这个引物设计的过程吧：
引物设计原则
1. 引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA聚合酶进行反应。 2. 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错配。引物3’端出现3个以上的连续碱基，如GGG或CCC，也会使错误引发机率增加。 3. 引物3’端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A的错配效率明显高于其他3个碱基，因此应当避免在引物的3’端使用碱基A。另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败。5’端序列对PCR影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物。 4. 引物序列的GC含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。 5. 引物所对应模板位置序列的Tm值在72℃左右可使复性条件最佳。Tm值的计算有多种方法，如按公式Tm＝4(G+C)＋2(A+T)，在Oligo软件中使用的是最邻近法(the nearest neighbor method)。 6. ΔG值是指DNA双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用3’端ΔG值较低（绝对值不超过9），而5’端和中间ΔG值相对较高的引物。引物的3’端的ΔG值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。 7. 引物二聚体及发夹结构的能值过高（超过mol）易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行。 8. 对引物的修饰一般是在5’端增加酶切位点，应根据下一步实验中要插入PCR 产物的载体的相应序列而确定。 引物序列应该都是写成5-3方向的， Tm之间的差异最好控制在1度之内， 另外我觉得扩增长度大一些比较好，500bp左右。 要设计引物首先要找到DNA序列的保守区。同时应预测将要扩增的片段单链是否形成二级结构。如这个区域单链能形成二级结构，就要避开它。如这一段不能形成二级结构，那就可以在这一区域设计引物。
引物设计的11条黄金法则
引物设计的11条黄金法则
PCR引物设计的11条黄金法则 1.引物最好在模板cDNA的保守区内设计。DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如DNAman）比对（Alignment），各基因相同的序列就是该基因的保守区。 2.引物长度一般在15~30碱基之间。 引物长度（primerlength）常用的是18-27bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于TaqDNA聚合酶进行反应。 3.引物GC含量在40%~60%之间，Tm值最好接近72℃。 GC含量（composition）过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。另外，上下游引物的Tm值（meltingtemperature）是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度。有效启动温度，一般高于Tm值
5~10℃。若按公式Tm=4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。 4.引物3′端要避开密码子的第3位。 如扩增编码区域，引物3′端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。 5.引物3′端不能选择A，最好选择T。 引物3′端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，当末位的碱基为A时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为T 时，错配的引发效率大大降低，G、C错配的引发效率介于A、T之间，所以3′端最好选择T。 6.碱基要随机分布。 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错误引发（Falsepriming）。降低引物与模板相似性的一种方法是，引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端
考试阅卷方法和流程
考试阅卷方法和流程 一级建造师方法信息:一级建造师考试阅卷方法和流程 阅卷是把多年来人工阅卷积累起来的丰富经验和现代高新技术相结合，以计算机*络技术和电子扫描技术为依托，以控制主观题(案例题)的评分误差，实现考试公平性原则为目的的一种新型阅卷方式。近年来，已经普遍应用到各种重要考试阅卷中。*上阅卷时，教师不是对考生的原始答卷直接评分，而是在计算机*络上对电子化了的考生答卷评分。建造师执业资格考试也将实行计算机*上阅卷。考生必须对*上阅卷有所认识，以避免出现答题技术上的丢分，影响考试成绩。 在印制试卷时，将试题与答卷分开，即试题部分不再给考生留作答空间，所有题的作答区域都印制在答题卡上。考生在答题时，客观题(单项选择题和多项选择题)在答题卡上相应位置涂黑，主观题(案例题)在答题卡的相应区域内作答。 阅卷过程因主观题和客观题不同，分为不同的阅卷阶段。 客观题的阅卷过程相对比较简单，阅卷时先用高速扫描仪或专用阅卷机快速扫描答题卡，然后由计算机自动对比标准答案给分。 主观题的阅卷则相对比较复杂，分为三个阶段：一是用高速扫描仪快速扫描答题卡;二是计算机根据阅卷要求按题目组合将答案切割成一个个图片，以批号流水号为索引给每个考生建立一系列文件存入服务器;三是服务器随机地将每个考生的答题图片自动分发给评阅相应题目的阅卷教师面前的终端计算机，阅卷教师根据评分标准进行评分并将结果输入计算机。 主观题每道题的阅卷是由两个或两个以上独立的教师完成的。当阅同一个考生同一道题的两个阅卷教师所给的分数差小于规定的误差值时，计算机自动取两人的平均分作为该考生这道题的最终得分;当两个阅卷教师所给的分数超出规定的`误差值时，任务分发引擎自动将该考生该题的作答图片随机分发给第三个评阅此题的阅卷教师，第三个阅卷教师评阅完毕后，误差引擎再对这三个阅卷教师的分数进行两两比对，如果某两个阅卷教师的分数差小于规定的误差值，计算机自动求平均值确定分数，如果都大于规定的误差值，服务器则将该考生该题的作答图片自动分发给阅卷组长，阅卷组长既可以单独根据评分标准给分，也可以查阅前三个阅卷教师的评分结果，选择一个合理的分数作为最终分数。考生的所有
引物设计的原理和程序
1 引物的设计以及初步筛选 引物的设计与初步筛选基本上通过一些分子生物学软件和相关网站来完成的，目前运用软件Primer Premier 5 或美国 whitehead 生物医学研究所基因组研究中心在因特网上提供的一款免费在线PCR引物设计程序 Primer 3来设计引物，再用软件Oligo 6进行引物评估，就可以初步获得一组比较满意的引物。但是对于初学者来说，运用软件和程序来设计引物好象无从着手，其实只要我们掌握了引物设计的基本原则和注意事项，所有问题便迎刃而解。因为无论是软件还是程序，都是以这些基本原则和注意事项为默认标准来进行引物设计的。所以，我们在进行引物设计的时候大可不必在软件和程序的参数上花费过多的时间来思考，如果没有特殊要求我们完全可以把一些参数设为默认值。下面我们主要讨论一下引物设计的原则和注意事项。 ①引物的长度一般为15-30 bp，最好在18~24 bp，因为太短易形成错配(False pr iming) 降低特异性，而太长也会降低特异性，并且降低产量[21。 ②引物在模板内最好具有单一性，也就是说在模板内部没有错配。特别是3’端，一定要避免连续4个以上的碱基互补错配。 ③引物序列的GC 含量最好在40％一60％，且上下游引物序列GC含量的差异不要太大，3’端最后5个碱基最好不要富含GC，特别是连续3个的G或C。 ④DNA双链形成所需的自由能AG，应该以5’端向3’端递减，3’端AG最好不要高于9．0 keaf mol[31。 ⑤避免形成稳定的引物二聚体(Dimer and Cross DimeO 和发夹结构(Hairpin)，AG 高于4．5 keal／mol时易引发上述两种结构的产生。 ⑥引物所在的模板区域应该位于外显子区，最好跨越一个内含子区，这样便于对扩增出来的片段进行功能鉴定和表型分析。 ⑦如果以DNA为模板设计引物，产物长度在100—600 bp比较理想。而以mRNA为模板设计引物时，产物长度在150—300 bp比较理想。 ⑧5’ 端对PCR影响不太大，可以引进修饰位点和标记物[2]。只要掌握了以上原则和注意事项，我们可以在软件和程序设计的一组引物中筛选出几对我们需要的目标引物。Primer Premier 5和Oligo 6可以在https://www.wendangku.net/doc/ef15556739.html,/soft/下载，primer3的主页位置在h ttp://https://www.wendangku.net/doc/ef15556739.html,。 2 引物的二次筛选 引物的二次筛选是指在初次筛选出的几对引物中进一步筛选出适合我们进行特异、高效PCR扩增的那对引物。本步应注意以下两点，一是得到的一系列引物分别在Genebank 中进行回检。也就是把每条引物在比对工具(https://www.wendangku.net/doc/ef15556739.html,/blast/) 的bl astnr中进行同源性检索，弃掉与基因组其它部分同源性比较高的引物，也就是有可能形成错配的引物。一般连续10 bp以上的同源有可能形成比较稳定的错配，特别是引物的3’端应避免连续5-6 bp的同源。二是以mRNA为模板设计引物时要先利用生物信息学的知识大致判断外显子与内含子的剪接位点(例如https://www.wendangku.net/doc/ef15556739.html,/GENESCAN.html的GENESCA N工具或者GeneParser软，然后弃掉正好位于剪接位点的引物。
本课程考核方式为考查
本课程考核方式为考查 Company number：【WTUT-WT88Y-W8BBGB-BWYTT-19998】
本课程考核方式为考查。考核方式多样，由平时成绩、实训成绩及考试构成。 成绩评定：平时成绩30%，实训成绩30%，考试成绩40%。 （1）平时考核： 平时考核分三部分内容：实验态度、实验操作、实验报告。 实验态度主要是对学生的考勤情况及其在课堂中表现的评价；实验操作成绩是指对学生在实验过程中表现出的操作规范程度、对实验仪器使用的熟练程度和对实验内容的熟悉程度的评价；实验报告成绩是对学生撰写的文档准确性、规范性的评价。这三部分在总成绩中所占的比例如下： 实验态度 10％ 实验操作 20％ 实验报告 10％ （2）期末考核： 期末考核分两部分内容：期末实验抽考、设计作品评测。 期末实验抽考是在期末对每位学生以抽签的形式选择实验内容进行实验考试，考试内容从平时实验中选取；学生平时利用课余时间分组设计实验电路模块、制板、焊接并调试，在期末对各组设计作品进行评测，评测小组成员由教师和各小组负责人组成。这两部分在总成绩中所占比例如下： 期末实验抽考 30％ 设计作品评测 30％ 改革单一的闭卷考试考核方法，树立全面的考试观。 改革以知识继承和记忆为主的闭卷式传统考试考核方法，建立以技术应用能力考核为重点，以专业技术标准和职业素质考核为基础的考试考核体系。在考核
内容的选择上，既考知识，又考能力，着重考核学生的综合素质和实践创新能力；在考核方式上，根据考试课程的特点，采用笔试、口试、技能操作、设计等多样化的考试考核方式；在评判学生学业成绩上，可采用百分制、五分制、两级评分等多种评分方法。通过改革考试考核方法，促进学生个性和能力的全面发展。 （一）考核办法 根据不同职业情景的实训要求，采取学生和教师共同评分的办法。根据每次实训的成绩积分，得出最后成绩。 （二）评分标准 共五部分综合评价，各分为五个等级，即优、良、中、及格、不及格。具体要求如下： 1、文档分(40％) 各类文档的完整、清楚、条理、字迹、录入速度等。 优——各类文档格式正确、结构完整、内容明确具体、主题突出、条理清楚、文字通顺、标点符号使用正确、在规定时限内快速完成，打印装订规范美观、完全符合要求。 良——格式正确、结构完整、内容具体、主题明确、条理清楚、文字通顺、及时完成、打印规范。 中——格式基本正确、结构基本完备、内容具体、条理清楚、按时完成、打印规范。 及格——格式基本正确、结构基本完备、内容基本符合要求、按时完成、打印规范。
microRNA反转和定量引物设计原理、实验方法
microRNA的引物设计 以ssc-miR-222-3p为例设计引物，其成熟体序列为：AGCTACATCTGGCTACTGGGTCT 反向引物：每个反向引物的都带有一段固定的序列，可以形成一个茎环， 固定的序列为：5，-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAG-3， 在这个序列后加上八个碱基，这八个碱基是ssc-miR-222-3p从后面数八个碱基的反向互补序列，就是CTGGGTCT的反向互补：AGACCCAG ，最后得到的反向引物的序列为 5，-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAG AGACCCAG -3， 正向引物：每个正向引物也带有一段固定的序列，固定的序列为：ACACTCCAGCTGGG 在这个序列后加上于成熟体除后面六个外剩下的碱基序列，成熟体除掉后面六个碱基后序列为：AGCTACATCTGGCTACT 5，-ACACTCCAGCTGGG AGCTACATCTGGCTACT -3， URP：统一反向引物，也是一段固定的序列，TGGTGTCGTGGAGTCG U6引物F-CTCGCTTCGGCAGCACA ，R-AACGCTTCACGAATTTGCGT 使用方法： 1逆转的引物：所有要做的miRNA反向引物的混合，每个10微升 2PCR的引物：50微升的体系，30微升的水，10微升的正向引物，10微升的URP
2．hsa-miR-124（hsmq-0032 引物） 推荐退火温度：60℃ hsa-miR-124 扩增曲线示意图hsa-miR-124 融解曲线示意图 3．hsa-miR-125b(hsmq-0034 引物) 推荐退火温度：60℃ hsa-miR-125b 扩增曲线示意图hsa-miR-125b 融解曲线示意图
引物设计步骤与要点
引物设计step by step 1、在NCBI上搜索到目的基因，找到该基因的mRNA，在CDS选项中，找到编码区所在位置，在下面的origin中，Copy该编码序列作为软件查询序列的候选对象。 2、用Primer Premier5搜索引物 ①打开Primer Premier5，点击File-New-DNA sequence, 出现输入序列窗口，Copy目的序列在输入框内（选择As），此窗口内，序列也可以直接翻译成蛋白。点击Primer，进入引物窗口。 ②此窗口可以链接到“引物搜索”、“引物编辑”以及“搜索结果”选项，点击Search按钮，进入引物搜索框，选择“PCR primers”，“Pairs”，设定搜索区域和引物长度和产物长度。在Search Parameters里面，可以设定相应参数。一般若无特殊需要，参数选择默认即可，但产物长度可以适当变化，因为100～200bp的产物电泳跑得较散，所以可以选择300～500bp. ③点击OK，软件即开始自动搜索引物，搜索完成后，会自动跳出结果窗口，搜索结果默认按照评分（Rating）排序，点击其中任一个搜索结果，可以在“引物窗口”中，显示出该引物的综合情况，包括上游引物和下游引物的序列和位置，引物的各种信息等。 ④对于引物的序列，可以简单查看一下，避免出现下列情况：3’不要出现连续的3个碱基相连的情况，比如GGG或CCC，否则容易引起错配。此窗口中需要着重查看的包括：Tm 应该在55～70度之间，GC％应该在45％～55％间，上游引物和下游引物的Tm值最好不要相差太多，大概在2度以下较好。该窗口的最下面列出了两条引物的二级结构信息，包括，发卡，二聚体，引物间交叉二聚体和错误引发位置。若按钮显示为红色，表示存在该二级结构，点击该红色按钮，即可看到相应二级结构位置图示。最理想的引物，应该都不存在这些二级结构，即这几个按钮都显示为“None”为好。但有时很难找到各个条件都满足的引物，所以要求可以适当放宽，比如引物存在错配的话，可以就具体情况考察该错配的效率如何，是否会明显影响产物。对于引物具体详细的评价需要借助于Oligo来完成，Oligo自身虽然带有引物搜索功能，但其搜索出的引物质量感觉不如Primer5. ⑤在Primer5窗口中，若觉得某一对引物合适，可以在搜索结果窗口中，点击该引物，然后在菜单栏，选择File-Print-Current pair，使用PDF虚拟打印机，即可转换为Pdf文档，里面有该引物的详细信息。 3、用Oligo验证评估引物 ①在Oligo软件界面，File菜单下，选择Open，定位到目的cDNA序列（在primer中，该序列已经被保存为Seq文件），会跳出来两个窗口，分别为Internal Stability（Delta G）窗口和Tm窗口。在Tm窗口中，点击最左下角的按钮，会出来引物定位对话框，输入候选的上游引物序列位置（Primer5已经给出）即可，而引物长度可以通过点击Change－Current oligo length来改变。定位后，点击Tm窗口的Upper按钮，确定上游引物，同样方法定位下游引物位置，点击Lower按钮，确定下游引物。引物确定后，即可以充分利用Analyze 菜单中各种强大的引物分析功能了。
考试规则和应对考试作弊学生的方式方法
作弊学生是什么心理？ 学生学习成绩差，就易产生自卑不自信的心理，于是想通过抄袭作弊等手段完成考试任务。教师面对学习成绩差的学生，要及时给以予他们热情的帮助，考前应对学生进行补差，找到知识的不懂处进行补助。 另外还要找学生谈心，了解他们的心理状态，解除他们的心理压力，帮助调节情绪，平衡心态，提高信心。坚决不讽刺不挖苦；尊重学生的内心想法。 1、如何避免学生考试作弊 对学生进行思想教育。 学生考试作弊，可能是对待考试是非观念不够清晰，教师要加强对其思想道德教育，特别注重正面教育，注重诚信教育，使学生明确考试舞弊是一种不诚信的表现。帮助学生在认识上分辨是非，树立诚信为荣的观念。 只有明辨是非，知道作弊是不正确的，学生才能加强自我管理能力。 思想教育课程在新闻课期间需要进行 2、发现考试作弊的学生处罚管理 1、考场规则 根据中考考场规则改编 一、考生必须本着诚实守信的态度参加考试，严格遵守试场规则，自觉服从监考人员管理，不得扰乱试场秩序。 二、按照规定的时间和地点参加考试。 三、开考前十五分钟考生进入试场。开考正式铃响后才能答题。开考十五分钟后，迟到考生考试成绩按零分处理。外语考试因有听力考试，考生须提前五分钟到达试场，听力开考（包括试听音）后十五分钟内，迟到考生按零分处理。 四、考生入场，除书写蓝（黑）字迹的钢笔、圆珠笔、铅笔和圆规、直尺、三角尺和橡皮外，书包、书籍、薄本、纸张、计算器等其它物品不准带入试场（政治考试开卷，可携带教材及相关资料）。严禁携带及涂改液、修正带等物品进入试场。 五、考生进入试场后，应对号入座。考生在答卷前，必须将自己的姓名和座位号准确清楚地填写在试卷规定位置上。如遇试卷分发错误及试题字迹不清等问题，可举手询问；但
LAMP技术原理和引物设计
LAMP原理及引物设计与实例 ．LAMP引物的设计 LAMP引物的设计主要是针对靶基因的六个不同的区域，基于靶基因3' 端的F3c、F2c和Flc区以及5' 端的Bl、B2和B3区等6个不同的位点设计4种引物。 FIP(Forward Inner Primer)：上游内部引物，由F2区和F1C区域组成，F2区与靶基因3’端的F2c区域互补，F1C区与靶基因5' 端的Flc区域序列相同。 F3引物：上游外部引物(Forward Outer Primer)，由F3区组成，并与靶基因的F3c区域互补。 BIP引物：下游内部引物(Backward Inner Primer )，由B1C和B2区域组成，B2区与靶基因3' 端的B2c区域互补，B1C域与靶基因5' 端的Blc区域序列相同. B3引物：下游外部引物(Backward Outer Primer )，由B3区域组成，和靶基因的B3c区域互补。 2．扩增原理 60-65℃是双链DNA复性及延伸的中间温度，DNA在65℃左右处于动态平衡状态。因此，DNA在此温度下合成是可能的。利用4种特异引物依靠一种高活性链置换DNA聚合酶。使得链置换DNA合成在不停地自我循环。扩增分两个阶段。 第1阶段为起始阶段，任何一个引物向双链DNA的互补部位进行碱基配对延伸时，另一条链就会解离，变成单链。上游内部引物FIP的F2序列首先与模板F2c结合（如图B所示），在链置换型DNA聚合酶的作用下向前延伸启动链置换合成。外部引物F3与模板F3c结合并延伸，置换出完整的FIP连接的互补单链（如图C所示）。FIP上的F1c与此单链上的Fl 为互补结构。自我碱基配对形成环状结构（如图C所示）。以此链为模板。下游引物BIP与B3先后启动类似于FIP和F3的合成，形成哑铃状结构的单链。迅速以3' 末端的Fl区段为起点。以自身为模板，进行DNA合成延伸形成茎环状结构。该结构是LAMP基因扩增循环的起始结构。 第2阶段是扩增循环阶段。以茎环状结构为模板，FIP与茎环的F2c区结合。开始链置换合成，解离出的单链核酸上也会形成环状结构。迅速以3’末端的B1区段为起点，以自身为模板。进行DNA合成延伸及链置换．形成长短不一的2条新茎环状结构的DNA，BIP引物上的B2与其杂交。启动新一轮扩增。且产物DNA长度增加一倍。在反应体系中添加2条环状引物LF和LB，它们也分别与茎环状结构结合启动链置换合成，周而复始。扩增的最后产物是具有不同个数茎环结构、不同长度DNA的混合物。且产物DNA为扩增靶序列的交替反向重复序列。 https://www.wendangku.net/doc/ef15556739.html,MP的特点 LAMP与以往的核酸扩增方法相比具有如下优点： (1)操作简单，LAMP核酸扩增是在等温条件下进行，对于中小医院只需要水浴锅即可，产
甲基化引物探针设计方法
本文叙述了一种用于甲基化分析的探针法定量PCR的引物和探针设计方法，目前用于甲基化检测的引物探针设计工具非常多，都有使用成功的案例，经过初步多方尝试，本文中叙述的为本人认为较为靠谱的方法。Oligo7的优势在于专业，参数详尽且可自由设置，模块化设计，学会后使用便利。专业的活就是要专业的用专业的工具干。
首先是进行序列转换，有较多的在线工具和联机软件都可实现，这里使用https://www.wendangku.net/doc/ef15556739.html,/methprimer/，较为简单直观。
直接将目标序列放入如上图的编辑框中，此也可直接用于相关引物的设计，不过本人没使用过，因为不能设计探针。submit后就有转化后的序列信息，如下图： 以上详细标记了CpG位置和非CpG位置的C，可直接复制到Word标注使用，下面就可以使用Oligo7利用上边的序列设计引物和探针了，如果是设计非甲基化引物探针，则使用原始序列。
关于引物和探针的一些主要参数，主要参考invtrogen的建议： Primer设计的基本原则： a)引物长度一般在18-35mer。 b)G-C含量控制在40-60%左右。 c)避免近3’端有酶切位点或发夹结构。 d)如果可能避免在3’端最后5个碱基有2个以上的G或C。 e)如果可能避免在3’端最后1个碱基为A。 f)避免连续相同碱基的出现，特别是要避免GGGG或更多G出现。 g)退火温度Tm控制在58-60C左右。 h)如果是设计点突变引物，突变点应尽可能在引物的中间。 T aqMan 探针设计的基本原则： a)T aqMan 探针位置尽可能靠近扩增引物（扩增产物50-150bp），但不能与引物重叠。 b)长度一般为18-40mer 。 c)G-C含量控制在40-80%左右。 d)避免连续相同碱基的出现，特别是要避免GGGG或更多G出现。 e)在引物的5’端避免使用G。 f)选用比较多的碱基C。 g)退火温度Tm控制在68-70℃左右。 另：目标变异碱基最好在3’末端或3’末端-1位置，保证扩增特异性，对于甲基化，则最好是C。
最新研究生考试方式方法
最新研究生考试方式方法 一、考试方式概述： 1. 全国统考：只能报考除工商管理硕士、公共管理硕士、旅游管理硕士、工程管理硕士、会计硕士、图书情报硕士、审计硕士、法律硕士(非法学)、法律硕士(法学)外的学科(类别)、专业(领域)，注意工程硕士中的项目管理、教育硕士中的教育管理、体育硕士中的竞赛组织应届毕业生不得报考，请仔细阅读招生简章。 2. 推荐免试：报考除工商管理硕士、公共管理硕士、旅游管理硕士、工程管理硕士、及工程硕士中的项目管理、教育硕士中的教育管理、体育硕士中的竞赛组织外的学科(类别)、专业(领域);需要自具有推免权的毕业院校获取校验码，推荐免试校验码有学术型、专业学位、支教团推免计划和免费师范生计划四种类型，其中专业学位类型推免免试校验码(第八位为1)只能选择报考专业学位，学术型推荐免试校验码(第八位为0)，可选择报考学术型和专业类型，支教团推免计划推荐免试校验码(第八位为2)，免费师范生计划推荐免试校验码(第八位为3)。 3. 单独考试：专业学位只能报考建筑学硕士、工程硕士、城市规划硕士、农业推广硕士、兽医硕士、风景园林硕士、林业硕士、临床医学硕士、口腔医学硕士、公共卫生硕士、护理硕士、
药学硕士、中药学硕士等13个专业学位类别，学术型专业均可报考。 4. 管理类联考：只能报考工商管理硕士、公共管理硕士、旅游管理硕士、工程管理硕士、会计硕士、图书情报硕士、审计硕士。 5. 法硕联考：只能报考法律硕士(非法学)、法律硕士(法学)类别领域。 6. 强军计划：只能报考除工商管理硕士、公共管理硕士、旅游管理硕士、工程管理硕士、会计硕士、图书情报硕士、审计硕士、法律硕士(非法学)、法律硕士(法学)外的学科(类别)、专业(领域)，需要从报考招生单位获取校验码。 7. 援藏计划：只能报考除工商管理硕士、公共管理硕士、旅游管理硕士、工程管理硕士、会计硕士、图书情报硕士、审计硕士、法律硕士(非法学)、法律硕士(法学)外的学科(类别)、专业(领域)，需要从西藏考试院获取校验码。 8. 农村师资计划：只能报考专业学位中教育硕士类别下的领域(除教育管理)，需要从具有推出农村师资计划的毕业院校获取校验码。 二、专项计划概述： 专项计划包括强军计划、援藏计划、农村师资计划、少数民族骨干计划、支教团推免计划，免费师范生计划;其中强军计划与接收(报考)单位联系获取校验码，援藏计划与西藏考试院联系获
引物设计的原理与方法
PCR引物设计的原理及方法 阎振鑫S111666(四川大学生命科学学院细胞生物学成都610014) 摘要：自20世纪后期发展了PCR技术以来，PCR已经改变了整个生物学研究的进程。而PCR反应的第一步就是设计引物，引物设计的好坏直接关系到PCR的成败。PCR引物设计有许多的原则必须要遵循：引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构，引物与模板的序列要紧密互补。引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应等。另外，引物的设计方法也越来越多，出现了许多专门的设计软件和网站，如：PrimerPremier5.0等。 关键词：PCR 引物原理方法NCBI PrimerPremier5.0 PCR primer design principle and method YanZhenxin (sichuan Univercity, Life science college cell biology chengdu 610014 ) Abstract: When PCR technology was find, PCR has changed all of the program in research of biology. The design of primer is the frist step of PCR. It is relation to the fate of PCR. There are some principals must be obey: dipolymer and hairpin structure must be avoid between different primers. The DNA polymerization reaction should not be triggered at the wrong site. Therefore, there are more and more methods of design primer, include the professional softwares and professional web site. Key word: PCR primer principle NCBI PrimerPremier5.0 聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction。PCR)是20世纪后期发展起来的一种体外扩增特异DNA片断的技术。具有快速、简便及高度敏感等优点，能极大地缩短目的基因扩增时间[1]。因此，其一直是生物学者们致力于构建cDNA文库、基因克隆以及表达调控研究的必要前提和基础[2]。PCR的第一步就是引物设计。引物设计的好坏，直接影响了PCR的结果，因此这一步很关键。成功的PCR反应既要高效，又要特异性扩增产物，因此对引物设计提出了较高的要求。引物设计需要注意的地方很多，在大多数情况下，我们都是在知道已知模板序列时进行PCR扩增的。在某些情况比如构建文库的时候也会在不知道模板序列的情况下进行设计。这个时候随机核苷酸序列就与模板不是完全匹配。我们通常指的设计引物都是在已知模板序列的情况下进行。设计的目的是在两个目标间取得平衡：扩增特异性和扩增效率。
考试答题步骤、方法与技巧+迎接考试心态调整方法
考试答题步骤、方法与技巧 +迎接考试心态调整方法 考试答题步骤、方法与技巧 如何避免在答题时"会干不会考，考场得分少"的问题？ 一、市政案例题答题方法 1.只要问到质量控制，特别是材料方面的质量控制。（比如砼、无机结合材料、沥青等）。 答案包括七点： ①原材料合格； ②配合比准确； ③搅拌均匀； ④运输覆盖； ⑤摊铺浇筑满足规范要求； ⑥碾压货振捣满足规范要求； ⑦养护达到养护要求。 2.答所有题目，点要多字要少。 3.答任何题目，凡是问质量问题出在哪里？违反了什么条例？
原因？ 答题三步骤： ①首先回答对错。 ②二步答错误之处，首先写（错误之处在于不符合规范），然后抄背景，如果不知道错在哪里，将背景里有关质量施工时的步骤全部认为是错的，抄题目，抄背景，将背景里的错误之处一一列出，反正错了不扣分。 ③三步答正确做法，(首先写正确的做法是根据规范)如果万一不知道正确做法，将背景里的步骤全部反向答。 4.如题目考到这样做的依据是什么，证据是什么。 必须写依据法律法规、设计文件、规范标准。 5.题目出现任何要问原因，先抄背景，如不记得，再从人机料法环五方面写。 6.如果题目要针对特点提出问题，把特点写出来，抄背景。 二、市政“万能公式” （1）“任何”（案例分析中出现下列题型，必须照写） 1：任何模板、支架的验算：强度、刚度、稳定性。 2：任何市政工程确定任何参数不凭经验，必须一律通过实验。 3：任何工程的技术交底做法：单位工程、分部工程和分项工程开工前，工程项目部技术负责人应对承担施工的负责人货分包方全体人员进行书面技术交底，技术交底资料应办理签字手续并归档，不能代签。
引物设计的原理与方法
引物设计的原理与方法 The latest revision on November 22, 2020
PCR引物设计的原理及方法 阎振鑫S111666(四川大学生命科学学院细胞生物学成都 610014) 摘要：自20世纪后期发展了PCR技术以来，PCR已经改变了整个生物学研究的进程。而PCR反应的第一步就是设计引物，引物设计的好坏直接关系到PCR的成败。PCR引物设计有许多的原则必须要遵循：引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构，引物与模板的序列要紧密互补。引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应等。另外，引物的设计方法也越来越多，出现了许多专门的设计软件和网站，如：PrimerPremier5.0等。 关键词：PCR 引物原理方法 NCBI PrimerPremier5.0 PCR primer design principle and method YanZhenxin (sichuan Univercity, Life science college cell biology chengdu 610014 ) Abstract: When PCR technology was find, PCR has changed all of the program in research of biology. The design of primer is the frist step of PCR. It is relation to the fate of PCR. There are some principals must be obey: dipolymer and hairpin structure must be avoid between different primers. The DNA polymerization reaction should not be triggered at the wrong site. Therefore, there are more and more methods of design primer, include the professional softwares and professional web site. Key word: PCR primer principle NCBI PrimerPremier5.0 聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction。PCR)是20世纪后期发展起来的 一种体外扩增特异DNA片断的技术。具有快速、简便及高度敏感等优点，能极大地缩短目的基因扩增时间[1]。因此，其一直是生物学者们致力于构建cDNA文库、基因克隆以及表达调控研究的必要前提和基础[2]。PCR的第一步就是引物设计。引物设计的好坏，直接影响了PCR的结果，因此这一步很关键。成功的PCR反应既要高效，又要特异性扩增产物，因此对引物设计提出了较高的要求。引物设计需要注意的地方很多，在大多数情况下，我们都是在知道已知模板序列时进行PCR扩增的。在某些情况比如构建文库的时候也会在不知道模板序列的情况下进行设计。这个时候随机核苷酸序列
三 考试科目和考试方式
三考试科目和考试方式 1、考试科目 （1）硕士学位研究生入学资格考试(英文名称为Graduate Candidate Test，简称GCT)、专业考试和相关测试。 （2）复试(专业课笔试和面试) 2、考试方式 （1）工程硕士生入学考试采取两段制考试方式。第一阶段,所有考生参加国家统一组织的GCT考试，该阶段主要测试考生的综合素质。考生取得的GCT成绩一年有效。考生只可选择1个培养单位报考。我校根据本校的实际情况自行确定GCT成绩合格分数线。GCT考试的命题及阅卷工作委托教育部学位与研究生教育发展中心统一组织； 第二阶段，达到我校规定的GCT成绩合格分数线的考生，持本人的GCT成绩，申请参加我校自行组织的物流工程或计算机技术领域的专业考试和相关测试。 我校自行安排第二阶段的报名工作，具体事项另行通知。 （2）参加第二阶段考试的所有考生需填写《2011年参加在职人员攻读工程硕士学位第二阶段考试的考生情况登记表》（以下简称《登记表》，样表见附件）。 考生可直接登陆我校研招网（https://www.wendangku.net/doc/ef15556739.html,/yzb_zhaosheng/ ）或计算机与信息工程学院研究生招生网站 （https://www.wendangku.net/doc/ef15556739.html,/ciecol/web/ArticleList.jsp?id=20 ），查询第二阶段考试的相关事宜。 我校根据考生的GCT成绩、专业考试和相关测试结果决定是否录取。第二阶段的考试工作于2011年12月中旬全部结束。 3、命题依据 “GCT”命题依据《硕士学位研究生入学资格考试指南》（科学技术文献出版社） 第二阶段复试中的笔试部分，考试科目为： （1）物流工程专业领域：物流管理与技术，复习参考书为：《物流学概论》，崔介何，北京大学出版社，2004版。