不可逆电穿孔如何诱发肺癌细胞凋亡？

不可逆电穿孔如何诱发肺癌细胞凋亡？

电穿孔(electroporation)是指当细胞置于高强度的电场中时，由于高压电场的作用，使细胞膜通透性明显增加，引起细胞外液分子扩散入细胞膜内的现象。这种现象主要是由于细胞膜中的双分子脂膜在高强度电场中被击穿而造成的，并且随着作用强度的增加及时间的延长而变化，可以由早期的可逆电穿孔(reversible electroporation, RE)转变为不可逆电穿孔(irreversible electroporation, IRE)。

因此，根据外加脉冲电场撤消后细胞膜能否恢复到正常生理状态, 电穿孔分为可逆电穿孔(reversible electroporation, RE)和不可逆电穿孔(irreversible electroporation, IRE , 又称不可逆电击穿)。

细胞可逆电穿孔技术多用于将各种物质，诸如DNA、RNA、蛋白质、药物、抗体和荧光探针等，转载进入细胞的研究中。不可逆电穿孔由于具有对细胞造成不可逆的破坏，最终引起细胞死亡的特性，近年来已经被尝试的应用于肿瘤的微创治疗。

方法：选择处于生长周期的A549 细胞，共分为A-G7 个组进行研究，其中A 组为不施加电场的空白对照组，B-G 组为实验组，B 组施加500

V/cm强度高压电场，G组施加1750 V/cm的高压电场，BG组之间各组的高压电场强度间隔为250 V/cm。其他电场条件：脉冲宽度100 μs，重复频率1Hz，连续9个直流方波。电场

强度计算公式：电场强度= 电压/ 距离。

结果评估：采取细胞抑制实验、不可逆电穿孔示踪实验、细胞凋亡实验，检验A549细胞细胞凋亡与电场强度的关系。

细胞抑制实验：采用CCK-8 法检测细胞存活率，经公式计算存活率，存活率= 实验组吸光率OD 值/ 对照组吸光率OD 值;抑制率=1-存活率。

不可逆电穿孔示踪实验：，各实验组经不同强度电场处理后，立即使用流式细胞仪检测PI 染色阳性的A549 肺癌细胞，计算细胞染色率，即为电穿孔率。

细胞凋亡检测：实验步骤与不可逆电穿孔示踪实验略有不同。使用流式细胞仪检测。双参数图中，AnnexinV 及PI 均为阴性的为正常细胞，AnnexinV

阳性及PI 阴性的为早期凋亡细胞，AnnexinV 及PI 均为阳性的为晚期凋亡细胞。

结果：

(1)不同强度高压电场对A549肺癌细胞的抑制作用

(2)不同强度高压电场对A549肺癌细胞的不可逆电穿孔作用

(3)不同强度高压电场对A549 肺癌细胞的凋亡作用

讨论：

在实验最低的高压电场强度条件下，A549肺癌细胞就出现了明显的抑制，且随着电场强度的变化出现了线性相关的特点，说明在非生理条件的高压电场中，肺癌细胞的抑制率与电场强度成正相关。

本研究中，在电场强度为1250 V/cm 时，AnnexinV 阳性染色的细胞明显升高。提示对于A549 肺癌细胞，引起早期凋亡的高压电场强度为1250 V/cm。PI 是一种高选择性的荧光染色剂，其与双链DNA 结合后，可以释放出超出20 倍的红色荧光，易于被流式细胞仪检测。细胞膜完整时，PI 无法进入细胞内。而当细胞晚期凋亡出现明显的穿孔时，PI可以通过细胞孔洞进入细胞进行染色。因此通过PI 染色，可以明确细胞晚期凋亡或死亡。实验发现，电场强度达到1000 V/cm 时，细胞的PI 染色明显增加，达到将近60%;电场强度达到1250 V/cm 时，细胞的PI 染色率达到80%左右;电场强度达到1500 V/cm 时，细胞的PI 染色率达到95%左右。这些说明，当电场强度在1000-1500V/cm 之间时，细胞PI 阳性染色率显著上升，电场强度大于1500 V/cm 时，肺癌细胞死亡率上升不显著。说明对于A549肺癌细胞，产生不可逆电穿孔引发晚期凋亡或死亡的高压电场强度为1500 V/cm。我们认为，高压电场强度与A549肺癌细胞的抑制程度密切相关。随着高压电场强度的增加，肺癌细胞在电场中明显受到抑制。

总之，高压电场不可逆电穿孔诱发A549 肺癌细胞早期凋亡的强度为1250V/cm，产生不可逆电穿孔引发晚期凋亡或死亡的高压电场强度为1500V/cm，并且随着电场强度的增加

其凋亡率持续升高。

本文摘自：卢强、闫小龙等《高压电场不可逆电穿孔诱发A549 肺癌细胞凋亡的实验研究》