3,5-二硝基水杨酸比色定糖法
实验一 3，5-二硝基水杨酸比色定糖法
目的要求
1.掌握 3，5-二硝基水杨酸比色法定糖的原理及方法。
2.用 3，5-二硝基水杨酸定糖法测定山芋份中的总糖度及还原糖。
3.熟悉 721型分光光度计的原理及使用方法
实验原理
3， 5-二硝基水杨酸与还原糖共热后被还原成棕红色的氨基化合物，在一定范围内，还原糖的量和反应液的颜色强度呈比例关系，利用比色法可测知样品的含糖量。该方法是半微量定糖法，操作简便，快速，杂质干扰较少。
实验操作方法
一、葡萄糖标准曲线的制定
取9支大试管，分别按下表顺序加入各种试剂：
将上述各管溶液混匀后，在721分光光度计上用520纳米进行比色测定，用空白管溶液调零点。记录光吸收值。以葡萄糖浓度为横坐标，光吸收值为纵坐标绘制出标准曲线。
二、山芋粉中总糖和还原糖含量的测定
1.样品中还原糖的提取：准确称取2克山芋粉，放入100毫升烧杯内，加入85%乙醇50毫升，混匀，在50℃恒温水浴中保温30分钟，过滤，滤渣再用85%乙醇提取二次。将滤液合并，蒸去乙醇，加少量水，移入100毫升容量瓶中，用水稀释到刻度，备用。
2.样品中总糖的水解及提取：准确称取山芋粉1克，放入大试管中，加入10毫升6N盐酸和15毫升蒸馏水。混均，在沸水浴中加热半小时后，用碘化钾-碘溶液检查水解程度。若已水解完全，则不呈现蓝色。冷却后加入酚酞指示剂1滴，以10%氢氧化钠中和至溶液呈微红色。过滤并定容至100毫升。再精确吸取上述溶液10毫升，放人100毫升容量瓶中，稀释刻刻度，备用。
3.样品中含糖量的测定：取7支大试管，分别按下表加入各种试剂：
将各管混匀后，按制作标准曲线时同样的操作测定各管的光密度，在标准
曲线上查出相应的还原糖含量，按下述公式计算出山芋粉内还原糖与总糖的百
分含量。
试剂和器材
一 、试剂
（1）3，5-二硝基水杨酸试剂 （又称DNS 试剂）：
甲液：溶解6.9克结晶酚于15.2毫升IO%氢氧化钠中，并稀释至69毫升，
在此溶液中加入6.9克亚硫酸氢钠。
乙液：称取255克酒石酸钠，加到300毫升10%氢氧化钠中，再加入880毫
升1%3，5-二硝基水杨酸溶液。
将甲液与乙液相混合即得黄色试剂，贮于棕色试剂瓶中。在室温下，放置7
—10天以后使用。
（2）0.1%葡萄糖标准液：准确称取100毫克分析纯的葡萄糖（预先在105℃
干燥至恒重），用少量蒸馏水溶解后定容至100毫升，冰箱保存备用。
（3）6N 盐酸溶液。 （4）10%氢氧化钠溶液。
（5）碘化钾-碘溶液（碘试剂）。 （6）酚酞指示剂。
（7）85%乙醇。
二、器材
（1）试管和试管架。 （2）碱滴定管（50毫升）。
（3）铁台。 （4）滴定管夹。
（5）吸量管（1毫升和2毫升）。 （6）容量瓶（100毫升）。
（7）铜水浴锅。 （7）玻璃漏斗和烧杯。
（9）铁三脚架。 （10）量筒（10毫升、100毫升）。
（11）电热恒温水浴。 （12）煤气灯。
100%??=
样品重量
样品稀释倍数还原糖毫克数还原糖100%??=样品重量
样品稀释倍数水解后还原糖毫克数总糖
（13）玻璃棒。（14）白瓷板。
（15）721分光光度计
思考题
1.比色测定的操作要点是什么？基本原理是什么？
2.721型分光光度计的原理及使用时的注意事项是什么？
3.比色测定时为什么要设计空白管？
4.总糖包括哪些化合物？
答：1.（1）比色测定的操作要点：1.用相同型号的比色管.2.配制等体积的系列标准样品.
3.配制待测样品(与标准样品等体积).
4.对比,找出相同的浓度.
DNS法的原理是：在碱性条件下，还原糖与3,5-二硝基水杨酸共热，3,5-二硝基水杨酸被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸，而还原糖则被氧化成糖酸及其它产物。在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色深浅的程度量呈一定的比例关系，在540nm波长下测定棕红色物质的消光值，查对标准曲线可求出样品中还原糖的含量。
2.分光光度计的基本依据是朗伯—比耳定律，它是根据相对测量原理工作的，即先选定某一溶剂作为标准溶液，设定其透光率为100%，被测试样的透光率是相对于标准溶液而言的，即让单色光分别通过被测试样和标准溶液，二者能量的比值就是在一定波长下对于被测试样的透光率。
实验注意事项：（1）为了防止光电管疲劳，不测定时必须将试样室盖打开，使光路切断，以延长光电管的使用寿命。
（2）取拿比色皿时，手指只能捏住比色皿的毛玻璃面，而不能碰比色皿的光学表面。
（3）比色皿不能用碱溶液或氧化性强的洗涤液洗涤，也不能用毛刷清洗。比色皿外壁附着的水或溶液应用擦镜纸或细而软的吸水纸吸干，不要擦拭，以免损伤它的光学表面
3.用空白管调整零位时，仪器和试剂等造成的系统误差就可以抵消或减小到最低程度。
上面说的是一般概念，在很多试验中都是这样做，或者以标准试样做空白试验，就是为了降低系统误差。
4.总糖主要指具有还原性的葡萄糖，果糖，戊糖，乳糖和在测定条件下能水解为还原性的单糖的蔗糖（水解后为1分子葡萄糖和1分子果糖），麦芽糖（水解后为2分子葡萄糖）以及可能部分水解的淀粉（水解后为2分子葡萄糖）。