BPA及其类似物诱导斑马鱼自闭症相关的神经毒性研究

BPA及其类似物诱导斑马鱼自闭症相关的神经毒性研究

摘要

自闭症（ASD）是一种发生在儿童早期的神经和发育障碍疾病，其临床症状为：多动、注意力低下、焦虑、情绪异常、学习能力和社会交往能力下降，行为刻板、头部变大等，这些症状可能是与早期发育过程中脑部受到影响有关。有研究表明它的发生与基因遗传和离子通道有关。同时，随着自闭症的发生几率越来越大，有研究表明：自闭症的发生可能与环境中内分泌干扰物有关。但目前诱发自闭症的机制尚需进一步研究。

双酚A(BPA)具有2个苯酚结构，与内源性雌激素具有相似结构的内分泌干扰物，它在生活消费产品和环境中无处不在。人类暴露雌激素类似物会增加乳腺癌和睾丸癌发病率，并导致癌症、泌尿生殖道畸形、免疫功能减退、代谢疾病和心脏疾病等。目前，随着国内外的重视，BPA已经被限制使用，但是与BPA 结构类似的化合物如：BPA、BPF、BPS、BPAF、BPB、BPC等类似物相继出现。有研究表明：人类的尿液和血液中都检测到BPA类似物，其中含量最多的是BPA、BPF、BPS。目前国内外大量研究都是关于BPA的生殖毒性和神经毒性，但是BPF、BPS的神经毒性研究较少，以及诱发自闭症的机制尚不明确。因此，本文以斑马鱼为模式生物，诱发自闭症药物VPA作为阳性对照，通过前期研究BPA 及类似物对斑马鱼的毒性效应，进而深入研究BPA、BPF、BPS对斑马鱼的行为表型、头部大小、运动神经元及神经细胞的影响。

通过对斑马鱼的畸形、死亡表型的研究，我们发现：BPA及其类似物在一定浓度下能够对斑马鱼的生长发育有着危害作用，会导致游囊没有打开、心包囊肿、卵黄囊肿、身体严重弯曲、心包出血等；严重的会致死。BPA及其类似物的毒性效应由大到小依次为：BPAP、BPAF、BPC、BPZ、HPP、BPB、BPA、BPF、BPE、BPP、BPS。

斑马鱼的集群社会行为实验中，我们发现，不同化合物导致斑马鱼行为发生异常的程度不同，BPZ、BPAF、BPAP这三个化合物可能因为毒性效应大而导致斑马鱼的活力下降，较对照组而言，表现出反应不灵敏的行为；而BPA、BPF、BPS这三种毒性较低的化合物则会导致斑马鱼的离散行为发生，并且运动活力提高，与评价斑马鱼的自闭症的行为相似。

为了进一步验证，我们以诱发自闭症药物VPA为阳性对照，DMSO（0.1%）为阴性对照组，进一步研究BPA、BPF、BPS对斑马鱼自主运动，头部测量，运动行为、惊吓反应、光暗探索、社会交往实验的影响，结果表明，BPA（0.2μM、

2μM时）、BPF（3μM）、BPS（1μM、10μM、100μM）时，显著影响斑马鱼胚胎24hpf时自主运动，与阳性对照结果一致；在头部测量实验中：BPA（2μM）、BPF（3μM）、BPS（1μM）时，斑马鱼的头部明显增大（ID、LJL、CCL三个指标），与VPA结果一致；在运动行为实验中：BPA（2μM）、BPF（3μM）、BPS （1μM、10μM、100μM）斑马鱼的运动活力水平和VPA一致显著性升高；通过惊吓反应实验，结果表明：暴露化合物BPA、BPF、BPS导致斑马鱼对光刺激的适应能力减弱；光暗探索实验结果表明：BPA（2μM）、BPF（3μM、30μM）、BPS（1μM、10μM、100μM）时，斑马鱼停留在白光区域的时间增多，且穿梭在黑白之间的次数减少，在白光区域的运动活力水平升高，与VPA结果一致；在社会交往实验结果表明：BPA（在0.2μM、2μM时）、BPF（3μM）、BPS（1μM、10μM、100μM）时，斑马鱼的社会交往次数减少，交往时间也一样减少和VPA结果一致。综上这些结果说明：化合物暴露BPA（2μM时）、BPF（3μM）、BPS（1μM）时，斑马鱼的头部变大、运动活力水平升高、社会交往次数较少、适应力差、喜欢白光。低剂量暴露BPA、BPF、BPS可能诱发自闭症的发生。

我们分别选取BPA（2μM）、BPF（3μM）、BPS（1μM）三个浓度进一步对24hpf的斑马鱼进行TUNEL染色研究细胞凋亡，并且通过用Histon H3标记进行免疫荧光实验，来研究48hpf斑马鱼的神经元前体细胞增殖情况。研究结果发现：暴露BPA（2μM）、BPF（3μM）、BPS（1μM）对24hpf斑马鱼的细胞凋亡没有显著性影响，但较阴性对照组显著增加了48hpf斑马鱼的神经元前体细胞，结果均与VPA一致。我们进一步通过免疫荧光方法来研究5dpf斑马鱼的头部的增殖神经干细胞和新生成熟神经元的表达，我们发现化合物BPA（2μM）、BPF（3μM）、BPS（1μM）暴露后的斑马鱼，增殖神经干细胞和新生成熟神经元的表达较阴性对照组均显著性升高，与阳性对照VPA结果一致。我们推断：暴露BPA（2μM）、BPF（3μM）、BPS（1μM）后，由于神经元前体细胞增殖、增殖神经干细胞和新生成熟神经元表达增多，可能是导致斑马鱼头部增大的一个因素。

我们采用突变体Islet斑马鱼（初级运动神经元发绿色荧光）进一步研究初级运动神经元，结果显示：Islet斑马鱼在27hpf暴露BPA（2μM）、BPF（3μM）、BPS（1μM）后，初级运动神经元较对照组发育迟缓；通过免疫组化研究72hpf 的野生型斑马鱼的神经元突触的变化，研究发现，暴露BPA（2μM）、BPF（3μM）、BPS（1μM）后，72hpf的野生型斑马鱼的突触发生改变。

由于自闭症的产生与离子通道有关，我们实验室的以往基因测序也发现离子通道有关的一些基因发生变化，因此我们对一些与离子通道相关的基因进行了探讨：钾离子通道相关基因（kctd4/kctd12/kctd13/kcnab1a/kcnh4a/kcnj6）、钙离子通

道的相关基因（ryr1a/ryr1b/ryr2/ryr3/tnnc-1/tnnc-2）、钠离子通道相关基因（scn4bb）、以及神经元乙酰胆碱受体基因（chrna1）；我们发现暴露BPA（2μM）、BPF（3μM）、BPS（1μM）后的5dpf的野生型斑马鱼的钾、钠离子通道基因较阴性对照DMSO 大多数都上调，与阳性对照VPA结果一致；钙离子通道相关基因大多数较阴性对照都上调，但是与阳性对照VPA结果相反；乙酰胆碱受体基因只有BPF（3μM）、BPS（1μM）上调，与阳性对照结果一致，BPA（2μM）的结果与VPA相反。综上实验结果表明：BPA及其类似物在一定浓度下可以对斑马鱼产生毒性效应。低剂量暴露BPA、BPF、BPS可以使斑马鱼行为改变，产生神经毒性，进而诱发自闭症的发生。产生的神经毒性效应和行为改变可能与离子通道有关，诱发机制还需进一步研究。

关键词：BPA及其类似物；斑马鱼；神经发育毒性；自闭症；行为；离子通道

BPA and analogues induce neurotoxicity associated with autism

in zebrafish

Abstract

Autism is a kind of neurological and developmental disorders in early childhood, its clinical symptoms are:hyperactivity,inattention,anxiety,mood disorders,reduced of learning ability and the social ability,behavior stereotype,larged head circumference etc.These symptoms may be related to the brain affected in the process of early development.Studies have shown that the occurrence of autism may be related to genetic inheritance and ion channels.Meanwhile,with the increasing incidence of autism,some scientists have speculated that the occurrence of autism may be related to endocrine disruptors in the environment.But the underlying mechanism still largely unknown.

Bisphenol A(BPA)is a compound with two phenolic structures.It is an endocrine disrupter with similar structure to endogenous estrogen,which is ubiquitous in consumer products and environment.Exposure to estrogen in humans increases the incidence of breast and testicular cancer and leads to cancer,genitourinary deformity, immunodeficiency,metabolic diseases and heart disease.At present,with the attention of both domestic and foreign countries,BPA has been restricted to use,but similar compounds such as BPA,BPF,BPS,BPAF,BPB,BPC and other similar compounds have emerged.Studies have shown that BPA and anoalogues are found in both urine and blood,with the highest detected levels for BPA,BPF and BPS.At present,many studies both at home and abroad are focused ont reproductive toxicity and neurotoxicity of BPA,but the neurotoxicity of BPF and BPS is not well studied,and the mechanism of inducing autism is still unclear.Therefore,in this paper we utilized the zebrafish as a model and investigated the effects of BPA and analogues on behavioral phenotypes,the head size,motor neurons and nerve cells of zebrafish.

Our study demonstrated that BPA and analogues could have harmful effects on mortality and malformation rate and abnormal phenotype of zebrafish under a certain concentrations,including unopened swim capsule,pericardial cyst,yolk cyst,severe body bending,pericardial bleeding,and even death.The toxic effects of BPA and its analogues varied greatly with the ranking order from high to low as:BPAP,BPAF,