牙周膜来源细胞膜片在牙周再生中的应用研究进展_冯馨仪
人牙周膜干细胞的初步鉴定及体外成骨诱导
万方数据
甄蕾，等．人牙周膜干细胞的初步鉴定及体外成骨诱导 ＺＨＥＮＬｅｉ．ｅｔａＬＨｕ眦ｎＰｅｒｉｏｄｏｎｔａｌＬｉｇａｍｅｎｔＳｔｅｍＣｅｌｌｓＤｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｉｎｔｏＯｓｔｅｏｂｌａｓｔｓ／ｎｖ／ｔｒｏ?３１９? ＲＮＡ提取试剂盒、一步法ＲＴ．ＰＣＲ试剂盒（Ｔｉａｎｇｅｎ公司。北京）。 １．２方法 １．２．１牙周膜细胞原代培养收集临床１２一１８岁因正畸需要而拔除的牙周健康、无龋的新鲜前磨牙，ＰＢＳ洗３次，刮取根中ｌ，３牙周膜组织，采用酶解组织块法培养，每隔３ｄ换液．直至细胞从组织块周围游出。细胞生长达８０％汇合时传代。 １．２．２有限稀释法克隆化培养纯化ＰＤＬＳＣｓ取对数生长期的第１代细胞。以１～２个／孔的密度接种于９６孔板，常规培养７。１４ｄ，至出现细胞克隆（细胞数≥５０为判定标准）后扩大培养。 １．２．３ＰＤＬＳＣｓ的初步鉴定分别取第２代克隆形成细胞进行爬片。采用ＳＰ法检测波形蛋白和角蛋白的表达。同时利用兀ＴＣ荧光标记二抗检测ＳＴＲＯ．．１和ＣＤｌ４６的表达。 １．２．４体外诱导分化取第２代对数生长期的克隆形成细胞。按５ｘｌｌＹ个／ｍＬ接种于２４孔板中，待细胞进入对数生长期后弃去原培养液。ＰＢＳ洗３遍，换诱导液（１０ｍｍｏｌ／ＬＢ．甘油磷酸钠、１０｛ｍｏｌ／Ｌ地塞米松、５０Ｉ．Ｌｇ／ｍＬ维生素Ｃ）培养２１ｄ。对照组细胞常规培养。 １．２．５成骨性能的鉴定 １．２．５．１茜素红Ｓ染色观察钙结节形成人ＰＤＬＳＣｓ诱导培养２１ｄ后弃去培养液，４％多聚甲醛固定３０ｍｉｎ后饱和茜素红Ｓ溶液染色１０ｍｉｎ，观察钙结节形成情况。 １．２．５．２定性的细胞ＡＬＰ活性检测人ＰＤＬＳＣｓ诱导培养２１ｄ后弃去培养液。按ＡＬＰ检测试剂盒说明书规范操作。光学显微镜下观察染色情况。 １－２．５．３免疫细胞化学检测ＢＳＰ、Ｉ型胶原表达人ＰＤＬＳＣｓ诱导培养２１ｄ后常规ＳＰ法检测ＢＳＰ、Ｉ型胶原蛋白表达情况。 １．２．５．４ＲＴ－ＰＣＲ检测ＡＬＰ、ＢＳＰｍＲＮＡ表达收集诱导培养２１ｄ后的人ＰＤＬＳＣｓ．。使用细胞总ＲＮＡ提取试剂盒提取培养细胞总ＲＮＡ。采用一步法进行ＲＴ－ＰＣＲ反应，以Ｂ．ａｃｔｉｎ为内参照。参照ＧｅｎＢａｎｋ数据库，采用Ｏｌｉｇｏ计算机软件设计引物，Ｂ．．ａｃｔｉｎ上游引物５＇－ｇｃｇａｇａａｇａｔｇａｃｃｃａｇａｔｃａｔｇｔｔ一３’。下游引物５’一ｇｃｔｔｃｔｃｃｔｔａａｔｇｔｃａｃｇｃａｃｇａｔ－３’：ＡＬＰ上游引物５＇－ａｔｅｔｔｔｇ．－ｇｔｃｔｇｇｃｃｃｃｃａｔｇ－一３。下游引物５＇－ａｔｇｃａｇｇｃｔｇｃａａｔａｃｇｃｃａｔ一３７；ＢＳＰ上游引物５＇－ａｔｇｇｃｃｔｇｔｇｃｔｔｔｃｔａａｔ－３’。下游引物５＇－ｔｔｃｃｔｅｃｔｅｃｔｃｔｔｃｔｇａａｃｔｇ．－３’：由上海生工生物技术公司合成。反应条件：５０。Ｃ３０ｍｉｎ逆转录，９４。Ｃ５ｍｉｎ逆转录失活，然后９４。Ｃ３０ｓ，５８。Ｃ３０ｓ，７２。Ｃ３０ｓ，３５个循环，７２。Ｃ延伸７ｍｉｎ。ｌ％琼脂糖凝胶电泳检测，鉴定ＰＣＲ产物片断大小。 ２结果 ２．１ＰＤＬＳＣｓ的分离及纯化 本实验采用酶解组织块法培养原代细胞。３～１０ｄ组织块周围有细胞爬出。２周左右可达８０％汇合。有限稀释法筛选出来的细胞克隆呈圆形、多角形等多种形态，但都表现为胞核聚集在中心，胞质形成的突起向外呈放射状．具有成体干细胞的特征。２．２ＰＤＬｓＣｓ的鉴定 免疫细胞化学检查发现．ＰＤＬＳＣｓ广谱角蛋白阴性表达，波形蛋白阳性表达（图１），说明本实验克隆形成细胞为中胚层来源的间充质细胞．且无外胚层来源的细胞污染。免疫荧光检测可见克隆细胞ＳＴＲＯ．１、ＣＤｌ４６均呈阳性表达，细胞发出明亮的绿色荧光（图２、３），提示其具有干细胞特性。 田１第２代ＰＤＬｓＣｓ波形蛋白染色阳性（免疫组化。ｘ１００ｌ Ｆｉｇｍｕｍ１Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｖｉｍｅｎｌｉｎｉｎｔｈｅｓｅｃｏｎｄｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ０ｆＰＤＬＳＣｓ（ｉｍｍｕｎｏｈｉａｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．ｘ１００） 圈２第２代ＰＤＬＳＧｓＳＴＲＯ．１染色阳性（免疫荧光，ｘ１００） Ｆｉｇｍ陀２ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＳＴＲＯ?１ｉｎｔｈｅｓｅｃｏｎｄｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｏｆ ＰＤＬＳＣｓ（ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ，ｘ１００） 万方数据
8.引导骨再生(一)硬组织处理引导骨再生技术(一)
引导骨再生技术（一） 讲师：Dr. Lim Sang-Chul 硬组织处理 微创手术 ?某些骨增量技术是由于解剖或生理条件限制而提出的。然而因为带来多次手术、额外费用和更长的治疗时间，造成许多病人难以接受。 用于后牙区的短种植体 ?近年来，短种植体临床应用越来越多?短种植体减少了骨增量操作 ?还可减少类如上颌窦穿孔和下唇麻木等种植风险 Nobel Shorty Dentium Superline Branemark Shorty 使用短种植体时的考虑要点 ?是否能获得很好的初期稳定性?避免单端桥Five ‐year clinical evaluation of short dental implants placed in posterior areas: a Retrospective study ‐Survival rates: 99.2%(Anitua et al., J Periodontol 2008) ?尽量消除侧向力 ?分散夹板带来的压迫力量 Straumann短种植体
又粗又短的种植体 Dentium Superline FX7008SW 窄颈种植体 ?窄颈种植体有很高的成功率和留存率（99.4%）， 与常规直径种植体相近 ?未检查到种植体折裂 ?不同窄颈种植体类型未发现明显差异 (Degidi et al., J periodontol2008)
术后26个月Narrow ridge 窄牙槽嵴 空间填充 某些病例，既可以做GBR，也可以单纯填充缺失空间
种植体侧穿做松弛切口 骨移植材料必须填于缺损部位和骨膜之间 引导骨再生（GBR） ?骨量不足，不管是局部不足还是整体不足，都是种植治疗中的巨大挑战。目前已有充分研究证实，引导组织再生可应用于种植体周围的骨组织重建。 ?屏障膜的目的是隔离出骨新生的空间，诱导骨组织在未完全埋入的种植体表面生长(Dahlin and Senner by1991) 。 ?牙槽嵴增宽效果与具体手术步骤和术者经验有很大关系，而种植体的留存率则与种植体周的骨组织有关，与骨移植材料关系不大。 GBR成功要点 ? 1.使用合适的屏障膜 2. 软组织初期关闭 3. 维持空间 4. 骨粉和屏障膜位置要稳定 5. 足够的愈合时间
口腔生物学教学大纲
《口腔生物学》教学大纲 （供口腔医学专业本科使用） 前言 口腔生物学是口腔医学中的一门基础课程，它是医学基础课与口腔专业课之间的桥梁，从基础理论上解释疾病的发生、发展和预后。口腔生物学内容广泛，包括口腔微生物学，口腔生物化学，口腔疾病分子生物学，口腔免疫学，牙周骨组织生物学，口腔细胞培养及其应用。这些内容是口腔医学专业本科生必须掌握的知识，为他们将来从事医疗，教学和研究打下基本的功底。通过学习口腔微生物，树立口腔生态系的观念，有助于对口腔中最常见的疾病——龋病和牙周病本质的理解；通过学习口腔生物化学，了解其生物矿化过程与龋病的关系；了解龋病和牙周病发生的机制；了解作为牙齿的外环境和口腔内主要的营养调节体液——唾液对维持机体生理平衡、抵御疾病的重要作用；通过学习分子遗传学的基本知识，结合口腔疾病，了解分子生物学研究的基本操作技术，能进行初步的研究设计；通过口腔免疫学的学习，了解口腔常见病与免疫和诊断技术，能将理论知识用于临床疾病的诊治上；通过学习牙周骨组织生物学，熟悉牙硬组织、牙周组织、牙槽骨的生理特点，对临床治疗的设计和研究大有裨益；通过学习细胞培养，为今后从事细胞生物学、组织工程学研究奠定基础。 本大纲适用于我院五年制本科口腔医学专业学生学习和教师教学。主要由前言、学时分配、各章节的主要内容和要求（包括目的要求、教学难点、教学内容、复习思考题）、参考书籍和常用网址等四个部分组成。该课程为1学分，计划理论学时为26学时。理论教学采用多媒体辅助的讲授方式为主，开展问题式教学，构建科学合理的知识网络，采用对比记忆法、相互联系记忆法使学生分析归纳问题的能力、理解想象问题的能力和创新思维能力等科学文化素质得到提高和发展。 考试方式及成绩构成：理论考试为闭卷，题型主要有名词解释、填空、选择、判断、简答、论述，占总成绩的100%。
牙周膜干细胞的研究
牙周膜干细胞的研究 作者：常秀梅， 刘宏伟， 金岩 作者单位：常秀梅(广东医学院附属医院口腔科,广东,湛江,524001)， 刘宏伟(同济大学口腔医学院)， 金岩(第四军医大学口腔医学院病理科) 刊名： 临床口腔医学杂志 英文刊名：JOURNAL OF CLINICAL STOMATOLOGY 年，卷(期)：2009,25(7) 被引用次数：3次 参考文献(19条) 1.Surani MA Reprogramming of genome function through epigenefic inheritance[外文期刊] 2001(6859) 2.McCulloch CA Origins and functions of cells essential for periodontal repair:the role of flbroblasts in tissue homeostasis 1995(04) 3.McCulloch CA;Barghava U;Melcher AH Cell death and the regulation of populations of cells in the periodontal ligament[外文期刊] 1989(01) 4.Arceo N;Sauk JJ;Moehring J Human periodontal cells initiate mineral-like nodules in vitro 1991(08) 5.Nohutcu RM;McCauley LK;Koh A J Expression of extracellular matrix proteins in human periodontal ligament cells during mineralization in vitro 1997(04) 6.Chou AM;Sae-Lim V;Lim TM Culturing and characterization of human periodontal ligament fibroblasts- a preliminary study 2002 7.Seo BM;Minra M;gronthos Investigation of muhipotent postnatal stem cells from periodontal ligament 2004(9429) 8.Handa K;Saito M;Y amauchi M Cementum matrix formation in vivo by cultured dental follicle cells[外文期刊] 2002(05) 9.Handa K;Saito M;Tsunods A Progenitor cells from dental follicle are able to form cementum matrix in vivo[外文期刊] 2002(2-3) 10.Gould TR;Melcher AH;Brunette DM Location of progenitor cells in periodontal ligament stimulated by wounding 1977(02) 11.McCulloch CA;Nemeth E;Lowanberg B Paravascular cell in endosteal spaces of alvelar bone contribute to periodontal ligament cell populations 1987(03) 12.Kramer PR;Nares S;Kramer SF Mesenchymal stem cells acquire characteristic of cells in the periodontal ligament in vitro[外文期刊] 2004(01) 13.刘宏伟;欧龙;庞劲凡自体骨髓基质细胞用于牙周骨缺损移植的动物实验研究[期刊论文]-牙体牙髓牙周病学杂志 2000(03) 14.Groeneveld MC;Everts V;Beertsen W A quantitative enzyme histochemical analysis of the distributtan of alRaline phosphatnse acclivity in the periodontal ligament of the rat incisor 1993(09) 15.Tsuboi Y;Nakanishi T;Takano-Yamamto T Mitogenic effects of neutrophins on a periodontal ligament cell line[外文期刊] 2001(03) 16.Byers MR;Maedu T;Brown AM GFAP immunorcecfivity and transcription in trigeminal and dental
植骨术加正畸引导骨组织再生的临床研究
龙源期刊网 https://www.wendangku.net/doc/e717192941.html, 植骨术加正畸引导骨组织再生的临床研究 作者：薛超 来源：《健康必读（上旬刊）》2019年第08期 【摘 ;要】目的：探究植骨术加正畸引导骨组织再生治疗牙周炎骨缺损的临床效果。方法：选择我院自2016年1月至2017年12月收治的1例牙周炎骨缺损患者作为研究对象，对 其行植骨术加正畸引导骨组织再生术治疗，统计患者治疗后的症状改善情况，并对比患者治疗前和术后2周的骨缺损高度、牙槽骨密度、牙周袋深度及出血指数。结果：术后2周拆线可见，患者牙龈红肿症状消失，软组织愈合良好，且未见引导性组织再生膜外露，X线片检查显示骨袋底部钙化增加明显，已达根中1/3，术后3月对患者进行X线片检查复诊，原骨缺损处生出大量新生骨，远中面探针深度颊舌侧为3mm;术后2周，患者骨缺损高度（1.34±0.78）mm、牙周袋深（2.71±0.23）mm及出血指数（0.63±0.11）均显著低于术前（4.15±1.22）mm、（5.16±0.85）mm、（1.48±0.52），患者牙槽骨密度（725.13±10.82）HU顯著高于术前（610.78±9.45）HU，前后对比具有统计学意义（P结论：植骨术加正畸引导骨组织再生治疗牙周炎骨缺损的临床效果显著，值得应用和推广。 【关键词】植骨术;正畸引导骨组织再生术;牙周炎骨缺损 【中图分类号】R782.1;;;;;;【文献标识码】A; ;;;;【文章编号】1672-3783（2019）08-0127-01 牙周炎骨缺损是一种由牙周炎发展而来的口腔疾病，指的是牙周炎发展至中晚期引发患者牙槽骨缺损和形成深的牙周袋[1]。其不仅会对患者口腔的外在美观性和牙齿咀嚼功能造成严重的影响，同时，还易导致其牙齿松动、脱落等，从而对患者日常生活和预后质量造成严重的影响，因此，需积极探寻有效方案对患者进行治疗[2]。以往，临床多采用植骨术对患者治疗，虽具有一定的效果，但整体疗效有待加强，我院在植骨术的基础增加正畸引导骨组织再生术对1例牙周炎骨缺损患者进行治疗，获得了满意效果。现将植骨术加正畸引导骨组织再生治疗牙周炎骨缺损的临床效果分析报告如下。 1 资料与方法 1.1一般资料
口腔生物学课程教学大纲
口腔生物学课程教学大纲 课程简介 一、课程简介 口腔生物学为2001年始新开设的一门口腔基础学科，它是衔接前期医学基础课(生理、生化、微生物、免疫、分子生物学等)与口腔临床学科(口内、口外、口修和正畸等)的一门重要的桥梁学科，包括“口腔微生物”、“口腔免疫学”、“口腔生物化学”、“口腔疾病分子生物学”、“牙周骨组织生物学”和“口腔细胞培养及其应用”六大部分内容，从不同角度阐明口腔疾病的发生、进展和预防。理论大课28学时，考试2学时，要求学生把握口腔生物学的差不多理论、差不多知识和差不多技术，为今后从事口腔医疗、教学和科研打下扎实的基础。 二、总体要求 通过本学科学习，要求学生： 1.把握口腔生态系的阻碍因素，牙菌斑的形成、分类及要紧物质代谢、矿物质转换。 2.把握要紧致龋菌、牙周致病菌的生物学特性、致病机制以及宿主免疫反应在牙周炎发病中的重要作用。 3.把握釉质、牙本质、牙骨质的化学组成。 4.氟在生物矿化中的作用。 5.把握分子生物学研究的要紧方法及在口腔致病菌研究中的应用。 6.把握骨改建的生物学基础 7.把握细胞培养的差不多原理与技术。 8.把握细菌培养、细菌鉴定、毒力检测方法 三、学时分配 四、考核要求 按照把握、熟悉、了解三个层次进行考核。理论考核题型为：名词讲明、填空题、选择题和咨询答题。
学习目的要求 一、把握口腔生态系定义及阻碍因素、牙菌斑的形成及分类、口腔正常菌丛的概念及其成员。 二、熟悉细菌粘附的学讲、正常菌丛的双重作用。 三、了解口腔生物学的内容及意义。 课程内容 一、口腔生物学简介 1.口腔生物学的定义 2.口腔生物学的进展 3.口腔生物学的六个组成部分 二、口腔微生物学概论 1.口腔生态系及其阻碍因素：生态系、生态学、口腔生态系的概念，口腔生态系的阻碍因素 2.口腔正常菌丛：来源和类型 3.牙菌斑：形成、分类、成份 考核知识点 一、口腔生物学的定义、进展 二、口腔生态系的概念及其阻碍因素 三、口腔正常菌丛的概念及来源 四、牙菌斑的形成和分类 考核要求 一、把握口腔生态系定义及阻碍因素、牙菌斑的形成及分类、口腔正常菌丛的概念及其成员。 二、熟悉细菌粘附的学讲、正常菌丛的双重作用。 三、了解口腔生物学的内容及意义。 复习摸索题 一、口腔生态系及其阻碍因素。 二、何谓牙菌斑？ 三、口腔正常菌丛的概念及其双重作用。 第二章牙体微生物及其免疫 学习目的要求 一、把握要紧致龋菌的生物学特性和致病机制 二、熟悉免疫防龋的概念 三、了解防龋疫苗的研究、根尖周病的发病机制 课程内容 一、正常口腔菌丛成员 1.链球菌属 变形链球菌群
牙周组织再生治疗方法研究进展_刁晓悦
牙周组织再生治疗作为恢复因牙周炎或牙龈炎症造成牙周支持结构丢失的一种特殊的技术。定义为经过正规而系统的牙周治疗后，牙周袋消除，已破坏的牙周组织得到重建，即有新的牙骨质和牙槽骨形成，其间有新的牙周膜纤维将其连接，形成有功能性的牙周附着结构，是牙周治疗的理想结果[1]。 专业的牙周治疗和维护，加上危险因素的控制，对减少牙周疾病的进展有积极意义。与传统抗炎治疗不同的是，牙周组织再生目的在于恢复丢失的牙周组织，包括牙槽骨、牙周膜和根面牙骨质。 在过去的十年中，牙周研究已经试图证明有可以预见效果的牙周组织再生方法。在众多的方法中，软硬组织移植，细胞屏障生物膜的应用在临床试验观察中已经取得了一定的疗效。 牙周组织再生结果依赖于：(1)患者，如菌斑控制、吸烟习惯、余牙的牙周感染或引导组织再生膜的暴露；（2）咬合力量在轴向、侧向传导的影响；（3）临床医生的技术等。对牙周组织再生的研究继续用组织移植、根面处理、新的屏障膜技术、细胞生长因子、基因传递的应用来简化并加强重建的丢失的牙周支持组织。 1牙周伤口愈合 对牙周伤口愈合的研究有利于对牙周组织再生的基本机制的理解。许多在细胞学和分子学上有价值的发现已经被用于在牙周药物领域设计再生生物材料。 基于对牙周软组织实验切口的观察，血凝块形成后愈合的顺序为：软组织炎症、粒细胞形成、细胞间的形成和改建。牙周伤口的形态学包含牙龈上皮、牙龈结缔组织、牙周韧带和硬组织成分，如牙槽骨、牙根表面的牙骨质或牙本质。这些特殊组成部分在牙周组织中的位置不同，愈合的过程和时间也不同。上皮中伤口愈合的最终结果是在牙齿周围形成结合上皮。另一方面，牙龈结缔组织的愈合导致了它的量的减少，因此可能造成牙龈退缩和牙周袋的减少。牙周韧带依靠来源于牙周韧带肉芽组织的成牙骨质细胞在新形成的牙骨质上再生。牙槽骨随着来源于牙龈结缔组织的间充质细胞通过局部骨形成蛋白的表达转化成骨原细胞而改建[2]。 通常，向下增长的上皮沿牙根表面达到的牙周韧带前，牙周韧带已经重新生成新层牙骨质和新长入结缔组织的纤维。因此，为了促进牙骨质重建和牙周韧带生长，牙龈上皮必须阻止形成一个沿着根面到前水平牙周韧带的长联接上皮。这是引导组织再生在标准的临床过程中放置膜的关键。 2硬组织移植 在一些临床试验和动物实验，牙周皮瓣方法是结合骨移植或植入材料促进牙周组织再生。各移植和植入材料分类是：（1）自体移植：同一个有机体内，移植从一个位置到另一个；（2）异体移植：同一物种的生物体，移植从一个到另一个生物体；（3）异 牙周组织再生治疗方法研究进展 刁晓悦综述柳忠豪审校 【摘要】牙周组织再生是牙周治疗的理想结果和最终目标，且在牙周手术、义齿修复及种植手术中有重要的影响。目前，已经有许多方法取得了一定的成果和进展，有效的修复了缺损的牙周组织，本文将对牙周组织再生治疗方法做一综述。 【关键词】牙周组织再生；生长因子；引导组织再生；种植体 中图分类号：R782.1文章标识码：A文章编号：1007-3957(2014)01-34-4 文献综述 作者单位:264008山东烟台市口腔医院。
三种方法原代培养人牙周膜细胞
中国组织工程研究与临床康复第14卷第23期 2010–06–04出版Journal of Clinical Rehabilitative Tissue Engineering Research June 4, 2010 Vol.14, No.23 Department of Oral Medicine, Stomatological Hospital Affiliated to Luzhou Medical College, Luzhou 646000, Sichuan Province, China Jiang Jun-qiang★, Master, Lecturer, Department of Oral Medicine, Stomatological Hospital Affiliated to Luzhou Medical College, Luzhou 646000, Sichuan Province, China jqjiang@https://www.wendangku.net/doc/e717192941.html, Correspondence to: Cai Wei, Lecturer, Department of Oral Medicine, Stomatological Hospital Affiliated to Luzhou Medical College, Luzhou 646000, Sichuan Province, China caiwei311@https://www.wendangku.net/doc/e717192941.html, Supported by: the Scientific Research Foundation of Health Department of Sichuan Province, No. [2007]431* Received: 2010-01-19 Accepted: 2010-05-10 三种方法原代培养人牙周膜细胞*★ 蒋俊强，王忠朝，黎春晖，蔡炜 Primary culture of human periodontal ligament cells using three methods Jiang Jun-qiang, Wang Zhong-chao, Li Chun-hui, Cai Wei Abstract Jiang JQ, Wang ZC, Li CH, Cai W.Primary culture of human periodontal ligament cells using three methods. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu. 2010;14(23): 4290-4294. [https://www.wendangku.net/doc/e717192941.html, https://www.wendangku.net/doc/e717192941.html,] 摘要 蒋俊强，王忠朝，黎春晖，蔡炜.三种方法原代培养人牙周膜细胞[J].中国组织工程研究与临床康复，2010，14(23):4290-4294. [https://www.wendangku.net/doc/e717192941.html, https://www.wendangku.net/doc/e717192941.html,] 0 引言 细胞培养技术是细胞生物学研究的基础[1]。从组织中分离的原代细胞较好地保存了原组织细胞的遗传特征和生物学特征[2]。体外培养的人牙周膜细胞(human periodontal ligament cell，hPDLC)对研究牙周细胞生物学、药理学、毒理学以及牙周组织工程研究具有重要意义[3-7]。牙周膜是一种致密的结缔组织，由细胞、基质和大量的胶原纤维组成。由于受到牙周组织的解剖结构和取材数量的限制，牙周膜细胞的原代培养较为困难，这也成了限制牙周细胞生物学研究的瓶颈[8-10]。大量的研究者对其培养方法进行了探索，目前常用的方法主要有两种：组织块法和酶消化法[11-15]。作者在实验过程中发现这两种方法存在培养周期较长，成功率较低、培养出的细胞活性欠佳等缺陷。若将两种方法结合起来，采用酶消化结合组织块法能够有效提高hPDLC培养的成功率。本实验分别采用这3种方法进行hPDLC的原代培养，比较其培养成功率，同时对所培养细胞进行鉴定，探索hPDLC原代培养的方法，为牙周细胞生物学研究奠定基础。
牙周膜成纤维细胞培养
我的细胞培养计划 1、培养目的： 人牙周膜成纤维细胞( human periodontal ligamentfibroblasts, PDLFs) 是牙周组织修复与重建的前体细胞之一., 在牙周病病理变化和转归中起着重要作用。因此, 希望通过较简单的实验方法能较容易地培养出生长状态良好的牙周膜成纤维细胞,为研究牙周膜的生物学特点及各种与牙周膜成纤维细胞相关的实验研究提供较好的体外模型。 2、实验室条件： 超净工作台、培养箱、倒置显微镜、冰箱、冷冻保存装置、细胞计数板和电子细胞计数仪、离心机、PH计、天平、水纯化装置、高压蒸汽消毒装置、电热干燥箱、过滤除菌装置、手术器械、培养器皿、移液器、特殊用具、杂用品。DMEM 培养基, 胶原酶, 胰蛋白酶, 小牛血清, ABC 免疫组化试剂盒。 3、培养方法： 1）、培养基: DMEM 培养基, 内含10%小牛血清、青霉素100u/ ml、链霉素100Lg / ml。 2）具体操作方法及步骤（按实际操作分步列出）； 选择12 岁~ 25 岁因正畸或阻生拔牙患者, X 线显示无根尖病变, 无骨质吸收, 牙龈正常, 主诉该牙无既往病史。在拔牙过程中不增隙也不使用牙挺, 拔除后, 用消毒刮匙刮取拔牙创骨壁中部的牙周膜, 将刮取的牙周膜立即放入盛有培养基的无菌瓶中, 送往实验室处理。
3）、组织块的冲洗: 在洁净工作台上用含双抗( 青霉素100u/ ml, 链霉素100Lg / ml ) 的HANK. S 液反复冲洗3 次, 尽量去除组织块上附着的血污等其它杂质和细菌。 4）、PBS 冲洗2次后, 加入0. 125% 胰蛋白酶及0. 1%胶原酶5ml, 37℃振荡下消化30～60min。镜下观察, 组织松散、大部分细胞游离时, 用吸管吹打使其彻底分散。将消化的细胞悬液经190目筛过滤, 收集并离心( 1000 r / min, 10 min) , 弃去上清液。 5）、加入含10%小牛血清的DMEM 培养基, 充分吹打细胞悬液, 血细胞计数板计数,将细胞按4 ×105 / 瓶接种于25cm2 培养瓶, 加入4 mlDMEM 培养基, 内含10%小牛血清、青霉素100u/ ml、链霉素 100Lg / ml, 于二氧化碳孵箱内培养。培养条件为5%CO2、95% 空气、37℃、饱和湿度。待细胞贴壁后, 隔日换液。 4、注意事项： 1）、在收集标本, 供体年龄越小越易取得成功, 标本要新鲜并及时处理。在刮除牙龈1/ 3牙周组织以避免污染的情况下, 要彻底刮下中2/ 3剩余牙周组织, 以防止牙周膜细胞成分的丢失。 2）、在消化时间上,应根据组织块的大小采用不同的消化时间。本实验采用0. 1%胶原酶和0. 125% 胰蛋白酶联合消化约50min左右, 显微镜下密切观察组织消化情况, 及时收集细胞, 消化时间过长, 将会影响细胞贴壁及成活率。 3）、在细胞贴壁方面, 通常原代细胞贴壁速度较慢, 可通过:a. 培养瓶胶原涂膜; b. 在培养瓶内盛有少量培养基并预先1、2天放置二
壳聚糖在引导骨再生膜中的应用
［文章编号］ １６７１－５８７Ⅹ（２０１２）０４－０８１３－ ０４［收稿日期］ ２０１２－０３－ １３［基金项目］ 浙江省科技厅自然科学基金资助课题（Ｙ２１１０２６０ ）［作者简介］ 平飞云（１９５４－） ，女，浙江省杭州市人，主任医师，主要从事口腔颌面肿瘤及口腔颌面软硬组织畸形整复的研究。 ［通信作者］ 董 研（Ｔｅｌ：０５７１－８７７８４６１９，Ｅ－ｍａｉｌ：ｗｅｎｑｉｎｇ＿ ６６＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ）壳聚糖在引导骨再生膜中的应用 Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｈｉｔｏｓａｎ ｉｎ ｇ ｕｉｄｅｄ ｂｏｎｅ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｍｅｍｂｒａｎｅｓ平飞云１，苗卓伟１，王新木２，董 研３ （１．浙江大学医学院附属第二医院口腔颌面外科，浙江杭州３１０００９；２． 杭州市第一人民医院口腔科，浙江杭州３１０００６；３．浙江大学医学院附属第二医院口腔矫形科，浙江杭州３１０００９ ）［摘 要］ 壳聚糖（又称几丁糖）是几丁质脱乙酰基的产物，作为一种具有高度生物相容性的生物大分子材料，被广泛应用于医学领域。本文作者查阅近几年国内外有关壳聚糖可吸收生物膜在引导骨再生技术中应用的文献，总结其研究成果并探讨其发展方向。壳聚糖的生物特性，使其在制备可吸收引导骨再生膜中具有突出的优势。与此同时，在生物体内降解周期长是壳聚糖存在的主要问题。为了在可吸收生物膜领域开拓出广阔的应用前景，与胶原、生长因子等材料结合是壳聚糖未来的发展趋势。［关键词］ 壳聚糖；引导骨再生；生物膜；生长因子；牙种植［中图分类号］ Ｒ３１８．０８；Ｒ６８１．３ ［文献标志码］ Ａ 采用种植技术进行牙修复，缺损区牙槽骨质与量直接影响种植体－骨结合、种植体长期稳定性及种植体周围软组织的愈合速度。意外创伤、长时期牙缺失及重度牙周炎等因素导致的牙缺失可造成牙槽骨进行性吸收，使牙槽嵴高度下降、宽度缩窄，影响种植体植入后的骨结合质量，同时有碍种植义齿的固位和稳定。以往解决骨量不足的问题常采用自体髂骨、腓骨移植技术，但这种方式导致供骨区 的手术创伤及术后可能诱发感染等并发症［ １］ ，引导骨再生（ｇ ｕｉｄｅｄ ｂｏｎｅ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ，ＧＢＲ）技术［２－４］是已被实验及临床证实可以有效解决牙种植术中遇到的骨量不足问题。ＧＢＲ技术是在引导组织再生（ｇｕｉｄｅｄ ｔｉｓｓｕｅ ｒｅｇ ｅｎｅｒａｔｉｏｎ，ＧＴＲ）技术上发展起来的，２０世纪８０年代初，Ｋａｒｒｉｎｇ ［５］ 提出了ＧＴＲ技术的概念，并将其定义为在完成外科手术后的愈合过程中，隔膜所创造的空间被合适的或正确的组织重新充填。此后，针对骨组织的隔膜再生技术被定义为 ＧＢＲ技术。Ｄａｈｌｉｎ等［６］用聚四氟乙烯膜进行小鼠下颌角骨 缺损愈合实验，发现有膜覆盖侧可见完全骨组织再生，而无膜覆盖侧几乎未见骨组织再生，可见ＧＢＲ膜是此技术关键，膜在骨组织修复过程中有重要作用。ＧＢＲ技术出现至今，已经有２０余种膜被研究和应用，本文作者对壳聚糖膜研究现状和发展方向做一论述。１ ＧＢＲ膜分类 按照膜在体内能否被吸收，ＧＢＲ膜分为不可吸收膜和可吸收膜［ ７－ ８］。不可吸收膜又称生物不可降解膜，主要有钛膜、聚四氟乙烯（ｅｘｐａｎｄｅｄ ｐｏｌｙｔｅｔｒａｆｌｕｏｒｏｅｔｈｙｌｅｎｅ，ｅ－ＰＴＦＥ）膜、钛加强的聚四氟乙烯膜、纤维素膜及微孔滤膜等。其中钛膜和ｅ－ＰＴＦＥ膜是实验研究较多并证明在引导骨再生方面有肯定效果的，两者在临床上的应用也很广泛。钛膜机械强度高，可维持骨再生需要的空间。聚四氟乙烯膜具有一定的可塑性，使用时易于成形，不可吸收膜可根据骨缺损愈合的具体情况决定膜在体内的留置时间。但是不可吸收膜的组织亲和性较差，常导致创口感染开裂，膜早期暴露影响骨再生质量。骨缺损修复后膜在体内不可降解，需进行二次手术，对已修复牙龈组织造成损伤，且增加感染的风险。膜的取出过程延长了治疗时间，患者需承担更多的疼痛和更高的治疗费用。 可吸收膜又称生物降解膜，主要有胶原膜、聚乳酸膜、壳聚糖膜及异体冻干骨膜等。其中异体冻干骨膜由于来源有限易引起免疫反应等因素已很少使用。胶原膜和壳聚糖膜成为主要研究对象。可吸收膜的生物相容性好，抗原性低，具有一定的抗感染性。在体内经过一段时间可自行降解。胶原膜和壳聚糖膜呈纤维网架结构，利于有骨再生潜能的细胞附着。但是可吸收膜的机械强度低，不能长时间保持骨再生所需空间。各种来源的材料因制备方式不同导致膜降解速度不同。另外，降解过程中会引起轻度炎症反 ３ １８第３８卷 第４期２０１２年７月吉 林 大 学 学 报 （医 学 版） Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｊｉｌｉｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｅｄｉｔｉｏｎ）Ｖｏｌ．３８Ｎｏ．４ Ｊｕｌ．２０１２
牙周再生治疗
牙周再生治疗 为进一步提升牙周炎治疗效果，特别是一些骨下袋牙周缺损患者，在菌斑控制的基础上获得牙周缺损组织的再生，是治疗所希望达到的理想目标。实现牙周组织再生，可以彻底消除骨下袋及其所带来的再感染风险，重建牙周组织对患牙的支撑功能，意义重大、影响深远。第一代牙周组织再生技术起源于上世纪八十年代末、九十年代初，以GTR技术引入牙周炎治疗为标志，后来伴随多种骨材料的问世，GTR 与植骨术联合应用已经成为目前常用的临床再生治疗方法；第二代牙周组织再生技术是伴随着蛋白工程等生长因子重组技术的发展而建立起来的，以生长因子的临床应用为主要手段（其中也包含自体来源的内源性生长因子的应用）；第三代牙周组织再生技术是基于组织工程、干细胞治疗的再生新策略，通过进一步基础和临床转化研究，有望获得高效、可预期的牙周组织再生。 1 第一代牙周组织再生技术 1.1 引导组织再生 GTR 技术是指在牙周手术中利用膜性材料作为屏障，阻挡牙龈上皮在愈合过程中沿根面生长，避免牙龈结缔组织与根面接触，同时提供一定的空间，引导具有形成新附着能力的牙周膜细胞优先占据根面，从
而在已暴露于牙周袋内的根面上形成新的牙骨质，并有牙周膜纤维埋入，形成牙周组织的再生，即形成新附着性愈合。因此，屏障膜的选择是该技术的关键因素。屏障膜包括不可吸收膜和可吸收膜两大类。不可吸收膜主要以聚四氟乙烯为代表，具有良好的生物相容性和力学性能，临床中可单独使用。由于需要二次手术取出，不可吸收膜临床应用仅局限于一些特定的病例。 可吸收膜以胶原膜为代表（如Bio-Gide 等），具有良好的生物相容性，表面利于细胞生长、参与组织修复。但可吸收膜力学性能差，往往需要与植骨材料联合使用，主要适用于垂直型骨缺损（Ⅱ壁或Ⅲ壁）、根分叉病变和个别牙根面裸露的治疗，也可用于种植术所需的牙槽嵴增高等。虽然GTR 联合植骨术已经成为临床牙周治疗中针对上述情况的常用方法，且临床效果比单纯翻瓣术好，但也有研究表明，GTR 联合植骨术，并不一定可以获得比单纯植骨术更好的临床效果。因此，牙周植骨术是否一定需要联合GTR，有待进一步临床试验研究去证实。 1.2 植骨材料的研究和应用 牙周植骨术是采用骨或骨组织替代品等移植材料来修复因牙周病造成的牙槽骨缺失的一种方法。目的在于通过移植材料促进新骨形成，修复骨缺损，恢复牙槽骨的解剖形态，从而达到理想的骨再生和新附着性愈合。理想的牙周植骨材料应具有良好的生物相容性、生物安全
细胞生物学细胞基质与功能
细胞基质与功能 细胞外基质 细胞是生物体的基本结构单位，然而在多细胞生物体中，细胞大都以组织的形式存在，组织中除了细胞成分外，尚存在有非细胞性的细胞间物质。 在动物组织中，这种细胞间物质是由一些蛋白质和多糖大分子构成结构网络，这些存在于细胞间的大分子结构称为细胞外基质。 实际上细胞外基质是细胞的分泌物在细胞附近构成的精密结构，它通过与细胞质膜中的细胞外几种受体结合，同细胞建立相互关系。它对细胞的分化、增殖、形状、迁移和功能活动都由重要的影响。 细胞外基质主要由凝胶基质和纤维网架构成 凝胶基质为多糖，包括氨基聚糖和蛋白聚糖 纤维网架为纤维蛋白。纤维蛋白非两种，一是起结构作用的，如胶原蛋白、弹性蛋白 一是起黏合作用的，如纤连蛋白和层连蛋白。 基质中的多糖凝胶使细胞外基质具有抵抗压力的作用，细胞外基质凝胶中的纤维呈网状结构，因而各种养料、代谢产物和激素等物质可穿越网孔迅速扩散，便与在血液和组织之间进行交换。 细胞外基质是指分布于细胞外空间，由细胞分泌的蛋白质和多糖所构成的网络结构，细胞外机制不仅为组织的构建提供了框架，还对其接触的细胞命运及其它功能产生重要的调控作用。细胞外机制具有以下功能： 1.细胞外基质将细胞粘连在一起构成组织；动物组织的构建既是多细胞相互作用的结果，也是细胞与细胞外基质相互作用的结果 2.提供细胞外网架，在组织中或组织之间起支持作用 3.细胞外基质的三维结构即成分是动态变化的没通过细胞微环境的改变对细胞形态、生长、分裂、分化和凋亡起到控制作用。 糖胺聚糖（GAG） 糖胺聚糖是重复二糖单位构成的长链多糖，不分支。二糖单位为氨基糖（N-乙酰葡糖胺或N-乙酰版乳酸）和糖醛酸（即葡萄糖醛酸）。氨基糖大多硫酸化。过去糖胺聚糖也称为粘多糖。 根据糖残基性质、连接方式和硫酸基的数量和存在部位。可将糖胺聚糖分为4类：1.透明质酸 2.硫酸软骨素和硫酸皮肤素 3.硫酸类肝素和肝素 4.硫酸角质素糖胺聚糖的特性与功能意义：糖胺聚糖多糖连不能曲折，形不成球状构象，呈充分展开构象，且糖胺聚糖呈高度亲水性。糖链带有大量负电荷，可吸引许多阳离子，从而对渗透压具有很大影响，可将大量水分吸收吸收到基质中，使其具有高膨胀压，可耐受很强的压力。在细胞外形成多空的糖胺聚糖凝胶，占据了细胞质的大部分空间，提供机械支持作用。由于糖胺聚糖凝胶中的许多空洞，因此水溶性分子可在凝胶状红迅速扩散，同时也游离于细胞在机制中的迁移。 透明质酸 4类糖胺聚糖当中，分子结构最为简单，是唯一一种不含硫酸的成员，存在于动物所有组织和体液中，在早期胚胎组织中特别丰富。 细胞外基质中的透明质酸不是由细胞分泌产生的，而是由质膜中的酶复合物直接从细胞表面聚合出的分子链。透明质酸不与蛋白质形成共价结合的蛋白聚糖 透明质酸的功能是多方面的：1.在成体组织和关节肿抵御压力 2.在胚胎发育中起空袭
引导骨再生膜技术
引导骨再生膜技术 第十六章引导骨再生膜技术 膜技术的原理及技术 膜的分类及用途 骨缺损GBR膜植入术(以不可吸收Gore-Tex膜为例) 膜技术的原理及作用 引导骨再生的生物膜技术(Guided Bone Regeneration，GBR technique)最早始于牙周病学领域，称为引导组织再生技术(guided tissue regeneration，GTR technique)。根据各类不同组织细胞迁移速度不同，即上皮细胞、纤维组织细胞比形成牙骨质、牙周韧带及骨组织的细胞快，采用生物材料人工制成一种带微孔的生物膜，起屏障作用，以阻止软组织中成纤维细胞及上皮细胞长入骨缺损区，避免这些细胞与有骨生成能力的细胞产生竞争抑制，保护血块的稳定，维持血块充填的间隙，使有骨生成能力的细胞缓慢进入骨缺损区，修复骨缺损。 ________________________________________ 返回页首 膜的分类及用途 GBR膜有不可吸收（生物不降解）及可吸收（生物降解）两类。不可吸收
膜以聚四氟乙烯膜（expended polytetrafuorethylene-ePTFE,又称 Gore-Tex膜）临床应用最多，它又分两种类型：一种为中间硬，边缘柔软，微孔为0.45um，孔大允许结缔组织长入；另一种为膜中加钛网支架或聚丙烯网架，以保持骨缺损间隙。可吸收膜目前尚不成熟，有聚乳酸膜、聚乙烯酯膜、共聚物膜及胶原膜等，但因其降解速度与成骨速度的控制尚不理想，临床应用受到限制。GBR膜技术应用于种植外科始于80年代末 90年代初，已取得了满意的效果，有很好的应用前景。 ________________________________________ 返回页首 骨缺损GBR膜植入术（以不可吸收Gore-Tex膜为例） 【适应证】 ⑴术前增加种植区因失牙后或外伤缺损之骨量； ⑵拔牙后即刻种植种植体颈部骨缺损； ⑶种植手术中造成的骨裂开或骨旁穿； ⑷由种植体周围炎造成的骨吸收。 【术前准备】 ⑴全身情况、口腔检查及Ｘ检查，同一般种植手术。 ⑵准备生物膜：根据骨缺损准备好适当大小的生物膜（ePTFE，Gore-Tex 膜）及固定钛螺钉； ⑶备好植骨材料：如取自体骨，应先选定取骨部位及骨科手术器械。 【麻醉及体位】 同拔牙麻醉。患者取平卧位，手术者在头顶或右侧。
口腔执业医师考试辅导：牙周组织再生
口腔执业医师考试辅导：牙周组织再生 目前牙周病的治疗包括3个方面：消除炎症、防止感染复发及重建牙周组织的正常结构和功能。牙周病变过程中牙周组织因炎症而破坏，如何获得牙周组织结构和功能的重建——即牙周组织再生，是牙周病研究领域中的重要课题。近年来的研究发现，只有来源于牙周膜的牙周前体细胞才具备形成牙骨质、牙槽骨和牙周膜的能力。要使这些牙周前体细胞占据病损部位并有效地重建牙周组织，必须阻止不能合成牙周组织的细胞占据病损部位、改善病变根面的生物相容性及增强牙周前体细胞的活性。 一、阻止牙龈上皮细胞根向生长 常规牙周手术治疗后生长最快的是牙龈上皮细胞，形成长结合上皮贴附于根面，阻止了牙周结缔组织对根面的附着，不利于牙周组织重建。引导组织再生术（GTR）就是在牙周骨丧失部位使用生物相容性膜阻止牙龈上皮的根向生长，并形成一定间隙以利于牙周膜细胞占据根面，重建牙周结构。迄今，研究得较多的是Gore-Tex膜，这是一种不能降解的聚四氟乙烯膜，Becker等报道应用Gore-Tex膜治疗牙槽骨垂直吸收和Ⅱ度根分叉病变，经过5年临床观察，牙周袋深度减少6.4mm，附着水平增加4.5mm，疗效满意。Pontoriero和Lindhe 报道GTR对Ⅱ度和Ⅲ度根分叉病变的临床疗效较好。但亦有临床研究认为GTR对Ⅲ度根分叉病变疗效欠佳。总之，GTR能明显改善牙周状态，组织学观察发现在骨缺损修复部位靠根向为新生的牙周膜、牙槽骨和牙骨质，冠向仍有部分结合上皮附着，两者之间有结缔组织
形成。 由于Gore-Tex膜不能降解，需二次手术取出，近年来研究者们相继研制了一系列可降解的生物膜，包括胶原膜、氧化纤维素膜、卡吉氏膜、可水解聚酯膜、聚乳酸膜等。作者采用中国医学科学院生物医学工程研究所提供的胶原膜，进行了引导牙周组织再生术的动物实验研究，发现胶原膜能有效地阻止龈向上皮的根向生长，使用胶原膜部有明显的牙骨质和牙槽骨新生，并有接近正常结构的牙周膜形成。近年来由Guidor公司研制的另一种由聚乳酸和枸橼酸酯组成的可吸收性膜也被广泛用于临床，取得了和Gore-Tex膜一样的临床效果。对于可吸收性膜尚需进一步研究其在局部保留的时间及膜的降解对牙周愈合有无影响等，以期得到更佳的治疗效果。 二、改善病变根面的生物相容性 牙周炎会造成根面牙骨质的病理性改变。由于牙周附着的破坏、结合上皮根向迁移，使牙根暴露于牙周袋或口腔；表面附着的菌斑、牙石、细菌及其毒素还可渗入到牙本质内；牙根面还可发生脱钙和过矿化等改变。病变的根面不利于牙周组织的新生及附着。为研究病变根面对牙周愈合的影响，Polson和Caton将猴的一颗上颌中切牙造成实验性牙周炎，然后将其两个中切牙一并拔除并分别再植入对侧牙槽窝内。40天后，正常牙植入病变牙槽窝显示沟内上皮附着于釉牙骨质界、结缔组织附着于根面、嵴上纤维连接牙骨质与邻近结缔组织；植入正常牙槽窝的病变牙龈沟上皮沿根面生长移行止于牙槽嵴根方，无结缔组织附着形成。该研究表明是病变的牙根面而不是减少了的牙