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分解纤维素的高温真菌筛选及其对烟杆的降解效果

第27卷第2期唐山师范学院学报 2005年3月 Vol. 27 No.2 Journal of Tangshan Teachers College Mar. 2005 ────────── 收稿日期：2004-10-20 作者简介：高凤菊（1978-），女，河北乐亭人，四川农业大学生命科学学院硕士研究生。 - 7 - 真菌与细菌纤维素酶研究进展高凤菊1，李春香2 （1.四川农业大学生命科学学院，四川雅安 625014；2.唐山师范学院生物系，河北唐山 063000）摘要：对分解纤维素真菌及细菌的种类，纤维素酶的组成和分类，分子结构、作用机理，纤维素酶基因工程及研究展望进行了综述。关键词：真菌；细菌；纤维素酶中图分类号：Q556+.2 文献标识码：B 文章编号：1009-9115（2005）02-0007-04 资源和环境问题是人类在21世纪面临的最主要的挑战。生物资源是可再生性资源，地球上每年光合作用的产物高达1.5×1011~2.0×1011t ，是人类社会赖以生存的基本物质来源。其中90％以上为木质纤维素类物质，[1]其中的纤维素是地球上最丰富的多糖物质， [2] 这类物质是植物细胞壁的主要成分，也是地球上最丰富、最廉价的可再生资源。我国的纤维素资源极为丰富，每年农作物秸秆的产量达5.7×108t ，约相当于我国北方草原年打草量的50倍。目前这部分资源尚未得到充分的开发利用，主要用于燃料，畜牧饲料与积肥，不仅利用率低，还对环境造成一定的污染。 [3] 随着世界人口迅速增长、粮食、矿产资源日渐枯竭，开发高效转化木质纤维素类可再生资源的微生物技术，利用工农业废弃物等发酵生产人类急需的燃料、饲料及化工产品，即化工原料的“绿色化”，具有极其重大的现实意义和光明的发展前景。在自然界中，许多霉菌[4]和细菌[5]都能产生纤维素酶，但有关细菌纤维素酶的报道很少。由细菌所产生的纤维素酶一般最适中性至偏碱性，因为这类酶制剂对天然纤维素的水解作用较弱，长期以来没有得到足够的重视。近十几年来，随着中性纤维素酶和碱性纤维素酶在棉织品水洗整理工艺及洗涤剂工业中的成功应用，细菌纤维素酶制剂已显示出良好的使用性能和巨大的经济价值。[6][7][8] 1 纤维素分解微生物 1.1 纤维素分解性细菌 (cellulose decomposingbacteria ) 纤维素分解性细菌是能分解纤维素的细菌。由于纤维素酶等的作用，纤维素可一直被分解到葡萄糖为止，有时在分解过程中会积累纤维二糖。这类细菌多见于腐植土中。好氧性细菌如纤维单胞菌属（Cellulomonas ）、纤维弧菌属（Cellvibrio ）、噬胞菌属（Cytophaga ）等能分解纤维素；但在好氧条件下土壤中纤维素的分解，主要是纤维素分解真菌在起作用。而在厌氧条件下纤维素的分解，一些厌氧性的芽孢梭菌属（Clostridium ）的细菌具有重要作用。纤维素分解细菌亦可栖息于草食动物的消化道、特别是反刍动物的瘤胃中。它们在其中进行分解纤维素的活动，这些细菌是厌氧性细菌，例如产琥珀酸拟杆菌（Bacteroides succinogenes ）、牛黄瘤胃球菌（Ruminococcus flavefaciens ）、白色瘤胃球菌（R.albus ）、溶纤维丁酸弧菌（Butyrivibrio fibrisolvens ）（程光胜译）等。细菌纤维素酶多数结合在细胞膜上，菌体细胞需吸附在纤维素上才能起作用，使用很不方便，酶的分离提取也较困难。但是细菌主要产生中性纤维素酶和碱性纤维素酶。碱性纤维素酶由于在洗涤剂工业中有良好的应用价值，也成为研究热点，其产生菌主要集中在芽孢杆菌属[9]。由于酶的耐热性在生产中具有现实意义，所以耐热细菌也是研究的热点。 1.2 纤维素分解性真菌真菌类有黑曲霉、血红栓菌、卧孔属、疣孢漆斑菌QM460、绳状青霉、变幻青霉、变色多空霉、乳齿耙菌、腐皮镰孢、绿色木霉、里氏木霉、康氏木霉、嗜热毛壳菌QM9381和嗜热子囊菌QM9383等[10]；丝状真菌产生的纤维素酶一般在酸性或中性偏酸性条件下水解纤维素底物。真菌纤维素酶通常是胞外酶，酶被分泌到培养基中，用过滤和离心等方法就可较容易地得到无细胞酶制品。目前饲用纤

纤维素分解细菌的分离和鉴定一．实验目的： 1.研究低温环境下纤维素降解细菌的分离与鉴定． 2.采用低温培养的方法从秸秆堆肥中筛选出3株分解纤维素的细茵。 3.通过PCR克隆这3株茵的16s rDNA并与相似菌株做比对．进一步构建分子进化树．来研究其分类情况。 4.综合其个体形态、茵落形态、生理生化特征、16S rDNA发育树构建结果等分类依据。二．实验原理：细菌进行化能异养、短杆状、无出芽分裂、好氧、革兰氏染色阴性．无芽孢、无丝状菌体、有细胞壁且能独立生存。应为其第二部分滑动细菌或第七部分的假单胞菌类。由于滑动细菌能在“固体表面和汽一水交界面缓慢滑动”，故其固体菌落边缘应不整齐，且其一般形成亮色肉眼可见的子实体。将灭菌的滤纸蘸取无菌生理盐水后贴在已凝固的平板上，用接种环蘸取土样，点样在平板滤纸上，15℃下培养10 d。用接种环从有滤纸水解透明圈的单菌落处刮取细菌，在贴有滤纸的初筛平板上划线，计数并且观察。三、实验仪器： 1、材料试验材料为背阴处长时间堆放的秸秆堆肥表层； 2、培养基：初筛培养基。浓缩10倍的赫奇逊固体无机盐培养基”。：啦嘞1．00 g，MgS04·7H20 0．30 g，NaCl 0．10 g，F'eCl3O．0l g，NaN03 2．50 g，CaCi2 0．10 g，琼脂18．00 g，蒸馏水l000lnl，pH值7．0～7．2．121℃灭菌20min。无淀粉滤纸(浙江富阳纸厂)用浓度l％的醋酸浸泡一夜后用浓度2％的Na-2C03水溶液洗至中性，晾干备用。把上述处理过的滤纸剪成直径约为8 ca的圆形滤纸片．放在干净的平皿中，用报纸包好．采用湿热的方法灭菌； 3、复筛培养基。浓缩10倍的赫奇逊固体无机盐培养基：啦P04 1．009，m．庐04‘7H200．309。NaO 0．109．FeCl30．01g，NaN03 2．50 g．CaCl20．10g，羧甲基纤维素钠lO．00 g，琼脂18．00g，蒸馏水10130ml，pH值7．0—7．2，121℃灭菌20 min。 4、牛肉膏蛋白胨固体培养基； 5、生理生化特征鉴定培养基。四、实验步骤： 1、菌种分离菌种初筛。将灭菌的滤纸蘸取无菌生理盐水后贴在已凝固的平板上，用接种环蘸取土样，点样在平板滤纸上，15℃下培养10 d。用接种环从有滤纸水解透明圈的单菌落处刮取细菌，在贴有滤纸的初筛平板上划线，15℃下培养10 d。重复此操作至菌种初步纯化。 2、菌种复筛。用接种环从已初步纯化的初筛平板上滤纸水解透明圈的菌落处，刮取菌种在复筛平板上划线，15℃下培养7 d，得到单菌落。将分离纯化的单菌落回接到初筛培养基上，观察其对滤纸的分解。将分离到的单菌落接种到牛肉膏蛋白胨培养基上。15℃下培养7 d,4℃保留菌种或用作各种鉴定。

分解纤维素的微生物的分离栾旭东，张兴敏，周雪霞，闫超，何溢涛（山东大学生命科学学院2005级生科基地班，济南250100）摘要：纤维素是地球上含量最丰富的多糖类物质，它能被土壤中某些微生物分解利用，是因为它们能够产生纤维素酶。本实验通过从土壤中分离分解纤维素的微生物，初步鉴定了其形态特征和生理生化特性，为日后更进一步的研究打下基础。关键词：纤维素土壤微生物纯培养刚果红染色法 Abstract: cellulose is the most abundant polysaccharide on the earth, which can be digested by some microorganisms in the earth because they produce cellulase. In our experiment, we isolated these microorganisms from the earth and checked up the cells’ and colonies’ morphology and the bioreactions they can act. Key words:cellulose, microorganisms in the earth, pure culture, Congo red staining 资源和环境问题是人类在21世纪面临最主要的挑战。生物质资源是可再生资源，地球上每年光合作用的产物高达 1.5×1011—2.0×1011，是人类社会赖以生存的基本物质资源，其中90%以上为木质纤维素类物质[1]。目前这部分资源尚未得到充分的开发利用。随着世界人口迅速增长，矿产资源日渐枯竭，开发高效转化木质纤维素类可再生资源的微生物技术，利用工农业废弃物等发酵生产人类急需的燃料、饲料及化工产品，即化工原料的“绿色化”，具有极其重要的意义和光明的发展前景。地球上的植物每年产生的纤维素超过70亿吨，其中40%~60%能被土壤中的某些微生物分解利用，这是因为它们能够产生纤维素酶。而要研究这些微生物，首先要将它们从土壤中种类乏多的微生物中分离出来。 1.土壤中纤维素分解菌的分离[2] 土壤有“微生物的天然培养基”之称，同其他生物环境相比，土壤中的微生物数量最大，种类最多。在富含有机质的土壤表层，有更多的微生物生长。实验的具体操作步骤如下。 1.1土样的采集土壤中的微生物，大约70%~90%是细菌。细菌适宜在酸碱度接近中性的潮湿土壤中生长，绝大多数分布在距地表约3~8cm的土壤层。因此，土壤取样时，一般要铲去表层土。另外，土样的采集要选择富含纤维素的环境，这是因为在纤维素含量丰富的环境，通常会聚集较多的分解纤维素的微生物。综合各种因素，本小组从图书馆后院的落叶堆积丛取土样。

《分解纤维素的微生物的分离》 1.下列有关微生物培养与应用的说法正确的是( ) A．天然培养基是指直接取自自然界不需加工的培养基 B．接种前需对培养基、培养皿、接种环、实验操作者的双手等进行严格的灭菌处理 C．大肠杆菌的纯化培养过程包括培养基的配制和纯化大肠杆菌两个阶段 D．分离分解尿素的细菌时，尿素是培养基中唯一的氮源和碳源 2.微生物与人类生产、生活密切相关，下列相关说法不合理的是( ) A．土壤中的微生物能降解多种化合物，是大自然的清洁工 B．生活中许多发酵产品需要微生物，如酿醋需要的关键细菌是酵母菌 C．可利用能分解纤维素的微生物分解秸秆，并将其产物转化为乙醇 D．许多微生物也可导致人类患病 3.微生物(除病毒外)需要从外界吸收营养物质，并通过代谢来维持正常的生长和繁殖。下列有关微生物营养的说法正确的是( ) A．纤维素分解菌与硝化细菌所利用的碳源物质是相同的 B．许多微生物(如细菌、放线菌)为原核生物，不含线粒体，所以只进行无氧呼吸，为厌氧型生物 C．培养基中的营养物质浓度越高对微生物的生长越有利 D．生长因子通常是微生物生长必需的，而微生物本身合成这些物质的能力往往不足 4.苯酚是工业生产排放的有毒污染物质，自然界中存在着降解苯酚的微生物，某工厂产生的废水中含有苯酚，为了降解废水中的苯酚，研究人员从土壤中筛选获得了只能降解利用苯酚的细菌菌株，筛选的主要步骤如下图所示，①为土壤样品。下列相关叙述错误的是( ) A．使用平板划线法可以在⑥上获得单个菌落

B．如果要测定②中的活细菌数量，常采用稀释涂布平板法 C．图中②培养目的菌株的选择培养基中应加入苯酚作为碳源 D．微生物培养前，需对培养基和培养皿进行消毒处理 5.要将从土壤中提取的自生固氮菌与其他细菌分离开来，应将它们接种在( ) A．含五大类营养物质的培养基上B．加入某种指示剂的鉴别培养基上 C．含蛋白胨等营养物质的培养基上D．无氮的选择培养基上 6.下列关于分离纤维素分解菌的实验的叙述，错误的是( ) A．经选择培养后将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上 B．选择培养这一步可省略，但培养纤维素分解菌少 C．经稀释培养后，用刚果红染色 D．对照组可用同样量的培养液涂布到不含纤维素的培养基上 7.鉴别培养基是根据微生物的代谢特点在培养基中加入一些物质配制而成的，这些物质是( ) A．指示剂或化学药品B．青霉素或琼脂C．高浓度食盐D．维生素或指示剂8.在加入刚果红的培养基中会出现透明圈，产生的透明圈是( ) A．刚果红与纤维素形成的复合物B．刚果红与纤维二糖形成的复合物 C．纤维素分解后形成的葡萄糖导致的D．以纤维素分解菌为中心形成的 9.在分离分解纤维素的微生物实验中，下列关于土壤取样的叙述，不正确的是( ) A．可选取深层的土壤作为样品 B．可选取树林中多年落叶的腐殖土作为样品 C．可选取树林中多年积累的枯枝败叶作为样品 D．可把滤纸埋在土壤中经过30 d左右，再选取已腐烂的滤纸作为样品 10.下列有关纤维素分解菌分离实验的说法中，不正确的是( ) A．通常采用刚果红染色法筛选纤维素分解菌

分解纤维素的微生物的分离一基础知识 1. 纤维素是一种由相连而成的高分子类化合物，是植物（细胞结构）的主要成分之一， __________是自然界中纤维素含量最高的天然产物。植物产生的纤维素在的催化作用下分解。 2.完成下列过程 3．筛选纤维素分解菌的方法是，简称（）。该方法可以通过反应直接筛选。 4．原理：刚果红与纤维素形成，当纤维素被分解后，红色复合物无法形成，出现以 ________ 为中心的，我们可以通过来筛选纤维素分解菌。二实验设计 1. 实验流程【思考】本课题实验流程与课题2中的实验流程有哪些异同 ________________________________________________________________________________________________ 2. 实验操作要点（1）土壤取样选择____________________环境，因为_______________________________.还可以将滤纸埋进土壤，这样做是为了___________________________________________. （2）选择培养步骤：a.制备选择培养基：参照课本旁栏中的比例配制该培养基从物理性质方面属于_______培养基，如何起到选择作用_______________________,怎么证明培养基是否起到选择作用________________________________________________________ . b.选择培养的操作方法 c.目的：_________________________________________________________________________. 【思考】为什么选择培养能“浓缩”所需要的微生物 ______________________________________________________________________________________ (3)梯度稀释（4）将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上 a.制备培养基 b.接种菌液（5）挑选产生透明圈的菌落刚果红染色，挑选产生透明圈的菌落常用的刚果红染色方法两种，一中是先_____________,再加入刚果红进行________反应，另一种是在___________就加入刚果红。三课题延伸 1．为了确定分离得到的是纤维素分解菌，还需要进行实验，纤维素酶的发酵方法有发酵和发酵。 2．纤维素酶测定方法是对纤维素酶分解滤纸等纤维素所产生的 ___ 含量进行定量测定。

目录实验一产纤维素酶菌种的分离与初筛实验二产纤维素酶菌种的复筛与保藏实验三酶活测定与传代保藏实验四产纤维素酶菌种的紫外诱变育种实验五产纤维素酶菌种的产酶条件优化实验六产纤维素酶菌种的产酶条件优化的结果分析

实验一产纤维素酶菌种的分离与初步鉴定一、实验目的 1．了解产纤维素酶微生物分离的基本原理； 2．掌握产纤维素酶微生物分离的操作方法。二、实验原理自然界中存在大量的纤维素类物质，同时存在着很多能分解纤维素类物质的生物，小到细菌、放线菌、真菌，大到一些食草类昆虫与动物。这些生物与绿色植物一起构成了这个世界的碳循环。在发酵堆肥中，存在着大量的，耐高温的纤维素分解菌株，但多半都为混合分解，菌种需要： 1.内切型葡萄糖苷酶（endo-1,4-β-D-glucanase,EC3.3.1.4,简称EBG），也称Cx酶、CMC 酶、EG。这类酶作用于纤维素分子内部的非结晶区，随机识别并水解β-1,4-糖苷键，将长链纤维素分子截短，产生大量非还原性末端的小分子纤维素； 2.外切型葡萄糖苷酶（exo-1,4-β-D-glucanase,EC 3.2.1.91），也称C1酶、微晶纤维素酶、纤维二糖水解酶（Cellobiohydrolase,简称CBH）,这类酶从纤维素长链的非还原性末端水解β-1,4-糖苷键，每次切下纤维二糖分子； 3.Β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase，EC3.2.21，简称BG）又称纤维二糖酶，它能水解纤维二糖以及短链的纤维寡糖生产葡萄糖，对纤维二糖和纤维三糖的水解很快。随着葡萄糖聚合酶的增加水解速度下降，这种酶的专一性比较差。只有三种酶的协同作用，才能较好的分解纤维素。就单菌落而言，霉菌如木霉、曲霉和青霉的总体酶活性较高，产量大，故在畜牧业和饲料工业中的应用的纤维素酶主要是真菌纤维素酶。本实验以羟甲基纤维素钠为唯一碳源的培养基作为筛选培养基，只有能够水解纤维素成单糖并加以利用的微生物才能在筛选培养基上生长，利用筛选培养基分离产纤维素酶的微生物。以羧甲基纤维素钠（CMC-Na）为唯一碳源，通过微生物分解利用CMC-Na，分离出能产纤维素酶的菌种；刚果红是一种酸性染料，可与纤维素反应形成红色复合物。三、实验仪器及试剂 1．材料土样取自学校校门口小树林5—20cm深处； 2．仪器试管、烧杯、移液管、平板、锥形瓶、玻璃珠、电磁炉、电子称、量筒、培养皿、酒精灯、移液枪、接种环、高压灭菌锅等； 3．培养基（1）筛选培养基（500ml） CMC-Na 10g、(NH4)2SO4 1.4 g、MgSO4 0.3g KH2PO4 2g、MnSO4 1.6mg、FeSO4 5mg ZnSO4 2.5mg、CoCl2 2.0mg 琼脂20g PH7.0 （2）保藏培养基（500ml） CMC-Na 15g、MgSO4 0.5g、K2HPO4 1.5g、酵母粉10g NaCl 5g、蛋白胨15g、琼脂20g、刚果红 PH7.0 四、实验步骤 1.土样采集取自学校校门口小树林5—20cm深处； 2.实验器材灭菌：平板、移液管的包扎及灭菌；

那些是植物结构多糖，是细胞壁的主要成分。通过对降解纤维素微生物发生的分析。可知具有降解纤维素能力的微生物分布在细菌、放线菌、和真菌的许多菌属中，其中真菌被认为是自然界中有机质特别是纤维素物质的主要降解者、降解纤维素微生物种类木质素的存在木质素（lignin ）与纤维素及半纤维素共同形成植物体骨架，是自然界中在数量上仅次于纤维素的第二大天然高分子材料，据估计全世界每年可产生600 万亿吨[18] 。木质素是植物的主要成分之一，它是植物细胞胞间层和初生壁的主要填充物，其产量是仅次于纤维素的最为丰富的有机物，通常在木质细胞中占 15%～30%。从化学结构看[19]，针叶树的木质素主要由松柏醇的脱氢聚合物构成愈创木基木质素；阔叶树的木质素由松柏醇和芥子醇的脱氢聚合物构成愈创木基紫丁香基木质素；而草本植物则是由松柏醇、芥子醇和对香豆醇的脱氢聚合物和对香豆酸组成因而使木质素成为结构复杂、稳定、多样的生物大分子物。木质素依靠化学键与半纤维素连接，包裹在纤维之外，形成纤维素。植物组织由于木质素存在而有了强度和硬度。在生活生产中，大部分的木质素被直接排放，不仅浪费了这种宝贵的资源，

还对周围环境产生巨大影响，因此研究木质素的降解和利用越来越成为热门的课题。绿色植物占地球陆地生物量的95% ，其化学物质组成主要是木质素、纤维素和半纤维素，它们占植物［］干重的比率分别为15%~20%,45%和20% 农作物秸杆是这类生物质资源的重要组成部分，全世界年产量为20 多亿吨，而我国为 5 亿多吨但是，要充分、有效地利用这类资源却相当困难，这是由于秸秆产量 ! B ' 随季节变化，且量大、低值、体积大、不便运输，大多数动物都不能消化其木质纤维素，自然降解过程又极其缓慢，导致大部分秸秆以堆积、荒烧等形式直接倾入环境，造成极大的环境污染和浪费' 存在于秸秆中的非水溶性木质纤维素很难被酸和酶水解，主要是因纤维素的结晶度、聚合度以及环绕着纤维素与半纤维素缔合的木质素鞘所致'木质素与半纤维素以共价键形式结合，将纤维素分子包埋在其中，形成一种天然屏障，使酶不易与纤维素分子接触，而木质素的非水溶性、化学结构的复杂性，导致了秸秆的难降解性'所以，要彻底降解纤维素，必须首先解决木质素的降解问题'因此，秸秆利

专题2 微生物的培养与应用课题2.3 分解纤维素的微生物的分离一、【课题目标】（一）知识与技能简述纤维素酶的种类及作用，从土壤中分离出分解纤维素的微生物；掌握从土壤中分离某种特定微生物的操作技术（二）过程与方法分析分离分解纤维素的微生物的实验流程，弄懂实验操作的原理（三）情感、态度与价值观领悟科学探究的方法，发展科学思维和创新能力二、【课题重点】从土壤中分离分解纤维素的微生物三、【课题难点】从土壤中分离分解纤维素的微生物四、【教学方法】启发式教学五、【教学工具】多媒体课件六、【教学过程】（一）引入新课上节课我们探讨学习了土壤中尿素分解菌的分离与计数，这节课我们以纤维素分解菌的分离与纯化为例，巩固加深对这方面技术的理解和掌握。（二）进行新课 1．基础知识活动1：阅读“纤维素与纤维素酶”，回答下列问题： 1．1纤维素是一种由葡萄糖首尾相连而成的高分子化合物，是含量最丰富的多糖类物质。纤维素能被土壤中某些微生物分解利用，这是因为它们能够产生纤维素酶。延伸：草食性动物是怎样消化食物中纤维素的？肠胃中的共生物生物。 1．2棉花是自然界中纤维素含量最高的天然产物。纤维素的分解需要在纤维素酶的催化作用下完成，请完成下列过程：〖思考1〗实验分析：P27的小实验是如何构成对照的？在一支试管中添加纤维素酶，另一支试管不添加纤维素酶；尽管醋酸－醋酸钠缓冲液用量不同，但都能维持相同的pH。〖思考2〗1个酶活力单位是指在温度为 25 ℃，其它反应条件最适宜情况下，在 1 min内转化 1mmol 的底物所需要的酶量。活动2：阅读“纤维素分解菌的筛选”，回答下列问题： 1．3筛选纤维素分解菌的方法是刚果红染色法。该方法可以通过颜色反应直接筛选。 2．4其原理是：刚果红可以与纤维素形成红色复合物，当纤维素被纤维素酶分解后，红色复合物无法形成，出现以纤维素分解菌为中心的透明圈，我们可以通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。 2．实验设计活动3：完成实验方案流程图，讨论回答问题：

纤维素降解细菌的筛选及其培养基的优化自然界中能够降解和利用纤维素的微生物种类繁多，真菌、细菌、放线菌以及部分酵母菌等很多主要的微生物类群中都有，但长久以来人们一直以产酸性胞外纤维索酶的木霉、曲霉等真菌作为主要的研究对象。近年来，随着纤维素酶在洗涤剂、棉织品水洗抛光整理和制浆造纸等行业上的应用和发展，使得由细菌产生的中性以及碱性纤维素酶得到广泛重视，尤其是细菌产生的胞外纤维素酶拥有简化发酵工艺，节约资源的优势，正逐步显示出它良好的使用性能和巨大的工业价值。 1 材料与方法 1．1 材料 1．1．1 土壤样品采集造纸厂排水处附近中性偏碱性土壤。 1．1．2 培养基 (1)筛选培养基A：蛋白胨10 g，羧甲基纤维素钠10 g，NaC1 5 g，磷酸二氢钾1 g，琼脂18 g，水1 000 ml，pH值调至8。筛选培养基B：磷酸二氢钾2 g，硫酸铵 1．4 g，硫酸镁 0．3 g，氯化钙 0．3 g，CMC 20 g，琼脂18 g，水1 000 ml，pH值调至8。 (2)斜面培养基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaC1 5 g，琼脂15～20 g，水1 000 ml，pH值7。 (3)种子培养基：蛋白胨10 g，酵母膏5 g，NaC1 10 g，水1 000 ml，pH值7。 (4)基础培养基：羧甲基纤维素钠10 g，蛋白胨10 g，磷酸二氢钾1 g，硫酸镁 0．2 g，NaC1 10 g水1 000 ml，pH值7。 1．2 方法 1．2．1 刚果红染色鉴定法 1．2．2 粗酶液制备方法将发酵液于4 500 r／rain离心15 rain，取其上清液收集保存。 1．2．3 酶活测定方法 0．5 的粗酶液加入1．5 用柠檬酸缓冲液配制的0．51％的CMC．Na溶液，50℃作用15 min，加入DNS 1．5 沸水浴5 rain，540 nm测光吸收，酶活力定义为每1 h 产生1 g还原糖所需的酶量为一个纤维素酶活力单位用1 U／ml表示。 2．3 培养基的优化 2．3．1 最佳碳源的确定改变基础培养基中碳源的种类和浓度，培养后测定酶活力。 2．3．2 最佳氮源的确定改变基础培养基中氮源的种类和浓度，培养后测定酶活力。 2．3．3 最优培养基的确定考虑到细菌的产酶除了碳源、氮源外，钾、镁、钠等无机离子对其也有影响，综合上述单项试验结果，选用麸皮作为碳源(A)，蛋白胨作为氮源(B)，磷酸二氢钾（C)，硫酸镁 (D)，NaC1(E)作为无机盐进行L (45 )正交试验。 16 因素水平表

纤维素降解菌研究概况及发展趋势赵斌（山东农业大学生命科学学院 2010级生物工程三班）摘要纤维素是地球上最丰富的可再生有机资源，因为难分解大部分未被人类利用。另外，纤维素是造纸废水的COD和SS的主要来源之一。分解纤维素并将其转化成动物易吸收或利用的能源、食物、饲料或化工原料，是纤维素合理应用的重要途径。筛选高效纤维素分解菌，确定其酶学性质是降解纤维素的关键。关键词：微生物；纤维素；降解；纤维素酶 Abstract Cellulose is the earth's most abundant renewable organic resources, because the majority is not difficult to break down human use. In addition, the cellulose is one of the main sources of the papermaking wastewater COD and SS. Into the animal's susceptibility to absorption or utilization of energy, food, feed or chemical raw materials decompose cellulose and cellulose reasonable application. Screening cellulolytic to determine the nature of its enzymatic degradation of cellulose. 纤维素是地球上最丰富、来源最广泛的碳水化合物，同时也是地球上最大的可再生资源，占地球生物量的约50%[1]。纤维素分子本身的致密结构以及由木质素和半纤维素形成的保护层造成纤维素不容易降解而难以被充分利用或被大多数微生物直接作为碳源物质而转化利用。中国每年仅农业生产中形成的农作物残渣(稻草、秸秆等)就约有7亿吨, 工业生产中还有数百万吨的纤维素废弃物, 但都没有得到充分利用,相当大的一部分被废弃、焚烧, 不仅严重污染环境，同时也浪费了可利用的有用资源和能源。另外，纤维素是造纸废水的COD和SS的主要来源之一，造纸废水中含有大量的纤维素，造纸黑液难以处理，严重污染水环境[2]。因此有效的开发利用纤维素资源已是目前的一个研究热点，分解纤维素并将其转化成动物易吸收或利用的能源、食物、饲料或化工原料，是纤维素合理应用的重要途径[1]。目前纤维素降解主要是酸解、酶解和微生物降解，无论是酶解还是微生物降解都离不开高效纤维素降解菌株。微生物对纤维素的降解与转化不仅是自然界中碳素转化的主要环节，也是土壤微生物能量代谢的主要来源。纤维素的分解主要依靠微生物产生的胞外酶完成，纤维素酶是水解纤维素生成纤维二糖及葡萄糖的一类酶的总称[3]。一、纤维素降解菌的研究现状 1.1纤维素的结构及微生物降解过程

2.3 分解纤维素的微生物的分离一基础知识 1. 纤维素是一种由相连而成的高分子类化合物，是植物（细胞结构）的主要成分之一， __________是自然界中纤维素含量最高的天然产物。植物产生的纤维素在的催化作用下分解。 2.完成下列过程 3．筛选纤维素分解菌的方法是，简称（）。该方法可以通过反应直接筛选。 4．原理：刚果红与纤维素形成，当纤维素被分解后，红色复合物无法形成，出现以________ 为中心的，我们可以通过来筛选纤维素分解菌。二实验设计 1. 实验流程【思考】本课题实验流程与课题2中的实验流程有哪些异同？ ________________________________________________________________________________________________ 2. 实验操作要点（1）土壤取样选择____________________环境，因为_______________________________.还可以将滤纸埋进土壤，这样做是为了___________________________________________. （2）选择培养步骤：a.制备选择培养基：参照课本旁栏中的比例配制该培养基从物理性质方面属于_______培养基，如何起到选择作用_______________________,怎么证明培养基是否起到选择作用________________________________________________________ . b.选择培养的操作方法 c.目的：_________________________________________________________________________. 【思考】为什么选择培养能“浓缩”所需要的微生物？ ______________________________________________________________________________________ (3)梯度稀释（4）将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上 a.制备培养基 b.接种菌液（5）挑选产生透明圈的菌落刚果红染色，挑选产生透明圈的菌落常用的刚果红染色方法两种，一中是先_____________,再加入刚果红进行________反应，另一种是在___________就加入刚果红。三课题延伸 1．为了确定分离得到的是纤维素分解菌，还需要进行实验，纤维素酶的发酵方法有发酵和发酵。 2．纤维素酶测定方法是对纤维素酶分解滤纸等纤维素所产生的 ___ 含量进行定量测定。【练习题】某同学在做微生物实验时，不小心把圆褐固氮菌和酵母菌混在一起。该同学设计下面的实验，分离得纯度较高的圆褐固氮菌和酵母菌。 (1)实验原理：圆褐固氮菌是自生固氮菌，能在无氮培养条件下生长繁殖而酵母菌则不能；青霉素不影响酵母菌的生长繁殖，而会抑制圆褐固氮菌的生长繁殖。 (2)材料用具：（略） (3)主要步骤：①制备两种培养基，一种是培养基，另一种是培养基，将两种培养基各自分成两份，依次标上A 、a 和B 、b 。 ②分别向A 、B 培养基中接种混合菌，适宜条件培养了3—4天。 ③分别从A 、B 培养基的菌落中挑取生长良好的菌并分别接种到a 、b 培养基中，适宜条件下培养3—4天。 (4)请同答：①将题中的空处填充完整：培养基和培养基。 ②本实验中，根据上述原理配制的培养基的类型属于培养基。 ③根据所需目的配制上述培养基时除营养要协调外还应注意。 ④实验步骤中第③步的目的是。 ⑤圆褐固氮菌与酵母菌在结构上的主要差异为。 ⑥青霉素抑制圆褐固氮菌的生长繁殖，其作用机理是破坏或抑制其细胞壁的形成。请据此推测不影响酵母菌等真菌生长繁殖的原因是______________________________________________________________.

分解纤维素菌种的筛选张　功　峥　嵘 (内蒙古师范大学生物系) 摘　要:本文通过平皿分离、摇瓶培养、固态发酵等步骤,从8种微生物中筛选出分解纤维素能力和蛋白质合成能力强的菌种——毛壳菌。关键词:分解纤维素;菌种;筛选我国每年的农作物秸杆如麦秸、稻草、玉米秸、高梁秸、豆秸等约8亿吨之多〔1〕。这些秸杆饲料中粗纤维的主要成份是木质素、纤维素、半纤维素和果胶物质,它们都属于家禽、家畜难以直接消化或消化率低的粗纤维物质〔2〕。本研究的目的是筛选出不仅能分解纤维素,且可提高蛋白含量的菌种,利用简单、经济、可操作性强的微生物发酵技术,将纤维素物质转化成糖和蛋白质,提高秸杆的营养价值,开辟秸杆利用的新途径。 1　材料和方法111　材料 11112　供试秸杆:新鲜、无霉变晒干后的玉米秸杆和小麦秸杆。 11112　供试菌种:部分由中科院微生物所菌种保藏中心购得,另一部分由本实验室提供,包括:绿色木霉〔T richoderm a viride Pers .ex F r .〕、白地霉〔Geo trichum candidum L ink 〕、藤仓赤霉〔Gibberel 2la fu jiku ro i (Ss w .)W o llenw 〕、球毛壳菌〔Chaetom ium globo sum kunze ex Fx .〕、紫孢侧耳〔P leu ro tu s sap idu s (Schu l 2.)Sacc 〕、纤维单胞菌〔Cellu lom ono s 〕、黑曲霉〔A sp ergillu s n iger 〕、匍匐青霉〔Pen icillium decum ben s 〕。11113　培养基:a 1平皿中培养基以羧甲基纤维素钠(C M C —N a )代替查氏培养基中碳源蔗糖,其余配方不变;b 1摇瓶培养基:(N H 4)2SO 4215g ,KH 2PO 4015g ;K 2H PO 4014g ,M gSO 40105g ,玉米秸杆粉3g , 麸皮2g ,水150m l ,pH 自然;C 1固态培养基:50g 干料中90%的粉碎的秸杆粉,10%麸皮,(N H 4)2SO 45g ,KH 2PO 41g ,K 2H PO 40.8g ,M gSO 40.1g ,水150m l 。其中供试秸杆有两种,即玉米和小麦秸杆。2　方法211　平皿筛选将平皿培养基倒入24个已灭菌的平皿,待凝固后,分别接入供试菌,每种菌接3个平皿,置于恒温培养箱30℃培养3～5天后,用刚果红染色,再用N aC l 稀溶液冲洗平板,能产生纤维素酶的菌落周围会变成清晰的白色半透明圈。分别观察平皿菌落周围水解C M C —N a 半透明圈直径的大小,结果见表1。 212　摇瓶培养将供试菌种从平皿培养基上挑取,分别接入8个摇瓶培养基内,在32℃,摇床振幅8c m ,转速190r m in ,连续发酵培养72小时。表1　半透明圈直径比较单位:c m 绿色木霉藤仓赤霉白地霉球毛壳菌紫孢侧耳纤维单胞菌黑曲霉青霉直径 211 114 115 210 214 112 113 214 213　固态浅层培养接种量按固体培养料干重的10%,将每种供试菌摇瓶培养液接入2种已灭菌的固体培养料中,分别混匀后在浅盘中堆成4c m 厚,在31℃相对湿度90%条件下发酵5天。 214　发酵前后固体培养料的组分测定 6 7内蒙古科技与经济 2000年文献版

纤维素降解菌系的筛选及降解稻草条件研究摘要:以已分离的11株纤维素降解菌为材料,采用滤纸崩解法和透明圈法,初步筛选出4株纤维素降解能力较强的菌株?将这4株单菌进行两两组合,研究混合菌系在9d内的CMC酶活和FPA酶活与单菌发酵之间的异同?结果表明,混合菌发酵CMC酶活和FPA酶活均优于单一菌株;同时筛选出一组具有高降解能力的混合菌体系;并对该混合菌系降解稻草的最适反应温度?最适初始pH值?产生还原糖的时间进行了研究,结果表明,在30℃?pH值4.5?发酵96 h时混合菌降解稻草的效果最好? 关键词:纤维素降解菌;筛选;CMC酶活;FPA酶活;还原糖含量;降解条件Screening of Cellulose Degrading Microorganism and the Degrading Condition of Rice Straw Abstract: Four strains with strong degradation ability to cellulose materials were screened out of 11 bacteria using filter paper degradation method and clear halo method. Then a mixed germ with higher degradation ability was obtained as the CMC and FPA enzyme activity of mixed bacteria and pure bacterium was compared. The optimum degrading condition of the mixed germ to rice straw was 30℃, pH 4.5, and fermentation for 96 h. Key words: cellulose degrading microorganism; screening; CMC enzyme activity; FPA enzyme activity; degrading condition 纤维素是地球上最廉价?最丰富的可再生资源?全世界每年纤维素及半纤维素的生成量为850亿t?利用微生物产生的纤维素酶来分解和转化纤维素是纤维素利用的有效途径?纤维素的生物降解对开辟新能源和防止其污染环境有重要意义,一直是生物技术领域的研究重点[1,2]?在长期生产实践中发现该生物过程是微生物单独作用不能完成或只能微弱进行的,必须依靠两种或两种以上的微生物共同作用才能完成,微生物混合培养或混合发酵已越来越受重视[3]?而且国内对产纤维素酶能力较强的单一菌种研究较多,菌种混合发酵的研究较少[4,5]?本试验在纤维素降解单一菌株研究的基础上,着力于筛选降解纤维素的混合菌系,旨在为纤维素的高效转化提供依据? 1材料与方法 1.1菌种纤维素降解菌分别来自枯树根?烂菜叶?牛粪和牛胃中?

在生活生产中，大部分的木质素被直接排放，不仅浪费了这种宝贵的资源，还对周围环境产生巨大影响，因此研究木质素的降解和利用越来越成为热门的课题。绿色植物占地球陆地生物量的95% ，其化学物质组成主要是木质素、纤维素和半纤维素，它们占植物［］干重的比率分别为15%~20%,45%和20% 农作物秸杆是这类生物质资源的重要组成部分，全世界年产量为20 多亿吨，而我国为 5 亿多吨但是，要充分、有效地利用这类资源却相当困难，这是由于秸秆产量 !" B ’ 随季节变化，且量大、低值、体积大、不便运输，大多数动物都不能消化其木质纤维素，自然降解过程又极其缓慢，导致大部分秸秆以堆积、荒烧等形式直接倾入环境，造成极大的环境污染和浪费’ 存在于秸秆中的非水溶性木质纤维素很难被酸和酶水解，主要是因纤维素的结晶度、聚合度以及环绕着纤维素与半纤维素缔合的木质素鞘所致’木质素与半纤维素以共价键形式结合，将纤维素分子包埋在其

专题2课题3：分解纤维素的微生物的分离【课程标准】 1．简述纤维素酶的种类及作用 2．从土壤中分离出分解纤维素的微生物 3．讨论分解纤维素的微生物的应用价值。【课题重点】从土壤中分离分解纤维素的微生物。【课题难点】从土壤中分离分解纤维素的微生物。【基础知识】 1．是纤维素含量最高的天然产物。 2．纤维素酶是一种酶，它至少包括三种组分，即，，。前两种酶使纤维素分解为，第三种酶将纤维素分解为。 3。纤维素分解菌的筛选方法是利用。 4。刚果红染色法的原理是。 5．分解纤维素的微生物的分离的试验流程是、、、、6．鉴别培养基用于菌种的鉴别，其中加入可以鉴别出出现的现象是。 7．选择培养的操作方法是。 8．常用的刚果红染色法有两种即。 9．分解纤维素的微生物的分离实验完成后为确定得到的是纤维素分解菌，还需要进行实验，纤维素酶的发酵方法有两种即、。 10．分解纤维素的微生物的分离实验中要选择样品进行分离纤维素分解菌，该样品的特点是、。作出这种选择的理由是。 11．选择培养能够浓缩所需微生物，原因是。 12．分解纤维素的微生物的分离与土壤中分解尿素的细菌的分离流程有何区别？ 13．刚果红染色法有两种，这两种的主要优缺点是什么？

【跟踪练习】 1．下列生物能分解纤维素的是（）（1）人（2）兔（3）牛（4）蘑菇（5）纤维杆菌 A（1）（2）（3）（4）（5）B（2）（3）（5） C （2）（3）（4）（5）D（3）（5） 2．纤维素分解菌的培养基中胶木膏能提供的主要营养物质是（）（1）碳源（2）氮源（3）生长因子（4）无机盐 A（3）B（1）（2）C（1）（2）（3）D（1）（2）（3）（4） 3．从土壤中筛选蛋白酶产生菌时，所用培养基为（） A加富培养基 B 选择培养基 C 基础培养基D鉴别培养基 4．分离土壤中纤维素分解菌用到的方法是（）（1）稀释倒平板法（2）涂布平板法（3）单细胞挑取法（4）选择培养分离A（1）（2）B（2）（3）（4）C（2）（3）D（1）（3）（4） 5．鉴别纤维素分解菌的培养基中碳源为（） A CMC-Na B 木聚糖 C 纤维素 D 裂解酶 6．在酸性贫瘠的土壤中分解纤维素占优势的菌为（） A真菌 B 细菌 C 兼性厌氧细菌和真菌 D 放线菌 7．CX 酶能水解（） A纤维素和CMC-Na B纤维素和果胶 C纤维二糖和微晶纤维D麦芽糖和蔗糖 8．在加入刚果红的培养基中出现透明圈的菌落是（） A分解尿素的细菌 B 消化细菌 C 分解纤维素的细菌 D 乳酸菌 9．在对纤维素分解菌进行培养时，培养基中酵母膏的主要作用是（） A提供碳源 B 提供氮源 C 提供微生素 D 凝固剂 10．要将能分解纤维素的细菌从土壤中分离出来，应将它们接种在( ) A 加入指示剂的鉴别培养基上 B 含有蛋白胨的固体培养基上 C 只含纤维素粉无其他碳源的选择培养基上 D 含四大营养素的培养基上 11．纤维素分解菌选择培养基的选择作用原因在于（） A 硝酸钠 B 氯化钾 C 酵母膏 D 纤维素粉 12．选择培养的结果，培养液变（） A 清澈 B 浑浊 C 红色 D 产生透明圈 13．在对纤维素分解菌进行选择培养时用液体培养基的目的是（） A 可获得大量菌体 B 纤维素分解菌适宜在液体培养基上生长 C 可以充分利用培养基中的营养物质 D 可获得高纯度的纤维素分解菌