积累5-甲基四氢叶酸双抗突变株的选育及条件优化

叶酸代谢 王晓会 124120035 12生A 叶酸简介：叶酸(folic acid，FA)又称蝶酰谷氨酸，由喋啶核、对氨苯甲酸及谷氨酸三部分组成，是一种水溶性B族维生素。人体自身不能合成叶酸，需从食物或消化过程中解体的微生物菌体获得。目前人类所摄人的叶酸包括天然食品中的多聚蝶酰谷氨酸，及药物和强化食品中所添加的氧化型叶酸(folic acid，FA)。饮食中不同类型的叶酸在体内经肝脏代谢转化形成5-甲基四氢叶酸(5-methyltetrahydrofolate，5-MeTHF)后进入血液循环系统被细胞吸收利用。FA作为一类重要的微营养物质，对保持染色体正常染色体构像和DNA正常甲基化起到重要作用。FA具有众多的衍生化合物，包括蝶酰单谷氨酸、蝶酰多聚谷氨酸以及携带或不携带甲基的各种形式，所有这些FA的衍生分子统称folate(FL)植物或食品中的FL都以多聚蝶酰谷氨酸形式存在，被摄人体内后，大部分被还原为5-甲基四氢叶酸，5-methylTHF是进入血液的主要FL。5-methylTHF进入细胞后通过一碳单位的若干传递过程，最后转变为四氢叶酸(tetrahydrofolate，THF)。 叶酸的代谢过程：叶酸主要涉及DNA合成和DNA甲基化两个重要的生物化学过程，一方面涉及尿嘧啶脱氧核苷酸(dUTP)到胸腺嘧啶脱氧核苷酸（dTTP）的合成。另一方面，通过同型半胱氨酸（HC）合成甲硫氨酸（Met）、S-腺苷甲硫氨酸（SMA）的生化过程进而影响DNA 甲基化。当叶酸缺乏时会导致dTTP合成受阻，dUTP积累并掺入DNA，可在继后的DNA修复和修复过程中诱发基因突变、DNA单双链断裂、

实验十一紫外诱变技术及抗药性突变菌株的筛选 Ⅰ. 紫外诱变技术 一实验目的 以紫外线处理细菌细胞为例，学习微生物诱变育种的基本技术。了解紫外线对细菌细胞的作用。 二实验材料和用具 菌株：大肠杆菌（Escherichia coli） 培养基：营养肉汤（nutrient broth）固体和液体培养基 生理盐水等 器皿：10ml及1ml的移液管，无菌试管，无菌培养皿，无菌三角瓶（内有无菌的玻璃珠20~40粒），无菌漏斗（内有两层擦镜纸），无菌离心管，离心机，紫外诱变箱等。 三实验原理 以微生物的自然变易作为基础的筛选菌种的机率并不很高。因为自发突变率小，一个基因的自发突变率仅为10-6~10-10左右。为了加大突变频率，可采用物理或化学的因素进行诱发突变。物理因素中目前使用得最方便且十分有效是UV，UV诱变一般采用15w的紫外灭菌灯，其光谱比较集中在253.7nm处，这与DNA的吸收波长一致，可引起DNA分子结构发生变化，特别是嘧啶间形成胸腺嘧啶二聚体，从而引起菌种的遗传特性发生变易。在生产和科研中可利用此法获得突变株。 四实验内容 1、对出发菌株进行处理，制备单细胞悬液； 2、紫外线进行处理； 3、用平板菌落计数法测定致死率；

五 操作步骤 （一）出发菌株菌悬液的制备 1. 出发菌株移接新鲜斜面培养基，37℃培养16~24h ； 2. 将活化后的菌株接种于液体培养基，37℃ 110rpm 振荡培养过夜（约16h ），第二天，以20~30%接种量转接新鲜的营养肉汤培养基，继续培养2~4h ； 3. 取4ml 培养液与5ml 离心管中，10000rpm 离心3~5min ，弃去上清液，加4ml 无菌生理盐水，重新悬浮菌体，再离心，弃去上清，重复上述步骤用生理盐水恢复成菌悬液； 4. 将上述菌悬液倒入装有小玻璃珠的无菌三角瓶内，振荡20~30min ，以打散细胞； 5. 取诱变前的0.5ml 菌悬液进行适当稀释分离，取三个合适的稀释度倾注肉汤平板，每一梯度倾注两皿，每皿加1ml 菌液，37℃倒置培养24~36h ，进行平板菌落计数。 （二）UV 诱变 1. 将紫外灯打开，预热30min ； 2. 取直径6cm 的无菌培养皿（含转子），加入菌悬液5ml ，控制细胞密度为107~108个/ml ； 3. 将待处理的培养皿置于诱变箱内的磁力搅拌仪上，静止1分钟后开启磁力搅拌仪旋纽进行搅拌，然后打开皿盖，分别处理5s 、10s 、15s 、30s 、45s ，照射完毕后先盖上皿盖，再关闭搅拌和紫外灯； 4. 取0.5ml 处理后的菌液进行适当稀释分离，取三个合适的稀释度倾注肉汤平板进行计数（避光培养）。 六 实验结果 对平板菌落进行计数，并计算死亡率。 %100///?-=ml ml ml 照射前活菌数照射后活菌数照射前活菌数死亡率

全血PCR 直接扩增技术在亚甲基四氢叶酸还原酶基因C677T 多态性分析中的应用 刘冉1，尹立红1*，浦跃朴1，周国华2，王仪3，潘恩春3，杨文洲3 摘要： ［目的］ 应用全血PCR 直接扩增技术检测淮安汉族人群亚甲基四氢叶酸还原酶基因MTHFR C 677T 多态性并分析其地理分布特征，评价该技术在大规模现场人群基因多态性筛检中的应用价值。 ［方法］ 应用全血PCR 直接扩增技术分析205例淮安汉族健康个体MTHFR C677T 的基因型分布频率，并与传统的聚合酶链反应—限制性片段长度多态性（Polymerase chain reaction and restriction fragment length polymorphism ，PCR-RFLP ）技术检测结果进行比对。并将检测结果与已报道的不同地区汉族人群资料进行比较。 ［结果］ 全血PCR 直接扩增技术与传统PCR-RFLP 法测定MTHFR C677T 多态性的分布频率具有高度一致性（Kappa =0.946，95%CI ：0.906~0.985）。结果表明淮安汉族人群MTHFR C677T 的基因型频率分别为CC 32.68%、CT 46.83%、TT 20.49%；C 和T 等位基因频率分别为56.10%和43.90%；结合其他9个地区的汉族人群MTHFR 677T 等位基因频率的趋势性χ2检验，发现MTHFR 677T 的分布随地理纬度的降低，T 等位基因频率也降低（P =0.001）。 ［结论］ 全血PCR 直接扩增技术简便易行，适用于人群基因多态性的快速筛检。在所研究的10个中国汉族人群中MTHFR C677T 多态性显示与不同地理纬度的地区分布有统计学相关性。 关键词：外周血；亚甲基四氢叶酸还原酶；单核苷酸多态；筛检技术 MTHFR C677T Polymorphism Rapidly Detected with Direct Ampli ? cation Protocol in Peripheral Blood Samples LIU Ran 1，YIN Li-hong 12*，PU Yue-pu 1，ZHOU Guo-hua 2 ，WANG Yi 3，PAN En-chun 3，YANG Wen-zhou 3 （1.School of Public Health ，Southeast University ，Jiangsu Nanjing 210009，China ；2.Huadong Research Institute for Medicine and Biotechnics ，Jiangsu Nanjing 210002，China ；3.Huaian Center for Disease Control and Prevention ，Jiangsu Huaian 223001，China ） Abstract ：［Objective ］ To examine the frequency distribution of methylenetetrahydrofolate reductase （MTHFR ）C677T polymorphisms in Huaian Han population and to evaluate the application of Direct Amplification Protocol for detecting genetic polymorphisms in population. ［Methods ］ Polymorphisms of MTHFR C677T in 205 Huaian Han healthy volunteers was detected with Direct Amplification Protocol and RFLP technique ，respectively. The frequency of MTHFR C677T gene types was compared with other Han population data from different areas in China. ［Results ］ There was high consistency of MTHFR C677T polymorphisms between the method with blood sample and with genomic DNA （Kappa =0.946，95%CI 0.906~0.985）. The frequencies of the C/C ，C/T and T/T genotypes in the subjects were 32.68%、46.83% and 20.49% respectively ，and the allele frequencies of 677C and 677T were 56.10% and 43.90% respectively. The analysis of MTHFR 677T allele frequency with Han population in other nine different areas in China showed the distribution of MTHFR 677T was decreased with geographical latitude （P =0.001）. ［Conclusion ］ The frequency of the genetic polymorphisms of MTHFR C677T in Chinese Han populations from different areas depends on geographical latitude. The MTHFR C677T distribution of Huaian Han population group is consistent with the model of population groups with the latitude range between N30° and N35°. Direct Amplification Protocol in peripheral blood samples is a good system of direct PCR amplification with blood sample for rapid identification of genetic polymorphisms. Key Words ：peripheral blood ；methylenetetrahydrofolate reductase ；single nucleotide polymorphism ；screening 基金项目：国家自然科学基金资助项目（编号：30571540，30671732）作者简介：刘冉（1974-），女，博士生，研究方向：肿瘤环境基因组学*通讯作者（Correspondent author）：尹立红教授，E -mail：lhyin@https://www.wendangku.net/doc/ef17833020.html,. cn 作者单位：1.东南大学 公共卫生学院，江苏 南京 210009；2.华东医 学生物技术研究所，江苏 南京 210002；3.江苏省淮安市疾病预防控制中心，江苏 淮安 223001 文章编号:1006-3617(2007)01-0021-04 中图分类号:R735.1；R394-33 文献标识码:A 【论著】 亚甲基四氢叶酸还原酶（ methylenetetrahydrofolate reductase， MTHFR）是叶酸代谢中的关键酶之一，它可将还原型辅酶I （NADPH）相关的5，10-亚甲基四氢叶酸还原为5-甲基四氢叶酸［1］。前者生物学作用为细胞内一碳基团的传递体，参与嘌呤和嘧啶的合成及DNA 修复过程；后者作为甲基供体，在甲硫氨酸合成酶的催化下，同型半胱氨酸接收甲基基团，生成蛋氨酸，并进一步复甲基化为S -腺苷甲硫氨酸，参与体内广泛的甲基化反应。这一代谢途径的正常运转在维持DNA 正常甲基化和核苷酸从头合成以及DNA 损伤修复是至关重要的［2］。目前

第二章基因突变及其机制 1．突变（Mutation）：遗传物质核酸（DNA或病毒中的RNA）中的核苷酸序列突然发生了稳定的可遗传的变化。 2．突变型：由于突变体中DNA碱基序列的改变，所产生的新的等位基因及新的表现型称为突变型。 3．染色体畸变：染色体结构的改变，多数是染色体或染色单体遭到巨大损伤产生断裂，而断裂的数目、位置、断裂端连接方式等造成不同的突变。包括染色体缺失、重复、倒位和易位等。涉及到DNA分子上较大范围的变化，往往会涉及到多个基因。 4．基因突变；是指一个基因内部遗传结构或DNA序列的任何改变，包括一对或少数几对核苷酸的缺失、插入或置换，分为碱基置换（转换和颠换）和移码突变。 转换transition：DNA链中一个嘌呤（嘧啶）被另一个嘌呤（嘧啶）所置换。 颠换transversion：DNA链中一个嘌呤（嘧啶）被一个嘧啶（嘌呤）所置换。 5．错义突变missense mutation：由于突变后的密码子代表另一种氨基酸，从而造成个别碱基的改变导致多肽链上某个氨基酸为另一种氨基酸所取代。 6．同义突变：由于遗传密码的简并性，突变后的密码子编码的仍是同一种氨基酸。碱基序列发生改变而氨基酸序列未发生改变的隐蔽突变。 7．无义突变：突变后的密码子变成终止密码子，是一类是引起遗传性状改变的突变。8．移码突变frameshift mutation：在DNA序列中由于一对或少数几对核苷酸的插入或缺失，而使其后全部遗传密码的阅读框架发生移动，进而引起转录和转译错误的突变叫移码突变。一般只引起一个基因的表达出现错误。 9．条件致死突变型：在某一条件下具有致死效应，而在另一条件下没有致死效应的突变型。 如：温度敏感突变型。

菌种筛选方法 在实际工作中，为了提高筛选效率，往往将筛选工作分为初筛和复筛两步进行。初筛的目的是删去明确不符合要求的大部分菌株，把生产性状类似的菌株尽量保留下来，使优良菌种不致于漏网。因此，初筛工作以量为主，测定的精确性还在其次。初筛的手段应尽可能快速、简单。复筛的目的是确认符合生产要求的菌株，所以，复筛步骤以质为主，应精确测定每个菌株的生产指标,测得的数据要能够反映将来的生产水平。 1 从菌体形态变异分析有时，有些菌体的形态变异与产量的变异存在着一定的相关性，这就能很容易地将变异菌株筛选出来。尽管相当多的突变菌株并不存在这种相关性，但是在筛选工作中应尽可能捕捉、利用这些直接的形态特征性变化。当然，这种鉴别方法只能用于初筛。有人曾统计过3,484个产维生素B2的阿舒假囊酵母(Eremoth ecium ashbyii)的变异菌落，发现高产菌株的菌落形态有以下特点：菌落直径呈中等大小（8-10毫米），凡过大或过小者均为低产菌株；色泽深黄色，凡浅黄或白色者皆属低产菌株。又如，在灰黄霉素产生菌荨麻青霉(Penicillium urticae)的育种中，曾发现菌落的棕红色变深者往往产量有所提高，而在赤霉素生产菌藤仓赤霉（Gibberell a fujikuroi）中，却发现菌落的紫色加深者产量反而下降。 2 平皿快速检测法平皿快速检测法是利用菌体在特定固体培养基平板上的生理生化反应，将肉眼观察不到的产量性状转化成可见的

"形态"变化。具体的有纸片培养显色法、变色圈法、透明圈法、生长圈法和抑制圈法等，见图。这些方法较粗放，一般只能定性或半定量用，常只用于初筛，但它们可以大大提高筛选的效率。它的缺点是由于培养平皿上种种条件与摇瓶培养，尤其是发酵罐深层液体培养时的条件有很大的差别，有时会造成两者的结果不一致。图平皿快速检测法示意图平皿快速检测法操作时应将培养的菌体充分分散，形成单菌落，以避免多菌落混杂一起，引起"形态"大小测定的偏差。 1) 纸片培养显色法将饱浸含某种指示剂的固体培养基的滤纸片搁于培养皿中，用牛津杯架空，下放小团浸有3%甘油的脱脂棉以保湿，将待筛选的菌悬液稀释后接种到滤纸上，保温培养形成分散的单菌落，菌落周围将会产生对应的颜色变化。从指示剂变色圈与菌落直径之比可以了解菌株的相对产量性状。指示剂可以是酸碱指示剂也可以是能与特定产物反应产生颜色的化合物。 2) 变色圈法将指示剂直接掺入固体培养基中，进行待筛选菌悬液的单菌落培养，或喷洒在已培养成分散单菌落的固体培养基表面，在菌落周围形成变色圈。如在含淀粉的平皿中涂布一定浓度的产淀粉酶菌株的菌悬液，使其呈单菌落，然后喷上稀碘液，发生显色反应。变色圈越大，说明菌落产酶的能力越强。而从变色圈的颜色又可粗略判断水解产物的情况。 3) 透明圈法在固体培养基中渗入溶解性差、可被特定菌利用的营养成分，造成浑浊、不透明的培养基背景。将待筛选在菌落周围就

银屑病与亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态位点A677V关系的研究 银屑病与亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态位点A677V关系的研究 中华皮肤科杂志 1999年第2期第32卷论著 作者：杨维玲王晓慧郑淑云孙智晶王柏秋傅松滨 单位：杨维玲王晓慧郑淑云150001 哈尔滨医科大学附属第一医院；孙智晶王柏秋傅松滨哈尔滨医科大学生物遗传学研究室 关键词：银屑病；四氢叶酸脱氢酶；聚合酶链反应－限制性片段长度多态 【摘要】目的探讨银屑病与亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态位点A677V的关系。方法采用聚合酶链反应－限制性片段长度多态性，检测了3个银屑病家系和39例银屑病患者的亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态位点A677V。结果银屑病患者亚甲基四氢叶酸还原酶不耐热缺陷与正常人有显著性差异。结论亚甲基四氢叶酸还原酶A677V突变型与银屑病发病相关。 Study on the Relationship Between Psoriasis and the Polymorphic Site A677V of Methylenetetrahydrofolate Reductase Gene YANG Weiling,WANG Xiaohui,ZHENG Shuyun,et al. Department of Dermatology, First Affiliated Hospital of Harbin Medical University , Harbin 150001【Abstract】Objective To investigate the relationship between polymorphic site A667V of 5,10-methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR) gene and psoriasis .Methods PCR -RFLP method was used to detect the polymorphism of MTHFR gene in 3 psoriasis pedigrees and 39 psoriatics.Results Genotype frequencies of the psoriastics were A/A-20.51％, A/V=48.72％ and V/V=30.76％ ;the allelic frequencies were A=0.4487 and V=0.5513.Conclusion There is a significant difference of MTHFR gene thermolabile defect between the psoriatics and the control, and our results demonstrate MTHFR gene is related to A667V mutant. 【Key words】 PsoriasisTetrahydrofolate dehydrogenasePCR-RFLP 人亚甲基四氢叶酸还原（methylenetetrahydrofolate reductase， MTHFR)基因定位在1P36.3，现已发现严重的MTHFR缺陷与其不耐热变化这两种变异是由基因不同突变引起的，其中不耐热MTHFR缺陷主要由MTHFR677密码子中C被T置换引起，这种突变直接影响MTHFR的活性和耐热性。已有报道脑血管、周围血管、冠状血管疾病与MTHFR的不耐热变化密切相关。再者亦有报道，银屑病患者高血压和冠心病的相对危险性分别是正常人群的15.4倍和11倍。基于上述，我们以PCR－RFLP方法检测了银屑病患者的MTHFR基因多态位点A677V，旨在探讨MTHFR基因多态位点A677V与银屑病发病的关系。

一、试述高产突变株诱变选育的一般步骤及每步的目的及注意事项。 步骤： 1、选择出发菌种。 （1）、对一般出发菌株的要求： a、从自然界样品中分离筛选出来的野生菌株，虽然产量较低，但对诱变因素 敏感，变异幅度大，正突变高； b、在生产中使用的，具有一定生产能力，并且在生产过程中经过自然选育的 菌株； c、采用具有有利性状的菌株，如生长速度快、营养要求低以及产孢子早而多 的菌株； d、由于有些菌株在发生某一变异后会提高对其他诱变因素的敏感性，故有时 可考虑选择已发生其他变异的菌株作为出发菌株； e、采用一类被称为“增变菌株”的变异菌株，它们对诱变剂的敏感性比原始 菌株大为提高，更适宜作为出发菌株； f、在选择产核苷酸或氨基酸的出发菌株时，应考虑至少能累计少量所需产物 或其前体的菌株，而在选择产抗生素的出发菌株时，最好选择已通过几次 诱变并发现每次的效价都有一定程度提高的菌株作为出发菌株。（2）、选择具备一定生产能力或某种特性的菌株作为出发菌株。 （3）、选择纯种作为出发菌株。 （4）、选择出发菌株应考虑其稳定性。 目的：根据需要选择出发菌种，要尽量符合育种所需要的生物学和代谢的特性。 2、对出发菌种进行纯化、培养等操作，获得培养液。 （1）、确定诱变出发菌株之后，就要进行纯化。因为微生物容易发生变异和染菌。 诱变育种工作中，一般采用3—4个出发菌株，在逐代处理后，将产量高、特性好的菌株留作继续诱变的出发菌株。 （2）、通过前培养（同步培养）和密集培养制得出发菌种的培养液。 目的：同步培养物在诱变剂处理时，群体中变化一致，而且细胞内应具有丰富的内源性碱基。 3、单孢子（或单细胞）悬液的制备。 （1）、供试菌株的孢子或菌体要年轻、健壮。 （2）、菌悬液制备方法如下： a、细菌，最好在诱变处理前进行摇瓶振荡预培养； b、产孢子的菌类进行诱变，处理的材料是孢子，而不是菌丝，因为孢子一般 是单核的（如青霉和黑曲霉），菌丝是多核的。 c、不产孢子的真菌，可直接采用年幼的菌丝体进行诱变处理。有三种方法： 第一，菌丝尖端法。第二，处理单菌落周围尖端菌丝。第三，混合处理法。 此法常用于化学诱变剂。 目的：制备单孢子（或单细胞）的悬液，为下一步诱变处理做准备。 4、诱变处理及后培养。 （1）、诱变剂种类的选择。 a、选择诱变剂：诱变剂主要对DNA分子上基因的某一位点发生作用。根据 诱变剂作用机制，再结合菌种特性来考虑选择哪种诱变剂进行诱变。 b、根据菌种特性和遗传稳定性来选择诱变剂：对遗传稳定的出发菌株最好采

作者：娄忻张莉刘靓张玉莲陈丽华刘静贺建功 【摘要】以青霉素生产菌种87117#为出发菌种，采用紫外线诱变复合前体动态后处理的方法，结合限氧条件下的摇瓶筛选，从177支前体抗性株中筛出xy-137#高产突变株。该菌株摇瓶效价平均提高了8.8%,且遗传特性稳定，单位菌丝产物合成能力强。xy-137#菌株在百吨罐中经过近百批的生产验证，其放罐效价、发酵指数、罐批产量平均提高了3.83%、5.66%和2.69%。 【关键词】紫外诱变；动态后处理；理性筛选；青霉素高产菌株 由于青霉素原料的后加工与半合成领域愈来愈广泛，世界青霉素市场竞争十分激烈。生产厂家唯有不断地提高生产水平，降低生产成本以增强企业的竞争力，而优质高产菌种的选育和应用是其中的基础和关键。 随着青霉素菌种生产能力的提高，传统育种方法的局限性越来越明显。理性化筛选是应用遗传学和生物化学的原理，根据已知或可能的目的产物生物合成途径的调控机制和产物的分子结构，设计筛选方法，定向选出有效的性状突变株。我们依据理性育种的理念，参照现有生产条件设立基本筛选模型，采用紫外辐射震动工业生产菌种稳定的遗传结构，再辅以限氧条件下耐前体突变株的筛选，达到选育高产菌株的目的。 1 材料与方法 1.1 出发菌种 青霉素生产菌种penicillium chrysogenum 87117#。1.2 培养基 (1)分离及斜面培养基蔗糖、甘油、酵母粉、nacl、caso4、微量元素、琼脂。 (2)种子培养基以蔗糖、玉米浆为碳、氮源。 (3)发酵培养基以乳糖、玉米浆为主要碳、氮源，加无机盐类组成。 1.3 菌种诱变与筛选 (1)紫外诱变将出发菌株的单孢子悬液置紫外灯下40cm处照射90s。 (2)前体动态后处理定量吸取经过紫外线照射后的孢子液，分别加入含有不同剂量的前体(苯乙酸胺)的种子培养基试管中，使每支试管的前体终浓度在0～4.8%之间。将上述试管置25℃恒温振荡培养18h左右，然后稀释分离在固体培养基平板上。 (3)前体抗性菌落检出平板置25℃恒温培养8d。从耐受不同浓度前体处理后长出的抗性菌落中挑选孢子相对丰富、组织比较致密的菌落进行斜面传代培养，以备摇瓶筛选。 (4)摇瓶定向筛选低氧耗、低菌丝量的高产菌株将摇瓶机转速由通常的220r/min降至160r/min，在低通气条件下进行摇瓶筛选。后续的高产株特性考察和工艺优化均在此条件下进行。 摇瓶筛选考察指标为发酵效价和菌丝生长量(packed mycelial volume,pmv)。 1.4 样品检测 2 结果 2.1 xy-137#高产突变株的选育 出发菌株87117#先经过两次自然选育，然后采用紫外线复合前体动态后处理，挑取177支抗性株，在限氧条件下进行摇瓶筛选。于3.84%前体耐受浓度下获得xy-137#高产突变株，以87117#为对照，其5d和7d摇瓶相对效价分别为107.4%和110.3%，摇瓶效价平均提高了8.8%。

亚甲基四氢叶酸还原酶基因C677T和 A1298C多态与胃癌的遗传易感性 （作者:___________单位: ___________邮编: ___________） 作者：李松, 祭美菊, 侯鹏, 何农跃 [摘要]目的：探讨代谢叶酸的亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因单核苷酸多态与胃癌风险的关系。方法：以聚合酶链反应和限制性片段长度多态方法分析170例胃癌病人和性别、年龄配对的140例正常对照者的MTHFR基因C677T和A1298C基因型及其与胃癌风险的相关性。结果：在正常对照中，MTHFR基因677CC、CT、TT基因型频率分别为47.9%、40%和12.1%，而在胃癌病人中分别为35.9%、45.9%和18.2%。在病例组中677(CT+TT)变异型基因者占64.1％，显著高于对照组中的52.1％，差异具有显著意义（χ2=4.54，P ＜0.05）。与677CC基因型者相比,变异型基因者和TT型基因者发生胃癌的危险性分别高1.67倍（OR为1.67,95%CI为1.06~2.64）和2.67倍（OR为2.67,95%CI 为1.382~5.341）。A1298C基因型在病例和对照中的分布差异无显著性意义。但进一步分析发现，1298变异基因型与677变异基因型之间有协同作用。携带MTHFR 677TT/1298AC基因型个体发生胃癌的风险是携带MTHFR 677CC/1298AA基因型个体的 3.684倍 (95%CI为

0.829～25.776)。结论： MTHFR单核苷酸多态是胃癌的遗传易感性因素。 [关键词]胃癌；单核苷酸多态性；亚甲基四氢叶酸还原酶基因；疾病易感性 DNA 甲基化是基因表达，DNA 的稳定性、完整性和诱变的重要决定因素，染色体和DNA甲基化异常都是可遗传的，是导致基因组不稳定性而引发肿瘤的重要机制[1]。相关研究表明，细胞内低甲基化是胃癌形成的一个重要原因，亚甲基四氢叶酸还原酶(5,10methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR)基因多态会影响叶酸在体内的正常代谢，造成甲基不足，从而促进胃癌的产生，国内外刊物报道了此方面进行的一些研究。MTHFR基因在总的人群中呈高度多态性，在其编码区有2个常见的单核苷酸多态,即C677T 和A1298C，前者位于催化区而后者位于活性调节区 [2]。作者对江苏南京地区的170例胃癌病人和140例相匹配的正常对照者进行研究，分析MTHFR基因C677T 和A1298C多态性与胃癌发生的风险性的关系。 1 材料和方法 1.1 实验材料 1.1.1 标本来源标本取自170例胃癌病人和140例正常对照者。病人分别来自东南大学附属中大医院、南京市鼓楼医院和江苏省人民医院，样品为肿瘤组织和外周血；年龄、性别相匹配的正常对照者来自东南大学校医院和东南大学附属中大医院，所取样品均为健康人的外周血。所有的病例和正常对照者均为江苏省南京市及其周边区域居住

叶酸代谢简介

叶酸代谢 王晓会 124120035 12生A 叶酸简介：叶酸(folic acid，FA)又称蝶酰谷氨酸，由喋啶核、对氨苯甲酸及谷氨酸三部分组成，是一种水溶性B族维生素。人体自身不能合成叶酸，需从食物或消化过程中解体的微生物菌体获得。目前人类所摄人的叶酸包括天然食品中的多聚蝶酰谷氨酸，及药物和强化食品中所添加的氧化型叶酸(folic acid，FA)。饮食中不同类型的叶酸在体内经肝脏代谢转化形成5-甲基四氢叶酸(5-methyltetrahydrofolate，5-MeTHF)后进入血液循环系统被细胞吸收利用。FA作为一类重要的微营养物质，对保持染色体正常染色体构像和DNA正常甲基化起到重要作用。FA具有众多的衍生化合物，包括蝶酰单谷氨酸、蝶酰多聚谷氨酸以及携带或不携带甲基的各种形式，所有这些FA的衍生分子统称folate(FL)植物或食品中的FL都以多聚蝶酰谷氨酸形式存在，被摄人体内后，大部分被还原为5-甲基四氢叶酸，5-methylTHF是进入血液的主要FL。5-methylTHF进入细胞后通过一碳单位的若干传递过程，最后转变为四氢叶酸(tetrahydrofolate，THF)。 叶酸的代谢过程：叶酸主要涉及DNA合成和DNA甲基化两个重要的生物化学过程，一方面涉及尿嘧啶脱氧核苷酸(dUTP)到胸腺嘧啶脱氧核苷酸（dTTP）的合成。另一方面，通过同型半胱氨酸（HC）合成甲硫氨酸（Met）、S-腺苷甲硫氨酸（SMA）的生化过程进而影响DNA甲基化。当叶酸缺乏时会导致dTTP合成受阻，

dUTP积累并掺入DNA，可在继后的DNA修复和修复过程中诱发基因突变、DNA单双链断裂、染色体的断裂及等位基因稳定性下降事件；叶酸缺乏也可导致SMA合成受阻，降低整体DNA甲基化程度，甚至改变细胞中的特异性甲基化模式，从而改变基因表达方式，DNA甲基化水平的降低还可能导致着丝粒异染色质凝聚水平下降，从而在有丝分裂过程中引起某些染色体分离异常，形成非整倍体。 FL进入叶酸循环后，所参与的一碳单位传递转移包括几个关键步骤：首先，一碳单位在2种不同氧化态(甲酸氧化态和甲醛氧化态)的4个位点进入叶酸循环：携带甲酸氧化态一碳单位的FL通过5-formylTHF(5-甲酰四氢叶酸)、10-formylTHF(10-甲酰四氢叶酸)、5-formiminoTHF(5-亚胺甲基四氢叶酸)3个部位进入叶酸循环；携带甲醛氧化态一碳单位的FL通过5，10-methyleneTHF(亚甲基四氢叶酸，5，10-MnTHF)进入叶酸循环。携带一碳单位的FL进入叶酸循环以后，随即参与分子内一碳单位的传递与转换。5，1 0-甲基四氢叶酸一方面作为甲基供体随后被用于dTMP合成，参与DNA的合成，另一方面用于Met合成，从而形成在各种反应中所需的甲基供体之一的SAM，参与蛋白质的合成或生物的甲基化。5-formylTHF 及10-fomylTHF被转化为5，10-methenyl THF，后者随即被还原为5，10-MnTHF。亚甲基四氢叶酸还原酶将5，10-MnTHF还原为5-methylTHF，后者经甲硫氨酸合成酶催化转变为THF，以接受下一个碳单位。

第一章 1、在体外（如试管中）利用DNA聚合酶进行DNA合成时需要添加哪些成份？ 四种脱氧核苷酸、引物、DNA聚合酶、模板链 2、用基因工程手段将一个大肠杆菌的乳糖操纵子的阻遏蛋白基因敲除后，这一大肠杆菌的B-半乳糖苷酶基因是否在任何情况下都表现为高水平的转录？ 第二章 1、颠换：嘌呤和嘧啶之间的替换。 2、同义突变:由于密码的简并性，发生在基因编码区的突变可能并不改变编码的氨基酸，这种情况称为同义突变。 3、错义突变:是编码某种氨基酸的密码子经碱基替换以后,变成编码另一种氨基酸的密码子,从而使多肽链的氨基酸种类和序列发生改变。 4、无义突变:是指由于某个碱基的改变使代表某种氨基酸的密码子突变为终止密码子，从而使肽链合成提前终止。编码氨基酸的密码子突变为终止密码子，使肽链合成中断。 5、条件致死突变型:是指在某一条件下具有致死效应，而在另一条件下没有致死效应的突变型。 6、转座因子: 一段DNA顺序可以从原位上单独复制或断裂下来，环化后插入另一位点，并对其后的基因起调控作用，此过程称转座。 7、光复活作用:细菌受致死量的紫外线照射后，3小时内若再以可见光照射，则部分细菌又能恢复其活力，这种现象称为光复活作用。 8、切除修复: 此系统是在几种酶的协同作用下，先在损伤的任一端打开磷酸二酯键，然后外切掉碱基或一段寡核苷酸；留下的缺口由修复性合成来填补，再由连接酶将其连接起来。不同的DNA损伤需要不同的特殊核酸内切酶来识别和切割。 9、重组修复: 即双链DNA中的一条链发生损伤，在DNA进行复制时，由于该损伤部位不能成为模板，不能合成互补的DNA链，所以产生缺口，而从原来DNA的对应部位切出相应的部分将缺口填满，从而产生完整无损的子代DNA的这种修复现象 10、SOS修复: 指DNA受到严重损伤、细胞处于危急状态时所诱导的一种DNA修复方式，修复结果只是能维持基因组的完整性，提高细胞的生成率，但留下的错误较多，故又称为错误倾向修复（error-prone repair），使细胞有较高的突变率。 11、试论述各种诱变剂的作用机制. 12、根据你所学的关于诱发突变的知识，你认为能否找到一种仅仅对某一基因具有特异性诱变作用的化学诱变剂？为什么？ 不能找到具有特异性诱变作用的化学诱变剂，因为对于一般的化学诱变剂：碱基类似物、碱基修饰剂、移码突变剂，均不具有特异性。诱变的特异性是靠识别碱基对来进行的，而一个基因都不可能有完全特异的碱基对供识别。突变是随机性的。因为从分子生物学的角度来看，所有的基因都是存在于DNA双链中，基因的信息都存在于由ATCG碱基对的排列顺序中。即使有某些物质可以特异的识别某几个碱基的排列顺序，但这种排列也存在于其他基因之中，变是在整个基因组范围内发生的。所以从现有的科研水平来看，不存在有特异性的理化诱变剂。现在对基因的诱变可以通过传统的遗传学方法实现，可以构建带有诱变位点的基因载体转入生物体中，达到特异诱变的目的. 。

易错pcr获得木聚糖酶xynh突变株筛选 易错pcr获得木聚糖酶xynh突变株筛选 （一）项目简介 易错pcr技术是在采用dna聚合酶进行目的基因扩增时，通过调整反应条件，来改变扩增过程中的突变频率，从而以一定的频率向目的基因随机引入突变，获得蛋白质分子的随机突变体。 木聚糖水解酶系是一类降解木聚糖的酶系，包括β-1,4-内切木聚糖酶、β-木糖苷酶、α-l-阿拉伯糖苷酶、α-d-葡糖苷酸酶、乙酰基木聚糖酶和酚酸酯酶，可降解自然界中大量存在的木聚糖类半纤维素。 易错pcr技术获得木聚糖酶xynh突变株筛选，是通过易错pcr技术使木聚糖酶发生突变，从突变株中筛选出木聚糖酶的降解能力、耐热性、酶活性提高的突变株，这些突变株就是我们所需的突变株。 （二）国内外研究现状和发展动态 1.国内外研究现状 木聚糖酶可以应用在酿造、饲料工业中。木聚糖酶可以分解酿造或饲料工业中的原料细胞壁以及β-葡聚糖，降低酿造中物料的粘度，促进有效物质的释放，以及降低饲料用粮中的非淀粉多糖，促进营养物质的吸收利用，并因而更易取可溶性脂类成分。 国外对木聚糖酶的研究开始的较早。sorensen，1955年就对动物瘤胃和土

壤中的木聚糖酶进行了研究。1992年就已实现了木聚糖酶的工业化生产。目前国际上研究工作主要集中在对微生物木聚糖酶的诱导与调节机理研究，以及酶的提纯、鉴定方法，木聚糖酶基因分子的克隆和表达等（neeta 等，1999；raffaele等，2004）。自上世纪七十年代末开展木聚糖酶基因的研究工作以来，已有150多种来自真菌和细菌的木聚糖酶基因被克隆并在大肠杆菌中表达。 我国在木聚糖酶方面的研究起步较晚，但发展迅速。上世纪八十年代初期，中国科学院微生物所在张树政院士(曾宇成等，1987)的带领下，开始了我国对木聚糖酶的早期研究工作，首次从海枣曲酶（aspergillus phoenicis）中纯化得到了四种木聚糖酶：酶i、酶ⅱ、酶ⅲ和酶ⅳ，并深人研究了活力较高的组分酶ⅲ的酶学性质。“九五”期间，山东大学微生物技术国家重点实验室曲音波教授等（曲音波等，2001）开展了木聚糖酶在造纸方面的应用研究，从碱性假单胞菌sp. g6-2分离出两种木聚糖酶xyna和xynb。目前，我国对木聚糖酶的研究大多停留在产酶菌株的筛选和驯化、木聚糖酶的纯化和理化性质研究方面，部分课题已涉及木聚糖酶的分子生物学研究、木聚糖酶基因克隆、表达和重组。 2.发展动态 国内外目前对木聚糖酶的研究，主要是提高木聚糖酶的耐热性及低温酶活性。 木聚糖酶原酶在国内外市场的发展迅速，占了酶制市场份额的12%左右。世界上规模化生产木聚糖酶的国家有许多，例如：丹麦、爱尔兰、芬兰、

实验名称：抗药性突变株的获取 和突变率测定 姓名： 学号： 系别： 实验日期： 同组同学名单:

本实验利用紫外线诱变，获得大肠杆菌的链霉素抗性突变株，学习了解微生物诱变育种的基本技术。试验后，通过计算紫外照射造成的死亡率以及自发突变频率和诱导条件下突变频率，进一步加深对紫外诱导的认识。 【实验目的】 1.掌握获取细菌自发和经诱变产生的突变株的基本方法。 2.了解突变株频率和突变率的计算。 3.了解微生物诱变育种的基本技术。 4. 【实验材料】 1.菌种大肠杆菌（E. coli） 2.培养基及试剂牛肉膏蛋白胨液体培养基、牛肉膏蛋白胨固体培养基、蒸馏水、链霉 素（母液10 mg/mL；终浓度10 μg/mL）。 3.仪器及用具三角瓶（300 mL）、9 cm培养皿、6 cm培养皿、离心管（1.5 mL）、恒 温摇床、恒温培养箱、紫外照射箱、磁力搅拌器、大头针、涂布器、酒精灯 【实验方法及步骤】 （一）出发菌株培养液的制备 1. 取斜面或冻存菌种划平板，获得单克隆一个。 2. 取单克隆，37°C条件下在牛肉膏蛋白胨液体培养基培养8~24h；稀释培养液， 取102 ~103 个细菌个体转移到新鲜牛肉膏蛋白胨液体培养基，过夜培养。 （二）培养基的制备 倒牛肉膏蛋白胨固体培养基平板（非选择性培养基），以及含有链霉素的牛肉膏蛋白胨固体培养基平板（选择性培养基平板；链霉素终浓度10 μg/mL，在倒平 板前加入到培养基中） （三）自发突变的测定 取过夜培养液，稀释106倍（用1.5mL离心管装0.99mL 无菌蒸馏水，将10 μL 培养液加入到0.99 mL蒸馏水，震荡或吹打混匀，连续三次），取100μL 涂布在非

实验十用梯度平板法筛选大肠杆菌抗药性突变株 【实验目的】：了解并熟悉抗药性突变株的筛选原理和方法 【实验原理】：经诱变处理后的微生物群体中，虽然突变的数目大大增加，但所占的比例仍然是整个群体中的极少数。为了快速、准确地得到所需的突变体，必须设计一个合理的筛选方法，以杀死大量的未发生突变的野生型，而保留极少数的突变型。 梯度平板法是筛选抗药性突变型的一种有效简便方法，其操作要点是：先加入不含药物的培养基，立即吧培养皿斜放，待培养基凝固后形成一个斜面，再将培养皿平放，倒入含一定浓度药物的培养基，这样就形成一个药物浓度梯度由浓到稀的梯度培养基，然后再将大量的菌液涂布于平板表明上。经培养后，在高浓度药物处出现的菌落就是抗药性突变型菌株。【材料和器皿】： （1）菌种：大肠埃希氏菌 （2）培养基：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，2×（2倍浓度）牛肉膏蛋白胨培养液（分装于小三角瓶中，每瓶装20ml），生理盐水。 （3）器皿：培养皿，涂布棒，移液管，滴管，离心机 【方法和步骤】： 1 制备菌液 从已活化的斜面菌种上挑一环大肠埃希氏菌于装有5ml牛肉膏蛋白胨培养液的无菌离心管中（接2支离心管），置37℃条件下培养16h左右，离心（3500r/min，10min），弃去上清液后再生理盐水洗涤2次，弃去上清液，重新悬浮于5ml的生理盐水中。并且将2支离心管的菌液一并倒入装有玻璃珠的三角瓶中，充分振动以分散细胞，制成108/ml的菌液。然后吸3ml菌液于装有磁力搅拌棒的培养皿中。 2 紫外线照射 （1）预热紫外灯：紫外灯功率为15W，照射距离30cm。照射前先开灯预热30min。 （2）照射：将培养皿放在磁力搅拌器上，先照射1min后再打开皿盖并计时，当照射达2Min 后，立即盖上皿盖，关闭紫外灯。 3 增殖培养（在暗室红灯下操作） 照射完毕，用无菌滴管将全部菌液吸到含有3ml 2×牛肉膏蛋白胨培养液的小三角瓶中，混匀后用黑纸包裹严密，置37℃培养过夜。 4 制备梯度培养皿 取10ml 牛肉膏蛋白胨琼脂培养基于直径9cm的培养皿中，立即将培养皿斜放，使高处的培养基正好位于皿边与皿底的交接处。待凝固后，将培养皿平放，在加入含有链霉素（100μg/ml）的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基10ml。待凝固后，便得到链霉素从到0逐渐递减的浓度梯度培养皿。然后在皿底做一个“↑”符号标记。 5 涂布菌液 将增殖后的菌液进行离心（3500r/min，10min），弃去上清液，再加入少量生理盐水（约0.2ml），制成浓的菌液后将全部菌液涂布于梯度培养皿上，并将它倒置于37℃恒温箱中培养24h，然后将出现于高药物浓度区内的单菌落分别接种到斜面上，经培养后再做抗药性测定。 6 抗药性测定 （1）制备含药平板：取链霉素溶液（750μg/ml）0.2、0.4、0.6、0.8ml，分别加到无菌培养皿中，再加入融化并冷却到50℃左右的牛肉膏蛋白胨培养基15ml，立即混匀，平置凝固后即成一个对照平板（不含药物）。 （2）抗药性的测定：将上述每个皿底的外面用记号笔画成8等分，并注明1~8号，然后将

紫外诱变技术及抗药性突变菌株的筛选 姓名：张鑫淼班级：生工1301 一．实验目的 以紫外线处理细菌细胞为例，学习微生物诱变育种的基本技术。 了解细菌抗药性突变株的筛选方法 二．实验材料 菌株：大肠杆菌（Escherichia coli） 培养基：营养肉汤（nutrient broth）固体和液体培养基 试剂：2mg/ml链霉素，（Str）母液，无菌生理盐水。 仪器：1ml的移液管17个，10ml移液管11个，无菌试管9个，无菌培养皿15个，无菌三角瓶7个（其中一个内有无菌的玻璃珠20~40粒），无菌漏斗（内有两层擦镜纸），无菌离心管1个，离心机，紫外诱变箱等 营养肉汤蛋白胨10g牛肉膏3g氯化钠5g蒸馏水1000mLpH 7.4 营养琼脂蛋白胨10g牛肉膏3g氯化钠5g琼脂15～20g蒸馏水1000mL 三．实验原理 以微生物的自然变易作为基础的筛选菌种的机率并不很高。因为自发突变率小，一个基因的自发突变率仅为10-6~10-10左右。为了加大突变频率，可采用物理或化学的因素进行诱发突变。物理因素中目前使用得最方便且十分有效是UV，UV诱变一般采用15w 的紫外灭菌灯，其光谱比较集中在253.7nm处，这与DNA的吸收波长一致，可引起DNA 分子结构发生变化，特别是嘧啶间形成胸腺嘧啶二聚体，从而引起菌种的遗传特性发生变易。在生产和科研中可利用此法获得突变株。 链霉素属氮基糖昔类抗生素，其杀菌机理是作用于核糖体小亚基，使其不能与大亚基结合组成有活性的核糖体，从而阻断细菌蛋白质的合成。细菌对链霉素产生抗药性的作用机理一般是由于编码核糖体蛋白S12的rpsL基因或其他基因发生突变，导致相应的核糖体蛋白发生改变，是蛋白质合成不再受链霉素抑制。 四．实验内容与操作步骤 （一）出发菌株菌悬液的制备 1. 出发菌株移接新鲜斜面培养基，37℃培养16~24h； 2. 将活化后的菌株接种于液体培养基，37℃ 110rpm振荡培养过夜（约16h），第二天，以20~30%接种量转接新鲜的营养肉汤培养基，继续培养2~4h； 3. 取1ml培养液与1.5ml离心管中，10000rpm离心3~5min，弃去上清液，加1ml无菌生理盐水，重新悬浮菌体，再离心，弃去上清，重复上述步骤用生理盐水恢复成菌悬液； 4. 将上述菌悬液倒入装有小玻璃珠的无菌三角瓶内（预先加入9ml无菌生理盐水），振荡20~30min，以打散细胞； 5. 取诱变前的0.5ml 菌悬液进行适当稀释分离，取三个合适的稀释度倾注营养琼脂平板，每一梯度倾注两皿，每皿加1ml菌液，37℃倒置培养24~36h，进行平板菌落计数。同时选取合适浓度的菌悬液0.1ml涂布营养琼脂+Str平板（Str终浓度8ug/ml），37℃倒置培养24~36h,进行诱变前抗药菌落计数。 （二）UV诱变 1. 将紫外灯打开，预热30min； 2. 取直径6cm的无菌培养皿（含转子），加入菌悬液5ml，控制细胞密度为107~108个/ml；