秋水仙素诱导细胞周期停滞

细胞自噬与凋亡在心血管疾病方面的研究进展

细胞自噬与凋亡在心血管疾病方面的研究进展 发表时间：2018-06-22T10:59:28.583Z 来源：《心理医生》2018年14期作者：张文会 [导读] 提供更多途径、更多思路的选取合适的自噬水平，有望为临床综合防治心血管疾病的带来新的研究治疗前景[7]。 （徐州医科大学江苏徐州 221004） 【摘要】随着细胞自噬研究的不断深入，自噬作用于心血管疾病发生、发展过程逐步受到关注，本文主要论述了细胞自噬与凋亡在心血管疾病的研究进展，为临床心血管疾病的综合防治带来新的模式前景参考。 【关键词】细胞自噬；心血管疾病；凋亡 【中图分类号】R54 【文献标识码】A 【文章编号】1007-8231（2018）14-0061-02 细胞自噬即细胞可以破坏自身成分包括细胞器和部分胞质，从粗面内质网无核糖体区域脱落的双层膜状结构将这些成分包裹，形成袋状囊泡并转移给溶酶体进行降解回收，整个过程的完成均在自噬基因的调控下，完成细胞代谢和细胞器的更新[1]。细胞自噬广泛存在于真核生物中，当细胞受到刺激如饥饿或者损伤时，自噬可以快速反应，启动自噬机制，降解受损、衰老细胞器，保护细胞正常的生长代谢。 1.细胞自噬的研究现状 1.1 自噬的过程 首先在一定的诱导信号作用下，细胞接受信号刺激后，先形成较小的膜状机构即自噬前体，而自噬前体可能与通过细胞吞噬的吞噬泡、内体等融合。将胞浆中的细胞器等成分包裹，形成球状自噬体。然后溶酶体和自噬体接触后融合，自噬溶酶体形成。 1.2 自噬的分类及特性 自噬分为3类： 大自噬即自噬； 微自噬：指溶酶体通过主动而直接的方式吞噬细胞质； 分子伴侣介导的自噬：未折叠蛋白可以在一些分子伴侣的协助下通过溶酶体发挥作用。 1.3 自噬与凋亡 自噬和凋亡是机体在漫长的进化过程中发展起来的一种细胞死亡机制，研究表明，自噬和凋亡总是处在细胞生命周期的动态平衡之中。自噬和凋亡在一定的“程序”下调控细胞，两者之间在调控的基因及信号通路等可以发生相互的联系，自噬和凋亡就产生了相应的联系机制，因此研究两者的共同通路对于一些疾病如肿瘤、糖尿病心肌病提供良好的治疗研究前景[2]。 2.自噬与心血管疾病 心肌细胞发生自噬对维持正常心脏功能具有重要作用，近年来很多研究证实，自噬的出现均可以体现在各种心脏疾患上，如心肌病、心力衰竭等，包括各种心血管应激如心肌缺血再灌注等，同时，自噬程度的改变也伴随并影响着这些疾病和应激的进展。因此研究疾病状态下，心肌细胞自噬的发生机制对于阐明心血管疾病的发病机制具有重要的研究意义[3]。 2.1 心肌缺血再灌注与自噬 已有的研究表明，心肌细胞发生自噬往往伴随心肌缺血再灌注，但是具体的发生机制尚需进一步研究。Matsui等[4]认为缺血和再灌注两个阶段，自噬发挥完全相反的作用，前者是保护，后者可能是有害作用。而PRZYKLENK[5]等研究发现心肌细胞在启动凋亡程序后，同时自噬作用也会明显加强，心肌细胞凋亡发生普遍减少，心肌细胞发挥自身正常的功能在缺血再灌注阶段也因为自噬得到修复和保护。针对保护机制的解释可能是因为在自噬过程中，降解水解关键酶，氧化应激增强，凋亡升高。另外，研究表明再灌注损伤可能诱导心肌细胞自噬，如果缺血阶段通过温和方式进行，这时的自噬很可能具有保护心肌细胞的作用；相反，自噬发生过度激活则会导致细胞死亡。 2.2 心力衰竭与自噬 自噬与心力衰竭的发生联系机制尚不明确，推测可能是由于自噬造成心肌细胞大量丢失促进心力衰竭。另有研究表明，心肌细胞中发生适度的自噬，溶酶体激活对防止心肌病和心力衰竭的发生具有关键保护作用。因此，在心力衰竭过程中，适度的自噬可起到对心肌细胞的保护作用，而过度自噬则会导致心肌细胞丢失、细胞死亡，并可能会使心力衰竭进一步恶化。 2.3 心肌梗死与自噬 研究表明，通过上调Beclinl和激活AMPK表达诱导自噬增强，在心肌细胞发生缺血缺氧时，自噬会对心肌产生保护作用。还有研究指出，在心肌梗死模型中自噬还可以通过内质网应激的上调促进细胞内营养供应，心肌梗死范围不至于过大。这些结果都表明自噬在急性心肌梗死中具有重要的保护作用。因此在急性心肌梗死中，自噬的诱发会通过一些基因的调控和表达保护心肌细胞，避免大范围的心肌细胞的死亡。 2.4 心肌肥厚与自噬 心肌肥厚与自噬的关系研究一直不明朗。研究表明，抑制自噬能够对抗心肌肥厚，改善心肌重塑，提高病患的生存率。有的研究认为促进自噬能够抑制心肌肥厚，抑制自噬作用，心肌肥厚的情况得以改善。如Huang等[6]发现，自噬在被抑制以后，可以阻碍心肌肥厚的发生发展。同时，在病理条件下，通过抑制自噬发生过程中自噬小体的形成阶段，可以有效改善心肌肥厚的发生发展，这些均提示自噬的发生伴随在整个心肌细胞发生病理变化过程中。 3.展望 细胞自噬研究随着不断的深入加之自噬检测技术的迅猛发展，心血管疾病发生、发展过程与自噬相互之间的联系逐步受到关注，深入研究不同疾病状态下自噬的信号通路，包括一些自噬基因的调控研究，尤其是自噬发挥细胞保护或损伤作用的不同分子机制，提供更多途径、更多思路的选取合适的自噬水平，有望为临床综合防治心血管疾病的带来新的研究治疗前景[7]。 【参考文献】 [1] Shibutani ST,Saitoh T,Nowag H,et al.Autophagy?and?autophagy-related proteins in the immune system.Nat Immunol.2015;16(10):1014-24. [2]孙雅婧,郭青龙. 细胞自噬的研究进展[J]. 药学与临床研究,2012,03:236-239. [3] An DJ,GilleRe TG，Hill JA.Cardiomyocyte autophagy：remodeling repairing and reconstructing the hem[J].Curr Hypertens

PI染色检测细胞周期

1、离心收集细胞，弃上清，用预冷PBS洗细胞两次。 2、加入预冷70%乙醇，于4℃固定过夜，或-20℃长期固定（4℃过夜一般隔天就进行检测，如果想推迟几天测，那就保存在-20℃，有资料说-20℃可以保存一个月，个人建议尽量在最短时间内检测，有些实验是在不同时间点上收细胞，这时我就等最后一次固定完了一块测，基本上也多在一周内检测完毕，没有特地去比较保存时间对检测结果的影响）。 3、细胞染色 离心收集细胞，以1mL的PBS洗细胞一次，加入500uLPBS含50ug/mL溴化乙锭（PI），100ug/mL RNase A，0.2% Triton X-100，4℃避光孵育30分钟（PI我是直接用PBS配成工作浓度，然后加入细胞沉淀混匀，RNA酶现加，但有时不加发现对实验结果也没太大的影响）。 4、流式分析 以标准程序用流式细胞仪检测，一般计数2-3万个细胞，结果用细胞周期拟和软件ModFit分析。 分析时，使用FL2-w和FL2-A显示，去除联体细胞，具体如下图。 细胞周期流式后一般分为G0/G1,S,G2/M期三部份，如果有凋亡，在G0/G1期前面有个凋亡峰(也称sub-G0期),而如果分析时细胞窗口没设置好，可能在最前面还有细胞碎片峰。 结果解读 G0/G1期细胞占总的61.2%，峰位于横座标的45.76 G2/M期占13.07，峰位于横座标的91.43 S期占25.73 G2/G1为2.0（即G2期为4倍体细胞，而G1期为2倍体细胞，比值为2） 峰的变异系数为4.54%（好） 细胞碎片为0.48%，细胞聚集体有0.06%。 总的细胞数（仪器检测到的）为17525个， 在细胞周期中分析的细胞数为17431个（即排除了碎片及聚集体后）

人体胃细胞7天更新一次

人体胃细胞7天更新一次; 皮肤细胞28天左右更新一次; 肝脏细胞180天更换一次; 红血球细胞120天更新一次; 在一年左右的时间，身体98%的细胞都会被重新更新一次。而骨细胞更新需要7年。所以，不管你要美容、减肥、改善亚健康的问题，都需要耐心，要坚持!!给身体一点时间，改变自己!用科学的方法，针对性的配方。让自己越来越健康，越来越美丽! 什么是调整反应?

调整反应，中医称之为“瞑眩反应”，在保健及调理过程中，必然会有各种各样的调整反应。《书经》称“药不瞑眩,厥疾勿瘳”，其意为服药后,若人体没有明显的反应,则疾病难以被治愈。我们体会,虽服药愈病并非均有明显反应,但若药后有较明显反应者常收效较好。 一、皮肤痒 糖尿病，血糖不稳定，肾病，肝胆类疾病，寄生虫病，肿瘤，内分泌紊乱的必然反映，是大量废物，病毒从皮肤排泄的表现。 1、白细胞吞噬能力增强，皮部组织出现奇痒，病变部位气血流通了。 2、肾功能不好，气滞血淤的人，会反映皮肤奇痒无比，是皮肤无法应对大量毒素的排出。 3、皮肤出现小红肿，小红块，风疹块，呕吐，是胆囊炎，胆汁返流性疾病的一种表现，人体血液、体液内的废物在皮肤弱酸环境中的反映。皮肤承受不了调节，产生各种新的瘀堵，这是暂时的。 4、皮肤溃烂，流水，脱皮，局部肿大，是皮肤微循环瘀堵，流通不畅的一种表现，是原来瘀堵和病变的局部被打通了。

5、淋巴痛，咽喉红肿，口腔内痒，咳嗽，这是淋巴结，咽喉，等有疾病或瘀堵，病毒结合物，废物体，淤血点，粘膜内废物开始松动或分解，疏通。 6、头皮痒、头屑多，这是典型的肾阳虚反映，原来瘀堵在头皮的毛囊内脂肪和废物被大量排出后产生的适应感觉 二、各种疼痛 各种疼痛，是由于血流量增强，硬化萎缩，瘀堵的微血管开始恢复弹性，后面推，前面堵，会牵拉周围的组织，就会反映疼痛，有的人反应强烈，有的人反应弱; 1、局部肌肉酸痛，胀痛，刺痛，这是肌肉微循环严重堵塞。 2、关于胯骨，颈椎，腰椎，酸痛，刺痛，痛无定处，这是关节炎，风湿性，类风湿性、股骨头炎的一种表现，越痛说明越严重。 3、意想不到的局部出现疼痛，说明这个部位有淤积。 4、全身无力，全身酸痛，或者发烧，这是月风病，风湿类疾病，心脏病，痛风病的反映，巨噬细胞吞噬病毒的能力增强了，机体应变能力差，暂时不能适合新的平衡。

细胞凋亡与心脑血管疾病的关系

中国康复医学杂志，２００５年，第２０卷，第１１期ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＲｅｈａｂｉｌｉｔａｔｉｏｎＭｅｄｉｃｉｎｅ，Ｎｏｖ．２００５，Ｖｏｌ．２０，Ｎｏ．１１ ?综述?细胞凋亡与心脑血管疾病的关系 徐波１向青１，２ 细胞凋亡是一种不同于细胞坏死的生理性死亡方式，对生物机体的正常发育及自身稳定具有极其重要的作用。细胞凋亡功能的失控，抑制或增加，均会引起机体平衡失调，导致疾病，如与凋亡抑制有关的疾病：肿瘤、自身免疫性疾病等；与凋亡增加有关的疾病：神经系统脑缺血缺氧性疾病、老年性痴呆症、心肌梗死、心力衰竭、动脉粥样硬化等，其中心脑血管疾病是危害人类健康最主要的原因。因此，了解细胞凋亡途径及其调控因素，研究细胞凋亡与疾病发生、发展的关系，以细胞凋亡为切入点，探讨细胞凋亡相关疾病的预防措施及康复治疗方法成为近年来人们关注的热点之一。 １细胞凋亡 细胞凋亡是由细胞内在机制引起，可由某些因素诱导但不是坏死性的改变，是保持完整膜结构的细胞固缩，染色质浓缩并边集，由膜结构包裹部分细胞核和细胞质形成凋亡小体，凋亡细胞多为分散的个体细胞，琼脂糖凝胶电泳常呈现特征的ＤＮＡ梯形条带，整个过程无炎症反应［１］。 ２细胞凋亡途径 细胞凋亡过程大致可分为３个阶段：诱导期（ｉｎｄｕｃｔｉｏｎｐｈａｓｅ）、效应期（ｅｆｆｅｃｔｏｒｐｈａｓｅ）和降解期（ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎｐｈａｓｅ）。各种不同的内、外界刺激经相应受体，通过效应分子相互作用，引起ｃａｓｐａｓｅ家族的级联反应，降解各种细胞内底物，使细胞呈凋亡状态［２］。 目前认为主要的凋亡途径有以下两种：①死亡受体信号传导途径：死亡受体是细胞膜表面的某些蛋白质，通过与携带凋亡信号的特异性配基结合，迅速将凋亡信号转导至细胞内，引起细胞凋亡。②线粒体—细胞色素Ｃ凋亡信号传导途径：线粒体是细胞中产生能量的细胞器。Ｊａｃｏｂｓｏｎ等［３］发现：有核细胞去核后，胞质体仍可被诱导凋亡；进而，线粒体在有核细胞凋亡中的作用也得到证实。目前普遍认为：细胞凋亡过程中许多重要事件的发生都与线粒体形态与功能的改变密切相关，是凋亡的执行者，其诱导的凋亡具有相对的独立性。 ３细胞凋亡的相关基因及影响因素 细胞凋亡是机体在生长、发育和受到外来刺激时，为保持机体内环境平衡的一种自我调节机制。细胞凋亡过程受到一系列细胞内相关基因的调节与控制，如癌基因ｃ－ｍｙｃ、抑癌基ｐ５３、死亡基因ｂｃｌ－２家族、Ｆａｓ／ＦａｓＬ、转录因子ＮＦ－κＢ及细胞因子ＩＦＮ等。 ４细胞凋亡与相关的心血管系统疾病 近年来，越来越多的研究证明：细胞凋亡参与了心血管系统疾病的病理过程。在动脉粥样硬化、心肌梗死、心力衰竭等疾病中，分别发现有血管平滑肌细胞及心肌细胞的凋亡。４．１细胞凋亡与动脉粥样硬化 动脉粥样硬化斑块的发生、发展取决于细胞凋亡与细胞增殖的相对平衡［４］。Ｈａｎ等［５］对动脉粥样硬化患者的冠状动脉粥样硬化斑块进行观察，发现斑块内有血管平滑肌细胞的凋亡。研究表明：在动脉粥样硬化发生过程中活化的巨噬细胞和Ｔ淋巴细胞产生的淋巴因子，能使Ｆａｓ表达上调，促进血管平滑肌细胞的凋亡，且凋亡的发生与ｂｃｌ－２基因表达的下调有关［６－７］。凋亡的血管平滑肌细胞不仅具有产生凝血酶的能力，还能够增加动脉粥样硬化斑块局部凝血酶的活性，直接形成血栓，进而促进动脉粥样硬化的发生过程［８］。因此，进一步深入研究血管平滑肌细胞凋亡对动脉粥样硬化发生及发展的影响，可能为动脉粥样硬化的治疗与预防提供新途径。４．２细胞凋亡与心肌梗死 心肌梗死既有心肌细胞坏死，也有心肌细胞凋亡，其中心肌细胞凋亡是心肌梗死的重要方式。Ｋａｊｓｔｕｒａ等［９］发现：细胞坏死和细胞凋亡在急性心梗中的作用是相互独立的，细胞凋亡是扩大心肌梗死范围的独立因子，心肌梗死的大小更多地取决于细胞凋亡的程度。心肌细胞凋亡有如下特征：心肌损伤早期的主要形式是细胞凋亡，随后细胞死亡逐渐增加；梗死灶中心及边缘均有凋亡发生，梗死中心的凋亡细胞相对密集，梗死灶边缘的凋亡细胞多分散出现。研究还发现：心肌梗死的心肌细胞凋亡伴有Ｂｃｌ－２表达降低及Ｂａｘ表达增加。针对上述特点：尽早恢复心肌灌注，避免发生心肌细胞凋亡，阻断心肌细胞凋亡成为治疗心肌梗死的重要策略。 ４．３细胞凋亡与心力衰竭 近期研究结果显示Ｆａｓ活化作用参与了心肌炎和缺血性再灌注损伤主要病理学的发生，其表现为心律失常和机械性功能障碍。尽管心肌细胞有Ｆａｓ表达，但在心肌含氧量正常情况下，有抵制Ｆａｓ介导凋亡的作用，而在心肌细胞缺氧的情况下，Ｆａｓ被激活，诱导心肌细胞凋亡，其途径是通过激活酸性磷脂酶Ｃ等一系列级联反应，使胞浆内Ｃａ２＋浓度升高，直接激活依赖Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋的内源性核酸酶，导致ＤＮＡ断裂，染色质固缩，最终导致细胞凋亡，引起心力衰竭［１０］。 利用Ｐ３５基因抑制Ｃａｓｐａｓｅｓ的活性和ＤＮＡ组氨酸的构成，能改善心脏的收缩状况，同时延缓心肌衰竭；而将有活性的Ｃａｓｐａｓｅｓ３显微注射到完整的肌细胞的细胞质内，诱导肌纤维组织的破坏，并减少细胞的收缩力，导致细胞凋亡［１１］。 １北京中日友好医院临床医学研究所生化分子生物学研究室，１０００２９ ２通讯作者：向青（北京中日友好医院临床医学研究所生化分子生物学研究室，１０００２９） 作者简介：徐波，女，主管技师 收稿日期：２００５－０５－２６ ８７５

PI染色检测细胞周期实验步骤

protocol : PI染色检测细胞周期 1、收集细胞：胰酶（含EDTA）消化收集对数生长期细胞（加热处 理后损失多的组宜多收集细胞保证细胞有 0.5-2 X 10*6个），吸取旧培养基到一个新离心管里；少量常温PBS （根据培养皿大小决定量，PBS洗可以保证消化效率）洗2次，清洗的PBS也要收集到上述离心管内【检测凋亡才需收集旧培养基及清洗的 PBS J ;然后胰酶消化 （注意一定要消化完全，显微镜下观察细胞呈单个，而不是成片脱落）后利用旧培养基中和胰酶；离心（1000r/300g 5mi n）收集细胞沉淀。 2、用预冷的PBS清洗细胞两次。 3、固定细胞：用0.5ml预冷的PBS重悬细胞沉淀，使细胞充分悬浮成单细胞，再将重悬细胞加入1.2ml预冷的99.7%无水乙醇（乙醇终浓度70%），吹打混匀以免细胞团聚，4C固定2H至过夜。 4、细胞染色：离心（1000r/300g 5min ）收集固定的细胞，以1.8 mL的PBS洗细胞一次，离心（第一次实验时用7000rpm才把细胞离心下来，但最后流式结果显示细胞没有碎）再次获取细胞沉淀后加入1 00卩IRNaseA 于37 C水浴30min，最后加入400卩lPI避光染色30 min （常温或4C 均可） 【有的试剂盒说明是：每个样本加入500uL染色剂（据样本数，用P BS 临时配好总量，其中 PI 50ug/ml、RNase A 100ug/mL、Trit on X-100 0.2% ） 4 C避光染色30分钟】 5、流式分析以标准程序用流式细胞仪检测，一般计数2-3万个细胞，结

果用细胞周期拟和软件ModFit分析。分析时，使用FL2-W和FL2-A显示，去除联体细胞。

细胞外基质与心血管病

细胞外基质与心血管病 细胞外基质（Extracellular Matrix，ECM）是由成纤维细胞、间质细胞、上皮细胞等体内各种组织和细胞合成和分泌的一类大分子物质。主要分为胶元、非胶元糖蛋白、蛋白聚糖和弹性蛋白等四大类，主要分布和聚集在细胞表面和细胞间质，多成复杂网络结构，故称细胞外基质（间质）。它们是细胞和组织赖以生存、活动和调节的外环境：一方面为细胞和组织提供支持、联结、固定、保水、缓冲等物理性的保护作用，另一方面又是细胞与外环境进行物质交换、信息传递和汇集的中介。它可通过各种信号传递系统，调节细胞生长、增殖、迁移、分化、粘附、代谢、损伤修复、组织重构等各种生理功能。被称为是人体细胞和组织内稳态的主要调节者（The Central Regulator of Cell and Tissue Homeostasis）。 细胞外基质的成分十分复杂，除了各型胶元以外，还有各种粘连蛋白（FN）、层连蛋白（LN）、氨基聚糖（GAG）、蛋白聚糖（PG）、弹性蛋白（Elastin）、内动素（Cytotatin）、血栓结合素（Thrombospondin）、整合素（Integrin）、玻连蛋白（Vitronetin VN）、连结蛋白（Connexins）、钙粘素（Cadherins）、选择素（Selectin）、粘附素（细胞粘合素）、细胞粘合素（Cytotatin）等几十个类别。每一种类别又有几种至十几种亚型。细胞不同产生和分泌的基质成分亦不同；组织不同所含的细胞外基质的成分和比例亦不同；即使同一种细胞，同一种组织，在不同的生理、病理和反应条件下，细胞外基质的成分、结构和构型亦不同；结构和构型不同，细胞外基质的功能和作用亦不同；同一类型的细胞外基质，它还可分解成不同的降解片段，也有不同的生理功能。随着基因和蛋白质组生物学的研究进展，新的细胞外基质分子还在不断诞生，其类型、构型、构像还有更多发现，其功能亦在不断的扩展，构成了一个十分复杂的细胞外基质的网络家族和体系。 细胞外基质虽然来源、成分、分型和功能不同，各司其责，但在结构和功能上，它们又排列有序、疏密相间、相互联结、彼此协同，在细胞间质、组织间隙和器官内，形成各种复杂的相对固定的形式和分层网状结构，形成许多不同的功能结构区域，如在血管，可以形成内膜表面的粘附保护层、内膜下层、基底膜层、内弹力层、外弹力层、血管中层和外层系膜结缔组织等等。每一个结构区域都具有其复杂的成分、结构和各自的功能，形成多重通道、支架、隔栅、巢穴或屏障，保护和调节着血管的完整的功能。细胞外基质来源于器官和组织内的不同细胞。细胞不同，产生和分泌的基质亦不同，如在心脏，肌肉细胞可以产生胶元IV、

细胞凋亡与心血管疾病关系的研究

细胞凋亡与心血管疾病关系的研究(作者：__________ 单位：___________ 邮编：___________ ) 【关键词】细胞凋亡；心血管疾病；病理学 从细胞形态、超微结构和生化变化等特征来分析，细胞有坏死(necrosis)和凋亡(apoptosis) 2 种死亡形式［1］，坏死是细胞受到伤害时，细胞肿大、胀裂，胞内物质溢出，导致细胞周围组织发生炎症的病理生理改变；而凋亡是与细胞增殖相平衡的维持正常组织形态、体积和功能的主动自杀过程，无炎症改变。目前，细胞凋亡与疾病发生、发展、转归的研究是医学研究的热点之一，通过对凋亡的研究发现很多疾病都与细胞凋亡有着密切的联系。本文对凋亡与心血管 疾病关系的研究简要概述。 1凋亡概述 凋亡是在基因调控下发生的主动、有序的细胞死亡，大多数发生在生理情况下，某些病理性刺激也可影响凋亡的发生，其形态学特征表现为染色质浓缩、边集(margination)，进而形成月牙形核、细胞膜出芽、胞质进行性浓缩、细胞骨架改变、凋亡小体(apoptosis body) 形成等［1］。生物化学特征性改变尤以DNA片段化断裂及蛋白质的降解为特

点，凋亡发作时，细胞内外的凋亡诱导因素通过一系列细胞内信号转导环节激活内源性核酸内切酶使DNA碎裂成180?200 bp或其整数倍的片段，琼脂凝胶电泳时表现出典型的DNA梯状带(DNAIadder patern)［2］。细胞凋亡往往需要新的基因转录和蛋白质合成，是个耗能的过程，需要ATP的参与。 细胞凋亡过程有凋亡信号传导、凋亡基因激活、凋亡的执行、凋亡细胞的清除4个阶段和死亡受体、线粒体2个途径。细胞凋亡是一种不同于细胞坏死的生理死亡过程，在机体生命活动过程中调控着细胞增殖与更新间的平衡，维持组织器官正常生理功能及细胞数量的相对稳定［3］。 2凋亡在心脏中的主要信号转导途径 心肌细胞凋亡涉及5种主要的信号转导通路：(1)氧化还原系统 (通过氧自由基和NO/ONO激活);(2)细胞因子受体中的FadTNFa受体操纵(通过死亡区域与几条胞内信号通路联系)；(3)半胱天冬氨酸激 酶-半胱氨酸蛋白激酶家族操纵(受体起始信号或线粒体相关的细胞色素C 激活的级联反应中)；(4)配体、激动剂诱导的G蛋白偶联受体(CPcR)依赖的刺激，女口AT H和它的受体信号系统G caq和新颖的和Caq相关的CPcR S路［4］。其共同作用原理为：单个前凋亡刺激可能导致凋亡单个或多条通路的激活；凋亡信号通路的最后共同通路都包括许多细胞结构功能核蛋白的分解、转录的调节和细胞循环的调节；调节凋亡过程的检查点也在心肌细胞中出现，Bel拟2家族蛋白和Bax 相

PI染色检测细胞周期实验步骤

protocol：PI染色检测细胞周期 1、收集细胞：胰酶（含EDTA）消化收集对数生长期细胞（加热处理后损失多的组宜多收集细胞保证细胞有0.5-2×10*6个），吸取旧培养基到一个新离心管里；少量常温PBS（根据培养皿大小决定量，PBS洗可以保证消化效率）洗2次，清洗的PBS也要收集到上述离心管内【检测凋亡才需收集旧培养基及清洗的PBS】；然后胰酶消化（注意一定要消化完全，显微镜下观察细胞呈单个，而不是成片脱落）后利用旧培养基中和胰酶；离心(1000r/300g5min)收集细胞沉淀。 2、用预冷的PBS清洗细胞两次。 3、固定细胞：用0.5ml预冷的PBS重悬细胞沉淀，使细胞充分悬浮成单细胞，再将重悬细胞加入1.2ml预冷的99.7%无水乙醇(乙醇终浓度70%)，吹打混匀以免细胞团聚，4℃固定2H至过夜。 4、细胞染色：离心（1000r/300g5min）收集固定的细胞，以1.8 mL的PBS洗细胞一次，离心(第一次实验时用7000rpm才把细胞离心下来，但最后流式结果显示细胞没有碎)再次获取细胞沉淀后加入1 00μlRNaseA于37℃水浴30min，最后加入400μlPI避光染色30 min（常温或4℃均可） 【有的试剂盒说明是：每个样本加入500uL染色剂（据样本数，用P BS临时配好总量，其中PI 50ug/ml、RNase A 100ug/mL、Triton X-100 0.2%）4℃避光染色30分钟】 5、流式分析

以标准程序用流式细胞仪检测，一般计数2-3万个细胞，结果用细胞周期拟和软件ModFit分析。分析时，使用FL2-w和FL2-A显示，去除联体细胞。

炎症细胞因子与心力衰竭研究进展

炎症细胞因子与心力衰竭研究进展（作者： _________ 单位：___________ 邮编：___________ ） 【关键词】炎症；细胞因子；心力衰竭；心肌收缩力；心室重构 细胞因子是细胞受内、外环境变化刺激后分泌的一组功能性蛋白分子，其家族成员包括肿瘤坏死因子（TNF）、白细胞介素（IL）、干扰素、集落刺激因子、生长因子、趋化因子家族等。细胞因子主要参与激活信号转导通路、增加细胞内信使水平、激活转录因子、诱导编码基因等生理和病理过程。在众多炎症细胞因子中，起主要作用的是TNF』a、IL]1 B、IL]6、TGF] B、IL]1O。炎症细胞因子级联反应对于心衰的发生、发展具有重要作用。研究表明，其可降低心肌收缩力及心输出量，促发自发性功能障碍、胰岛素抵抗、内皮损失及血液高凝状态等 〔1〕。心衰时炎症细胞因子增加，其水平是判断心衰严重程度及预后的指标，抗炎治疗可降低高危患者心衰的发生率〔2, 3〕。 1 TNF]a TNF] a主要由脂多糖（lipopolysaccharide ，LPS）等激活的单核/ 巨噬细胞产生，是一种由157个氨基酸组成的肽类，分子量为17 kD。

TNF受体(TNFR)有两种，低亲和力受体TNFR1(分子量55 kD)和高亲和力受体TNFR2(分子量75 kD)。研究证实，TNF] a通过TNFR1 参与心衰的病理生理过程，而TNFR2起保护心脏的作用〔4〕。TNFR 的细胞外部分经蛋白酶剪接后成为可溶性TNF受体(sTNFR)，进入 血液和尿液，快速与TNF] a结合形成三聚体，一方面阻止TNF] a结合于细胞膜上的TNFR位点发挥作用，缓冲其细胞毒性；另一方面将结合的TNF] a缓慢释放，使其在体内的活性长时间保持低水平。而不稳定的TNF] a会很快被分解为无活性单体，因此sTNFR被认为是体内TNF[ a活性调节中的重要机制之一。生理情况下，TNF[a与sTNFR 处于平衡状态；心衰时这一平衡被打破，TNF[ a显著增高，sTNFR代偿性增高程度有限，TNF_ a sTNFR比值增高〔5，6〕。 1.1 TNF a对心肌细胞的负性肌力作用其作用机制如下。(1)TNFj a直接损伤心肌纤维，使细胞间质分裂，重新分布，毛细血管液体渗出，造成心肌细胞水肿，抑制心肌收缩力。⑵TNF[ a使B肾上腺素能受体解离，导致B [肾上腺素能刺激减敏〔7〕。⑶TNF[ a诱生多种细胞内一氧化氮合成酶(NOS)，心肌内NO产物增多，后者与TNF』a 延迟途径的负性变力效应有关：①高浓度的NO刺激鸟苷酸环化酶(GC)，使环磷酸鸟苷(cGMP)增多，激活蛋白激酶G(protein kinase G，PKG)，继而诱导细胞膜超极化，导致电压门控式钙通道关闭，同时PKG 降低肌钙蛋白对钙离子的敏感性，抑制磷酸肌醇水解，从而导致心肌收缩力降低〔8〕。②通过诱导型NOS(iNOS)表达，促进NO 生成，从而增

细胞研究进展概述

细胞研究进展概述——干细胞技术 20092358 谢芬霏16120901 生物技术 摘要：干细胞是人体及各种组织细胞的最初来源，具有高度自我复制、高度增殖和多项分化的潜能。干细胞的研究正在向现代生命科学和医学等各个领域交叉渗透，干细胞的研究也成为了生命科学的热点，本篇就几个干细胞的研究方向的进展展开一些介绍。 关键词：干细胞；多能性；神经干细胞；造血干细胞 引言： 干细胞是一类具有自我复制能力的多潜能细胞，在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞。根据干细胞所处的发育阶段分为胚胎干细胞(embryonic stem cell，ES细胞)和成体干细胞(somatic stem cell)。根据干细胞的发育潜能分为三类：全能干细胞(totipotent stem cell,TSC)、多能干细胞（pluripotent stem cell）和单能干细胞（unipotent stem cell）。干细胞(Stem Cell)是一种未充分分化，尚不成熟的细胞，具有再生各种组织器官和人体的潜在功能，医学界称为“万用细胞”。干细胞的形态上具有共性，通常呈圆形或椭圆形，细胞体积小，核相对较大，细胞核多为常染色质，并具有较高的端粒酶活性。胚胎干细胞(Embrtibuc stem cell)的发育等级较高，是全能干细胞（Totipotent stem cell），而成体干细胞的发育等级较低，是多能干细胞或单能干细胞。据最新研究发现，成体干细胞可以横向分化为其他类型的细胞和组织，为干细胞的广泛应用提供了基础。在胚胎的发生发育中，单个受精卵可以分裂发育为多细胞的组织或器官。在成年动物中，正常的生理代谢或病理损伤也会引起组织或器官的修复再生。胚胎的分化形成和成体组织的再生是干细胞进一步分化的结果。胚胎干细胞是全能的，具有分化为几乎全部组织和器官的能力，而成体组织或器官内的干细胞一般认为具有组织特异性，只能分化成特定的细胞或组织。 1 胚胎干细胞 1.1 胚胎干细胞的概念和生理学特性 胚胎干细胞（Embryonic Stem cell，ES细胞）。胚胎干细胞当受精卵分裂发育成囊胚时，内层细胞团（Inner Cell Mass）的细胞即为胚胎干细胞。胚胎干细胞具有全能性，可以自我更新并具有分化为体内所有组织的能力。胚胎干细胞的生物学特性有：①全能性，在体外培养的条件下, 胚胎干细胞可以诱导分化为机体的任何组织细胞。全能性的标志是细胞表面有胚胎抗原和Oct4蛋白【1】。②无限增殖性。胚胎干细胞在体外适宜条件下, 能在未分化状态下无限增殖。③胚胎干细胞具有种系传递的功能。④胚胎干细胞易于进行基因改造操作。⑤细胚胎干胞保留了正常二倍体的性质且核型正常。早在1970年Martin Evans已从小鼠中分离出胚胎干细胞并在体外进行培养【2】，而人的胚胎干细胞的体外培养直到最近才获得成功。进一步说，胚胎干细胞（ES细胞）是一种高度未分化细胞。它具有发育的全能性，能分化出成体动物的所有组织和器官，包括生殖细胞。研究和利用ES细胞是当前生物工程领域的核心问题之一。ES细胞的研究可追溯到上世纪五十年代，由于畸胎瘤干细胞（EC细胞）的发现开始了ES细胞的生物学研究历程。目前许多研究工作都是以小鼠ES细胞为研究对象展开的，如：德美医学小组在去年成功的向试验鼠体内移植了由ES细胞培养出的神经胶质细胞。此后，密苏里的研究人员通过鼠胚细胞移植技术，使瘫痪的猫恢复了部分肢体活动能力。随着ES细胞的研究日益深入，生命科学家对人类ES细胞的了解迈入了一个新的阶段。在98年末，两个研究小组成功的培养出人类ES细胞，保持了ES细胞分化为各种体细胞的全能性。这样就使科学家利用人类ES细胞治疗各种疾病成为可能。然而，人类ES 细胞的研究工作引起了全世界范围内的很大争议，出于社会伦理学方面的原因，有些国家甚至明令禁止进行

细胞凋亡与疾病

细胞凋亡与疾病 一、基本要求 （一）掌握细胞凋亡的概念、生物学意义 （二）掌握细胞凋亡的发生机制 （三）熟悉细胞凋亡的过程及细胞凋亡与坏死的差别 （四）熟悉细胞凋亡的主要变化 （五）熟悉细胞凋亡的调控 （六）了解细胞凋亡与常见疾病或病理过程的关系 （七）了解细胞凋亡在疾病防治中的意义 二、知识点纲要 一、基本概念 （一）细胞凋亡的定义：由体内外因素触发细胞内预存的死亡程序而导致的细胞自杀过程称为细胞凋亡(apoptosis)，也称为程序性细胞死亡(programmed cell death， PCD)。 （二）细胞凋亡的基本过程 1．凋亡信号转导 2．凋亡基因激活 3．细胞凋亡的执行 4．凋亡细胞的清除 （三）凋亡时细胞的主要变化 1．细胞凋亡的形态学改变：胞膜空泡化，细胞固缩，染色质边集，凋亡小体。 2．细胞凋亡的生化改变：DNA“梯”状条带，内源性核酸内切酶激活，caspases（凋亡蛋白酶）激活。 （四）细胞凋亡的调控 1．细胞凋亡相关因素 细胞凋亡相关因素分诱导性因素和抑制性因素两大类 (1) 诱导性因素:激素和生长因子失衡,理化因素,免疫性因素,微生物等 (2) 抑制性因素: 某些激素（ACTH、睾丸酮）或细胞因子(IL-2，神经生长因子等) 的去除,某些二价金属阳离子如:Zn2+，药物如: 苯巴比妥、半胱氨酸蛋白酶抑制剂，病毒如：EB病毒，牛痘病毒CrmA等及中性氨基酸具有抑制细胞凋亡的作用。 2. 细胞凋亡信号的转导 (1)特点:凋亡信号转导系统是连接凋亡诱导因素与核DNA片段化断裂及细胞结构蛋白降解的中间环节。这个系统的特点是:①多样性;②偶联性;③同一性;④)多途性。 （2）研究较多的信号转导系统有：①胞内Ca2+信号系统；②cAMP/ PKA信号系统；③) Fas蛋白/Fas配体信号系统；④神经酰胺信号系统；⑤二酰甘油/蛋白激酶C信号系统；⑥酪氨酸蛋白激酶信号系统。 （五）凋亡相关基因 细胞凋亡相关基因多达数十种，根据功能的不同可将其分为三类:抑制凋亡基因（EIB、I AP、Bcl-2），促进凋亡基因（Fas、Bax、ICE、P53），双向调控基因（c-myc、Bcl-x）。 1． Bcl-2 是抑制凋亡的基因。 2.Fas Fas基因的表达可促进细胞凋亡。 3．p53 野生型P53基因具有诱导细胞凋亡的功能，当该基因发生突变后反而可抑制细胞凋亡。 4. c-myc，Bcl-x c-myc是一种癌基因，它能诱导细胞增殖，也能诱导细胞凋亡，具有

流式检测细胞周期要点

1.收集细胞； ～5000rpm离心5min，收集沉淀，重悬于200ul的PBS中，再次离心收集沉淀； ％冰冻乙醇（-20度保存）4度固定过夜or-20度固定1h； 4.离心收集沉淀，PBS洗一次（视沉淀量可忽略）； 5.沉淀重悬于200～500ul的PBS，加入Rnase A 37度水浴1h； 目纱布过滤至流式管，加入PI染色，4度避光30min-1h，上机器。 1、Q：要做胃粘膜组织的DNA含量及倍体检查，但取材后要等几个星期才会做流式细胞术检查，请问：胃组织要怎样保存好呢？用低温保存，还是用乙醇固定？或者固定后再低温下保存？ A：我做过乳腺细胞的DNA含量测定，取得组织以后，先处理成单细胞悬液，然后再加70%冰乙醇固定，要保证冰乙醇的最终浓度为50%，这样固定的细胞悬液可以至少保存12小时，最多可保存一个月，上机检测前再加PI综合染液。我就是这样做的，保存了将近三个星期，结果还可以，变异系数为5%. 2、实验中想用PI分析细胞周期及凋亡率，请教几个问题： Q：（1）所用的RNAs酶用什么配制呢？用PBS配吗？ A：RNaseA用PBS配制没有问题，但是注意要沸水浴去除DNase的活性。 Q：（2）测细胞周期和凋亡率时都要用RNAs酶，可以一起检测吗？ A：用流式细胞仪测定时细胞周期和凋亡率是同时测定的，不用担心。 Q：（3）Triton－x－100是固定剂吧，用了70％的冷乙醇（是4℃吗？），是不是就不用Triton－x－100固定了？ A：Triton X-100是起透化作用的，不是固定剂，可以用75％的乙醇于-20度固定。 Q：（4）还要设什么内参标准（5％鸡红细胞）吗？

【细胞分子生物学】第六章 细胞周期及其调节

第六章细胞周期及其调节 细胞增殖(cell proliferation)与细胞生长分裂周期． 第一节细胞周期 一、细胞周期(cell cycle)：指亲代细胞分裂结束到子代细胞分裂结束所经历的过程，这个过程所需的时间称为细胞周期时间。 细胞周期由G1、S、G2和M期组成(G1、S和G2期又合称为分裂间期)。 G1(Gap1)期：DNA合成前期(复制前期)，从上次有丝分裂完成到DNA复制之前的阶段; S期：DNA复制期; G2期：合成后期，从DNA复制完成至有丝分裂开始; M期：有丝分裂(Mitosis)期，包括核分裂和胞质分裂． M期结束后形成两个新的子细胞。 注：①不同细胞的细胞周期时间不同，一般S+G2+M期较恒定，而G1期变化较大，因而它决定了细胞周期时间的长短； ②G1期细胞有三种可能的趋向：1)进入S期(即进入细胞周期)．2)处于静止期即Co期(在一定条件下可重新进入增殖周期)，3)分化、衰老、凋亡。 二、细胞周期中各时相的主要生化事件 细胞周期中每期都有其特殊功能，其中S期的DNA复制和M期细胞核的有丝分裂是细胞周期中2个最关键的过程： 1、G1期：为DNA复制作准备，G1早期合成各种RNA、结构蛋白和酶等，细胞通过一 1

个限制点(restriction point，R点)后在G1后期合成DNA复制有关的蛋白和酶。 在开始合成DNA之前有一个关卡(checkpoint)，检查染色体DNA是否有损伤，如有则先要进行修复。 2、S期：DNA(包栝端粒)的复制及组蛋白合成、核小体装配．S期后每一染色体复制成2个染色单体· S→G2期关卡：检查DNA复制是否完成 3、G2期：为有丝分裂作准备．有RNA和非组蛋白合成。 4、M期：染色体浓缩一仿锤体形成→染色体分离并移向细胞两端→染色体解聚，形成两个新核→胞质分裂。 第二节周期素依赖性蛋白激晦与细胞周期调节 周期素依赖性蛋白激酶(cyclin-dependent kinases，CDKs) 通过使特异底物磷酸化调节细胞周期进行，其活性依赖与周期素(cyclin)结合形成复合物。 一、周期素-周期素依赖性蛋白激酶 周期素家族和周期素依赖蛋白激酶(CDK)家族． 细胞周期的不同时相表达不同cyc-CDK，这些cyc-CDK复合物在各不同的细胞周期过渡点起作用． 1、G1期cyc-CDK G1期表达的周期素为周期素C、D（D1、D2、D3)和E。 D族周期素主要与CDK4(以及CDK2、CDK5、CDK6)结合成活性的蛋白激酶复合物，对细胞通过R点(G0→G1过渡有重要作用。 E族周期素与CDK2形成复合物。 cycE-CDK2复合物调控G1→S过渡。 2

人体细胞分裂周期和代谢周期

人的寿命与细胞分裂周期和代谢周期 这是美国学者海尔弗利在1961年提出来的。他根据实验研究发现动物胚胎细胞在成长过程中，其分裂的次数是有规律的，到一定阶段就出现衰老和死亡。这与细胞分裂的次数和周期有关。二者相乘即为其自然寿命。海尔弗利的具体实验情况是这样的：他将婴儿的细胞放在培养液中一次又一次地分裂，一代又一代地繁殖，但当细胞分裂到50代时，细胞就全部衰老死亡。他又在大量实验资料的基础上，提出根据细胞分裂的次数来推算人的寿命，而分裂的周期大约是2．4年，照此计算；人的寿命应为120岁。鸡的细胞分裂次数是25次，平均每次分裂的周期为一年零两个月，其寿命为30年。小鼠细胞的分裂次数是12次，分裂周期为3个月，其寿命为3年。 人体的自然寿命约120岁，而组成人体组织的细胞寿命有显著差异，根据细胞的增殖能力，分化程度，生存时间，可将人体的组织细胞分为四类： ①更新组织细胞：执行某种功能的特化细胞，经过一定时间后衰老死亡，由新细胞分化成熟补充，如上皮细胞、血细胞，构成更新组织的细胞可分为3类：a干细胞，能进行增殖又能进入分化过程。b过渡细胞，来自干细胞，是能伴随细胞分裂趋向成熟的中间细胞，c 成熟细胞，不再分裂，经过一段时间后衰老和死亡。 ②稳定组织细胞：是分化程度较高的组织细胞，功能专一，正常情况下没有明显的衰老现象，细胞分裂少见，但在某些细胞受到破坏丧失时，其余细胞也能进行分裂，以补充失去的细胞，如肝、肾细胞。 ③恒久组织细胞：属高度分化的细胞，个体一生中没有细胞更替，破坏或丧失后不能由这类细胞分裂来补充。如神经细胞，骨骼细胞和心肌细胞。 ④可耗尽组织细胞：如人类的卵巢实质细胞，在一生中逐渐消耗，而不能得到补充，最后消耗殆尽。 细胞的生命周期：连续分裂的细胞，从一次分裂完成时开始到下一次分裂完成时为止。细胞周期包括细胞分裂期和分裂间期（前、中、后、末）。 人体的细胞众多，各自的生活周期都是不一样的。 人体各种细胞的生命周期 据英国《每日邮报》报道，很多人担心衰老，但很少有人意识到，不管你的寿命多长，你身体的某些部分其实只有几周甚至几天的寿命。这是因为它们在不断进行自我更新。以下就是身体各部位的寿命： 1.肠细胞的寿命：2-3天 肠上分布着肠绒毛，这些肠绒毛是小的手指状的触角，可增大表面积帮助肠吸收营养。巴特与伦敦医院的免疫学教授汤姆·麦克唐纳德解释说，它们更新速度极快，每2到3天更新一次。这是因为它们经常暴露在化学物如分解食物的高腐蚀性胃酸中，因此它们通常饱受折磨。肠的其他部分通过一层粘液进行自我保护，虽然这种屏障无法长久抵御胃酸，所以，这些位置的细胞的自我更新频率为3到5天。 2.味蕾细胞的寿命：10天 英国牙医协会的科学顾问达明·维穆斯莱教授解释说，舌头上有大约9000个味蕾，帮助我们感受甜、咸、苦或者酸味。味蕾本身是舌头表面细胞的集合，每个味蕾有大约50个味觉细胞。味蕾一般只需要10天到2周便会自我更新一次。但是，任何引起发炎的因素如感染或者吸烟都会损害味蕾，影响它们的更新，减弱它们的敏感性。 3.肺细胞的寿命：2-3周 英国肺脏基金会副主席基思·普罗斯解释说，肺细胞不断自我更新。但是，肺有不

细胞周期同步化

细胞周期同步化 在细胞培养过程中，细胞多处于不同的细胞周期时相中，其中有少数细胞在进行有丝分裂活动，其余细胞分别处于G1、S和G2各期。不同时相的细胞对药物干预存在不同反应，会影响实验的重复性，因此，需要获得周期一致性的细胞。利用细胞同步化技术可使细胞大量的处于同一细胞时期，并可获得该时期大量的物质，如细胞中期时的染色体。细胞周期同步化(synchronization)是指为了研究某一时相细胞的代谢、增殖、基因表达或凋亡，借助某种自然或人为的实验手段,使细胞群体中处于细胞周期不同时相的细胞停留在同一时相( 除了G0期的细胞)的现象。细胞同步化本质上包括用一定的方法获得一定数量的同步化细胞群和使细胞进入同步化生长的两层含义。 DNA 合成抑制法是通过抑制DNA合成将细胞同步于同一时期的方法。高浓度TdR(胸腺嘧啶核苷)双阻断法是目前常用的抑制DNA 合成的同步化方法。它可逆地抑制DNA 合成，而不影响其他时期细胞的转运，最终可将细胞群阻断在S 期或G1 /S 交界处。其原理是: Td Ｒ是细胞DNA 合成不可缺少的前体，但向培养基中加入过量TdＲ，可形成过量的三磷酸腺苷，后者能反馈抑制其他核苷酸的磷酸化，从而抑制DNA 合成。它将细胞同步于G1 /S期交界处，同步化程度高，适用于任何培养体系，可将几乎所有的细胞同步化，但是容易产生非均衡生长，个别细胞体积增大。TdＲ双阻断法因为简单易行且可逆，在肿瘤药理方面对细胞周期同步化的实验中得到了广泛的应用。羟基脲、5-氟脱氧尿嘧啶、阿糖胞苷、氨甲蝶呤和高浓度ADR、GDR也属于DNA合成抑制剂，它们与TdR作用相似，均可通过抑制DNA合成达到同步化的目的。 中期阻断法是利用破坏微管的药物将细胞阻断在M期从而得到同一时期细胞的方法，常用的药物有秋水仙素等。秋水仙素通过抑制微管的聚合，进而抑制有丝分裂装置的形成，将细胞阻断于有丝分裂中期然后再释放使细胞达到同步化。中期阻断法非平衡生长问题不明显，但可逆性比较差，当阻断时间过长时，许多细胞产生异常分裂。过去研究中也发现，同步后的细胞的生长能力明显不如撤去阻断剂后得到的S期细胞旺盛。秋水仙胺、Nocodazole也是目前常用的中期阻断剂。 经过同步化之后的细胞可以通过流式细胞术对其周期进行分析。将细胞用PI（碘化丙啶）染液进行染色，使用流式细胞仪对细胞内DNA的相对含量进行测定，可分析细胞周期各时相的百分比。由于细胞的DNA含量在不同时期有显著的差异，因此可以将细胞分成