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PLOD3 基因 3

收稿日期:2008-05-14;接受日期:2008-06-05

基金项目:科技部973项目(2007CB947701, 2007CB815705);中科院重要方向项目(KSCX1-YW-R-34);国家自然科学基金(30525028,30630013,

30623007);云南省自然科学基金

*

通讯作者(Corresponding author ),博士生导师,Email: sub@http://www.wendangku.net/doc/ef6f8021ccbff121dd3683ca.html

动 物 学 研 究 2008,Aug. 29(4):363-367 CN 53-1040/Q ISSN 0254-5853 Zoological Research doi:10.3724/SP.J.1141.2008.04363

PLOD3基因3′调控区的人类特异突变改变

miR-124a 对PLOD3的调控

黄 琳1,2,3,张 锐1,2,3,宿 兵1,2,*

(1. 中国科学院昆明动物研究所 遗传资源与进化国家重点实验室,昆明 650223; 2. 中国科学院昆明灵长类研究中心,昆明 650223;

3. 中国科学院研究生院,北京 100049)

摘要:microRNAs(miRNAs)是一类在转录后水平调控基因表达的不编码蛋白质的小RNA(长度20—24个碱基)。其中,miR-124a 是一个在哺乳动物中枢神经系统高度表达的miRNA ,在神经前体细胞向神经元分化的过程中起着举足轻重的作用。由于miRNAs 特异性地识别靶基因的3′端调控区(3′UTR )的靶序列,因此,在人类起源过程中基因3′UTR 的单核苷酸序列变异有可能导致miRNA 调控的改变。通过靶基因预测和3′UTR 区在哺乳动物代表物种间的同源序列比较,我们发现miR-124a 的靶基因中有一个基因(PLOD3)3′UTR 的靶位点中存在人类特异突变位点。利用体外报告基因系统,发现PLOD3基因3′UTR 靶位点中所含的一个人类特异的突变导致miR-124a 对PLOD3的调控效率降低。研究表明,miRNAs 靶基因3′UTR 的序列变异具有功能效应,它有可能是人类中枢神经系统在起源和演化中发挥关键作用的重要遗传机制之一。

关键词:miRNA ;靶位点;人类特异突变;人类大脑进化

中图分类号:Q344;Q522 文献标识码:A 文章编号:0254-5853-(2008)04-0363-05

A Human-specific Mutation Leads to Reduced Interaction Between miR-124a and One of Its Target Genes, PLOD3

HUANG Lin 1,2,3,ZHANG Rui 1,2,3,SU Bing 1,2,*

(1. State Key Laboratory of Genetic Resources and Evolution,,Kunming Institute of Zoology ,the Chinese Academy of Sciences ,Kunming 650223, China ;

2. Kunming Primate Research Center, the Chinese Academy of Sciences, Kunming 650223, China ;

3. Graduate University of the Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China )

Abstract: MicroRNAs (miRNAs )are a class of noncoding RNAs (20-24 n t) that can post-transcriptionally regulate

the expression of protein coding genes in metazoans. Among them, miR-124a, which is preferentially expressed in the brain, controls the neuronal differentiation in mammals. As miRNAs recognize sequences in the 3′ untranslated region (UTR) of the target genes, during human origin, mutations located in the 3′UTRs of the target genes may lead to changes in miRNA regulation. Through target gene prediction and comparative sequence analysis in representative mammalian species, we identified a target gene (PLOD3) of miR-124a, which has a human-specific mutation in the 3′UTR target sequence. Using the in vitro reporter gene system, we discovered that the human specific mutation in the target site of PLOD3 leads to reduced interaction between miR-124a and PLOD3. This result implies that sequence changes located in the 3′UTR segment of the target genes may have functional consequence and eventually contribute to the origin and evolution of human cognition.

Key words: miRNA; Target site; Human specific mutation; Human brain evolution

人类区别于其他动物的最本质特征是其高级的认知能力。即使与其近亲-非人灵长类相比,人也拥有比非人灵长类大好几倍的脑容量和较高的的认知能力。但是目前为止,对人类起源过程中大

脑容量增大及认知能力提高的遗传学机制却知之甚少。一般认为,人类大脑的增大是达尔文正选择的结果。前人的研究也表明几个与大脑发育相关的蛋白质编码基因在人这一支受到了正向选择

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(Zhang,2003;Wang & Su,2004;Wang et al,2005)。同样也有证据表明人类大脑的进化可能是基因表达调控变化的结果(King & Wilson,1975; Hughes,2007)。因此寻找人与非人灵长类大脑表达基因的调控差异或许能够进一步为人与非人灵长类为何有如此巨大的差异提供分子生物学水平上的解释。

microRNAs(或称作miRNAs)是近十几年来发现的一类内源小RNA分子(Lee et al, 1993; Reinhart et al,2000)。它长约20—24碱基,广泛地存在于动植物机体中。在动物中,miRNAs基因最初的转录本(pri-miRNAs)在核内由Rnase III Drosha 酶处理后成为大约70碱基的带有茎环结构的miRNAs前体(Pre-miRNAs),而pre-miRNAs在核膜上一种转运蛋白Exportin-5的帮助下转运到细胞核外,之后再由胞质RNaseIII Dicer酶进行处理,酶切后成为成熟的miRNAs。成熟的miRNAs与miRNP核蛋白体复合物结合,通过与mRNA的3′端序列互补识别靶mRNAs,从而调控靶基因的表达(Bartel, 2004)。根据miRNAs与靶位点的互补程度的不同(完全互补或部分互补),miRNAs可以通过部分降解靶mRNA或者抑制靶mRNA的翻译来调控基因的表达(Wightman et al,1993;Bartel,2004;Yekta et al,2004;Lim et al,2005)。目前的研究表明miRNAs在胚胎早期发育、细胞代谢、细胞分化和生长、调亡和免疫反应等过程中,都起着举足轻重的作用(Ambros, 2003;Carrington & Ambros;2003; Xu et al,2003;Johnson et al,2005)。近年来,几个不同的研究小组用克隆的方法分离出大量大脑表达的miRNAs, 并发现不同miRNAs的表达量在大脑发育过程中有显著的变化,这暗示miRNAs可能参与大脑的发育调控(Lagos-Quintana et al,2002;Dostie et al,2003;Krichevsky et al,2003)。Berezikov et al (2006)利用小RNA文库测序的方法比较人和黑猩猩中大脑表达的miRNAs,他们发现即使和人的近亲相比,也存在人特异的miRNAs,这个结果暗示miRNAs可能参与人类大脑的进化。

miR-124a是一个在大脑高度表达的miRNA,在大脑的神经发生过程中表达量大幅度上升(Krichevsky et al,2003)。研究表明miR-124a可以促进神经前体细胞向神经元分化(Conaco et al,2006)。这些结果表明miR-124a在大脑的发育过程中发挥很重要的作用。Lim et al (2005)的研究结果表明,在Hela细胞中过量表达miR-124a可以使数百个基因的表达量降低。通过生物信息学手段的分析,大部分下调的基因都含有潜在的miR-124a的靶位点,并且这些基因在大脑都是低表达的。这提示miR-124a可能在体内也能够下调这些基因的表达。所以,如果miR-124a与其靶基因的调控模式在人类进化中发生了变化,可能会影响人类大脑的进化。因为与大部分的miRNAs一样,miR-124a 在种间非常保守,从啮齿类到灵长类,成熟的miR-124a没有发生任何改变(Kim, 2005)。因此,本研究主要关注其靶基因的靶位点是否发生人类特异的变异,从而可能导致不同灵长类物种基因表达水平的差异,并进一步引起表型变化。运用生物信息学的方法,我们分析了miR-124a的一个靶基因:PLOD3。分析结果表明,PLOD3的靶位点存在人特异的突变。进一步的体外实验证明,此位点的突变可导致miR-124a对PLOD3的调控效率降低。

1材料和方法

1.1靶位点及人类特有突变基因的寻找

利用Miranda软件预测Lim报道的表达受miR-124a调控的基因是否拥有对应的靶位点(Enright et al,2003; Lim et al,2005)。对应基因的3′UTR序列从Ensemble的Biomart中下载。miranda 的几个参数设定为:score 80,energy-17,shuffle。利用UCSC两物种全基因组比对文件,将预测到的靶位点在黑猩猩、猕猴、小鼠和狗的基因组的直系同源区域截取相应序列进行比对,最后选取靶位点中含有人特异突变位点的基因为候选基因。

1.2荧光素酶报告基因载体的构建

利用PCR方法扩增候选基因的人和黑猩猩的3′UTR序列(序列长度:CHSY1:1383b p;PLOD3:298b p)。引物序列如下:CHSY1:TTAAGATCTACT- CCTTTAAGATTGAGC/GTATCTAGATGGCAAGT CTATCACTGTTT;PLOD3:CACAGATCTACTCT- GCCAAACCTGCCC/CTTTCTAGATGTCCTTTATT CAGAGTGAGG。正向引物添加BglII(AGATCT)酶切位点和3个保护碱基,反向引物添加Xba I (TCTAGA)酶切位点和3个保护碱基。扩增产物用华舜DNA纯化试剂盒纯化,纯化产物进行Bgl II 和Xba I双酶切。纯化后的酶切产物连接pCS-Firefly荧光报告载体,4℃连接过夜,转化感受态细胞并涂板。挑取单克隆进行PCR及测序鉴定。阳性克隆用QIAgen小量质粒抽提试剂盒抽提质粒以备转染。

1.3 miRNA的化学合成

4期黄琳等:PLOD3基因3′调控区的人类特异突变改变miR-124a对PLOD3的调控 365

我们根据成熟miR-124a的序列设计miR-124a 双链(Lim et al,2005),再向上海吉玛生物有限公司订购。设计的原则是miR-124a双链的正义链5′端的碱基对结合率要比3′端低,这样才能保证miR-124a而非互补链进入RISC复合物发生作用(Schwarz et al,2003)。对照小RNA是由公司提供的对基因表达没有影响的小RNA。

miR-124a双链为:

UAAGGCACGCGGUGAAUGCCA/GCAUUC ACCGCGUGCCUUAAU

对照小RNA双链:

UUCUCCGAACGU GUCACG UTT/ACGUG- ACACGUUCGGAGAATT

1.4细胞培养及细胞转染

选取293T细胞系进行培养及细胞转染实验。细胞培养于含有10%胎牛血清(FBS)的合成培养基(DMEM)中,并在5% CO2以及37℃培养箱中培养。

细胞长势良好时可进行转染。转染前一天将细胞传代于24孔板中,控制细胞密度在30%-40%左右。转染时胞密度达到70%-80%。使用lipofectamine 2000试剂盒并按照其说明进行转染。简而言之,我们将含有miR-124a,带有对应3′UTR 的Firefly质粒和pTK-Renilla (Promega)质粒共转细胞系。每孔按siRNA 20μmoL,Firefly质粒100n g,Renilla 200n g进行转染。每个转染实验至少做3次重复。

1.5细胞收集及双荧光素酶活性的检测

转染细胞后36-48h内收集细胞。使用Promega公司的双荧光素酶检测试剂盒进行双荧光检测。Firefly的荧光读数和Renilla的荧光读数的比值作为最终荧光素酶的相对活性。

2结果和讨论

利用Miranda软件(Enright et al,2003),我们预测到6个表达下调的基因含有miR-124a的靶位点。进一步序列分析发现其中两个基因(CHSY1和PLOD3)的靶位点含有人类特异的突变(图1)。所以我们选择这两个基因进行后续的实验分析。首先我们用双荧光报告系统验证CHSY1和PLOD3是否是miR-124a的真实靶基因。将两个基因人的3′UTR 接入荧光素酶质粒中并分别与miR-124a共同转染293T细胞系。我们的结果显示与miR-124a共转时,含有PLOD3 基因3′UTR的荧光素酶的相对表达活性显著的低于与对照siRNA共转时的荧光素酶相对表达活性(P=0.001,t检验)。但CHSY1的结果不显著(P=0.1,t检验)(图2)。此结果表明,PLOD3是miR-124a的靶基因。

为了进一步证明PLOD3靶位点上的人类特异突变位点是否能够影响miR-124a对其调控的效率。我们将人和黑猩猩PLOD3基因的3′UTR分别接入荧光素酶质粒中并分别与miR-124a共转。另一方面,因为在用荧光报告系统检测CHSY1是否为miR-124a的真实靶基因时,我们只检测了包含人3′UTR的荧光素酶质粒,为了排除因为人类特异突变而使得miR-124a失去了对人CHSY1基因的表达调控作用的可能性。我们对人和黑猩猩CHSY1基因的3′UTR进行了与PLOD3基因相同的处理。转染结果表明:对于PLOD3基因,含有人3′UTR的荧光素酶相对表达活性明显高于含有黑猩猩3′UTR 荧光素酶的相对表达活性(图3)。这表明miR-124a 对人和黑猩猩PLOD3的表达调控效率不同。而对

PLOD3 基因 3

PLOD3 基因 3

图 1 CHSY1和PLOD3基因中可能的miR-124a靶位点区域不同物种的比较

Fig. 1 Alignment of the potential miR-124a target site regions in PLOD3 and CHSY1 genes among representative mammalian species

人特异突变在图中用阴影标明(the human specific mutations are highlighted)。

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PLOD3 基因 3

图 2 miR-124a 可显著抑制携带人PLOD3基因3′UTR 的

报告基因的表达(P =0.001,t 检验),而对携带CHSY1 基因3′UTR 的报告基因的抑制作用不明显(P =0.1, t 检验)

Fig. 2 miR-124a repressed the expression of the reporter

gene bearing the 3′UTR of PLOD3 (P =0.001,t test) but not CHSY1 (P =0.1,t

test)

PLOD3 基因 3

图 3 miR-124a 对含有人和黑猩猩的PLOD3基因(A )

和CHSY1基因(B )3′UTR 的报告基因抑制作用 的比较

Fig. 3 Comparison of the inhibitory effect of miR-124a on

the expression of the reporter genes bearing the 3′UTR segment from human or chimpanzee PLOD3 (A) and CHSY1(B) genes

*,差异显著(P =0.001, t 检验)。

Asterisk denotes significant difference (P =0.001, t test).

于CHSY1基因,人和黑猩猩两个荧光素酶质粒的相对表达活性没有明显的区别(图3)。结合前面的试验结果(图2),我们认为CHSY1不是miR-124a 真正的靶基因(图2)。在PLOD3基因的靶位点中,从黑猩猩到人类有一个从G 到T 的突变,从而使靶位点与miR-124a 的结合中的CG 结合变成了CU 结合(图1),因此降低了miR-124a 与靶位点的结合

稳定性,进而降低了miR-124a 对基因表达的抑制

作用,因而含有人3′UTR 的荧光素酶相对表达活性高于含有黑猩猩3′UTR 荧光素酶的相对表达活性。而在CHSY1基因的靶位点中虽然有两个人特异突变,一个是从T 到G 的突变,使得原来的CU 结合变成了CG 结合;另一个是从A 到G 的突变,使得原来的GA 结合变成了GG 结合(图1)。但是我们的实验结果表明miR-124a 对CHSY1的表达并没有调控作用,也就是说CHSY1并不是miR-124a 的真实靶基因。因而所预测的靶位点也不是真实的靶位点,所以即使有人特异的突变并也不会带来表达调控的改变。Lim et al (2005)的研究表明miR-124a 对CHSY1的表达有调控作用,这可能是因为CHSY1是miR-124a 靶基因的一个下游基因,miR-124a 通过调控靶基因的表达而调控CHSY1的表达。

PLOD3,也称为LH3,是赖氨酸羟基化酶的三个异构体之一,能够催化胶原蛋白中的赖氨酸残基进行羟基化;此外,研究表明PLOD3还具有半乳糖羟赖氨酸葡基转移酶活性,能够将葡萄糖基加到胶原蛋白的半乳糖羟赖氨酸残基上。由此可知PLOD3对胶原蛋白的合成及修饰有着极为重要的作用(Heikkinen et al ,1994;Valtavaara et al ,1998)。胶原蛋白参与了众多生理过程:首先它能够做为脚架蛋白支撑固定细胞,促进细胞间的连接及细胞的迁移等。也有证据表明胶原蛋白能够直接作为酪氨酸蛋白激酶受体的配体,从而介导一系列蛋白的磷酸化(Shrivastava et al ,1997;V ogel et al ,1997)。作为参与胶原蛋白合成和修饰的蛋白,PLOD3也间接参与了这些生理过程。PLOD3是一个广泛表达的基因,在体内的分布极广(Valtavaara et al ,1998;Mercer et al ,2003)。原位杂交的结果表明PLOD3在大脑中也是广泛表达的,尤其是在大脑皮层和海马中表达量较高(Visel et al ,2004)。值得关注的是,miR-124a 也被观察到在大脑皮层表达。这表明miR-124a 在大脑内确实调控PLOD3的表达。

虽然PLOD3在大脑发育过程中的功能和作用需要进一步的研究。我们的结果表明PLOD3靶位点上一个人特异的突变能够使miR-124a 对PLOD3基因的表达调控效率发生改变。该表达调控效率的改变可能对人类大脑进化产生影响。当然,在PLOD3基因的整个3′UTR 序列中,人与黑猩猩相比总共有三个突变位点。因为我们没有做靶位点的回复突变,所以不能完全排除表达差异是由于其他

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两个突变位点引起的可能性,尽管理论上这样的可能性很小,因为整个PLOD3的3′UTR只含有一个预测的靶位点,而另外两个突变位点不在靶序列区。此外,体内的表达调控是否真的发生了改变以及改变怎样影响大脑的进化尚需进一步的工作来验证。

致谢:感谢本实验室实验员张慧提供的技术支持。

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