实验四 红霉素的摇瓶发酵
实验四红霉素的摇瓶发酵
一、目的要求
1. 掌握微生物发酵的基本流程和技术。
2. 掌握红霉素发酵过程。
3. 学习计算红霉素的浓度及分析影响发酵结果的因素。
二、基本原理
1. 红霉素结构式：
柠檬酸分子式：C37H67NO13，分子量：733.93
2. 红霉素为大环内酯类抗生素，抗菌谱与青霉素近似，对革兰阳性菌，如葡萄球菌、化脓性链球菌、绿色链球菌、肺炎链球菌、粪链球菌、溶血性链球菌、梭状芽孢杆菌等有较强的抑制作用。对革兰阴性菌，如淋球菌、螺旋杆菌、百日咳杆菌、布氏杆菌、军团菌、脑膜炎双球菌以及流感嗜血杆菌、拟杆菌、部分痢疾杆菌及大肠杆菌等也有一定的抑制作用。作用机制主要是与核糖核蛋白体的50S亚单位相结合，抑制肽酰基转移酶，影响核糖核蛋白体的移位过程，妨碍肽链增长，抑制细菌蛋白质的合成，系抑菌剂。
红霉素的生物效价测定原理：红霉素的生物测定是用杯碟法，利用抗菌素在琼脂培养基内的扩散渗透作用，将已知效价的标准溶液与未知效价的样品溶液，在同样的条件下，在涂布有高度敏感型的试验菌株培养基上，进行对照培养。培养一定时间后，在抗菌素到达的适应浓度范围内，产生透明圈，比较两者抑菌圈的大小，利用图表法对算出未知抗菌素的效价。敏感菌：葡萄球菌等革兰氏阳性菌株。
三、实验材料
1．菌种红霉素链霉菌，金黄色葡萄球菌
2．实验器材
1 mol/L NaOH；1 mol/L HCl
50 mL无菌生理盐水、10mL 、5mL吸管、接种环；
酒精灯，滤纸，漏斗，250 mL三角瓶，200ml量筒，广范pH试纸，玻璃棒，滴管，天平，分光光度计等。
3.种子培养基：可溶性淀粉3.5%，硫酸铵0.75%，氯化钠0.5%，磷酸氢二钾0.08%，蛋白胨0.5%，糊精2%，葡萄糖3%，酵母粉2%，碳酸钙0.8%，硫酸镁0.05%，pH 7.5；
4. 发酵培养基：可溶性淀粉3%，硫酸铵0.5%，糊精1.5%，葡萄糖2%，玉米浆0.1%，碳酸钙
0.9%，豆油0.3 ml/75ml，pH 7.5。
四、实验步骤（实验内容）
1．菌种活化：
菌种活化：对于已长久保存的菌种，需经斜面培养基活化培养一次，即取保存的斜面菌种红霉素链霉菌，移至种子斜面，经34℃斜面培养5 d至孢子长好，作为活化后的种子。
2. 斜面种子的制备：取活化好的斜面菌种，无菌操作（不要在无菌室），取5 ml无菌水至种子斜面，用接种环轻轻刮下孢子，轻轻振荡制成孢子悬浮液。
3. 摇瓶种子液的制备：将孢子悬浮液接入1瓶无菌的液体种子培养基，34℃摇床培养3 d，摇床
转速为160 rpm。制成种子液。
4．发酵：无菌操作（不要在无菌室），取发酵培养基（液）3瓶，按10%的接种量，接入种子液。摇床转速160 rpm，31℃摇床培养2 d，另1瓶不接种留作对照。观察发酵过程中pH，OD，DNS的变化并记录。
5．发酵液预处理
取发酵液经过滤，除菌丝体，取滤液。
6. 效价测定
标准曲线法：
（1）倒平板：将LB琼脂培养基熔化后，倒平板，每个倒15 mL；
（2）涂平板：无菌操作吸取37℃培养了18 h的0.1 mL金黄色葡萄球菌菌液加入到上述平板，用无菌三角涂棒涂布均匀。
（3）标记：将上述平板皿底用记号笔分成4-6等份，分别标明红霉素标准浓度（1.5×10-4、1.5×10-5、1.5×10-6、1.5×10-7、1.5×10-8mg/mL）。
（4）贴滤纸片：无菌操作，用镊子取无菌滤纸片分别浸入5种不同浓度（（1.5×10-4、1.5×10-5、1.5×10-6、1.5×10-7、1.5×10-8mg/mL）的红霉素溶液中，在容器内沥干余液，再将滤纸片分别贴在平板上相应位置，在平板中央贴上浸有发酵液滤液的滤纸。平行做3个培养面。
（5）培养、观察：将上述平板倒置于37℃，培养24 h，观察并记录抑菌圈的大小，并计算红霉素发酵液的浓度
五、实验结果与与讨论
1．根据该实验，查阅资料，写出一种适合该发酵液中红霉素提取的实验方案。
2．记录0，12，24，36，48，各时间段，pH、OD，DNS值，分别以表格和图形形式表示。并对菌种产红霉素的能力进行评定。
3．如何进行红霉素的定性分析？
发酵技术汇编 发酵人论坛精华荟萃 编制说明 摇瓶与发酵 论坛帖子讲解 下期内容计划
编者：细履平沙信箱：biowsxycc@https://www.wendangku.net/doc/e818485026.html, 编制说明： 首先，感谢全体发酵人网站会员发得精彩贴子，使我们能够将很多优秀的经验进行汇总、整理、提炼然后编辑成文章。我们希望通过这一整理过程，将发酵人论坛的精华与所有已经加入或意愿加入发酵行业的朋友分享，这一整理过程能够将这一个个珍珠，串成串，形成一个美丽的珍珠项链，能够将一个个知识点汇总起来，整理成册，编著成如《抗生素生产一万个为什么》一样，成为发酵从业人员的宝典。 本网站的域名为：https://www.wendangku.net/doc/e818485026.html,，欢迎大家来这里深入交流发酵相关的经验和技能。 发酵人网站由王军峰先生于2006年8月8日创建，经过8年的发展目前也初具规模，在发酵行业有了一定的影响，论坛成立后也经历风雨：有服务器的不给力，导致丢失了很多附件和数据，有黑客的攻击和水军的骚扰，也有关站备案的考验。但是还是得到了广大会员的信赖和支持，在这里我代理发酵人论坛的管理人员向支持我们的朋友说声感谢。 目前，我们的网站虽处于低谷，但是我相信，只要有长期发展的信念，只要发酵从业人员有需求，我们的网站就可以稳步发展，发酵人网站就可以为同行提供更多、更实际的技术帮助。 前几天与中国发酵工业网（https://www.wendangku.net/doc/e818485026.html,）的负责人吕望东一起讨论发酵网站的前途和管理时，他问我：目前微信，微博，QQ，手机交流越来越多，论坛是否还有必要存在？我想，现在也到了我们众多小网站选择前行还是关闭的关键点，成功总是留给有
准备的人，所以如果没有好的思路、没有创新，向前发展的路只能越走越窄。经过我们深入的讨论，决定充分发挥发酵人网站已有资源，深入挖掘论坛在期刊发行，技术交流会组织，软件使用与仪器操作培训的先天优势，引导论坛恢复良性发展的循环。 所以我们决定采取以下改进和探索： 1，与中国发酵工业网加强合作，将发酵人论坛的广告业务交由吕望东先生来负责。发酵人论坛将通过整合发酵行业网站，结合线上，线下活动，给有贡献会员和版主提供更多的才华施展舞台，让会员与论坛共同发展。 2，发酵人论坛会定期对会员发的精华贴进行整理，然后发行《发酵技术汇编》电子月刊，以便发酵人论坛和中国发酵工业网的忠实用户共同分享。 3，定期组织会员见面会，我们计划每次只针对某一专项问题进行系统性讲座和讨论，从而扩大论坛的影响。讲座只会象征性的收费，以便付给主讲一些补贴和用于场地使用费。比如我们可以用2天时间，培训design expert 的详细用法，使一个不善于进行试验设计和数据处理的人员，快速掌握这些技能。 4，我们将招聘更多有经验的会员当版主，调动整个论坛的学术气氛，当然我们会热忱欢迎广大朋友为我们提供更多建议和指导。 本次内容作为网站知识汇总的第一期：摇瓶试验与发酵。
3本课题为陕西省科委重大攻关项目(96K12-G11);陕西省教委重点项目(97J ZK09)。其它工作人员:张 莉,李宝璋,杨隧东。收稿日期:1997212229,修回日期:1998207215。 红霉素发酵工艺优化研究3 范代娣1 陈 斌1 尚龙安1 沈立新1 孙建敏2 1 (西北大学化工系 西安 710069) 2 (西安制药厂 西安 710077) 摘 要 通过摇瓶正交实验,得出7种营养成分对红霉素生物合成的影响程度,对发酵工艺条件进行了优化研究,找到了红色链霉菌抗噬菌体68#菌种生长的优化组合,得出快速碳源 (葡萄糖)与慢速碳源(淀粉)配比为2164时,有利于红霉素的生物合成。还原糖/氮为20,总 糖/氮为80～120时对红霉素发酵极为有利。借助磷酸三钙、沸石对NH +4的独特吸附和释放作用,将二者按5∶1混合配成吸附和吐纳效果很好的捕集剂,对发酵液中游离无机氮源进行控制,可使抗生素生物合成提高15%～29%。关键词 红霉素,发酵工艺参数,优化 分类号 Q 1939197 文献标识码 A 文章编号 100023061(1999)0120104208 红霉素属大环内脂类抗生素,它的抗菌谱和青霉素G 相似,特别对革兰氏阳性细菌、 抗酸杆菌、立克次氏体及大病毒有抗菌活性,是治疗耐药性金黄色葡萄球菌感染和溶血性链球菌感染所引起疾病的首选药物,临床上可用于对青霉素过敏的患者。我国红霉素发酵水平与发达国家相比差距很大,属低水平重复操作,美国亚培公司年生产红霉素能力为2000t ,而我国红霉素年产量仅为200t [1],国外发酵单位已达8000～12000u/mL [2],生产 利润极少,但由于红霉素衍生物的不断涌现及人们对红霉素药理作用的重新认识,尤其是在医药行业被誉为“重磅炸弹”的红霉素衍生物,克拉霉素、阿齐霉素的兴起,更加剧了母体红霉素的供需矛盾。 本研究旨在利用具有抗噬特性的68#菌种作为研究对象对其工艺进行优化研究。不仅具有重要理论价值,而且具有明显的经济效益。 1 材料和方法 111 菌种 采用西安制药厂68#抗噬菌株。112 种子培养基 培养基组成淀粉315g ,黄豆饼粉117g ,玉米浆019g ,花生饼粉115g ,葡萄糖315g 。 蛋白胨113g ,硫酸铵016g ,磷酸二氢钾0115g ,酵母粉015g ,用自来水定容到100mL 。 15卷1期1999年1月 生 物 工 程 学 报 Chinese Journal of Biotechnology Vol.15No.1 January 1999
2020 实验报告发酵现象实验报告范文 _0613 EDUCATION WORD
实验报告发酵现象实验报告范文_0613 前言语料：温馨提醒，教育，就是实现上述社会功能的最重要的一个独立出来的过程。其目的，就是把之前无数个人有价值的观察、体验、思考中的精华，以浓缩、系统化、易于理解记忆掌握的方式，传递给当下的无数个人，让个人从中获益，丰富自己的人生体验，也支撑整个社会的运作和发展。 本文内容如下：【下载该文档后使用Word打开】 澄清的石灰水可以检测气体中有二氧化碳，重铬酸钾溶液遇到酒精由橙色变为灰绿色。实验操作： 1.将（100ml）40℃温水倒入锥形瓶，再用汤匙将一大勺糖及适量干酵母加进来，搅拌均匀后，将锥形瓶放在大烧杯中水浴保温温度保持在30―40℃左右。（先让酵母菌进行有氧呼吸，是酵母菌迅速繁殖，并把葡萄糖分解成二氧化碳和水。） 2.观察到酵母菌培养液有气泡产生，塞上橡胶塞（这样做既可以避免气体散失，影响后面实验效果，也为酒精的产生提供保障）。过一段时间后就可看到干瘪的气球慢慢膨胀起来了。（酵母菌的无氧呼吸） 3.将夹子打开，挤压气球，使瓶内产生的气体徐徐通过胶管导入试管内的澄清石灰水中，石灰水变浑浊了(检测气体中有二氧化碳。原理：二氧化碳遇石灰水，石灰水变浑浊)。
4.将重铬酸钾试剂分别滴在比色板的凹槽内，并分别标注1号、2号（作对照）、3号。在3号试剂上滴1滴酒精，在1号试剂上滴1滴酵母菌发酵液。发现1号和3号都由橙色变成了灰绿色。 通过上述实验，让我们对酵母菌“发酵现象”所需要的原料、条件及产生的物质都有了较直观的感受，比较容易理解课本上阐述的“酵母菌可以把葡萄糖转化为酒精和二氧化碳”等有关内容，而且印象深刻。使我们养成很好的节约意识。 1.闻到了发酵后特殊的甜酒的芳香气味。 2.详见【实验操作4】 3.澄清的石灰水变浑浊 实验一摇瓶发酵法制备糖化酶 （1）掌握摇床发酵法制备糖化酶的工艺流程及操作方法 （2）了解利用黑曲霉菌菌种发酵时的生长条件及注意事项 （3）熟练掌握实验过程中的无菌操作和培养条件的选择 菌种：黑曲霉 仪器：锥形瓶（500ml)、移液管、恒温水浴锅、秒表、50mL 比色管、牛皮纸、纱布（8层）、pH计。 药品：三水乙酸钠、冰醋酸、硫代硫酸钠、碘、氢氧化钠、硫酸、可溶性淀粉、玉米粉、豆饼粉、麸皮
摇瓶发酵优化——正交实验实验方案 实验内容：运用实验室摇瓶发酵技术，研究不同的镁盐、钾盐、钠盐及碳源用量对铜绿 假单胞菌摇瓶发酵的影响。 实验材料：铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa 仪器设备：超净工作台；高压蒸汽灭菌锅；旋转式摇床；磁力搅拌器；纯水机；三角摇 瓶；三角瓶封口膜；塑料培养瓶；1mL和5mL移液枪；酒精灯；电子天平；药匙；1000mL 烧杯；玻璃棒等。 试剂耗材：蛋白胨；牛肉膏；NaCl；NaNO3；K2HPO4;KH2PO4；MgSO4;CaCl2;KCl；NaCl；酵母粉；大豆油。 实验因素和水平：本实验研究镁盐、钾盐、钠盐及碳源用量四个因素及不同用量三个水平。 MgSO4(g/L) KCl(g/L) NaCl(g/L) 大豆油（mL）因素 水平 1 0.1 1 1 0 2 0.2 2 5 0.3 3 0.3 3 10 0.9 L9（3 4）正交表 实验数因素 MgSO4 KCl NaCl 大豆油实验结果 1 0.1 1 1 0 2 0.1 2 5 0.3 3 0.1 3 10 0.9 4 0.2 1 5 0.9 5 0.2 2 10 0 6 0.2 3 1 0.3 7 0.3 1 10 0.3
8 0.3 2 1 0.9 9 0.3 3 5 0 均值1 均值2 均值3 极差 具体实验方法： 1、种子培养基及母液的配制 种子培养基（g/L）:蛋白胨10 , 牛肉膏10 , NaCl 5, pH7.0 按种子培养基配方配制100mL培养基装入250mL三角烧瓶，塞上瓶塞。（50mL/瓶，2瓶） 母液：各1000mL，于试剂瓶中。 K2HPO4 40g/L KH2PO4 40g/L MgSO4 20h/L CaCl2 1g//L KCl 10g/L 共9个实验，为简便起见，只做2个平行，共18个摇瓶，每个摇瓶装液量30mL，共540mL，考虑到分装时的损耗，可以配600mL含共有成分的培养基。 2、器具及种子培养基高压蒸汽灭菌 培养皿、接种针和移液管用报纸包好，和配好的种子培养基一起高压蒸汽灭菌，121℃，20min. 3、菌种的活化 将种子培养基分装于塑料培养瓶中，将铜绿假单胞菌从冰箱中取出，在超净工作台上，用接种针接种于种子培养基中，使其活化。 4、按预定方案配制培养基 发酵培养基（g/L）:NaNO3 2.5, K2HPO4 4, KH2PO4 4, MgSO4 0.2, CaCl2 0.1 ,KCl 1, NaCl 1, 酵母粉1，炸货油5%，pH6.5 按发酵培养基的配方，结合正交表，配制相应的发酵培养基各200mL，然后分装于150mL
红霉素生产菌种与工艺技术 红霉素(Erythromycin)系由链霉菌Stretomyces erythreus所产生的14元环 的大内酯类抗生素。红霉素属抑菌剂，抗菌谱与青霉素相似但略广。对G菌有强大抗菌作用，对部分G菌、立壳次体、支原体、衣原体、螺旋体也有较强的抑制作用。主要作用于敏感细菌所致的呼吸道感染、金葡菌性皮肤感染、支原体肺炎、砂眼表原体引起的结膜炎等等．是治疗军团菌最有效的首选药。红霉素与口一内酰胺类抗生素一般无交叉耐药性。它与机体免疫系统之间存在着协同作用的关系，这对于免疫功能低下的病人具有特别重要的意义。因此，对红霉素的研究再次引起重视并趋活跃。 目前红霉素研究的重点大多集中在红霉素分子中去氧氨基乙糖上，先后制备出红霉索的乳糖酸、葡庚酸盐、硬脂酸盐、依托红霉索、琥乙红霉素等各种盐和酯类，这些衍生物便于口服或注射，已应用于临床。近年来，罗红霉素、阿齐霉素、克拉霉素、地红霉素．氟红霉素、氮红霉素等一系列新的红霉素衍生物相继研制成功。红霉素类抗生素新品种拓展丁抗菌谱和杀菌能力，增强了耐酸性和生物利用度，延长了药物半衰期，减少了服用剂量和给药次数，降低了不良反应发生率，因而受到广大医生和患者的普遍欢迎。随着人们对红霉素药物研究的进展以及降低医药费用呼声的增强，红霉素类药物在临床应用的地位也将得到重新评估，其市场前景较为乐观。 从目前厂家格局来看，产业链完整的企业还是有优势，硫氰酸红霉素生产企业中，宁夏启元和宜都东阳光两家企业可生产硫氰酸红霉素、红霉素碱、阿奇霉素等。在上游中间体紧张的情况下，产业链完善的企业在成本上有一定的优势。据了解，宁夏启元的阿奇霉素已计划生产，但是产品还没出来。而像硫氰酸红霉素的二线生产企业河南华星、岳阳同联等也都没货。预计，大环内酯类原料短期内价格依然坚挺，该行情可能要持续要下半年。当前硫氰酸红霉素成交价格在410-430元/kg；阿奇霉素的价格已接近1300元/kg。造成目前的主要原因：1、在阿奇、克拉、罗红等产品涨价之前，有客户提前下订单预计；加上是需求旺季，客户用量也不断增加，造成供不应求。2、硫氰酸红霉素国内及出口畅销，仍然满足不了需求，但硫氰酸红霉素国内价格还是稳在370-380元/kg左右。 技术指标：
一) 摇瓶培养 摇瓶培养技术问世于本世纪30年代，由于其简便、实用，很快便被发展成为微生物培养中极重要的技术而普及，并广泛用于工业微生物菌种筛选、实验室大规模发酵试验、种子培养等。 摇瓶培养设备主要有旋转式摇床和往复式摇床两种类型，也有旋转式和往复式的混合类型，其中以旋转式最为常用。用旋转式摇床进行微生物振荡培养时，固定在摇床上的三角烧瓶随摇床以200～250r/min的速度运动，由此带动培养物围绕着三角烧瓶的内壁平稳地运动。在用往复式摇床进行振荡培养时，培养物被前后抛掷，引起较为剧烈的搅拌和撞击。振荡培养中所使用的发酵容器通常为三角烧瓶，也有使用特殊类型的烧瓶或试管。在振荡培养过程中所采用的烧瓶类型和振荡类型主要取决于所要研究的发酵类型及性质。振荡培养通常用于有氧过程中，主要是两种类型：(1) 供氧相对较大，以产生大量的细胞，常见于丝状微生物(如食用菌、放线菌)中; (2) 需供氧但所需供氧量较小，常见于细菌。要获得高氧供应，可在较大的烧瓶(250～500ml三角烧瓶) 中盛装相对较小容积的培养基，由此可获得更高的氧传递速率，便于细胞的迅速生长，要获得较低的氧供，则采用较慢的振荡速度和相对大的培养体积。经连续振荡培养一段时间后，细菌等单细胞微生物可以呈均一的细胞悬液; 而丝状真菌和放线菌，可得到纤维糊状培养物——纸浆状生长。如果振荡不足，则会形成许多球状菌团——颗粒状生长。 振荡培养技术通常用于微生物菌种的筛选或生产工艺的改良和工艺参数的优化。因此，通常使用复合培养基。用于振荡培养的复合培养基通常由碳水化合物及多种蛋白质性物质(玉米上清、大豆粉、豌豆粉等) 及植物油组成。这些培养基组分以不同的速率被代谢掉，从而为微生物提供一较长的、最适生长和代谢的条件。在复合培养基中通常还加入一些固体物质如石膏(CaCO3)，以协助培养基pH的控制并有利于絮凝物的形成，此在啤酒工艺中特别重要。此外，经过精心设计的化学限定性培养基(避免pH 波动及防止重要培养基组分的突然耗尽)也可用于振荡培养，这类培养基的组成通常是蔗糖加酒石酸盐、铵盐、磷酸盐、金属盐类以及生长因子。 1. 摇瓶培养方法在浸没培养过程中振荡的目的在于改善活细胞的氧气和营养物的供给。摇瓶培养通常以特定生长条件下的培养物接种，也可用孢子接种。在绝大多数情况下，摇瓶接种量有一最佳浓度，此在摇瓶开始之前，必须通过预试加以确定。而在整个摇瓶发酵过程中保持相对无菌是成功地实施这项技术的必要保证。 摇瓶培养的机械装置主要由用于放置和固定烧瓶的平台以及牵引其运转的马达和运转系统组成，摇瓶需安装于有维持恒温和恒湿自动调节能力的隔热室内。目前也有具备恒温装置的小型台式摇床。考察摇床的设计和使用性能主要从下列几项入手：(1) 所使用的设备，(2) 平衡要求，(3) 摇床的大小、型号，(4) 培养条件及恒温调控，(5) 试管或小型发酵器的振荡培养性能。 通常，摇床的工作温度为25～37℃。由于电机和机械传动部分的产热、振荡产热和微生物生长代谢释放的热能，使摇瓶中培养基的实际温度要比实际室温高2℃左右，且在强烈振荡时，此温差更为明显。因此，在实验过程中设计高温点时必须认真注意到这一问题。另外，由于夏季气温偏高，温控困难随之增大; 培养放线菌和真菌时温控更为主要，因为大部分放线菌和真菌在30℃下培养时，其代谢已被严重干扰，而30℃的温度在摇瓶中是极易形成的。因此，在摇床室中必须装配一个可靠的致冷系统。一般台式摇床都有一通过空气循环或水浴来保持恒温的装置，可使所有的摇瓶内培养基温度处于同一水平。 振荡培养所用的发酵容器也可选用试管。所选用的试管大小可根据需要来定。将盛有一定体积的培养基的试管倾斜固定在支架上，倾斜角度一般为15～30°，倾斜方向与振荡方向一致。试管随摇床平台作旋转式或往复式运动。用试管作发酵容器的优点在于在较小的空间范围内一次可处理较大的试样数。但其效率远不如三角烧瓶。因此，在通常情况下更多的是选择25～50ml小烧瓶。同样，
2010级发酵大实验（1） 实验报告 任课老师： 姓名： 专业：生物技术 班级： 学号： 日期：2013年6月
实验报告 一、目的要求： 了解筛菌的基本操作，包括：培养基配制，灭菌，接种，涂板，摇菌，紫外分光光度计的使用等。 二、实验材料 1、菌种来源：英语公园葡萄树下土壤和生物学院院楼门口土样。 2、培养基： （1）淀粉液体培养基：可溶性淀粉1%、蛋白胨1% 、葡萄糖0. 5%、NaCl 0. 5%、牛肉膏0. 5% （2）淀粉固体培养基: 可溶性淀粉1%、蛋白胨1% 、葡萄糖0. 5%、NaCl 0. 5%、牛肉膏0. 5%、琼脂粉1.5% 。 3、器皿：试管，量筒，烧杯，移液管，培养皿，洗耳球，玻璃棒，酒精灯，接菌环，三角瓶，玻璃棒等。 4、仪器：高压蒸汽灭菌锅，水浴锅，恒温培养箱，摇床，天平、紫外可见分光光度计等。 5、试剂：1%碘液、1M NaOH、DNS、pH 5.6 0.05M 乙酸/乙酸钠缓冲液、1%淀粉溶液、1mg/mL的麦芽糖，结晶紫溶液。 6、其他：封口膜、纱布，棉花，试管架等。 三、实验步骤： 1、初筛： （1）配制培养基：按照上述培养基成分及数量称取各物质，放入三角瓶中，加水到100ml，包扎。和包扎好的试管、移液管、涂布器、培养皿等一起放入灭菌锅中121℃高压灭菌20min。然后干燥后使用。 （2）倒平板：把培养基置于无菌工作台上，待冷却到55℃左右后，倒入灭菌后的平板中，每个平板中约15-20ml，之后待冷却凝固。 （3）菌悬液制备：我们组分别从英语公园的葡萄树下和生物学院院楼门口采集土样，各称取10g，放入装有90mL无菌水的三角瓶中，震荡20min后静置5min。（4）浓度稀释：在无菌试验台上进行浓度梯度稀释,把土样摇匀，从中吸取1ml 置于事先灭好菌的试管中，再加入9 ml无菌水，再从该试管中吸取1ml土样置
用。此外,菌体高密度培养与产酶之间的关系还需进一步探索。 参考文献: [1]李晶,赵晓祥,沙长青,等1甲醇酵母基因表达系统的研究进展,生物工程进展.1999,19(2). [2]M.R omanos.Current opinion in Biotechnology ,1995,6∶527 -533. [3]J.M.G regg ,T.S.Vedvick ,W.C.Raschke.Biotechnology.1993,11∶905-910. [4]宋钢,官孝群,宋后燕1人微小纤溶酶原基因在甲醇营养型酵母中的表达.生物工程学,1999,15(2). [5]Clare ,J.J ,et al.G ene ,1991,105∶205-212. [6]C ouderc ,R.,et al.Agric.Bio1.Chem.1980,44∶2279-2289. [7]郑常文,刘惠侠1米曲霉植酸酶的分离纯化及性质研究.四川大学学报(自然科学版),1993,30(2). [8]赵见麟,金其荣1元花果曲霉(NRR L 3135)与黑曲霉(AS N70)植酸酶产酶条件的研究1食品与发酵工业,1996,3. [9]Shiel T.R ,W are J H.Suvey of m icrooganisms for the production of extracellular phytase.App1.M icrobiol.,1968,9. [10]Han Y W ,et al.Phosphatase production by A spetgillus ficu 2um.J.Industr.M icrobiol.,1987,2. Studies on high density culture conditions of producing -phytase Pichia pastoris combined strain Y U Xue -bing ,H UANGLu -qiang ,ZHE NG Y i ,SHI Qiao -qin ,W U S ong -gang (Bioengineering Institute ,Fujian N ormal University ,Fuzhou 350007,Chian ) Abstract :The high -density culture conditions of a combined strain of producing -phytase Pichia pas 2toris were studied ,including the effect of various carbon s ources ,yeast powder 015%,(NH 4)2S O 4,K H 2PO 4on this strain.The results are as follows :glycero 14%,powder 015%,(NH 4)2S O 4018%,K 2HPO 4011%,K H 2PO 4016%.On the basis of the experiments ,the other factors such as optimal tem perature ,pH etc.were als o mentioned. K ey w ords :Pichia pastoris ;phytase ;high -density 收稿日期:1999-06-02 中图分类号:Q935 文献标识码:A 文章编号:1004-311X (2000)03-0029-06 虾青素摇瓶发酵条件的研究 吕玉华1,金征宇2,徐学明2 (11上海市饲料质量监督检验站,上海201106;21无锡轻工大学,江苏 无锡214036) 摘 要:通过对P.rhodozyma 4-26的虾青素摇瓶发酵条件包括接种比、通气量和温度等,以及培养基主 要组分的优化,得到最优培养基及培养条件。在此条件下发酵72h ,虾青素量可达13145μg/ml 或1465μg/ gC DW ,较优化前提高1148倍。 关键词:虾青素;法夫酵母;发酵;优化 虾青素是一种重要的类胡萝卜素添加剂,具有独特的着色功能和重要的生理功能,在饲料、食品、化妆品及医药等领域中有着广阔的应用前景。目前主要有化学合成、从甲 壳类提取以及发酵等方法生产[1] 。本文主要对虾青素摇瓶发酵的接种量、通气量和温度等及培养基各主要组分进行研究,以求得一个比较优化的发酵工艺条件。 1 材料与方法 111 菌种:本实验室保藏的法夫酵母(Phaf 2 fia rhodozyma )4-26。112 培养基 培养基A :葡萄糖10g/L ,酵母膏3g/L ,蛋白胨5g/L ,麦芽汁(10°Bx )3g/L 。 培养基B (发酵培养基):葡萄糖20g/L 、(NH 4)2S O 42g/L 、K H 2PO 41g/L 、MgS O 4?7H 2O015g/L 、CaCl 2?H 2O011g/L 、酵母膏2g/L 。113 培养条件:装液量25ml/250ml 摇瓶,接种量8%,转速220r/min ,温度22℃,培养时间2d ～3d 。 第10卷第3期2000年6月 生 物 技 术BI OTECH NO LOGY V ol.10,N o.3 Jun ,2000
浅析红霉素发酵的工艺控制 红霉素是日常生活中最常用的抗生素之一，它作为我公司重要的原料药，为我公司做出了巨大贡献。文章主要介绍了红霉素发酵过程中几个重要的控制参数和它们对发酵过程的作用及影响。 标签：培养基；温度；PH；溶氧；发酵 红霉素是大环内酯类抗生素，由链霉素在无菌状态下纯种发酵所产生。它的发酵工艺有4个特殊要求：（1）种子质量要求高；（2）发酵过程要求严格的无菌操作；（3）需要不间断的通气搅拌；（4）发酵过程的分阶段控制。 发酵罐内部的代谢变化（含菌丝形态、菌浓、糖、氮含量、PH值、溶氧浓度和产物浓度等）比较复杂，受许多因素控制。各因素既相互影响，又相互制约。发酵的好坏会直接影响到产物的产量和质量。因此，要使发酵达到预期效果，就需要各方面严密配合、严格操作。文章主要谈谈影响红霉素发酵工艺的几个参数。 1 培养基的成分与作用 培养基的原材料有碳源、氮源、无机盐和水等。 （1）碳源。碳源是构成微生物细胞和代谢产物的物质基础，是红霉素发酵中使用的主要原料之一。生产中使用的碳源有碳水化合物（各种糖类），脂肪，有机酸等，公司日常生产中使用的主要有葡萄糖和淀粉。 （2）氮源。氮源是构成微生物细胞和代谢产物的营养物质，也是红霉素发酵中使用的主要原料之一。生产中常用的氮源包括有机氮源和无机氮源两种，有机氮源有黄豆饼粉、玉米浆、蛋白胨等；无机氮源有氨水、硫酸铵等。 （3）无机盐和微量元素。金属离子在低浓度时对微生物生理活性呈现刺激作用，在高浓度时表现出抑制作用，这要依据菌种的生理特性和发酵工艺条件来确定。 （4）水。水是培养基的主要组成部分，它既是构成菌体细胞的主要成分，也是营养物质传递的介质。水的质量对菌体生长繁殖和产物合成有着很重要的作用。 2 温度的影响及控制 红霉素发酵所用的菌种是中温菌，它的最适发酵温度，随菌种、培养基成分、培养条件和菌体生产阶段而改变。 温度的变化对红霉素发酵有两方面的影响：（1）影响各种酶的反应速率和蛋
第一节：摇瓶与发酵 之所以选择摇瓶作为第一节，主要原因是我对它有深厚的感情，本科时进行植物细胞培养时使用的是摇瓶，研究生课题设计多数时间也在使用摇瓶，进入企业种子培养，验证很多情况都是使用摇瓶。虽然简单，但它的确是我们一个非常好用的工具，不仅研究过程要应用，生产过程也离不开，它的用途多种多样。不仅用于种子制备，种子的测试，原料的测试，培养基的优化，发酵过程的优化，能够伴随整个发酵过程。 摇瓶虽然简单，但是要想得到有价值的结论，基本原则不能抛弃，细节也要掌握，毕竟细节决定成败。 首先我们讨论装量问题。因为没有理论上的规定发酵时摇瓶的装量是多少，所以大家装得一定也不一样。那么多少合适呢？我不知道有没有下限，但是肯定会有一个上限，总不能装满吧！因为装量越多，在一定转动的情况下，溶氧会越少，相对蒸发量就越低，出现异常的概率就会变大，而且单位发酵液分配的动力也可能会降低。 装量少也不行，因为放罐后要检测，体积总得要够各项检测用吧。在这里我给一个提示：按照一般经验，发酵液和摇瓶的体积比例为10%-20%。其实在这里强调了空气，其实也要考虑其他物质的混合，比如：摇床的作用也会使细胞分泌出来的成份快速在整个发酵液中混匀。 我们在摇瓶上进行研究的目的是为了未来能够在发酵罐上进行放大，那么摇瓶如何与发酵罐进行比较呢？现在比较流行计算流体力学，如果有人能够用计算流体力学模拟摇瓶和发酵罐空气，营养，动力等情况的分配，便可以优化摇瓶中培养基体积的多少，使摇瓶与发酵罐的参数更接近一些，为以后的放大提供更接近的数据。 提到装量，相信很多人做过试验进行过优化。我自己也做过。一开始没有仔细考虑，只是想优化一个最适的加量，能够使发酵单位最高。开始的时候，由于没有考虑，挥发量的变化，所以最后得出装量越少发酵越好的结论。显然与发酵罐是不相符合的，生产需要的是产量而不是发酵单位。 我们设计试验的目的不能够偏离实际。做试验设计之前，我们一定要能够确定我们的试验目的是什么，我们需要的是一个稳定的菌种还是一个可能高产但是质量不稳定的菌种，我们是要筛选到发酵单位高还是产量高的工艺或培养基。相信大家最终的目的是一样的，但是由于没有生产指导或者没有经验，一开始我们往往会犯错误，搞不清楚我们目的。
枯草芽孢杆菌产α-淀粉酶发酵试验 一、实验原理 以枯草芽孢杆菌（BacilusSubtilisBF—7658）为实验菌株，通过种子扩大培养，选出生长力旺盛的菌株进行液体摇瓶发酵。通过测定不同发酵时间生产的酶活，来初步估计发酵最佳时期和终点。 淀粉酶是能够分解淀粉糖苷键的一类酶的总称，包括α-淀粉酶、β-淀粉酶、糖化酶和异淀粉酶。芽孢杆菌主要用来产生α-淀粉酶和异淀粉酶，其中α-淀粉酶又称淀粉1，4-糊精酶，能够切开淀粉链内部的α-1，4-糖苷键，将淀粉水解为麦芽糖、含有 6 个葡萄糖单位的寡糖和带有支链的寡糖；而异淀粉酶又称淀粉α-1，6-葡萄糖苷酶、分枝酶，此酶作用于支链淀粉分子分枝点处的α-1，6-糖苷键，将支链淀粉的整个侧链切下变成直链淀粉。通过发酵实验，我们可以以酶活为依据，初步估计发酵的最佳时期和发酵终点。 二、实验材料 （一）实验菌株：以枯草芽孢杆菌 （二）培养基： 1、种子培养液：葡萄糖1% 、胰蛋白胨：1%, 、酵母提取物：0.5%、NaCl(氯 化钠)：1% 调pH7.2 ，若配置固体培养基，则再加入1.5% 琼脂。 2、产淀粉酶发酵培养液：玉米粉 2 .0 % 、蛋白胨1 .5% 、CaCl 2 0 .02 % 、 MgSO 40 .02% 、NaCl 0 .25% 、K 2 HPO 4 0 .2% 、柠檬酸钠0 .2% 、硫酸铵0 .075% 、 Na 2HPO 4 0 .2 % 调节pH 值7 .0 （三）0.02M磷酸缓冲液（pH6.0） （四）实验仪器 离心机、水浴锅、250mL三角瓶、试管 三、实验过程 1、分别按培养基配方配制种子培养基和发酵培养基。 2、种子斜面及种子液准备 A.挑取单菌落从平板转接于新鲜种子斜面培养基，37℃，24h作菌种（3支/组）。 B.将配好的种子培养液按每瓶50mL分装于250mL三角瓶中灭菌（ 100KPa 20min ）。 C.在无菌操作条件下，将活化的菌株接种于以上培养液中（每支斜面接两瓶），37℃ 120r／min振荡培养16h作种子液。（6瓶/组） 3、发酵培养 A、按15-20％的接种量接种于装有50mL已灭菌菌发酵培养基的250ml三角瓶中。37℃培养48h。 B、在无菌操作条件下，每4h取样2mL，测定酶活。40-48h酶活降低后结束实验。 4、发酵结束后，用显微镜检查是否染菌。 5、待测酶液的制备： 称取1g~2g酶粉(精确至0.000 1 g)或准确吸取酶液1.00 mL，用少量磷酸缓冲液充分溶解，将上清液小心倾入容量瓶中，若有剩余残渣，再加少量磷酸缓冲液充分研磨，最终样品全部移入容量瓶中，用磷酸缓冲液定容至刻度，摇匀。用四层纱布过滤，滤液待用。
实验一菌种的传代培养 一、实验目的 1．掌握菌种传代培养的原理 2．掌握菌种传代培养的操作过程 二、实验原理 细胞在培养器中长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长并且活化细胞的代谢性能，同时也将细胞数量扩大，就必须进行传代（再培养）。活化后的菌种经过扩大培养就会大量繁殖，把菌种通过逐级扩大培养，使其大量繁殖并保留生长更加良好的菌种。传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法，同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。 三、实验器材 1．菌种：金色链霉菌 2．培养基（麸皮培养基）：麸皮36．0克；磷酸氢二胺3．0克；磷酸氢二钾0．2克；硫酸镁0．1克；琼脂15．0克；蒸馏水1．0升；ph 7．0 3．其它：电子天平；250ml三角瓶；电炉；灭菌锅；培养皿（5个）；试管；无菌操作台；酒精灯；接种环；涂布棒；报纸；细绳；棉塞；牛皮纸；玻璃棒。 四、实验步骤 使用培养皿培养菌种 1.按上述培养基配方配制250毫升培养基，装入一只三角瓶中，加热使药品溶解，用棉塞 塞住瓶口，并用牛皮纸扎紧，以备灭菌。 2.把培养皿用报纸包好，细绳系牢，以备灭菌。 3.把物品放入灭菌锅中在121℃下灭菌15～20分钟，灭菌后放入已杀菌的无菌操作台中。 4.在无菌条件下，在每只培养皿中分别倒入培养基20ml左右，放平，冷却后备用。
5.待培养基冷却凝固后，在无菌条件下，选择一个生长良好的菌种，用接种环在平板培养 基上接种，并用涂布棒将菌种均匀涂遍整个培养皿。 6.将接种好的平板做好标号后，将其放入29℃的培养箱中培养，倒置培养。 使用试管培养菌种 1．按上述培养基配方配制250毫升培养基，装入一只三角瓶中，加热使药品溶解，然后将其倒入试管用棉塞塞住瓶口，并用牛皮纸扎紧，以备灭菌。 2．把物品放入灭菌锅中在121℃下灭菌15～20分钟，灭菌后放入已杀菌的无菌操作台中。3．将灭了菌的试管取出并斜放（保证足够的斜平面），待其冷却凝固。接下来的步骤同培养皿的培养方法。 注意事项： 1．4和5步均为无菌实验。 2．传代培养周期为4～5天。 实验二发酵种子培养 一、实验目的 掌握发酵种子培养的原理和方法。 二、实验原理 种子扩大培养简称种子扩培是发酵工程的一个组成部分，其实指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养,最终获得一定数量和质量的纯种过程。其目的首先是出于接种量的需要与菌种的驯化，同时对于缩短发酵时间、保证生产水平也有帮助。所以种子扩大培养的任务是为了得到纯而壮的培养物，即获得活力旺盛的、接种数量足够的培养物。对于不同产品的发酵过程来说，必须根据菌种生长繁殖速度快慢决定种子扩大培养的级数。抗生素生产中，放线菌的细胞生长繁殖较慢，常采用二级或三级种子扩大培养；一般50t发酵罐多采用二级或三级发酵，有的也采用四级发酵如链霉素生产。
目录 目录 (1) 一、设计背景 (1) 1.1、红霉素简介 (1) 1、抗生素分为 (1) 2、红霉素的作用及应用范围： (1) 3、目前市场上的主要红霉素商品有： (1) 1.2、红霉素的生物合成 (2) 合成机理 (2) 1.3、红霉素的生产原理及步骤 (2) 二、红霉素的生产流程 (2) 2.1、一般流程 (2) 2.2、发酵工艺要点 (2) 1、种子 (2) 2．培养基 (3) (1)碳源： (3) (2)氮源： (3) (3)前体： (3) 3．培养条件的控制 (3) (1)通气和搅拌： (3) (2)温度： (3) (3)pH： (3) (4)中间补料： (3) (5)通氨： (4) (6)发酵液浓度的控制： (4) (7)泡沫与消沫 (4) 2.3、发酵液的成分和提取难度分析 (4) 1、发酵液的成分 (4) 2、红霉素的分离提纯具有以下特点: (4) 三、提取红霉素的方法选择 (4) 3.1、预处理 (5) 1、预处理的目的: (5) 2、发酵液预处理的常用方法: (5) （1）加水稀释法和加热法： (5) （2）调节PH值： (5) （3）凝聚和絮凝： (5) （4）使用惰性助滤剂： (5) （5）使用反应剂： (5) （6）膜处理 (5) （7）离心： (5) 3、预处理方法的选择 (5) 3.2、固液分离及粗提取 (6) 3.3、分离纯化 (6) 1、传统的提取工艺——溶媒萃取法 (6) （1）原理： (6) （2）缺点： (6) （3）实际生产中还存在的问题 (7)
（4）改进方案——溶媒萃取结合中间盐沉淀法 (7) 2、萃取法提取红霉素的改进技术 (8) （1）固定床溶剂萃取法 (8) （2）以乙酸仲丁酯为萃取剂 (8) （3）薄膜浓缩法 (8) （4）双水相萃取 (9) （5）相转变萃取 (9) 3、盐析法 (9) 4、膜分离技术的应用 (9) （1）50nm陶瓷膜过滤 (10) （2）超滤——纳滤 (10) （3）100nm陶瓷膜微滤——纳滤 (10) 5、大孔树脂吸附法的应用 (10) 3.4、各种分离纯化方法的比较： (11) 四、工艺流程设计 (12) 4.1、总工艺流程图： (12) 1、工艺过程 (12) （1）絮凝剂 (13) （2）超滤 (13) （3）纳滤膜浓缩系统 (13) （4）萃取、结晶 (14) （5）EA(挥发性有机物萃取吸收)系统 (14) 2、优点分析 (15) 第2页
综合性实验报告 实验名称：小型发酵罐的使用与发酵 过程中主要生化指标测定 实验性质：综合性实验 所属课程名称：发酵工程工艺原理 班级：2012级食品营养3班 学号：姓名： 实验指导教师： 实验时间：2014.12.01 – 2014.12.03
小型发酵罐的使用与发酵过程中主要生化指标测定 摘要： 关键词： 1 前言 2 材料与方法 2.1 材料 2.1.1 菌种 大肠杆菌（E.coli） 2.1.2 培养基 种子培养基：葡萄糖10g，蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，氯化钠5g，水1000mL。pH7.0。 发酵培养基：葡萄糖20g，蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏10g，氯化钠5g，氯化铵5g，水1000mL。pH7.0。 全部用自来水配制培养基。 2.1.3 其他材料 泡敌、斐林试剂、0.1%标准葡萄糖溶液、40%氢氧化钠等。 2.1.4 设备 BIOTECH-7BGZ发酵罐1套（配套蠕动泵、pH电极、溶氧(DO)电极、空压机及所
3 实验方法3.1 流程管口表
图1 发酵过程流程 3.2 菌种准备 3.2.1 配制培养基 配制种子固体培养基100mL ，分装试管，0.1Mpa （121℃）灭菌20min ，摆成斜面。 配制种子培养液600mL ，分别分装50mL 于两个250mL 三角瓶中（作一级种子瓶），余下550mL 平均分装于三个500mL 三角瓶中（作二级种子用），同上灭菌备用。 3.2.2 接种与培养 （1）菌种活化 上罐前两天，从冰箱中取出菌种转接斜面，37℃培养24h 。 （2）接一级种 上罐前一天，由斜面菌种转接一级种子瓶，37℃振荡（125r/min ）培养12h 。分别测接种前和培养结束时的OD 值，计算出净增OD ，并作记录。 （3） 接二级种 将一级种转接二级种子，接种量5%。之后，37℃振荡（125r/min ）培养10h 。 3.3 上罐前的准备 洗净发酵罐及各联接胶管。 配制发酵培养基5000mL ，置发酵罐内，加入几滴泡敌。 校正pH 电极和溶氧(DO)电极。 安装好发酵罐，把电极插口、取样管、补料口、消泡剂料瓶等固定、密封好后，开夹套出、进水阀V2、W1，使夹套充满水。 3.4 实罐灭菌 用保护罩盖住罐盖及发酵罐，用倾倒螺钉锁紧法兰，开保护罩顶部排气阀V4，启动蒸气发生器，启动搅拌马达，调转速300r/min ，开启冷凝水出水阀V1，开启蒸气阀门S1， 菌种斜面 一级种子 （250mL 摇瓶二级种子培养10h 37℃37℃ )(500mL 摇 发酵罐 管路准备 实罐 灭菌 罐 酵 8～10h 取分析测定
实验9-1 乳酸摇瓶发酵实验 1目的要求 了解小型发酵罐发酵生产乳酸的全过程。 2实验原理 菌体的生长及产酸过程实质上是对周围环境的一种反应。只有在满足菌体所需要的物理（如温度等）和化学条件（如营养物种类和浓度等）时，菌体才能旺盛地生长和产酸。菌体发酵的生产水平不仅取决于生产菌种本身的性能，而且要赋以合适的培养条件才能使它的生产能力充分表达出来。本实验初步研究了所用菌种的基本特性，进行了该菌种的间歇发酵实验。 3实验器材 3.1 材料 乳酸细菌。 3.2 试剂 （1）种子培养基（g/L） 葡萄糖50，蛋白胨10，酵母提取物5，NaA c?3H2O 1，柠檬酸三铵2，K2HPO4 2，KH2PO4 2，MgSO4?7H2O 0.2，FeSO4?7H2O 0.01，MnSO4?4H2O 0.01，NaCl 0.01，吐温80 1 mL，pH自然。 （2）发酵培养基（g/L） 葡萄糖100，蛋白胨10，酵母提取物5，乙酸钠1，柠檬酸三胺2，K2HPO4 2，KH2PO4 2，MgSO4?7H2O 0.2，FeSO4?7H2MnSO4?4H2O 0.01，NaCl 0.01，吐温80 1 mL，pH 6.5。 3.3 仪器 三角瓶，分光光度计，离心机等。 4实验步骤 4.1 菌体光密度的测定 以CaCO3控制pH的发酵过程中，发酵液置于离心管中，10 000 r/min离心5 min，弃上清液；沉淀用5 %稀盐酸10 mL洗涤，以除去发酵液中悬浮的碳酸钙的影响；10 000 r/min离心5 min，弃上清液；再用10 mL的生理盐水洗涤沉淀，10 000 r/min离心5 min，弃上清液；用10 mL生理盐水悬浮沉淀，对悬浮液进行适当稀释，稀释倍数应使所测的OD值在0.2～0.6，在660 nm处测定其光密度（OD660）。 4.2 pH的测定 在摇瓶实验中，取样后，用pH计测定滤液的pH。在发酵罐实验中，发酵液pH在线检测。
兰州大学 生命科学学院发酵工程实验 谷氨酸发酵实验
摘要：谷氨酸棒杆菌在合适的培养基中经摇瓶培养能快速生长，为发酵实验准备菌种。还原糖的消耗和谷氨酸的生成是衡量谷氨酸发酵是否正常的重要标志，所以在发酵过程中，要求每两个小时测定一次还原糖的含量，并据此作出发酵的糖耗曲线。 关键字：种子的制备、发酵罐、谷氨酸棒杆菌、PH的调节 引言： 了解发酵工业菌种制备工艺和质量控制，为发酵实验准备菌种。 了解发酵罐罐体构造和管道系统，掌握对发酵罐及其管道系统的灭菌方法。 了解发酵罐的操作，完成谷氨酸发酵的全过程。 还原糖的消耗和谷氨酸的生成是衡量谷氨酸发酵是否正常的重要标志，在发酵后期当还原糖降至1％以下时，表明谷氨酸发酵已经完成。所以在发酵过程中，要定时测定还原糖的含量，要求每两个小时测定一次，并据此作出发酵的糖耗曲线。掌握还原糖和总糖的测定原理，学习用比色法测定还原糖的方法。 学习使用茚三酮比色法检测发酵液中谷氨酸浓度的方法。谷氨酸棒杆菌通常在0-12小时为生长期，12小时后为产酸期，所以应该从12小时以后开始检测谷氨酸的含量，每两个小时取一次样。 原理: 谷氨酸棒杆菌在合适的培养基中经摇瓶培养能快速生长，得到大量健壮的种子。谷氨酸棒杆菌生长速度较快，接种量一般在1-2%。 谷氨酸发酵是有氧发酵，发酵罐由蒸汽管道、空气管道、加料出料管道等组成，在实验之前必须先对发酵罐进行空消。 谷氨酸产生菌是代谢异常化的菌种，对环境因素的变化很敏感，在适宜的培养条件下，谷氨酸产生菌能够将50％以上的糖转化成谷氨酸，而只有极少量的副产物。如果培养条件不适宜，则几乎不产生谷氨酸，仅得到大量的菌体或者由发酵产生的乳酸、琥珀酸、а－酮戊二酸、丙氨酸、谷氨酰胺、乙酰谷氨酰胺等产物。生产上的中间分析只测定一些主要数据，只能显示微生物代谢的一般概况而不能反映细微的生化变化。因此，进一步完善生化分析项目，从生化角度对发酵进行控制，从而确定最适宜的工艺条件是提高发酵水平的重要课题之一。 在NaOH存在下，3,5－二硝基水杨酸（DNS）与还原糖共热后被还原生成氨基化合物。在过量的NaOH碱性溶液中此化合物呈桔红色，在540nm波长处有最大吸收，在一定的浓度范围内，还原糖的量与光吸收值呈线性关系，利用比色法可测定样品中的含糖量。 L-氨基酸与茚三酮在加热下可发生特有的氨基酸显色反应，产物显示其特有的蓝紫色。不同谷氨酸与茚三酮反应得到的显色产物的最大吸收波长不同，即λ不同；加之显色深浅不同,反应出相应氨基酸的不同含量。以此为依据，可为ma x 谷氨酸定性及定量。在pH 5～6 范围内氨基酸的显色反应最灵敏。 器材与试剂： 试管、三角瓶、高压灭菌锅、摇床、培养箱、显微镜、蒸汽发生器、生物发酵系统、空气压缩机、分光光度计，水浴锅，电炉，18mm×180mm试管。