鸽毛滴虫粘附蛋白基因在大肠杆菌中的表达及其免疫保护试验

鸽毛滴虫粘附蛋白基因在大肠杆菌中的表

达及其免疫保护试验

罗锋1,3，李国清1，苏遂琴2，梁刚2，陈泽华2

（1. 华南农业大学兽医学院广州 510642；

2. 佛山出入境检验检疫局佛山 528200；

3. 广东温氏食品集团研究院广东新兴 527400）

摘要：通过PCR方法扩增鸽毛滴虫黏附蛋白基因，将其插入表达载体pET-43.1a(+)，获得重组质粒pET-43-ap，并转化至表达菌BL21，用IPTG诱导后离心，超声波裂解，收集可溶性蛋白，并经SDS-PAGE和Western-blot检测；将诱导的重组蛋白加入佐剂，对鸽进行免疫保护试验。结果显示，诱导后的可溶性蛋白经SDS-PAGE电泳检测大小约为97KDa；且在6h之内诱导的外源蛋白表达量随着时间的增加而增加，最高表达量占细菌总蛋白浓度的40.1％；经Western-blot检测，其表达产物可以与相应的抗体发生反应；重组蛋白免疫后试验鸽产生了高水平的抗鸽毛滴虫抗体，保护率为100%。结果表明，鸽毛滴虫黏附蛋白基因可以作为鸽毛滴虫基因工程疫苗的重要侯选分子。

关键词：鸽毛滴虫；黏附蛋白；基因表达；免疫保护

中图分类号：S852.72+3

Expression of T. gallinae ap gene in E. coli and its

immunologic protection

Luo Feng1,3, Li Guoqing1, Su Suiqin2, Liang Gang2, Chen Zehua2

(1. College of Veterinary Medicine, South China Agricultural University, Guangzhou 510642;

2. Foshan Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Foshan 528200;

3. Guangdong Wen' Group Academy, Xinxing 527400)

Abstract: The Trichomonas gallinae adhension protein(ap) gene was amplificated by PCR and inserted into the expression plasmid pET-43.1a(+), the recombinant plasmid named pET-43-ap was obtained. The plasmid was transferred to E. coli BL21 and allowed to express under the induction of IPTG. After expression bacteria were splitted by ultrasonic and centrifugated，soluble proteins were collected，and detected by SDS-PAGE and Western-blot.The immunologic protective test for pigeons was conducted after the recombined protein were mixed with adjuvant. The result shows that a fusion protein about the size of 97 kDa was obtained, expressed exogenous protein increased over time within 6 hours, reaching a maximum level 40.1％ of the total bacterial protein. Western blotting indicated that this fusion protein could react with specific antiserum. After vaccinated, test pigeons produced high anti- T. gallinae antibody level, with protective rate of 100%. It is concluded that the T. gallinae ap gene is important candidate molecule for recombinant vaccine of the parasite.

Key words: Trichomonas gallinae; Adhesion protein; Gene expression; Immunologic protection

0引言

鸽毛滴虫病是由鸽源禽毛滴虫(Trichomonas gallinae)（简称鸽毛滴虫）寄生于各种鸽类

基金项目：教育部博士点基金(200805640004); 广东出入境检验检疫局科技计划项目(2006GDK03)

作者简介：罗锋（1974-），男，博士后，主要研究方向：鸽病与猪病的防控

通信联系人：李国清（1957-），男，教授，主要研究方向：兽医寄生虫学. E-mail: gqli@https://www.wendangku.net/doc/ea18834756.html,

上消化道所引起的一种原虫病，该病在世界各地广泛存在，目前控制该病完全依赖药物防治[1]。随着药物的长期使用，耐药虫株也不断出现，同时由于开发新药成本、新药注册费用的不断增加以及越来越多的国家对肉产品药物残留的严格限制[2]，因此，鸽毛滴虫病的防控必须研究新的措施，研制疫苗无疑是我们的首选途径。

目前尚未报道针对鸽毛滴虫疫苗的研究，但对阴道毛滴虫疫苗的研究却非常多，特别是针对黏附蛋白的研究。Engbring等[3]将阴道毛滴虫ap33克隆株进行Southern blot分析，确定ap33基因的存在，通过全序列分析表明ap33基因包含930 bp的ORF，编码一种近似33 KDa 的蛋白质；经比较发现，ap33基因编码的蛋白质在核苷酸和氨基酸水平上都具有高度的相似性，对其N-端氨基酸测序发现有前导多肽的存在，其重组蛋白仍保留与阴道毛滴虫黏附蛋白相同的粘附性。因此，黏附蛋白基因被认为可以作为未来基因工程疫苗的候选抗原之一。国内不少作者不仅对阴道毛滴虫不同株型的表面黏附蛋白进行了比较[4,5]，而且还进行了原核和真核表达的研究[6-9]。本研究借鉴阴道毛滴虫黏附蛋白基因克隆与表达的成功经验，首次克隆鸽毛滴虫的黏附蛋白基因（Tg ap），将该基因进行原核表达，并用其重组蛋白进行动物保护试验，以便了解鸽毛滴虫黏附蛋白基因重组抗原的免疫原性，为鸽毛滴虫病重组疫苗的研制奠定基础。

1 材料与方法

1.1质粒及主要试剂

pET-43.1a(+)载体系统为Novagen公司产品，由华南农业大学动物科学学院基因研究室改造并提供。丙烯酰胺、N，N-亚甲双丙烯酰胺购自宝泰克生物科技有限公司；TEMED（N，N，N’，N’四甲基乙二胺）购自Promega公司；IPTG购自sigma公司；Triton X-100购自北京鼎国生物工程技术服务有限公司；预染色的蛋白质分子量标准（Precision Protein TM standards，Pristained，broad Range）、2000bp分子量标准、M-MLV RTase cDNA Synthesis Kit、总RNA抽提试剂盒RNAiso Reagent、MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver.2.0、pMD18-T Easy载体质粒系统、DH5α、JM109感受态细胞购自TaKaRa公司；DEPC、X-gal、琼脂糖、溴化乙锭（EB）购自宝泰克生物科技有限公司。

1.2引物的设计

根据已克隆的鸽毛滴虫黏附蛋白基因序列[10]，设计一对引物用于扩增Tg ap基因阅读框;为了便于将PCR产物克隆至pET-43.1a(+)载体中，在上游引物的5’端引入EcoRⅠ酶切位点，下游引物5’端引入SalⅠ酶切位点，不带有终止密码子, 拟扩增长度为930bp。引物序列如下：上游引物为5'-AGAATTCATGCTCTCCTCTTCCTTCG- 3 ' ,下游引物为5' -TAGTCGACTTTA GATCTTGCCCATTC -3 '。

1.3目的基因的扩增

分别以经鉴定含pMD18-ap的阳性菌和其质粒为模板，扩增目的片段，反应体系如下：10×PCR buffer，5μL；模板，0.5μL；dNTPs，4μL（2.5mM）；上、下游引物，各1μL（20μM）；

EX Taq，0.25μL (5U/μL); ddH2O 补至50μL。反应条件如下：盖温104℃，94 5min

℃，94℃℃，共30个循环，最后72℃延伸10min。上述程序执行完毕，用1.5%℃，72 90s

40s，50 40s

琼脂糖凝胶（含0.5 μg/mL EB）电泳检测PCR产物，100V的电压下电泳，10min后在紫外灯下观察结果。将PCR产物回收并纯化。

1.4质粒pET-43.1a(+)的制备与PCR产物的酶切

取0.5μL pET-43.1a(+)质粒转化E. coli DH5α感受态细胞，菌液涂布于含100 μg/mL Amp的LB琼脂板，37℃培养箱中培养过夜。次日，挑取单菌落接种于10mL含100μg/mL Amp 的LB液体培养基中，37℃，220 r/min振摇培养12～16 h。取10 mL菌液，按照TaKaRa Plasmid Minipreps Kit说明书抽提质粒pET-43.1a(+)，取1μL进行琼脂糖凝胶电泳检测质粒的纯度并估计DNA含量。用Eco RⅠ和SalⅠ双酶切质粒pET-43.1a(+)及纯化的T g ap基因PCR扩增产物，37℃下作用3h，反应体系如下：10×buffer H，15μL；SalⅠ和EcoRⅠ，各5μL；pET-43.1a(+)，30μL；ddH2O 补至150 μL。

1.5 PCR产物与pET-43.1a(+)载体的连接

经Eco RⅠ和SalⅠ酶切、回收的PCR产物和pET-43.1a(+)载体在用T4 DNA连接酶的作用下，4℃连接过夜，反应体系如下：10× 连接buffer，1μL；PCR酶切回收产物，2μL；pET-43.1a(+)，2μL；T4 DNA连接酶，1 μL；dd H2O补至10 μL。

1.6连接产物转化DH5α感受态细胞

将连接产物加入到80μL E.coli DH5α感受态细胞中，冰浴30min；42℃水浴90s热休克，迅速转移到冰水中冰浴2min，加入800μL 37℃预热的 LB培养液，37℃ 160r/min 振摇45min，随后取菌液涂布于含X-gal、IPTG的Amp+（100μg/mL）LB琼脂板；同时，设Amp+对照组，接种E.coli DH5α感受态细胞；设阳性质粒转化对照组，37℃培养12~16h。

1.7转化子的PCR鉴定

从1.6制备的平板上挑取4个单菌落接种3 mL含100μg/mL Amp的 LB培养液中，37℃振摇培养12h后，取菌液用引物进行PCR检测，同时设立空白对照，反应体系如下：10×PCR buffer，2μL；菌液，0.5μL；dNTPs，2μL（2.5mM）；上游和下游引物各0.5μL（20μM）；EX Taq ，0.1μL (5U/μL)；ddH2O 补至20μL。

1.8阳性菌落的酶切鉴定

将PCR鉴定阳性的菌落置37℃ 220r/min过夜振荡培养，次日用TaKaRa Plasmid Minipreps Kit提取质粒。用Eco RⅠ和SalⅠ双酶切质粒，反应体系如下：10×buffer H，2.5μL；SalⅠ和EcoRⅠ各0.75μL；质粒，10μL；ddH2O补至25 μL。同时用Eco RⅠ进行单酶切作对照，反应体系如下：10×buffer H，2μL；EcoRⅠ，0.75μL；质粒，5μL；ddH2O补至20 μL。离心混匀后，37℃下2h，用1.0%琼脂糖凝胶电泳进行检测。挑取阳性菌落进行测序，取质粒酶切鉴定正确的转化子菌液送上海博亚公司测序，并将测序鉴定正确的重组表达质粒命名为pET-43-ap。

1.9 Tg ap基因在E.coli BL21中的表达

取质粒pET-43-ap 1μL转化E.coli BL21感受态细胞，质粒转化步骤同前，最后取菌液涂布含100μg/mL Amp 的LB琼脂培养基中，37℃培养12～16h。挑取菌落接种3mL LB液体培养基（含有100μg/mL Amp），37℃ 220r/min振摇过夜；次日，以1％的浓度接种10mL LB液体培养基（含有100μg/mL Amp）, 37℃ 220r/min 振摇至OD600=0.5时，加入终浓度为1 mmol/L IPTG进行诱导表达，取0～6h菌液，12000r/min离心2min，去上清，细菌沉淀中加50μL 1×SDS上样缓冲液，-80℃冻融三次，沸水中煮3～5min，12000r/min离心2min，取上清进行SDS-PAGE电泳。同时，设立pET-43.1a(+)在BL21中的表达作为对照。

1.10 表达产物的Western-blot检测

将表达产物在5％浓缩胶和12％分离胶中进行SDS-PAGE电泳；然后在槽式Bio-Rad 电转印仪上50mA稳流电转120min; 用镊子夹取硝酸纤维滤膜，转移至5%脱脂奶粉/TBS 溶液4℃封闭过夜; 翌日，用TBS漂洗硝酸纤维滤膜3次，将滤膜装入塑料袋，加入5mL 以1︰100稀释于1%脱脂奶粉/TBS中的鸽抗毛滴虫高免血清，封口，放在平缓摇动的摇床上，25℃温育1h。剪开塑料袋，弃液体，漂洗滤膜3次，每次10min。将滤膜装入另一新塑料袋，加入5 mL以1︰500稀释于1%脱脂奶粉/TBS中的兔抗鸽IgG，25℃摇床摇动温育1h; 弃二抗，TBS洗涤滤膜3次，每次10 min。把滤膜移至一平皿，加入底物液，待蛋白带的颜色深度达到要求，立即用清水漂洗滤膜，然后将滤膜转移至内装适量PBS液的平皿中;用扫描仪扫描滤膜照片，留作永久记录。

1.11 表达产物的可溶性分析

pET-43-ap BL21转化菌接种3mL LB液体培养基（含有100μg/mL Amp），37℃ 220r/min 振摇过夜；次日，以1％的浓度分别接种4管2mL LB液体培养基（含有100μg/mL Amp）, 37℃ 220r/min 振摇至OD600=0.5时，加入IPTG至终浓度分别为2 mmol/L和1 mmol/L，37℃220r/min振摇12h; 收集菌液，12000r/min离心1min，弃上清; 向细菌沉淀中加入2mL裂解液，冰浴10min，然后超声裂解细菌：工作时间4s，间隔时间10s，功率400w，循环10次。结束后，4℃ 12000r/min离心10min，收集上清和沉淀; 上清加入等量的2×SDS上样缓冲液，100℃处理5min，用于SDS-PAGE电泳; 沉淀加入100μL 1×SDS上样缓冲液，100℃处理5min，进行SDS-PAGE电泳。

1.12 鸽毛滴虫全虫乳化疫苗的制备

将鸽毛滴虫接种到培养基，经过3～5d的恒温培养，5000 r/min离心10min，弃上清，加入适量PBS（pH 7.2），超声波粉碎：工作时间4s，间隔时间10s，功率400w，循环30次；冰浴10 min，再同上条件循环30次。超声破碎完毕后，用BiopHotometer生物分光光度计测定蛋白含量，并稀释至100mg/mL备用。将稀释的全虫抗原蛋白与矿物油以1:1.5的比例于搅拌器中充分混匀乳化，用作乳化疫苗。

1.13 鸽毛滴虫重组蛋白疫苗的制备

将BL21-pET43-ap重组大肠杆菌接种含100μg/mL Amp 的LB液体培养基，37℃、220r/min振摇过夜培养，振摇至OD600=0.5时，加入IPTG至终浓度为0.5 mmol/L，20℃220r/min振摇12h; 收集菌液，3500r/min离心15min，弃上清，向细菌沉淀中加入适量裂解液，冰浴10min，然后超声裂解细菌，收集上清，用PBS（pH 7.2）稀释至100mg/mL，与矿物油以1:1.5的比例于搅拌器上充分混匀乳化，获得乳化疫苗。并以未加佐剂的表达蛋白作对照。

1.14 动物保护试验

所用试验鸽均来自广东铁牛鸽场的3月龄青年鸽，从口腔取分泌物镜检无毛滴虫，且无任何毛滴虫感染的征兆。80只健康青年鸽饲养于无鸽毛滴虫的环境中，分成全虫疫苗、重组蛋白、重组蛋白疫苗和对照4个组，每组16只鸽，分4个笼饲养，每笼4只鸽。将试验鸽于90日龄时首次免疫，15d后采血，检测血清抗体水平并检查鸽带虫情况，同时进行第二次免疫，15d后再次采血，检测血清抗体水平并检查鸽带虫情况，并对所有试验鸽经口腔接种1×107

个强致病性的鸽毛滴虫，连续观察15d。

1.15 试验鸽抗体的检测

以密度为5×105个/mL的鸽毛滴虫抗原，血清按1:400倍稀释，酶标二抗按1:500倍稀释，用已建立的间接ELISA 方法检测试验鸽抗鸽毛滴虫抗体水平，所得数据用SPSS Data Editor软件分析。

2 结果

2.1 Tg ap基因的PCR扩增

以重组质粒pMD18-ap为模板，以含Eco RⅠ和SalⅠ酶切位点的一对引物，PCR扩增Tg ap基因，将PCR产物在琼脂糖凝胶中电泳，可见一条大小约930bp的电泳条带，与预期大小相一致，见图1。

图1鸽毛滴虫粘附蛋白基因的PCR扩增

Fig.1 The amplification of T. gallinae ap gene by PCR

M．分子量标准DL2,000； 1. PCR扩增产物

M. Molecular weight marker( DL2,000)；1. The PCR product

2.2 重组质粒的酶切鉴定

将重组质粒以Eco RⅠ和salⅠ双酶切，以EcoRⅠ单酶切作对照，质粒经双酶切后，酶切产物经电泳后可见一条长约930bp和一条长度大于2000bp的电泳带；单酶切重组质粒的酶切产物经电泳后仅见1条大于2000bp的电泳带，详见图2。

图2 重组质粒的酶切鉴定

Fig. 3 Identification of recombinant plasmid by restriction enzyme

M. 分子量标准DL2,000 1、3、5为EcoRⅠ和salⅠ双酶切，2、4、6为EcoRⅠ单酶切M. Molecular weight marker( DL2,000); 1、3、5. The recombinant plasmid digested by restriction enzyme EcoRⅠ and SalⅠ; 2、4、6. The recombinant plasmid digested by restriction enzyme EcoRⅠ

2.3 重组质粒pET43-ap的序列测定

挑选经EcoRⅠ和SalⅠ双酶切分析正确的阳性克隆送上海博亚生物技术公司进行核苷酸序列测定，结果证实在pET43-ap质粒中目的基因的核苷酸序列及阅读框架均正确。

2.4表达产物的SDS-PAGE鉴定

用SDS-PAGE鉴定诱导表达的产物, 结果表明：在 1 mmol/L IPTG的诱导下, BL21-pET43.1a(+)表达的融合蛋白分子量约为65 KDa，重组质粒BL21-pET43-ap表达的融合蛋白，其分子量约为97KDa（图3），与预期大小相符合。在6h以内，其融合蛋白的表达量随着时间的延长而增加，重组蛋白表达量占细菌总蛋白含量依次为14.2、17.8、24.2、26.9、31.2、40.1。

图3 表达产物的SDS-PAGE鉴定

Fig.4 Identification of expression product of the T. gallinae ap gene by SDS-PAGE

1. 鸽毛滴虫蛋白；

2. BL21-pET4

3.1a(+)诱导表达后的上清；3. BL21-pET43.1a(+)诱导表达后的包涵体；4、6. BL21-pET43-ap诱导表达后的上清，5、7. BL21-pET43-ap诱导表达后的包涵体；M. 蛋白质标准分子量

1. The protein of T. gallinae；

2. The supernatant of BL21-pET4

3.1a(+) after induced; 3. The inclusion body

of BL21-pET43.1a(+) after induced；4、6. The supernatant of BL21-pET43-ap after induced;

5、7. The inclusion body of BL21-pET43-ap after induced；M. Protein molecular weight marker

2.5 表达产物的Western-blot检测

SDS-PAGE电泳分离重组蛋白后, 用鸽抗禽毛滴虫阳性血清进行Western-blot检测，以BL21-pET43.1a(+)表达产物作阴性对照。结果表明，在硝酸纤维素膜上出现1条特异性条带，其分子量大小约为97Kda, 见图4。

图4 表达产物的Western-blot鉴定

Fig.4 Identification of the expression product by Western-blot

M.蛋白质标准分子量；1. BL21-pET43.1a(+)菌液；2. BL21-pET43-ap包涵体；3.BL21-pET43-ap上清M. Protein molecular weight marker；1.The bacterium BL21-pET43.1a(+)；2.The inclusion body of

the BL21-pET43-ap；3.The surpernatant of the BL21-pET43-ap

2.6试验鸽抗体的检测结果

首免15d后，加佐剂与不加佐剂重组蛋白免疫组抗体水平差异不显著（p＞0.05），但与对照组相比均差异显著（p﹤0.05）；全虫疫苗免疫组与重组蛋白免疫组之间抗体水平差异不显著（p＞0.05）。二免后15d，全虫疫苗免疫组与对照健康鸽或带虫鸽的抗体水平比较，均差异显著（p﹤0.05）；加佐剂与不加佐剂重组蛋白免疫组之间抗体水平差异显著（p﹤0.05）, 与对照组相比差异显著（p﹤0.05）；不加佐剂重组蛋白免疫组与全虫疫苗免疫组之间的抗体水平差异不显著（p﹥0.05）；加佐剂重组蛋白疫苗免疫组与全虫疫苗免疫组之间的抗体水平差异显著（p﹤0.05），其中以加佐剂重组蛋白疫苗组的抗体水平为最高。详见表1。

表1 试验鸽免疫后抗鸽毛滴虫抗体水平（OD 450）

Tab. 1 The antibody level of anti-T. gallinae after vaccinated （OD 450）

组别

处理 首免 二免 1

全虫疫苗 0.029±0.00471b 0.044±0.00753c 2

重组蛋白 0.039±0.00464b 0.053±0.01228bc 3

重组蛋白疫苗 0.045±0.00270b 0.114±0.02344d 4 对照 0.016±0.00152a 0.016±0.00152a 注：表中标记字母相同表示差异不显著（p ＞0.05）；标记字母不同表示差异显著（p ﹤0.05）

Note: The same letter represents no significant difference among groups （p ＞0.05），The different letter represents significant difference among groups （p ﹤0.05）

2.7 试验鸽免疫保护效果

首免15d 后，所有试验鸽未见死亡且无鸽毛滴虫感染；二免15d 后，所有试验鸽仍未见死亡且无鸽毛滴虫感染。攻虫15d 后，未免疫的对照鸽死亡3只，死亡率为18.75%，未死亡鸽均已感染鸽毛滴虫，感染率100%；其它各组试验鸽无死亡，保护率为100%，但有不同程度的感染, 其中第1组感染率为56.25%, 第2组感染率为43.75%, 第3组感染率37.5%, 详见表2。

表2 试验鸽免疫保护效果

Tab. 2 The immunoprotective effect of the test pigeons

免疫15d 后死亡鸽只

组别 试验鸽只 首免

二免 攻虫15d 后死亡鸽只 剩余鸽只死亡率（％）感染鸽只 感染率（％）1 16 0

0 0 16 0 9 56.25 2 16 0

0 0 16 0 7 43.75 3 16 0

0 0 16 0 6 37.5 4 16 0 0 3 13 18.75 13 100

3 讨论

在本试验中，将T g ap 基因克隆至pET-43.1a(+)表达载体中，构建的重组质粒转化E.coli BL 21后，获得含有目的基因的重组菌在IPTG 的诱导下，得到了分子量约为65KDa 的融合蛋白；经过改造的pET-43.1a(+)表达载体在IPTG 的诱导下，得到大约为97KDa 的融合蛋白。以前用大肠杆菌诱导的融合蛋白大多以生物活性很弱的包涵体形式存在，而经过改造的pET-43.1a(+)表达载体在IPTG 的诱导下产生的融合蛋白主要以可溶性蛋白形式存在，这为本试验提供了很大的便利。试验结果表明，诱导的可溶性表达产物的含量很高，诱导时间越长，产生的融合蛋白也越多; 在同一温度下，以不同浓度的IPTG 诱导，细菌裂解上清中目

的蛋白含量并没有随着IPTG浓度的改变而呈比例的改变。迄今为止，大肠杆菌表达系统仍是一个受到广泛应用的重组蛋白表达系统，它具有方便培养、外源基因易于导入、外源蛋白表达量高等优点，但也具有一个明显的缺点：表达产物一般以空间构象不正确的包涵体形式存在。本试验中采用改造的pET-43.1a(+)表达载体就是基于这一因素考虑的，试验结果表明所诱导产生的融合蛋白主要以可溶性蛋白形式存在，而且具有His.Tag标签，除了具有检测和纯化目的蛋白的作用之外，还可以促进外源蛋白的溶解。

以全虫疫苗免疫试验鸽，与对照组相比差异显著（p﹤0.05）, 说明全虫疫苗能够刺激机体产生抗体；将两次免疫所产生抗体水平进行比较，二免15d后的抗体水平比首免15d后的高，说明全虫疫苗第二次免疫可以刺激机体进一步产生抗体。以未加佐剂或加佐剂的重组蛋白疫苗首免健康鸽，15d后其抗体水平差异不显著（p＞0.05），但与对照鸽的抗体水平相比均差异显著（p﹤0.05），说明重组蛋白确实能刺激机体产生抗体；二免15d后，未加佐剂的重组蛋白免疫组与对照组的抗体水平相比差异显著（p﹤0.05），但与首免的抗体水平相比差异不显著（p＞0.05）；加入佐剂的重组蛋白疫苗免疫组与其他试验组相比其抗体水平差异显著（p﹤0.05），说明加入佐剂乳化的重组蛋白疫苗第二次免疫可明显地刺激机体进一步产生抗体。总之，未加佐剂的重组蛋白与全虫疫苗免疫组抗体水平相比差异不显著，但加入佐剂的重组蛋白疫苗二免后与全虫疫苗免疫组抗体水平相比差异显著，其抗体水平远远高于其他各试验组。

鸽毛滴虫的感染非常普遍，几乎所有鸽都是毛滴虫的带虫者，在形成足够的免疫保护力之前，受强毒虫株感染时，死亡率可高达50%，感染鸽耐过后能抵抗强毒虫株的攻击[11]，本次试验验证了这一现象。本次试验中注射了鸽毛滴虫全虫疫苗、重组蛋白疫苗的鸽子都能抵抗强毒虫株的攻击，保护率为100%，而未注射疫苗的部分鸽不能抵抗强毒虫株的攻击而死亡。可见根据鸽毛滴虫黏附蛋白基因所表达的重组蛋白能够像鸽毛滴虫黏附蛋白一样刺激机体产生抗鸽毛滴虫抗体而起到免疫保护作用。

4 结论

本试验成功地将Tg ap基因克隆到pET-43.1a(+)表达载体，并命名为pET-43-ap。将重组质粒pET-43-ap转化到BL21大肠杆菌后，用终浓度为1 mmol/L IPTG诱导表达，获得了大小约为97KDa的融合蛋白；在6h之内，外源蛋白表达量随着时间的延长而增加，最高表达量占细菌总蛋白浓度的40.1％。Western-blot结果表明，Tg ap基因在大肠杆菌中的表达产物可以与相应的抗体反应，在约97KDa处有特异性条带，表明诱导的融合蛋白具有良好的抗原性和免疫原性。动物保护试验结果表明鸽毛滴虫重组蛋白疫苗能够刺激鸽体产生抗鸽毛滴虫抗体，具有较高的保护率。

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