保护性酶
保护性酶
保护酶系：
1. 过氧化物酶POD
2. 超氧化物歧化酶SOD
3. 苯丙氨酸解氨酶PAL
4. 过氧化氢酶CA T
5. 多酚氧化酶PPO
6. 丙二醛（MDA）含量、游离脯氨酸含量、
7. 谷胱甘肽还原酶(GR
8. 谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)
9. 抗坏血酸(ASA)过氧化物酶（APX）Ascorbic acid peroxidase
活性氧酶促保护系统主要包括：
1 超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase ，SOD)、
2. 过氧化氢酶（Catalase,CAT）
3.抗坏血酸过氧化物酶(Ascorbate Peroxidase，AP)、
4 脱氢抗坏血酸还原酶Dehydroascorbate Reductase，DR)
5. 单脱氢抗坏血酸还原酶(Monodehydroascorbate Reductase，MR)
6 谷胱甘肽还原酶(Glutathione Reductase，GR)
7.非特异性过氧化物酶(non—specific peroxidase，POD)等。
张家口农专学报, 2002年6月,第l8卷第2期
自由基清除酶一抗坏血酸自由基还原酶
抗坏血酸过氧化物酶（APX）
亚硒酸钠对小麦幼苗中谷胱甘肽过氧化物酶和谷胱甘肽转硫酶活性以及谷胱甘肽含量的影响--《植物生理学通讯》2004年02期
谷胱甘肽过氧化酶（GSH-PX）测试盒说明书
一、测定意义
谷胱甘肽过氧化物酶是机体内广泛存在的一种重要的催化过氧化氢分解的酶。它特异的催化还原型谷胱甘肽对过氧化氢的还原反应，可以起到保护细胞膜结构和功能完整的作用。谷胱甘肽过氧化物酶的活性中心
是硒半光氨酸，硒是GSH-PX的必需部分，每克分子酶含4克原子硒。测定GSH-PX的活力可以作为衡量机体硒水平的一项生化指标。
测定原理
谷胱甘肽过氧化物酶可以促进过氧化氢与还原型谷胱甘肽反应生成H2O及氧化型谷胱甘肽，谷胱甘肽过氧化物酶的活力可用其酶促反应的速度来表示，测定此酶促反应中还原型谷胱甘肽的消耗，则可求出酶的活力。
H2O+2GSH→2H2O+GSSG
谷胱甘肽的活力以催化GSH的反应速度来表示，由于这二个底物在没有酶的条件下，也能进行氧化还原反应（称非酶促反应）,所以最后计算此酶活力时必须扣除非酶促反应所引起的GSH减少的部分。
GSH量的测定:GSH和二硫代二硝基苯甲酸作用生成5-硫代二硝基苯甲酸阴离子呈现较稳定的黄色，在412nm处测其吸光度即可计算出GSH的量。
试剂盒有效期和保存条件
本试剂盒保存期：6个月；储存温度:4℃.
实验中所需的仪器和自备的试剂
1.412nm的分光光度计
2.37℃恒温水浴锅
3.台式离心机
4.可调式移液器
5.蒸馏水
二、试剂组成与配制
1.储备液（100T为1ml1瓶，50T为2ml1瓶）用时取0.1ml加蒸馏水至10ml，也就等于是100倍稀释配成应用液。现用现配，4℃保存。
2.甲粉，乙粉，各1瓶，甲加90-100℃的热蒸馏水充分溶解（100T加170ml，50T加85ml）；乙粉加90-100℃的热蒸馏水充分溶解（100T加50ml，50T加25ml）。将已经配好的甲乙两种溶液混合，室温静置冷却后如有结晶，取上清进行实验。4℃或室温保存
3.粉剂，1瓶，加蒸馏水溶解（100T加200ml，50T加100ml）
4.粉剂（100T）加蒸馏水50ml溶解；液体（50T）直接加量。避光4℃保存
5.粉剂（100T4支，50T2支）每支加蒸馏水10ml溶解，4℃保存。
6.GSH标准品粉剂3.07mg/支（100T4支，50T2支）
7.标准品溶剂储备液，1瓶（100T为10ml，50T为5ml），标准品溶剂应用液：储备液：蒸馏水=1：9，现用现配，4℃保存。
GSH应用液的配制：
1mmol/LGSH溶液GSH的分子量为307，每次测定前将1支3.07mg的GSH标准品粉剂加到GSH标准品的溶剂应用液中，定容至10ml即为1mmol/L的GSH溶液，现用现配。、
100umol/LGSH溶液取1mmol/LGSH溶液2ml加GSH标准品溶剂应用液18ml定容至20ml，作标准曲线用，若不做标准曲线可以不配。（见附录）
20umol/L的GSH标准溶液取1mmol/LGSH溶液0.2ml加GSH标准品溶剂应用液定容至10ml，即为20umol/L的GSH标准溶液。
全血中GSH-PX活力的测定
1. 样本的前处理：
溶血液的配制：1.取肝素抗凝全血20ul，以蒸馏水稀释至1ml，配成1：49的溶血液；鼠血10ul加蒸馏水至1ml，配成1：99的溶血液。
2. 充分混匀，放置5分钟直至使玻璃管中的溶血液对光呈完全透明状，方可进行检测。
3. 已经配好的溶血液中GSH-PX活力只能保持45分钟-60分钟，天冷时可延迟至120分钟，如果当天来不及测定则以抗凝全血冰箱（4℃-8℃）保存，2-3天内酶活力变化不大。
注：请在正式实验前参见附录摸索最佳取样浓度；
注：测溶血液中GSH-PX含量要注意样品测试前红细胞一定要充分溶血。（以对光观察透亮为标准，若不透亮可以冻溶一次，但有部分大鼠及猪的红细胞是不可放置0℃以下，否则不易溶血，例如糖尿病大鼠和部分正常大鼠的红细胞冻后很难溶血，在做正式实验时最好先取1-2只样本做预试。）
测定操作步骤：
1.酶促反应
37℃水浴预温5分钟
37℃水浴准确反应5分钟
混匀，3500-4000转/分，离心10分钟，取上清1ml作显色反应。
2.显色反应
混匀，室温静置15分钟，412nm处，1cm光径比色杯，蒸馏水调零，测各管OD值。
注意：
注：空白管、标准管一般只需做1-2只。
注：最佳取样量及最佳取样浓度因样品种类不同，其GSH-PX活力不一。根据酶的百分抑制率与酶的活力呈抛物线关系，各种测定的样品取样量及取样浓度不一样，在每测定一种新的样品前最好选择一个最佳取样量及最佳取样浓度。
最佳取样浓度的摸索
测试前先预试以确定最佳取样浓度：当您第一次使用本试剂某一种的样品时最好先做三只不同浓度的测试管，例如测全血时，则分别取用蒸馏水1：24、1：49、1：99稀释的溶血液200ul进行预试，然后进行计算：抑制率=(对照管OD-测定管OD)/对照管OD×100%，结果应该在15%-55%之间，然后取百分抑制率在45%或50%左右的一管作为最佳取样浓度，因为酶的百分抑制率与酶的活力呈抛物线关系，若百分抑制率大于60%时（曲线的平坦部分）,则需要将样品浓度稀释后再测试。若百分抑制率小于20%时，则需要将样品浓度加大后测试。
这样做对科研结果分析及t检验有很大帮助；若百分抑制率大于60%或小于10%，各个测定组的结果在t 检验中无显著性差异。
全血中GSX-PX活力的计算
公式一：
全血GSX-PX酶活力=（非酶管OD值-酶管OD值）/（标准管OD值-空白管OD值）×标准液浓度（20umol/L）×稀释倍数[5*×（1+X***）/(1+49***）]
公式二：
（标准曲线法）
全血GSH-PX酶活力=(非酶管OD值-酶管OD值)×A**×稀释倍数[5*×（1+X***）/(1+49***）]
注：*从酶促反应表中看出反应液0.5ml加试剂二2ml，在反应液中为5倍稀释，所以乘5.
**A为标准曲线斜率的倒数，本所A值为165.16（见附录）
***X为全血稀释比例，例如1：99稀释，X即为99.
***1+49：溶血液为1：49稀释时，取0.2ml检测即等于取样量为4ul的全血。
3.标准曲线的制定：
取1mmol/LGSH标准液2ml加试剂二18ml定容至20ml，配制成100umol/L的GSH标准应用液。
混匀，室温静置15分钟，1cm光径，412nm处，蒸馏水调零，测各管吸光度。
根据标准曲线计算A值：A=标准管中GSH浓度值（umol/L）/标准管的GSH光密度值OD值
4.对数法计算鼠的全血中GSH-PX活力：
注采用对数法计算鼠全血中GSH-PX活力时，实验过程中37℃水浴时间必须为3分钟
公式：鼠全血GSH-PX活力单位数=（非酶管lg(GSH)-酶管lg(GSH)）/3分钟×1/取样量（0.2ml）×样本测试前稀释倍数=（lg(非酶管OD-空白管OD)-lg（酶管OD-空白管OD））/3分钟×样本测试前稀释倍数（150）/取样量（0.2ml）
组织、线粒体和细胞膜中GSX-PX活力的测定
一、
样本的前处理：
1.10%组织匀浆的制备：a.取组织块（0.2-1克）用冰冷的生理盐水漂洗，除去血液，滤纸拭干，称重，放入5-10ml的小烧杯内。
b.用量筒取预冷的匀浆介质（PH7.4,0.01mol/L蔗糖，0.01mo/LTris-HCI,0.000mol/LEDTA2Na溶液）或生理盐水。匀浆介质或0.86%生理盐水的量应该是组织重量的9倍，用移液管将总量2/3的匀浆介质或生理盐水移入烧杯，用眼科小剪尽快剪碎组织块（天热时小烧杯要放入冰水中）。
c.将剪碎的组织倒入玻璃匀浆管中，再将剩下的1/3匀浆介质或0.86%生理盐水用来冲洗残余在小烧杯中的碎组织一起倒入玻璃匀浆管中进行匀浆，左手持匀浆管将下端插入盛有冰水的器皿中，右手将杆垂直插入套管中上下转动研磨数十次（6-8分钟），充分磨碎，使组织匀浆化。或者用组织捣碎机10000-15000r/min
研磨制成10%组织匀浆，也可以用内切式组织匀浆器制成10%组织匀浆（匀浆时间10秒/次，间隙30秒，连续3-4次，温度0-4℃），心肌组织等可延长匀浆时间。
注：根据预试结果取最佳浓度进行测定。
d.将制备好的10%匀浆用普通离心机或低温离心机3000r/min左右离心10-15分钟。将离心好的匀浆留上清弃下面沉淀。
e.根据你生物实验需要，取适量上清液进行各种测定。
2.线粒体的制备：取10%的组织匀浆5-10ml，以1000-2000r/min离心10分钟（用普通离心机或低温离心机），取上清液以8000-10000r/min（低温高速离心机）离心15分钟，沉淀物为线粒体。
组织、线粒体和细胞膜中GSH-PX活力测定操作表
1.酶促反应:
37℃水浴预温5分钟
混匀，3500-4000转/分，离心10分钟，取上清1ml作显色反应。
显色反应：
混匀，室温静置15分钟后，412nm处，1cm光径比色杯，蒸馏水调零，测各管OD值。
注意：
注：空白管、标准管一般只需做1-2只。
注：最佳取样量及最佳取样浓度因样品种类不同，其GSH-PX活力不一。根据酶的百分抑制率与酶的活力呈抛物线关系，各种测定的样品取样量及取样浓度不一样，在每测定一种新的样品前最好选择一个最佳取样量及最佳取样浓度。
最佳取样浓度的摸索
测试前先预试以确定最佳取样浓度：当您第一次使用本试剂某一种的样品时最好先做三只不同浓度的测试管，例如想测组织匀浆是时，则分别取10%、5%、1%的匀浆200ul进行预试，然后进行计算：抑制率=(对照管OD-测定管OD)/对照管OD×100%，结果应该在15%-55%之间，然后取百分抑制率在45%或50%左右的一管作为最佳取样浓度，因为酶的百分抑制率与酶的活力呈抛物线关系，若百分抑制率大于60%时（曲线的平坦部分）,则需要将样品浓度稀释后再测试。若百分抑制率小于20%时，则需要将样品浓度加大后测试。
这样做对科研结果分析及t检验有很大帮助；若百分抑制率大于60%或小于10%，各个测定组的结果在t 检验中无显著性差异。
3.组织中GSH-PX活力的计算：
公式一：
组织GSH-PX酶活力=（非酶管OD值-酶管OD值）/（标准管OD值-空白管OD值）×标准管浓度（20umol/L）×稀释倍数（5*）÷反应时间÷（取样量×样本蛋白含量）
公式二：
组织GSH-PX酶活力=（非酶管OD值-酶管OD值）×A**稀释倍数（5*）÷反应时间÷（取样量×样本蛋白含量）
注：从酶促反应表中看出反应液0.5ml加试剂二2ml，在反应液中为5倍稀释，所以乘5.
公式二中A为标准斜线斜率的倒数，本所A值为165.16.（详见标准曲线测制定）
血清（浆）中GSH-PX活力的测定
1.血清(浆)GPX测定操作方法：
酶促反应：
37℃水浴预温5分钟
37℃水浴准确反应5分钟
混匀，3500-4000转/分，离心10分钟，取上清1ml做显色反应。
2.显色反应：
混匀，室温静置15分钟后，412nm处，1cm光径比色杯，蒸馏水调零，测各管OD值。
注意：
注：空白管、标准管一般只需做1-2只。
注：最佳取样量及最佳取样浓度因样品种类不同，其GSH-PX活力不一。根据酶的百分抑制率与酶的活力呈抛物线关系，各种测定的样品取样量及取样浓度不一样，在每测定一种新的样品前最好选择一个最佳取样量及最佳取样浓度。
最佳取样浓度的摸索
测试前先预试以确定最佳取样浓度：当您第一次使用本试剂某一种的样品时最好先做三只不同浓度的测试管，例如想测血清时，则分别取未稀释的血清及应用生理盐水1：1、1：4、1：9、1：19稀释血清100ul 进行预试，然后计算：抑制率=(对照管OD-测定管OD)/对照管OD×100%，结果应该在15%-55%之间，然后取百分抑制率在45%或50%左右的一管作为最佳取样浓度，因为酶的百分抑制率与酶的活力呈抛物线关系，若百分抑制率大于60%时（曲线的平坦部分）,则需要将样品浓度稀释后再测试。若百分抑制率小于20%时，则需要将样品浓度加大后测试。
这样做对科研结果分析及t检验有很大帮助；若百分抑制率大于60%或小于10%，各个测定组的结果在t 检验中无显著性差异。
血清中GSH-PX酶活力的计算：
公式：
血清（浆）GSH-PX活力=（非酶管OD值-酶管OD值）/（标准管OD值-空白管OD值）×标准管浓度（20umol/L）×稀释倍数（6*）×样本测试前稀释倍数
注：*：从酶促反应表中看出反应液0.4ml，加试剂二2ml，在反应液中为6倍稀释。
注意点：1.溶血液在室温下1小时内活力不变。建议样品稀释不超过1小时为宜，测试前先将其他准备工作做好在准备溶血液
2.血样要新鲜，肝素抗凝后放冰箱4-8℃存放不要超过48小时。
3.测溶血液中GPX含量要注意样品测试前红细胞一定要充分溶血（以对光观察透亮为标准，若不透亮可以冻融一次，但有部分大鼠及猪的红细胞是不可冻融越冻越不破，最好先取1-2只样本做预试）。
4.试剂一存放瓶要彻底洗干净，应用液要现用现配。
5.1mmol/LGSH、0.1mmol/LGSH、20umol/LGSH的标准品，现用现配。
6.37℃水浴反应时间5分钟或3分钟，记录反应时间要准确。
7.测定上清液当天提取，当天测试。
8.组织蛋白质的测定法有多种，可购买本研究所蛋白定量试剂盒（考马测试盒）
GSH标准曲线的制备
标准曲线的制定：
取1mmol/LGSH标准液2ml加GSH标准品溶剂应用液18ml定容至20ml，配制成100umol/L的GSH标准应用液
混匀，室温静置15分钟，1cm光径，412nm处，蒸馏水调零，测各管吸光度。
以浓度为横坐标，OD值为纵坐标，坐标准曲线。
根据标准曲线计算A=标准管中GSH浓度值（umol/L）/标准管的GSH光密度(OD值)
Determination of glutathione peroxidase activity in
some plant families
<<广西农业科学>>2004年第35卷第03期
作者: 张景萍, 吴珍龄,
期刊ISSN : 1002-8161(2004)03-0177-02
用直接测定法测定10种植物样品谷胱甘肽过氧化物酶活性,其中以百合科的蒜、葱,葫芦科的绞股蓝活性较高.这一结果为今后在高等植物中该酶的进一步研究奠定了实验基础,并对测定方法提出改进意见.
关键词: 高等植物, 谷胱甘肽过氧化物酶, 活性, 测定, | 全部关键词
谷胱甘肽过氧化物酶
谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）
谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）是机体内广泛存在的一种重要的过氧化物分解酶。硒是GSH-Px酶系的组成成分，它能催化GSH变为GSSG，使有毒的过氧化物还原成无毒的羟基化合物，同时促进H2O2的分解，从而保护细胞膜的结构及功能不受过氧化物的干扰及损害。GSH-Px的活性中心是硒半胱氨酸，其活力大小可以反映机体硒水平。GSH-Px酶系主要包括4种不同的GSH-Px，分别为胞浆GSH-Px、血浆GSH-Px、磷脂氢过氧化物GSH-Px及胃肠道专属性GSH-Px。胞浆GSH-Px由4个相同的分子量大小为22kDa的亚基构成四聚体，每个亚基含有1个分子硒半胱氨酸，广泛存在于机体内各个组织，以肝脏红细胞为最多。它的生理功能主要是催化G SH参与过氧化反应，清除在细胞呼吸代谢过程中产生的过氧化物和羟自由基，从而减轻细胞膜多不饱和脂肪酸的过氧化作用。血浆GSH-Px的构成与胞浆GSH-Px相同，主要分布于血浆中，其功能目前还不是很清楚，但已经证实与清除细胞外的过氧化氢和参与GSH的运输有关。磷脂过氧化氢GSH-Px是分子量为20kDa的单体，含有1个分子硒半胱氨酸。最初从猪的心脏和肝脏中分离得到，主要存在于睾丸中，其它组织中也有少量分布。其生物学功能是可抑制膜磷脂过氧化。胃肠道专属性GSH-Px是由4个分子量为22kDa的亚基构成的四聚体，只存在于啮齿类动物的胃肠道中，其功能是保护动物免受摄入脂质过氧化物的损害。
产品简介
产品简介：
产品编号产品名称产品包装产品价格
S0056谷胱甘肽过氧化物酶检测试剂盒100次319.00元谷胱甘肽过氧化物酶检测试剂盒(Cellular Glutathione Peroxidase Assay Kit)是一种简单易行的通过紫外比色来检测细胞、组织或其它样品中谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase)活性的试剂盒。绝大部分细胞内的谷胱甘肽过氧化物酶都是含硒的，且硒为该酶的活性中性组成部分。细胞内也有很少量的不含硒的谷胱甘肽过氧化物酶存在。本试剂盒检测的是最常见的含硒的谷胱甘肽过氧化物酶。
本试剂盒如果和总谷胱甘肽过氧化物酶检测试剂盒(S0058)配合使用，可以定量检测出样品中不含硒的谷胱甘肽过氧化物酶。
谷胱甘肽过氧化物酶可以清除活细胞内过氧化物，在保护细胞免受自由基损伤过程中起着关键作用。细胞内的脂类容易和自由基发生反应，产生脂类过氧化物。谷胱甘肽过氧化物酶可以利用还原型谷胱甘肽(GSH)还原脂类过氧化物，从而消除自由基的毒害作用。
谷胱甘肽过氧化物酶几乎在所有组织中都有分布。在一些病理状况下谷胱甘肽过氧化物酶的活力会发生明显上调或下调。
谷胱甘肽过氧化物酶可以利用还原型谷胱甘肽(GSH)催化过氧化氢以及许多有机过氧化物，产生水或有机醇。如果以过氧化氢为底物进行检测，则同样可以分解过氧化氢的过氧化氢酶(Catalase)的酶活性会干扰谷胱甘肽过氧化物酶的测定。本试剂盒利用了一种间接测定的方法。谷胱甘肽过氧化物酶可以催化GSH 产生GSSG，而谷胱甘肽还原酶可以利用NADPH催化GSSG产生GSH，通过检测NADPH的减少量就可以计算出谷胱甘肽过氧化物酶的活力水平。在上述反应中，谷胱甘肽过氧化物酶是整个反应体系的限速步骤，因此NADPH的减少量和谷胱甘肽过氧化物酶的活力线性相关。
本试剂盒利用了如下的反应原理，GPx为谷胱甘肽过氧化物酶，GR为谷胱甘肽还原酶，R-OOH为过氧化物。
本试剂盒提供的有机过氧化物试剂(t-Bu-OOH)在没有谷胱甘肽过氧化物酶存在的情况下不会和GSH产生反应，也不会被细胞内的过氧化氢酶催化而分解。因而可以较为特异地检测出谷胱甘肽过氧化物酶的活力。
由于t-Bu-OOH不能被不含硒的谷胱甘肽过氧化物酶所催化，所以本试剂盒可以比较特异地定量检测最常见的含硒的谷胱甘肽过氧化物酶。
可检测组织匀浆产物、细胞裂解产物等样品中谷胱甘肽过氧化物酶的活性。一个试剂盒可进行100次检测。
植物学通报2005, 22 (3): 350~356
Chinese Bulletin of Botany
①国家重点基础发展规划项目(2003CB114305)和国家自然科学基金项目(30370765)资助.
②通讯作者.Author for correspondence. E-mail: songcp@https://www.wendangku.net/doc/fb1003298.html,
收稿日期: 2004-08-26 接受日期: 2005-03-02 责任编辑: 白羽红
专题介绍
植物谷胱甘肽过氧化物酶研究进展①
1,2苗雨晨1白玲1苗琛2陈珈1宋纯鹏②
1(河南大学生命科学学院开封475001)
2(中国农业大学植物生理生化国家重点实验室北京100094)
摘要氧化胁迫可诱导植物多种防御酶的产生, 其中包括超氧化物歧化酶(SOD, EC1.15.1.1),
抗坏血
酸过氧化物酶(APX, EC1.11.1.11),过氧化氢酶(CAT, E.C.1.11.1.6 )和谷胱甘肽过氧化物酶(GPXs,
EC1.11.1.9).它们在清除活性氧过程中起着不同的作用.GPXs是动物体内清除氧自由基的主要酶类,
但它在植物中的功能报道甚少.最近几年研究表明, 植物体内也存在类似于哺乳动物的GPXs 家族, 并
对其功能研究已初见端倪.本文综述了有关GPXs的结构以及植物GPXs功能的研究进展.
关键词氧化胁迫, 谷胱甘肽过氧化物酶, 磷脂氢过氧化物谷胱甘肽过氧化物酶
Progress in Plant Glutathione Peroxidase
1,2MIAO Yu-Chen 1BAI Ling 1MIAO Chen 2CHEN Jia 1SONG Chun-Peng②
1(College of Life Sciences, Henan University, Kaifeng 475001)
2(State Key Laboratory for Plant Physiology and Biochemistry, China Agricultural University, Beijing 100094)
Abstract Oxidative stress in plants induces several antioxidant enzymes, including superox-
ide dismutase (SOD, EC 1.15.1.1), ascorbate peroxidase (APX, EC 1.11.1.11), catalase (CA T, E.
C.1.11.1.6) and glutathione peroxidase (GPX, EC1.11.1.9), which have specific roles in scav- enging reactive oxygen species. Glutathione peroxidases are a family of key enzymes involved
in scavenging oxyradicals in animals. Only recently has evidence for the existence of this enzyme in plants been reported. However, the information about the function of plant GPXs is limited, according to our current knowledge. The paper reviews the structure of GPXs and the progress of plant GPXs.
Key wordsOxidative stress, Glutathione peroxidase, Phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase (PHGPX)
植物是一个需氧代谢的有机体.在呼吸和光合作用过程中, 线粒体,叶绿体和过氧化物酶体均可导致活性氧(Reactive OxygenSpecies, ROS)含量的提高.当ROS积累到一定水平时, 将会对植物造成一定的伤害.同动物细胞一样, 植物为了防御氧化胁迫, 也存3512005苗雨晨等: 植物谷胱甘肽过氧化物酶研究进展在着一套相应的酶促和非酶促解毒体系(Grene, 2002).植物体清除ROS的酶促系统主要包括SOD (superoxide dismutase),APX (ascorbate peroxidase),CAT (catalyse)和GPX (glutathione peroxidase).SOD是一类含金属离子的酶, 它作为清除ROS的第一道防线, 其功能是将.O2-歧化为H2O2, 然后由APX和CAT再分解多余的H2O2(Asada, 1994).另外, APX和CA T结合H2O2的机制有所不同, 前者需要抗坏血酸作为底物, 并与H2O2的亲合力较强; 后者虽然可直接分解H2O2, 但它与H2O2的亲合力相对于前者较弱.因此CA T在清除胁迫产生的H2O2时也存在一定的局限性.从近几年研究结果来看, 不同的抗氧化酶在不同组织不同细胞器中发挥着作用, 这说明植物体存在一个复杂的防御系统.与植物不同的是动物清除ROS的主要酶类是谷胱甘肽过氧化物酶, 根据其亚细胞定位,氨基酸序列不同以及结合底物的特异性,它又可分为几种不同的同功酶(Ursini et al., 1995; Arthur,2000), 并且GPXs多数以GSH (glutathione)作为底物催化分解生物体内产生的H2O2.直到最近几年, 在植物中也开展了GPXs功能研究, 这些酶在结构,底物的特异性及植物组织的分布上有很大的不同, 对抵御外界胁迫起了很重要的作用.因此, 植物中同样也存在属于GPX家族的酶类, 但人们对于其功能和结构特性认识还有限, 还需要进行大量的工作.
1 动物GPXs的结构与功能
Mills(1957)最初发现了具有抗氧化作用的GPX, 其功能被认为防御红血球氧化而引起的溶血, 命名为谷胱甘肽过氧化物酶.这是过去一直认为经典的GPX, 而现在把具有这种功能的
酶命名为GPX-1.Rotruck(1973)等研究表明硒是抗氧化酶GPXs催化活性中心的一个重要组分.后来Flohe研究小组纯化了该酶,并进一步分析了分布在细胞中并作用于各种有机过氧化物和H2O2的GPX, 是由4个各含1个硒半胱氨酸的蛋白质亚基构成的四聚体, 并以离子化硒醇(selenol)形式形成酶的氧化还原活性中心(Flohe et al., 1973).大量研究表明,哺乳动物GPXs有较高的催化活性, 可迅速清除体内产生多余的活性氧.目前, 根据GPXs包含的半胱氨酸残基不同, 可简单分为含硒和不含硒两大类. GPX-1存在于动物细胞的胞质中, 代谢分解H2O2和胆固醇以及长链脂肪酸在内的一系列组织过氧化物(Sunde, 1987).它以谷胱甘肽为催化底物, 消除过量H2O2对组织造成的氧化损害.因此, 研究GPX-1常常与谷胱甘肽还原酶的活性联系在一起, 因为该酶不断地催化氧化态的谷胱甘肽生成还原态的谷胱甘肽, 激活GPX-1以抵御氧化损害.大量研究表明, GPX-1是一个含有4个相同亚基的四聚体蛋白, 每个亚基各含1个硒代半胱氨酸残基,其分子量为22~23 kD.研究牛的GPX-1蛋白三维结构显示, 其4个球形亚基的表面凹陷中都有一个硒代半胱氨酸, 它是酶的活性中心(Epp et al., 1983).如用半胱氨酸取代GPX活性中心的硒代半胱氨酸, 却大大降低了该酶的活性(Rocher et al., 1992). GPX-2是存在于胞质中的一种四聚体GPX, 也称为胃肠型GPXG, 即GPXG1.其蛋白质与GPX-1有65%的同源性, 并且具有相似的底物, 二者都能分解体内产生的H2O2和脂肪酸羟基过氧化物, 但不能分解磷脂氢过氧化物(Chu et al.,1993).另外具有独特性质的同功酶GPX-3是一种糖基蛋白, 它的分子量大约为23~25 kD, 与GPX-1有40%~50%的同源性. GPX-3的mRNA大多数发现于肾脏, 尤其是近端小管的表皮细胞中.有研究表明, GPX-3有较低含量的GSH存在时, 就会显示其氧化还原活性, 并且硫氧还蛋白还原酶以及硫氧还蛋白系统也能作为GPX-3的电子供体, 以提高胞液35222(3)中电子供体的浓度, 提高了该酶的活性, 可作为胞外的抗氧化剂.但是GPX-3是否和其他同功酶一样具有相似的特性, 有待于进一步研究. GPX-4或磷脂氢过氧化物GPX(Phosphol-ipid hydroperoxideglutathione peroxidase, PHGPX)是人们公认的第4类含硒谷胱甘肽过氧化物酶, 其分子量约为20~22 kD, 与上述3种结构比较发现, 它是一个单聚体, 不但以磷脂氢过氧化物为底物, 又能作用于H2O2和多数脂类氢过氧化物(Maiorino et al., 1991).这种特性可能与其单体结构有关, 它比四聚体GPX结合的底物更为广泛.除此之外, 还有一些不同种类的GPXs, 它与GPX-1也有较高的同源性.另外, 谷胱甘肽-S-转移酶(GlutathioneS-transferases, GSTs)家族多数也具有GPX的活性.这类酶是非硒依赖性的GPX, 它主要防御组织内的氢基过氧化, 不能直接分解H2O2.要想清楚理解GSTs这方面的特性可以参看相关的文献综述(Hayes and Mclellan,1999).
2 植物GPXs功能
最初开展植物体内GPX的研究是从烟草(Nicotiana sylvestris)的叶片里克隆了与动物依赖硒的GPXs有较高同源性的cDNA(Criquiet al.,1992).后来从柑橘(Holland et al., 1993),拟南芥(Sugimoto and Sakamoto, 1997),大白菜(Eshdat et al., 1997),菠菜(Sugimoto et al.,1997),向日葵(Roeckel-Drevet et al., 1998),番茄(Depege et al., 1998),豌豆(Mullineaux et al., 1998),水稻(Li et al., 2000)和中国大白菜(Jung et al., 2002)等分离得到了类似的基因.研究发现, 植物基因组GPXs核苷酸序列携带的是一个半胱氨酸残基, 替代了动物基因组GPXs核苷酸UGA终止密码子处插入的硒代半胱氨酸.前已述及, 动物含硒代半胱氨酸残基的GPX有较强的催化活性, 而植物中多数为半胱氨酸, 这大大降低了GPXs在植物中的催化作用(Stadman, 1996).近年来, 从衣藻和高等植物中也分离得到类似硒代半胱氨酸残基的GPX基因(Yokota et al.,1988; Shigeoka et al.,1991).后来从萌发的大麦和芦荟中纯化了一个16 kD的四聚体含硒蛋白(Sabeh et al.,1993; Huang, 1994), 但还没有直接证据表明植物硒代半胱氨酸GPXs的分子结构特征.Fu等(2002)以衣藻为材料并利用分子生物学和生物化学技术研究了编码GPXs基因的UGA终止密码子处同样存在一个硒代半胱氨酸, 这与报道的动物含硒GPXs有较大的相似性, 并且从蛋白水平上也证实了该酶的催化活性.然而, 也有人在研究柑橘体内的GPXs时,
用硒代半胱氨酸残基取代了半胱氨酸残基, 却没有出现类似哺乳动物GPXs的活性.因此, 对于植物体内GPXs的结构与功能认识仍然有限.
最近, 模式植物拟南芥GPXs的功能研究也得到了初步进展.Milla等(2003)通过分析拟南芥基因组序列和EST序列发现, 有7种推测为GPXs的同功酶, 分布在3条染色体上, 分别定位在胞质,叶绿体,线粒体和类囊体等亚细胞器中.它们在内含子和外显子等结构上有很大的区别, 并且多数具有较保守的结构域.研究表明, 非生物胁迫条件下AtGPX家族受不同的信号转导途径所调节, 并且分析其启动子区域, 与人类相比较, 具有相似的抗氧化反应元件.上述结果提示: 植物体内的GPX也可能有多种家族成员, 其家族成员可能在进化的不同时期以及不同的胁迫被招募来控制不同的发育途径和防御反应.从现有的研究结果来看, 不同的环境胁迫(如病原菌侵染,高盐和重金属等)下, 表达GPXs的mRNA水平将稳步提高.因此, GPXs在植物氧化信号转导过程中可能起着重要作用.
3 植物体内的磷脂氢过氧化物谷胱甘肽过氧化物酶(PHGPX)
目前从多种植物中已分离得到类似哺乳
3532005苗雨晨等: 植物谷胱甘肽过氧化物酶研究进展
动物GPXs基因.序列比较分析发现, 这些基
因多数与动物PHGPXs有较高的同源性.最
初研究植物PHGPXs的是Ben-Hayyim实验室,
他们从盐胁迫的柑橘胚珠愈伤组织中分离得
到了类似的GPXs, 后来命名为Cit-SAP(citrus
salt-stress associated protein).研究发现, 其
分子量约为22 kD, pI为6.1.大量实验证据
表明, 该酶在豌豆等植物中同样表达, 通过在
大肠杆菌表达该基因发现, 其耐受氧化胁迫的
能力明显加强.后来, 通过亲和层析技术从
柑橘植物中的GST中分离得到了纯化的Cit-
SAP蛋白, 该蛋白具有PHGPX的催化活性, 并
且在GSH存在的条件下能特异性的催化磷脂
酰胆碱氢过氧化物的氧化还原活性(Ben-
Hayyim et al.,1991, 1993).虽然植物体内的
PHGPXs的功能多有报道, 但是还没有更直接
的证据表明该酶的催化活性.
分析植物PHGPXs结构功能, 发现它的催
化残基位点是Cys, 而不是依赖硒的Cys.这种
结构上的不同, 导致了二者功能上的差异.譬
如, 植物PHGPX只有以磷脂氢过氧化物为催化
底物时, 才表现出较高的催化活性; 它不能以
H2O2为底物, 即使有GSH存在时也不能分解体
内产生多余的H2O2.而动物PHGPX结合的底
物更为广泛.因此植物赋予PHGPX在氧化信
号转导过程一个全新的角色, 也可能通过本身氧
化还原状态的改变, 而导致下游基因的表达.
最近, 一些实验结果表明了硫氧还蛋白过
氧化物酶为PHGPX的一个新的同功酶, 它对
硫氧还蛋白表现出高的氧化活性, 而不能作用于GSH.有人研究疟原虫GPX时却发现, 该
基因编码了一个类似硫氧还蛋白过氧化物酶
的同系物, 并且以Trx (thioredoxin)作为底物的催化反应速率远远高于GSH (Sztajer et al., 2001).最近, 在马铃薯,向日葵和大白菜中
发现了类似的PHGPX的活性, 同时也具有硫
氧还蛋白过氧化物酶的活性(Herbette et al., 2002).因此, 植物体内的PHGPX催化激活时, 硫氧还蛋白可能是改变其氧化还原状态的主
要电子供体.另外, Avsian-Kretchmer等(1999,2004)以柑橘为材料研究干旱和盐胁迫条件下GPXs的活性, 结果发现PHGPXs蛋白的含量增加, 并且从转录水平上证明了盐和氧化胁迫诱导了胞内H2O2的增加, 继而导致了gpx-1启动子的表达.这说明PHGPXs对于植
物增加抗性及避免胁迫诱导的氧化损害起了
很重要的作用.令人感兴趣的是, 酵母GPX-
3可作为H2O2信号转导链中的氧化还原转导子或具有受体功能已有报道, 并且酵母GPX-3 氧化还原底物也为Trx, 是一种非硒依赖的谷
胱甘肽过氧化物酶(Delaunay et al., 2002), 这
与植物中报道的PHGPX结构存在一定的相似性.由此推测, 植物中也可能存在这样的转
导机制, 它在植物体内不仅具有保护植物细胞膜免遭氧化损害的功能, 同时也可能通过半胱氨酸残基氧化还原状态的改变以转导下游基
因的表达, 即GPXs的Cys残基不同将决定其转导或代谢不同的生理过程.
虽然PHGPX在还原脂质过氧化物上有较
高的活性, 但这种酶的活性与APX相比要低得多.因为它不能直接分解H2O2, 但它在底物的分配以及应答环境胁迫等方面有较高的特异性, 因此它在植物体内感受或清除活性氧的机制与APX有明显的区别.Eshdat等(1997)已勾画了PHGPX作用机制的一个可能模式图, 即生物或非生物胁迫条件导致H2O2含量的增加, 过量的H2O2将会产生Fenton反应, 最终导致脂质过氧化物的形成, 随后被PHGPX所分解.因此, 植
物PHGPXs是防御生物膜免遭氧化伤害的一道防线.总之, 植物与动物PHGPX结构的差别,
也将导致功能的改变.为进一步了解H2O2的
信号转导的分子机制, 研究植物PHGPX的结构
与功能将是一个有意义的课题.
4 展望
活性氧作为有害的副产物, 它在植物耐受
35422(3)
胁迫反应中起了很重要的作用.虽然其产生
和清除机制已有轮廓, 但对其信号转导机理还
不太清楚.开展GPXs在植物中的研究, 将进
一步揭示ROS信号转导链中的一些中间环
节.譬如GPXs与活性氧相互作用的机理, 它
与影响ROS产生的上下游蛋白信号的关系等
等, 都是非常有意义的研究课题.因此, 深入
了解GPXs在植物活性氧信号转导中的作用, 无参考文献
疑会促进人们对活性氧作为信号分子的理解.
随着后基因组时代的到来以及利用微阵列分析,
就可以找到特异的信号组分与下游的效应基因
之间的级联关系; 利用蛋白质组学的方法, 可以
搞清楚GPXs的结构信息; 利用酵母双杂交技术构建GPXs的连锁图谱可以了解GPXs与一些蛋白质之间特异性的相互作用.以上技术将会
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射线辐照对植物保护性酶活性和MDA含量的影响
陈云飞。强继业 (云南农业大学烟草学院，云南昆明650201)
摘要综述了在生长发育和储藏保鲜过程中不同剂量一射线处理对植物体内保护性酶活性和MDA含量的影响，并且在辐照保鲜
中保护性酶活性和MDA含量的变化。
关键词一射线；辐射；保护性酶活·I~；MDA
中圈分类号S124~1 文献标识码A 文章编号0517—6611(2006)10-2034—02
植物体内的主要保护性酶
正常情况下细胞内活性氧水平很低，不会使植物受到伤害。植物细胞内活性氧的清除主要通过保护酶和一些抗氧化物质。细胞保护酶主要有：超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)、谷胱甘肽还原酶(GR)等。其中，以SOD、POD、CAT较为重要，它们协调工作，防止细胞内活性氧水平过高，统称保护酶系统。
SOD的主要功能是清除植物细胞内O
2-，生成无毒的O
2
：和毒性较低的H
2
2
。
若细胞内SOD含量降低，则O
2
-含量会相应增加，脂类过氧化产物(MDA)迅速积累。MDA积累速率可代表组织中总的清除自由基能力。
CAT能有效清除植物体内的过氧化氢，催化H
20
2
的分解，
H 2O
2
+ H
2
O
2
2H
2
O+O
2
。因此，CAT是植物保护自身免受H
2
O
2
毒害的关键。CAT
普遍存在于植株组织中，其活性与植物的代谢强度和抗寒抗病能力密切相关。
POD也能清除植物体内的H
20
2
，但作用机理不同于CAT，它是通过催化H
2
2
与其他底物反应而消耗H
20
2
，H
2
2
+R(OH)
2
---2 H
2
0+RO
2
。
安徽农业科学，Journal of Anhui Agri.Sci．2006，34(10)：2034—2035
活性氧酶促保护系统的组成：
活性氧酶促保护系统主要包括：
1 超氧物歧化酶(Superoxide dismutase ，SOD)、
2. 过氧化氢酶（Catalase,CAT）
3.抗坏血酸过氧化物酶(Ascorbate Peroxidase，AP)、
4 脱氢抗坏血酸还原酶Dehydroascorbate Reductase，DR)
5. 单脱氢抗坏血酸还原酶(Monodehydroascorbate Reductase，MR)
6 谷胱甘肽还原酶(Glutathione Reductase，GR)
7.非特异性过氧化物酶(non—specific peroxidase，POD)等。
张家口农专学报, 2002年6月,第l8卷第2期
自由基清除酶一抗坏血酸自由基还原酶
抗坏血酸过氧化物酶（APX）
植物维生素C过氧化物酶研究进展--《现代生物医学进展》2008年06期
维生素C过氧化物酶(ascorbate peroxidase,APX)是植物体内的重要酶系,是植物AsA-GSH氧化还原途径的重要组分,是清除H_2O_2(特别是叶绿体中的H_2O_2)的关键酶。本文综述了维生素C过氧化物酶表达调控方面的研究进展,包括逆境(干旱胁迫、空气污染、微量元素缺乏、离子胁迫、过度光强、照射以及盐胁迫等)与APX的表达调控、植物细胞程序性死亡(PcD)与APX的表达调控、植物生长发育与APX的表达调控、植物进化与APX表达调控等。植物体内的APX基因包括基质和类囊体两类,不同的APX基因序列存在一定差异,本文还综述了这两类APX基因在植物方面的分离和克隆进展情况,同时对APX基因的遗传转化进行了简要回顾,最后指出了APX今后的研究方向。
【作者单位】：河南科技大学林学院;河南科技大学林学院河南洛阳471003;河南洛阳471003
【关键词】：维生素C过氧化物酶(APX);逆境;表达调控
【基金】：河南科技大学人才科学研究基金;河南科技大学校青年基金(2006QN008)
【分类号】：Q946
【DOI】：CNKI:SUN:SWCX.0.2008-06-050
【正文快照】：
前言植物体内有效清除活性氧的保护机制可分为非酶促和酶促两类。非酶促类抗氧化剂包括抗坏血酸、谷胧甘肤和类黄酮等。酶促系统包括超氧化物歧化酶(s叩erexide dismutase，Son)、抗坏血酸过氧化物酶(aseorbate peroxidase，APX)、过氧化氢酶(c atalase，CAT)和谷胧甘肤过氧化
Ascorbate peroxidase(APX)was one of the important enzymes in plants and was an important factor in AsA-GSH cycle to eliminate H_2O_2,especially in chloroplast.Progress of expression and regulation of APX in plant was reviewed in this paper, including adversity(drought stress,air pollution,lack of microelement,ion stress,excess light,UV radiation and salt stress),programmed cell death(PCD),development and evolution.There were two types of apx genes,one expressed in stoma,the other expressed in thylakoid,and there were some differences in sequence of these two apx genes.Isolation and clone of apx genes in plant were reviewed as well as the transformation.The tendency in the future was also pointed out.
【Keyword】：Ascorbate peroxidase(APX);Adversity;Expression and regulation
植物抗坏血酸过氧化物酶研究进展(综述)--《亚热带植物科学》2006年02期
本文从酶的作用机制、酶学特征、分子生物学等方面综述植物抗坏血酸过氧化物酶(APX)的研究进展。
【作者单位】：福建农林大学园艺植物生物工程研究所;福建农林大学园艺植物生物工程研究所福建福州350002;福建省亚热带植物研究所;福建厦门361006;福建福州350002
【关键词】：植物抗坏血酸过氧化物酶(APX);维生素C过氧化物酶;H_2O_2
【基金】：国家自然科学基金(30471204);霍英东青年教师基金(71026);福建省自然科学基金(C0410012)资助
【分类号】：Q946
【DOI】：cnki:ISSN:1009-7791.0.2006-02-019
【正文快照】：
抗坏血酸过氧化物酶(APX),也叫维生素C过氧化物酶,存在于高等植物、真核藻类及某些蓝细菌中,在某些昆虫中也检测出APX活性[1]。抗坏血酸过氧化物酶属于末端氧化酶的一种,直到1976年才被Foyer和Halliwell发现[2]。近年来,其重要的生理生化功能得到广泛的关注。APX是血红蛋白,血红素过氧化物酶可以基于序列的比较以及酶位置分成三类,APX与细胞色素c同属于第一类[3]。APX与其它类最大的区别在于对底物AsA极高的专一性[4]。高等植物的APX同工酶主要分为两大类:胞质型(cytosolic APX,cAPX)和叶绿体型(chloroplasts
APX,chlAPX)。叶…
In this paper,the functional mechanism,enzymatic characteristics and molecular biology of ascorbate peroxidase in plants are reviewed.
【Keyword】：ascorbate peroxidase(APX);vitamin C peroxidase;H2O2
卷心菜中过氧化物酶热稳定性的初步方案设计研究
实验一卷心菜中过氧化物酶热稳定性的初步研究 一、实验原理 果蔬中的过氧化物酶（peroxidase）往往具有较高的热稳定性，对果蔬进行热烫处理时，常以过氧化物酶是否失活作为热烫是否充分的标准。许多研究表明果蔬中的过氧化物酶有热稳定和热不稳定两部分。这两部分的比例取决于果蔬的品种和热烫处理的温度。 过氧化物酶催化的典型反应为：H2O2＋AH2→A＋2H2O。 AH2是无色的还原性化合物，如果它经过氧化转变成有色的A，那么反应体系在特定波长下的吸光值就会随反应进行而增加。因此，可以用分光光度法测定过氧化物酶的活力。 二、试剂和仪器 试剂：0.05mol/L磷酸盐缓冲液pH7.0，含1.0mol/L NaCl(缓冲液Ⅰ)、0.1mol/L磷酸盐缓冲液pH7.0(缓冲液Ⅱ)、1%邻苯二胺-乙醇溶液、0.3%过氧化氢溶液 仪器：组织捣碎机、抽滤装置、水浴锅、721分光光度计（含比色皿）、秒表、常规玻璃仪器 三、实验步骤 1、从卷心菜中提取过氧化物酶 125g卷心菜＋125mL缓冲液Ⅰ ↓均质（20000rpm，2min） 匀浆 ↓抽滤
液体 ↓离心（8000rpm，15min，4℃） ↓ˉˉˉˉˉˉˉˉˉˉˉˉˉˉˉˉˉ↓ 残渣滤过液（粗酶液） 2、过氧化物酶热处理 将从卷心菜中萃取得到的过氧化物酶粗酶液置于试管中。 取适量酶液稀释5倍左右，过滤后测定酶活。 另取适量酶液分别置于已编号的试管中，将试管在60℃水浴中保温1 min，然后移至85℃水浴锅中，分别处理0.5min、1min、1.5 min、2 min、3 min、5 min、7 min和10 min，然后立即将试管转移至冰浴中，快速冷却至0℃。 再取适量酶液分别置于已编号的试管中，并将试管在60℃水浴中保温1 min，然后在100℃下分别处理15s、30 s、45 s、1 min、1.5 min、2 min 和3 min，然后在冰浴中快速冷却，测定残余过氧化物酶活力。 3、过氧化物酶活力测定 如果热处理后酶液中产生混浊，应在比色前过滤去除沉淀。 向比色皿中加入2.6mL缓冲液Ⅱ，0.1mL邻苯二胺-乙醇溶液，0.2mL过氧化氢溶液，然后加入0.1mL酶液，并立即搅匀计时，在430 nm下测定反应混合物的吸光值随时间的变化。空白以缓冲液代替酶液。根据吸光值变化情况调节加酶量，保持酶液和缓冲液体积之和恒定。 四、数据记录与处理 1、粗酶液活力测定数据
植物激活蛋白对番茄防御酶活性的影响
第34卷第5期湖南农业大学学报(自然科学版) Vol.34 No.5 2008年10月Journal of Hunan Agricultural University (Natural Sciences) Oct．2008 文章编号：1007-1032(2008)05-0534-04 植物激活蛋白对番茄防御酶活性的影响 李 丽1，2，刘 峥1，杨秀芬1，邱德文1* (1.中国农业科学院农业环境与可持续发展研究所，北京 100081；2湖南文理学院生命科学系，湖南常德 415000) 摘要：用2 μg/mL植物激活蛋白处理番茄叶片，测定番茄叶片内苯丙氨酸解氨酶(PAL)、过氧化物酶(POD)、POD同工酶、多酚氧化酶(PPO)和超氧化物歧化酶(SOD)含量．结果表明：经植物激活蛋白诱导处理后，防御酶活性明显增强．诱导1 d后，PAL活性最大，是对照的3.93倍，8 d后仍为对照的3.4倍；POD和PPO诱导后4 d 活性最高，分别比对照增加118.72% 和101.79%，8 d 后仍比对照高；SOD活性诱导后4 d达高峰，8 d后稍高于对照．POD同工酶活性诱导后3 d比对照增加了88.96%，同时还出现了新的酶带． 关键词：植物激活蛋白；番茄；诱导抗性；防御酶；灰霉病菌 中图分类号：Q554+.9 文献标识码：A Effect of plant activator protein on tomato defence enzyme LI Li1，2，LIU Zheng1，YANG Xiu-fen 1，QIU De-wen1* (1.Institute of Environment and Sustainable Development in Agriculture，Chinese Academy of Agricultural Science，Beijing 100081，China；2.Department of Life Sciences，Hunan University of Arts and Science，Changde，415000 China） Abstract：The induced resistance was studied in tomato leaves treated with 2 μg/mL plant activator protein. The phenylalanine ammonia-lyase(PAL), peroxidase(POD) and its isozyme,polypenoloxidase(PPO) and superoxide dismutase(SOD)concentration of tomato were tested. Results show the activities of defense enzyme in tomato leaves increased obviously. The activities of PAL peaked 1 day after the treatment while the activities of SOD, POD and PPO reached their maximum 4 days after the treatment．Compared with control, PAL, POD, PPO and SOD in treated leaves kept higher activities for 8 days during the experiment．Peroxidase isozyme in treated leaves reached the peak 3 days after inoculation 88.96% higher than that in the contro1,which could induce the thickening of the original isozyme bands and the expression of some new isozyme bands． Key words：plant activator protein；tomato；induced resistance；defense enzyme；Botrytis cinerea 诱导植物抗性的生物因子有非致病菌、弱毒菌株及蛋白激发子等，这些诱导抗性通常为系统获得抗性(system acquired resistance，SAR)或诱导系统抗性(induced system resistance，ISR)[1-3].苯丙氨酸解氨酶PAL、过氧化物酶POD、多酚氧化酶PPO和超氧化物歧化酶SOD是植物体内重要的防御酶，其活性高低与植物抗病性相关，PAL是植物体内莽草酸途径中的关键酶，其活性高低直接影响木质素、植保素等抗菌物质的合成，许多研究者发现，在诱导抗性特别是系统获得抗性中能产生具有抗菌能力的病程相关蛋白(pathogenesis-related protein，PR)[1,4].植物激活蛋白[5-6]是从真菌中分离提取的一类具有促进植物生长[7-8]和提高植物抗性的蛋白激发子，它对灰霉病菌(Botrytis cinerea)等多种植物病原真菌有较好的防效，防效达71.03%以上[9]．笔者以2 μg/mL植物激活蛋白和灰霉病菌孢子悬浮液分别处理番茄叶片，比较番茄叶片防御酶活性的变化，以期从诱导抗性的角度分析植物激活蛋白的诱导抗病性，为植物激活蛋白诱导抗性机理的研究提供参考. 1 材料与方法 1.1 材 料 植物激活蛋白提取自链格孢菌(Alternaria sp.) 收稿日期：2008-03-10 基金项目：国家“973”项目(2003CB114204) 作者简介：李丽(1978-)，女，湖南娄底人，硕士，湖南文理学院讲师．*通讯作者：dewenqiu@https://www.wendangku.net/doc/fb1003298.html,．
影响酶活性的因素
影响酶活性的因素 a.温度： 温度（temperature）对酶促反应速度的影响很大，表现为双重作用：（1）与非酶的化学反应相同，当温度升高，活化分子数增多，酶促反应速度加快，对许多酶来说，温度系数（temperature coefficient）Q10多为1～2，也就是说每增高反应温度10℃，酶反应速度增加1～2倍。（2）由于酶是蛋白质，随着温度升高而使酶逐步变性，即通过酶活力的减少而降低酶的反应速度。以温度（T）为横坐标，酶促反应速度（V）为纵坐标作图,所得曲线为稍有倾斜的钟罩形。曲线顶峰处对应的温度，称为最适温度（optimum temperature）。最适温度是上述温度对酶反应的双重影响的结果，在低于最适温度时，前一种效应为主，在高于最适温度时，后一种效应为主，因而酶活性迅速丧失，反应速度很快下降。动物体内的酶最适温度一般在35～45℃，植物体内的酶最适温度为40～55℃。大部分酶在60℃以上即变性失活，少数酶能耐受较高的温度，如细菌淀粉酶在93℃下活力最高，又如牛胰核糖核酸酶加热到100℃仍不失活。 最适温度不是酶的特征性常数，它不是一个固定值，与酶作用时间的长短有关，酶可以在短时间内耐受较高的温度，然而当酶反应时间较长时，最适温度向温度降低的方向移动。因此，严格地讲，仅仅在酶反应时间已经规定了的情况下，才有最适温度。在实际应用中，将根据酶促反应作用时间的长短，选定不同的最适温度。如果反应时间比较短暂，反应温度可选定的略高一些，这样，反应可迅速完成；若反应进行的时间很长，反应温度就要略低一点，低温下，酶可长时间发挥作用。 各种酶在最适温度范围内，酶活性最强，酶促反应速度最大。在适宜的温度范围内，温度每升高10℃，酶促反应速度可以相应提高1～2倍。不同生物体内酶的最适温度不同。如，动物组织中各种酶的最适温度为37～40℃；微生物体内各种酶的最适温度为25～60℃，但也有例外，如黑曲糖化酶的最适温度为62～64℃；巨大芽孢杆菌、短乳酸杆菌、产气杆菌等体内的葡萄糖异构酶的最适温度为80℃；枯草杆菌的液化型淀粉酶的最适温度为85～94℃。可见，一些芽孢杆菌的酶的热稳定性较高。过高或过低的温度都会降低酶的催化效率，即降低酶促反应速度。 最适温度在60℃以下的酶，当温度达到60～80℃时，大部分酶被破坏，发生不可逆变性；当温度接近100℃时，酶的催化作用完全丧失。 一般而言，温度越高化学反应越快，但酶是蛋白质，若温度过高会发生变性而失去活性，因而酶促反应一般是随着温度升高反应加快，直至某一温度活性达到最大，超过这一最适温度，由于酶的变性，反应速度会迅速降低。 热对酶活性的影响对食品很重要，如，绿茶是通过把新鲜茶叶热蒸处理而得，经过热处理，使酚酶、脂氧化酶、抗坏血酸氧化酶等失活，以阻止儿茶酚的氧化来保持绿色。红茶的情况正相反，是利用这些酶进行发酵来制备的。
耐高温酶
耐高温a-淀粉酶 一、概述 耐高温 a-淀粉酶是采用地衣芽孢杆菌经过深层次培养、提炼等工序精制而成。是一种内切酶能随机水解淀粉、糖原及降解物内部的 a-1.4-葡萄糖苷键使得胶状淀粉溶液的黏度迅速下降，产生可溶性糊精和寡聚糖，过度的水解可产生葡萄糖和麦芽糖。 二、适用范围 耐高温 a-淀粉酶具有极高的耐热性能，广泛用于淀粉、酒精、白酒、啤酒、味精、酿造、制糖、饴糖、纺织、印染、造纸及其他发酵等工业上。 三、产品特性 耐高温a-淀粉酶为褐色非粘性液体，无臭无刺激性异味，易溶于水，比重1.05-1.35g/ml ；较低浓度的钙离子存在，起到稳定酶活的作用 耐高温 a-淀粉酶最适温度为 90-95℃。本产品最适作用温度为 90℃以上（连续喷射液化中，温度也可在 100-105 摄氏度）。MOORETE40000耐高温ａ－淀粉酶稳定的PH范围５.０～１０.０，有效PH范围５．０～８．０。最适PH范围５．５～７．００，最佳PH范围为６．０～６．２，在淀粉糖和味精行业生产中均采用６．０～６．２。钙离子存在，可以起到保护酶的热稳定性作用，该酶对钙离子的浓度要求很低，为５０～７０㎎/㎏，如果自来水中有足够的钙离子，用自来水配料即可满足酶的要求，不必另加。Cu 、 Fe 、 Co 等金属离子对本品酶活力有一定影响， Al 、 Pb 、 Zn 等金属离子对本品酶活力有较强的抑制作用。 四、酶活力定义及参考用量 1、产品规格：液体型按活力分为20000 u/ml、26000 u/ml 、30000 u/ml、40000u/ml 四种。固体型分为20000u/g、40000u/g两种。 2、酶活力定义：在70℃、 PH6 条件上， 1 分钟液化可溶性淀粉 1 毫克成为糊精所需要的酶量为 1 个酶活力单位。参考用量： 0.2-1千克/ 吨淀粉原料。 3、产品标准：执行中华人民共和国行业标准QB/T2306-97。国家标准：GB/8275-2009。 五、应用方法 1啤酒工业：待辅料与水均匀混合后，一次加入本品 0.3 升左右（ 20000u/ml ）左右，迅速升温， 95 -97 ℃时效果最佳。升温至 100 ℃，保温30 分钟左右，碘液实验合格则液化完成。 2酒精工业：原料以直径为 1.5mm 为宜，以料水比 1:3.5-4.0 混合均匀，水温 45 -55 ℃。加入高淀 0.6 升 / 每吨（ 20000u/ml ）左右，搅拌后泵入蒸煮加热器，温度控制在 95 -105 ℃，时间 100 分钟，冷却糖化。 3味精、饴糖和葡糖糖等工业：可根据工艺要求制成淀粉乳，调 PH6.2 左右，每吨加入本品 0.6-0.7 升左右（ 20000u/ml ）。如采用间歇液化，液化罐迅速升温到 95-100 ℃，
烟草品种防御酶活性对黑胫病菌响应差异
云南农业大学学报Journal of Yunnan Agricultural University，2012，27（3）：321－326http：//https://www.wendangku.net/doc/fb1003298.html, ISSN1004－390X；CODEN YNDXAX E-mail：xb@https://www.wendangku.net/doc/fb1003298.html, DOI：10.3969/j.issn.1004－390X（n）.2012.03.004 烟草品种防御酶活性对黑胫病菌响应差异* 王戈1，杨焕文1＊＊，赵正雄1，李佛琳1，易建华2 （1．云南农业大学烟草学院，云南昆明650201；2．云南省进出口检验检疫局，云南昆明650228） 摘要：以不同抗、感黑胫病烤烟品种云85（高抗）、K326（中抗）、净叶黄（中感）和红花大金元（高感）为供试材料，采用人工接种方法研究了黑胫病菌诱导的这些品种超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、多酚氧化酶（PPO）和苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性差异及其与品种抗性的关系。结果表明，接种黑胫病后不同抗性品种SOD，POD，PPO和PAL活性与对照相比均出现明显提高，抗病品种SOD和POD活性较感病品种上升快且维持较高活性水平，且抗病品种POD酶活高峰较感病品种出现得早；抗病品种PPO和PAL较感病品种活性上升幅度更大，维持时间更长。相关性分析表明，SOD，POD，PPO和PAL活性与品种的黑胫病抗性呈正相关关系。 关键词：烤烟；黑胫病；超氧化物歧化酶；过氧化物酶；多酚氧化酶；苯丙氨酸解氨酶 中图分类号：S435.72文献标识码：A文章编号：1004－390X（2012）03－0321－06 Response Difference of the Defence Enzymes of Flue-cured Cultivars to Phytophora parasitica var．nicotiana WANG Ge1，YANG Huan-wen1，ZHAO Zheng-xiong1，LI Fo-lin1，YI Jian-hua2 （1．College of Tobacco Science，Yunnan Agricultural University，Kunming650201，China； 2.Entry-exit Inspection Quarantine Bureau，Kunming650228，China） Abstract：Four different resistance cultivars，Yun85（high resistance，HR），K326（middle resistance，MR），Jingyehuang（middle susceptibility，MS）and Hongda（high susceptibility，HS）were used to study SOD，POD，PPO and PAL active dynamic and relation with resistance after inoculation with Phyto-phora parasitica var．nicotiana．The result showed that compared with control，SOD，POD，PPO and PAL activity of difference resistance cultivars all appeared obvious increase after inoculation．And dis-ease-resistant cultivar raise was rising faster than susceptible cultivars and keep higher activity．POD ac-tivity of resistance cultivars was earlier than susceptible cultivar．Rising range and holding time of PPO and PAL activity of disease-resistant cultivars were greater and longer than susceptible one．Correlation analysis showed that there was a positive correlation between SOD，POD，PPO and PAL and resistance．All above results demonstrated that there was obvious response difference of SOD，POD，PPO and PAL activity to P．parasitica var．nicotiana and was direct correlation with cultivar resistance． Key words：flue-cured tobacco；Phytophora parasitica var．nicotiana；uperoxide dismutase；peroxi-dase；polyphenol oxidase；phenylalanine ammonia lyase 收稿日期：2011－07－09修回日期：2011－11－10网络出版时间：2012－05－1010?21 *基金项目：中国烟草总公司重大科技专项及云南省烟草公司项目（09YN022）。 作者简介：王戈（1982－），男，云南沾益人，博士研究生，主要从事烟草生理生化研究。 E-mail：wangge302@https://www.wendangku.net/doc/fb1003298.html, ＊＊通讯作者Corresponding author：杨焕文（1963－），男，云南剑川人，教授，博士生导师，主要从事烟草生理生化教学及科研工作。E-mail：mryanghuanwen@https://www.wendangku.net/doc/fb1003298.html, 网络出版地址：http：//https://www.wendangku.net/doc/fb1003298.html,/kcms/detail/53.1044.S.20120510.1021.201203.321_009.html
嗜热酶耐热机制及提高酶热稳定性的研究进展
亚热带农业研究第2卷第4期Subtr op ical Agriculture Research2006年11月嗜热酶耐热机制及提高酶热稳定性的研究进展 吴穗洁1,吴文林2,刘 斌33 (1.厦门大学生命科学学院,福建厦门361005;2.泉州师范学院生物系,福建泉州362000;3.福建农林大学食品科学学院,福建福州350002) 摘要:嗜热酶因其在高温条件下特殊的耐受及催化功能,在工农业生产方面有着广阔的应用前景。本文从蛋白质一级结构、高级结构的特点和环境因素的影响几方面,简要概述了近年来在耐热机理这一领域的研究进展,并介绍了常用的有效提高酶稳定性的方法。 关键词:嗜热酶;耐热性;耐热机制;稳定性改造 中图分类号:Q939.129文献标识码:A文章编号:167320925(2006)0420293205 Advances i n m echan is m s of ther m ost ab ility of therm ozym es and stra teg i es for therm ost ab ili za iton WU Sui2jie1,WU W en2lin2,L I U B in3 (1.School of life Sciences,Xia men University,Xia men,Fujian361005,China;2.Depart m ent of B i ol ogical Sciences,Quanzhou Teachers College,Quanzhou,Fujian362000,China;3.College of Food Science,Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou,Fujian350002,China) Abstract:Ther mozy mes have received increasing research interest due t o their ther mostability and op ti m al activity at high te mpera2 tures and potential app licati on in vari ous industrial p r ocesses and markets.This paper gives a brief overvie w of the advance in the mechanis m s of ther mostability,encompassing the effects of the p ri m ary structure and advanced structure of the p r otein and s ome en2 vir on mental fact ors.Moreover,s ome useful p r otein ther mostability engineering methods were intr oduced. Key words:ther mozy me;ther mostability;mechanis m of ther mostability;ther mostability engineering 自1969年从美国黄石国家公园分离出第1个严格意义的水生栖热菌(Ther m us aquaticus)嗜热菌以来,已有超过70个属140种嗜热菌被发现,包括矿泉古生菌界嗜热菌、宽广古生菌界嗜热菌、细菌域嗜热菌(高温神袍菌、产水细杆菌、产芽孢高温菌、非芽孢高温菌)等[1]。理论及现实证据表明,超嗜热菌(hy2 perther mophile)可能是地球上形成的第一类生命形式[2],其高温、高压、低氧的生存环境与早期地质环境相似,研究它对探索生命起源具有重要意义。 嗜热菌的代谢过程和特殊的生物学功能,是由在极端条件下的酶和蛋白质的功能所决定的。从这些嗜热极端微生物中分离出来的酶具有极高的热稳定性、pH稳定性和耐受物理、化学变性剂的优良特性,在工农业生产中具有巨大的应用价值,引起了研究者广泛的关注和兴趣。与常温酶相比,嗜热酶作为生物催化剂有许多优势[3]。(1)加快了动力学反应。(2)对反应的冷却系统要求降低,因而降低了能耗,既可降低成本,又可减少冷却过程对环境造成的污染。(3)稳定性提高,可在室温下分离、提纯和包装运输,并长时间保持活性。(4)在嗜热酶催化反应的条件下(大于60℃),减少了杂菌的污染,从而减少了细菌的代谢产物对产品的污染,可提高产物的纯度,简化提纯过程。(5)生化过程在高温下进行,能改善底物如淀粉、纤维素、脂类的溶解性和可利用性,降低有机化合物的黏度而利于物质的扩散和混合。(6)能耐受物理和化学变性剂(表面活性剂、有机溶剂),极端pH等。基于上述优点,嗜热菌、超嗜热菌及其产生的嗜热酶在食品、化工、制药、能源开发和环境保护等领域具有广阔的应用前景。 同时,嗜热酶还被生物学家、化学家、物理学家广泛作为一种模式来探索酶的进化、蛋白质质热稳定性 收稿日期:2006-08-19 作者简介:吴穗洁(1982-),女,硕士研究生。研究方向:嗜热酶。 3通讯作者。刘斌(1969-),男,副教授。研究蛋白质方向:嗜热微生物,嗜热酶和高温病毒。
纤维素酶稳定性的研究
纤维素酶稳定性的研究 一．背景介绍 纤维素是地球上最丰富、最廉价的再生资源。有资料表明 ,全世界每年的植物体生成量达1500亿吨干物质 ,其中纤维素及半纤维素的总量为850亿吨。纤维素的基本单位是葡萄糖 ,但由于纤维素具有水不溶性的高结晶构造 ,其外围又被木质素包围着 ,要把它水解成可利用的葡萄糖非常困难。所以到目前为止仍没有得到很好地利用。当前 ,新能源、新食品资源的开发利用是世界各国都在研究的重大课题 ,因此 ,纤维素酶的研究成为其主要组成部分。 纤维素是一种多糖, 是葡萄糖以β- 1,4-糖苷键结合的聚合物, 在自然界中储量极其丰富, 在纤维素酶的催化条件下可分解产生二糖或葡萄糖, 纤维素的利用目前尚未完全开发, 造成资源及能源的巨大浪费。为了更好地利用纤维素, 愈来愈多的国内外学者开始关注纤维素酶的研究与应用, 期望能借助纤维素酶将地球上最丰富(占全球总生物量 80%)、最廉价的可再生资源纤维素转化为能直接利用的能源和资源。现在纤维素酶的应用已扩展到食品发酵、医药、纺织、日用化工、造纸、工业洗涤、烟草、石油开采、废水处理及饲料等各个领域, 其应用前景十分广阔。[1] 1. 纤维素酶的组成 纤维素酶是指 3种起协同作用的一组酶的总称 ,现已确定纤维素酶主要组分如下: 内切型葡聚糖苷酶、外切型葡萄糖苷酶、纤维二糖酶。[2] 2. 纤维素酶的特性 2.1 内切型葡聚糖苷酶 也称 Cx酶、CMC酶。它以随机的形式在纤维素聚合物内部的非结晶区进行切割 ,对末端键的敏感性比间键小。其主要产物是纤维糊精、纤维二糖和纤维三糖等带非还原性末端的小分子纤维素。[2] 2.2 外切型葡萄糖苷酶 又叫纤维二糖水解酶或微晶纤维素酶。该酶在天然纤维素的降解过程中起主导作用 ,
酶活测定方法
二十、果蔬中多酚氧化酶活性的测定 一、目的要求 了解多酚氧化酶的作用，掌握果蔬组织中多酚氧化酶活性的测定方法。 二、基本原理 多酚氧化酶（Polyphenol oxidase，PPO）是一种以铜为辅基的酶，能催化多种简单酚类物质氧化形成醌类化合物，醌类化合物进一步聚合形成呈现褐色、棕色或黑色的聚合物。在后熟衰老过程或在采后的贮藏加工过程中，果蔬出现的组织褐变与组织中的多酚氧化酶活性密切相关。 多酚氧化酶催化邻苯二酚氧化形成的产物在420 nm处有最大光吸收峰。因此，可利用比色法测定多酚氧化酶的活性。 三、材料、仪器及试剂 （一）材料 梨、苹果、马铃薯等。 （二）仪器及用具 研钵、高速冷冻离心机、分光光度计、计时器、移液器、离心管、试管、容量瓶（100mL、1000 mL）。 （三）试剂 1．100 mmol/L、pH 5.5醋酸缓冲液 母液A（200 mmol/L醋酸溶液）：量取11.55 mL冰醋酸，加蒸馏水稀释至1 000 mL。 母液B（200 mmol/L醋酸钠溶液）：称取16.4 g无水醋酸钠（或称取27.2 g 三水合乙酸钠），用蒸馏水溶解、定容至1 000 mL。 取68 mL母液A和432 mL母液B混合后，调节pH至5.5，加蒸馏水稀释至1 000 mL。 2．提取缓冲液（含1 mM PEG、4% PVPP和1% Triton X-100） 称取340 mg PEG 6000（聚乙二醇6000）、4 g PVPP（聚乙烯吡咯烷酮，Polyvinyl–polypyrrolidone），取1 mL Triton X-100，用100 mmol/L、pH 5.5醋酸缓冲液溶解、稀释至100 mL。 3．50 mmol/L邻苯二酚 称取275 mg邻苯二酚，用50 mmol/L、pH 5.5醋酸缓冲液溶解、稀释至50 mL。 四、实验步骤 （一）酶液制备 称取5.0 g果蔬组织样品，置于研钵中，加入5.0 mL提取缓冲液，在冰浴条件下研磨成匀浆，于4℃、12 000×g离心30 min，收集上清液即为酶提取液，低温保存备用。 （二）活性测定 取一支试管，加入4.0 mL 50 mmol/L、pH 5.5的醋酸缓冲液和1.0 mL 50 mmol/L邻苯二酚溶液，最后加入100 μL酶提取液，同时立即开始计时。将反应混合液倒入比色杯中，置于分光光度计样品室中。以蒸馏水为参比，在反应15 s 时开始记录反应体系在波长420 nm处吸光度值作为初始值，然后每隔1 min 记录一次，连续测定，至少获取6个点的数据。重复三次。 五、实验结果与计算 1．将测定的数据填入下表
纯化鸡蛋清溶菌酶的热稳定性分析
实验四 纯化鸡蛋清溶菌酶的热稳定性分析 一、实验目的 1，了解各环境因素（如：温度、pH 值等）对酶稳定性的影响。 2，了解衡量酶稳定性的指标：半衰期T 1/2。 二、实验原理 酶的稳定性常用半衰期（T 1/2：：一定条件下酶活力丧失50%所需的时间）来衡量。一般来说半衰期越长表明酶在特定条件下的稳定性越好。 溶菌酶的热失活行为可简化为不可逆的一级失活模型 令时间为t 时活性酶的浓度为[E]t , 酶活性为A t ，则有： 根据式（1），以0 ln t A A 对处理时间t 作图其斜率即为d k 。进而通过式（2）便可求得半衰期（T 1/2）。 三、实验材料、试剂、仪器 1. 材 料：实验二亲和层析所得的纯化鸡蛋清溶菌酶。 2. 试 剂：0.5 mol/L NaOH 。 3. 仪 器；pH 计、离心管、金属浴 四、实验步骤 1.酸性条件下溶菌酶的稳定性 稀释5倍 75℃ 纯化溶菌酶—————→分装离心管（0.5mL/管）———→分别处理0, 10, 20, 40, 60 min 保温 冷却至室温 ———————→测酶活 2. 碱性条件下溶菌酶的稳定性 稀释5倍 75℃ 纯化溶菌酶—————→调pH 值调至8.0左右—→分装离心管（0.5mL/管）———→分别 保温 冷却至室温 0000 1/2[][][][]exp()ln[]ln[]ln ln ln .................................(1)ln 2 ..................................(2)t d t t d t d t d d t d d E k E dt E E k t E E k t A A k t A k t A T k -==-=-=-==
酶的结构,功能,稳定性及其计算和应用
大题目:酶的结构，功能，稳定性及其计算和应用：从原子，分子到网络 1.纤维素酶的结构，功能，稳定性：实验（吕红） 2.纤维素酶的结构，功能，稳定性：计算（黄强，吕红） 3. b ａｍｏｇｕｉｓｈ的蛋白folding和高聚合：计算（韦广红吴？） 4.单分子酶动力学及其在细胞网络中的建模：（葛？钱纮） 5.小GTPase的酶动力学测量：实验（王志新） 6.纤维素酶的X-光结构与ｍｕｔａｔｉｏｎ（徐？吕红） 7.ｌａｃｏｐｅｒｏｎ的计算与实验比较（吕红葛？） 8.T4 lysozyme结构与稳定性的建模（吴？） 9.cAMP ｘｘｘ酶的结构与功能（余绍宁复旦化学系） 10.酶的动力学和核磁氢交换方法：实验（余绍宁王文宁） 11.酶的动力学和核磁氢交换方法的建模：计算（韦广红钱纮） 1.纤维素酶的结构，功能和稳定性实验和计算 九十年代，美国？大学的分子生物研究所开展了一个为期十年的“T4 lysozyme”项目，这个工作是由美国科学院院士Brian mottens带领，有几个组（例如科学院院士john schellman）参加的。这个为期十年之久，有多于十数篇nature和science论文结果的大项目的中心思想是要为酶的结构与其热稳定性，以及突变的关系进行一个系统的研究，从而为更为广泛的蛋白，酶的结构与稳定性以及功能提供一个“理想模型”。 但是，这个为期十年余的工作，有一个很大的问题。那就是它没有把酶的活性作为一个重要的研究对象，因此，整个T4 lysozyme项目虽然位蛋白的folding打了一个很好的实验基础，它的结果没有能够更为有效的在酶的工程和应用中起大作用。更为重要的是，整个T4 lysozyme项目没有能够把那“浩如烟海”的实验数据（主要是突变子的蛋白三维结构以及蛋白的热稳定性）用一个计算生物学的方法进行提高和总结。所以，T4 lysozyme的大量经验至今（查文献！！！）没有能为更多的蛋白工程服务。 在我国国内，从七十年代起，邹承鲁先生就一再提出酶的稳定性与功能的关系。邹先生的这一倡导是有很深刻的生物意义的：他指明光是研究蛋白（或酶）的结构与folding的关系是不够对真正的生物科学有重大贡献的，正像美国科学家John Hophield鲜明的指出的：若是只对生物系统中的过程的物理性质进行研究，但是不对过程的“生物功能”进行讨论，那么这样的研究只不过是在“海边玩沙子”——生物学家没有兴趣的。 我们对纤维素酶的研究证实在以上的大背景中进展的。由于我们的工程目的是纤维素酶在高温下的高活性，功能和热稳定性是我们最为关注的问题。通过突变和结构，我们希望能够建立一套计算的方法来预测突变引起的酶的高温下的活性，从酶的理论上来讲，我们的工作将是继承和发展T4 lysozyme项目和邹承鲁先生的工作，使之得以发扬和光大。 最简单的模型：最简单的数学模型假设只要酶是folded，它的活性是个常数，不跟着温度而改变，但是因为温度对酶的fold和unfold有影响，而unfold的酶是没有活性的（活性为零），因此我们能有 活性（Ｔ）＝ｆｏｌｄｅｄ酶活性＊ｆｒａｃｔｉｏｎｆｏｌｄｅｄ＋０＊ｆｒａｃｔｉｏｎｆｏｌｄｅｄ 而其中ｕｎｆｏｌｄｅｄ／ｆｏｌｄｅｄ＝Ｋ（Ｔ）是ｆｏｌｄｉｎｇ－ｕｎｆｏｌｄｉｎｇ的平衡常数：ＲＴＬＮＫ（Ｔ）＝△Ｇ 在以上的模型中我们假设了ｆｏｌｄｅｄ酶的活性是与温度无关的。这个假设是不够准确的，为了更好的深化我们的模型，我们有兴趣研究ｆｏｌｄｅｄ酶的活性是怎么样跟着温度
POD活性测定
可见光的范围350-770，紫外A 400-315nm，B 315-280nm，C 280-190nm 酶活单位=△ODmg一1·FW·min一1 1. POD活性测定：称取组织1g放于研钵中，加5mL0.05mol/L的磷酸缓冲液（pH5.5）在冰浴中研磨成匀浆。将匀浆全部转入离心管中，在3000rpm，4℃条件下离心10min，上清液为酶粗提液，4℃保存备用。 取酶液100μL，加反应混合液 1. 2.9ml 0.05mol/L的磷酸缓冲液(pH5.5) 2. 1mL 0.05mol/L愈创木酚溶液，0.05mol/L愈创木酚溶液,0.06207g愈创木酚定容10ml 3. 1.0 ml 2%H2O2, 30% H2O2670μL，加水至10ml. 在37℃水浴中混合均匀，于470nm处测定其吸光度，连续记录3min。以不加酶的反应混合液作对照，每30秒钟读一次数，以每分钟吸光度值变化值0.01为一个酶活单位。 酶活计算: OD290。g- 1.FW.h- 1=OD变化值/材料鲜重/反应时间 POD的酶活性增加倍数与抗病性呈正相关 2. CAT活性测定：设置两个重复一个对照,测定体系包括 1. 0.2 ml酶液、 2. 1.5 ml磷酸缓冲液pH7.0、 3. 1 ml蒸馏水， 4. 25℃预热后逐管加入300μL 0.1 mol/L的H2O2 (30% H2O256.8μL加水至10ml.) 在240 nm下测定吸光度，每隔1 min读一次，共测3 min，以1 min内减少0.1的酶量为1个酶活单位。 3. SOD活性的测定：采用改进的高灵敏度的氯化硝基氮兰四唑（NBT）光还原法测定SOD活性。每处理取3个小烧杯，分别加入3mLSOD反应液（参照附录B）， A）0.lmol/L pH7.8磷酸缓冲液 准确称取0.72gNa2HPO4·12H2O溶于20ml水中取18.3mL；准确称取0.312gNaH2PO4·2H2O 溶于20mL水中取1.7mL，混合并定容至20mL。 （B）104mmol/L的甲硫氨酸称取0.39g甲硫氨酸溶解并定容至25mL。 （C）0.3mmol/L的NBT 称取0.0025g氯化硝基氮兰四唑（NBT），溶解后定容于10mL。（D）0.8mmol/L的乙二胺四乙酸（EDTA）准确称取0.01gEDTA，定容于25mL。 （E）50μmol/L的核黄素称取0.0012g核黄素，定容于10mL容量瓶中。 取A液8mL、B液2mL、C液4mL、D液2mL，共16mL混匀为SOD反应液。 再加入150μL的50μmol/L的核黄素和150μL粗酶液，在25℃，4000Lx光照20min后于黑暗中停止反应。另作一组不加酶液其它处理同前的作为空白对照，并以pH7.8磷酸缓冲液调零。在560nm下测定吸光度。 计算公式：SOD的OD560值/g鲜重=（对照OD560-样品OD560）/0.5×60 分别计算不同酶液量的各反应系统中抑制NBT光还原的相对百分比,作出二者相关曲线,找出抑制NBT 50%光化学还原的酶液量(μl),定为一个酶活单位U,计算总酶活单位和酶的比活性。 4. MDA含量测定：取④中粗酶液1.5mL，加入2.5mL0.5%的硫代巴比妥酸（TBA，取0.5gTBA溶解于100mL20%三氯乙酸），在沸水浴中保温30min后，立即冷却，10000rpm 离心20min，取上清液分别在450nm、532nm和600nm下测吸光度值（A），计算公式：MDA （μmol/L）=6.45（A532-A600）-0.56A450。 5. PPO活性的测定：植物组织1g，用预冷的PH7.8(0.05M)磷酸缓冲液1ml，研磨，再加1ml缓冲液，倾入5ml离心管，于4度，10000rpm下离心20min，收集上清。反应体系为3ml0.2M邻苯二酚（用pH7.8磷酸缓冲液配制），1ml酶液，以灭活的酶液为空白对照，
海藻糖对酶热稳定性保护作用的研究
海藻糖对酶热稳定性保护作用的研究 李 群 袁勤生 李永丰 (华东理工大学生化研究所,上海200237) 摘 要 初步研究了海藻糖在保护酶蛋白热稳定性方面的作用。实验表明:海藻糖可以作为一种天然保藏剂,有效地提高酶蛋白的热稳定性;本文还分别比较了葡萄糖、蔗糖、甘露醇和海藻糖对酶蛋白的保护效果,结果发现海藻糖保护效果最佳,蔗糖次之,葡萄糖和甘露醇较差。 关键词 海藻糖;乙醇脱氢酶;超氧化物岐化酶(SOD);热稳定性 酶在医药、化工、食品及临床与化学分析等领域获得了广泛的应用。但是由于酶不稳定而使其应用开发受到限制。虽然引起酶蛋白变性的因素很多,如物理因素、化学因素以及生物学因素等,但是温度却是造成酶失活的最主要因素。近年来,一种建立在海藻糖基础上的天然保藏剂,为酶的热稳定性保护提供了新的方法。海藻糖是由两个葡萄糖残基通过半缩醛羟基结合而成的一个非还原性二糖,在昆虫、无脊椎动物、酵母、真菌的孢子和子实体以及高等植物中都发现其存在,化学性质很稳定[1]。本文采用海藻糖作为酶的稳定介质,初步研究了它对乙醇脱氢酶和SOD 的保护作用,并比较了葡萄糖、蔗糖、甘露醇和海藻糖在保护酶活方面的效果。 1 材料与方法 1.1 材料 海藻糖由上海生化试剂商店提供;SOD 由华东理工大学生化研究所提供;葡萄糖、蔗糖、甘露醇均为分析纯试剂。 1.2 方法 1.2.1 酵母中乙醇脱氢酶的制备[2] 150ml0.066mol/L的Na2HPO4溶液加入到达50克酿酒酵母细胞中,37℃水浴中搅拌保温2h后,取出,室温下再搅拌抽提3h,离心弃菌体,上清液立即置于55℃水浴中15m in,冷却后离心,上清液置0℃冰箱中过夜。 冰浴下按每100ml的抽提液中,加入50m l的冷丙酮,20min后,0℃离心,弃沉淀;再在上清液中按每100ml加入55ml冷丙酮, 0℃维持20m in后离心,弃上清液,沉淀用冰水溶解,置透析袋中透析3h,3500r/min下离心20m in,弃沉淀。每100ml上清液中加入36g硫酸铵,0℃冰箱放置3h,14000r/m in离心20min,弃上清液;沉淀用15ml水溶解,加入3g硫酸铵,盐析3h后离心弃沉淀。上清液中即含有乙醇脱氢酶。 乙醇脱氢酶活力测定采用Dotzayer 法[3]。 1.2.2 酵母蛋白的制备及测定(4) 20克酵母中加水30ml,在-20℃下速冻2h,取出放在20℃恒温水浴中保温30min,为一次冻融;重复三次。离心取出上清液,得到酵母蛋白。 利用紫外分光光度计分别测定酵母蛋白溶液样品在260nm,280nm处的吸光度值,按下表计算蛋白含量: 蛋白质浓度(mg/m l)= 1.55A280-0.77A260 28 药 物 生 物 技 术 Pharm aceutical Biotechnology 1997,4(1):28～31 收稿日期 1996-05-20
耐热酶的机制
耐热酶天然构象的耐热机制 (1). 氨基酸组成 高温下嗜热酶中一些氨基酸会出现共价修饰作用主要Asn、Gln、Ser、Cys等氨基酸的脱氨、氧化水解、二硫键相互转化等，因此这些不稳定氨基酸在嗜热酶中含量较低。而Pro、Arg、Glu含量较高。Pro由于其结构熵比其它氨基酸小且更易折叠，一旦折叠则需要更多的能量才能解开，所以Pro在嗜热酶中含量高于常温酶，Arg和Glu分别比带同种电荷的氨基酸有更大的侧链，侧链所提供的疏水作用及离子间相互作用有助于提高蛋白质的热稳定性。在螺旋的排布中，有支链的氨基酸（如Va l、Th r）结构上会有更多的限制，因此，它们在嗜热酶中出现的频率很低。 (2). 共价键的抗性 嗜热酶是通过共价修饰而非解折叠失活的，共价键抗性越强的酶越稳定。已表明，二硫键在60℃—80℃时，可稳定嗜热酶。 (3). α-螺旋的稳定性 引入易形成螺旋的氨基酸残基可增加α-螺旋的稳定性，Al a常出现在嗜热酶的螺旋中。已有人将一个及多个Ala引入T 溶菌酶的螺旋中，除Leu133Ala突变（增加内部空穴且减少了螺旋的局部刚性）外，所有突变都增加了酶的稳定性。 (4). 疏水作用 人们认为疏水作用为蛋白质在水溶液中折叠提供能量。PaceC N对四种酶的72个脂肪侧链突变中发现，每一个包埋的-CH为酶构象的稳定提供了平均1.3 kcal*mol的能量。 (5). 氢键 氢键对蛋白质稳定性的贡献早已被定点突变所证实，但直到1996年才被常温酶与嗜热酶的结构比较结果所验证。J.Tanner等比较了T.aquati—cus GAPDH与其它三种同源酶的结果发现，耐热性与亚基间的氢键(带电基团-中性基团)数目成正相关。Hideaki S等研究也发现，嗜热菌Chlorobium tepidum的苹果酸脱氢酶(MDH)每个亚基间的氢键比常温菌Chlorobium vibrioforme MDH 的要多。比较常温酶与嗜热酶的结构发现，这种耐热相关性广泛存在于自然界。 (6). 离子网状结构 极端蛋白质的晶体结构表明，离子对可能在超嗜热蛋白(其中疏水效应较小)的稳定中起主要作用，它可使二级结构稳定，增强其刚性。从超嗜热菌及常温菌中分离到的葡萄糖苷酶的结构比较也表明，超嗜热酶在其蛋白表面有更多的离子对，因此更耐热。嗜热酶Arg／Lys 比常温酶更高Arg在高温下可更好地参与离子键形成，可能由于其含胍基及其更长的侧链，比Lys提供离子键的范围更广。离子网状结构比疏水作用的作用范围更大，这在超嗜热酶中