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台湾金线莲转录组特性研究

分子植物育种,2015年,第13卷,第12期,第2743-2753页Molecular Plant Breeding,2015,Vol.13,No.12,2743-2753

研究报告

Research Report

台湾金线莲转录组特性研究

姜福星1魏丕伟2寇亚平3贾茵1陈其兵1*

1四川农业大学园林研究所,成都,611130;2四川理工学院生物工程学院,自贡,643000;3中国农业大学园艺学院,北京,100083*通讯作者,cqb@https://www.wendangku.net/doc/f21890179.html,

台湾金线莲(Anoectochilus formosanus )是我国传统的珍贵药材,素有“金草”、“神药”等美称,具有很

高的药用价值、观赏价值和经济价值。台湾金线莲的全草入药,且挥发油中也含有多种药用成份。本研究采用Illumina HiSeq 2000高通量测序技术,对其全草进行转录组分析,共获得原始数据5.3Gb ,有效数据4.4Gb ,Unigene 有173513条,Unigene 平均长度为680bp ;通过与其他核酸、蛋白质数据库的Blast 比对,58451条得到Nr 功能注释,21386条得到COG 功能分析,45812条GO 功能解释。KEGG 代谢途径研究发现,130条Unigene 与黄酮类物质有关,114条Unigene 与生物碱有关,441条Unigene 与萜类物质有关。搜索发现21195个微卫星位点,其中单核苷酸最多有13126个,占61.93%,其次分别是三核苷酸和二核苷酸,分别占17.4%和15.61%。

关键词台湾金线莲,转录组分析,药用活性成份,微卫星标记

Study on the Characterization of the Transcriptome of Anoectochilus formosanus Taiwan

Jiang Fuxing 1Wei Piwei 2Kou Yaping 3Jia Yin 1Chen Qibing 1*

1Institue of Garden Research,Sichuan Agriculture University,Chengdu,611130;2College of Bioengineering,Sichuan University of Science and Engineering,Zigong,643000;3College of Horticulture,China Agricultural University,Beijing,100083*Corresponding author,cqb@https://www.wendangku.net/doc/f21890179.html, DOI:10.13271/j.mpb.013.002743

Abstract Anoectochilus formosanus is a precious traditional Chinese medicine,known as the laudatory name of “Golden grass ”,“God medicine ”,have high medicinal,ornamental and economic value.Stems and leaves from Anoectochilus formosanus are commonly used medicinal parts,and the volatile oil also contains a variety of me-dicinal ingredients.We sequenced the global transcriptome of stems and leaves from Anoectochilus formosanus with RNA-seq method by using Illumina HiSeq TM 2000platform,raw data of 5.3Gb were obtained,valid data of 4.4Gb were acquired,173513unigene were acquired,the mean length were 680bp.Among of them,58451annotation was from Nr,21386from COG,45812from GO by compared with functional annotation against these databases.Through the study of KEGG secondary metabolism,we discovered 130Unigene involved in flavone biosynthesis,additionally,114Unigene and 441Unigene were predicted to take part in alkaloid and terpenoid biosynthesis.21195SSR locus were found,trinucleotide repeat was the highest reaching 13126,which was 61.93%,following by trinucleotide and dinucleotide,they were 17.40%and 15.61%.

Keywords Anoectochilus formosanus ,Transcriptome analyse,Pharmaceutically active ingredient,SSR marker 基金项目:本研究由四川省教育厅重点项目(15ZA0023)资助

台湾金线莲(Anoectochilus formosanus Hay )系兰科开唇兰属(Anoectochilus spp )多年生草本植物,又

名“台湾金线兰”,全草入药,具有清热解毒、退风祛湿、凉血平肝、降血糖、镇痛等药效,对肿瘤、糖尿病、肝炎等多种疑难病症均有较好的疗效,具有“百药之

王”、“金草”、“神药”等美誉(周玉美,2009;周玉美等,

2009)。台湾金线莲全草药食兼用,国内外分析表明,

植株体内含有黄酮、多糖、生物碱、氨基酸、金线莲苷

分子植物育种Molecular Plant Breeding

及免疫蛋白等多种有效成分(钟添华等,2006;杨秀伟等,2007;王常青等,2008;Du et al.,2008;Kuan et al., 2011;Zhang et al.,2013);也叶片发出淡淡的清香,药食兼用,营养保健价值很高(柯伙钊等,2010,中成药, 32(11):2014-2017)。同时又有较高的观赏价值,小巧的叶片丰盈椭圆,墨绿色叶表衬以灿黄的网脉,闪亮夺目,可作为盆景、盆花等(周玉美等,2009)。开唇兰属植物共有40余种,进行人工开发的,仅有台湾金线莲(A.formosanus)、恒春金线莲(A.koshunensis)和福建金线莲(A.roxburghii)这3种,对该属其他植物的研究甚少,有很大的开发潜力和发展空间,亟需进行种质资源及其遗传背景的研究工作(何春年等,2004,中国药学杂志,39(2):81-84)。

台湾金线莲的研究多集中于生物学特性的调研、栽培技术、组培快繁和药用成分的初步分析,但是对其分子机制和相关功能基因的研究很少,遗传信息严重缺乏,给深入研究带来了很大的困难(何春年等, 2004,中国药学杂志,39(2):81-84;Kuan et al.,2011)。

无论是对台湾金线莲珍稀的野生资源进行研究和保护,还是对组培和人工栽培条件下发生的变异等问题进行分析,以及同属不同种间及其相近属的种类进行鉴定,均亟需更多的分子数据及更有效的分子标记,便于更好展开工作(何春年等,2004,中国药学杂志,39(2):81-84;Zhang et al.,2010;Lv et al.,2015)。而根据转录组测序结果分析不同微卫星(SSR)基序出现的频率和规律,是进行微卫星(SSR)标记开发的有效途径(王晓锋等,2013;贾新平等,2014;巩檑等,2015)。

RNA高通量测序技术的快速发展极大促进植物基因表达的研究(郝大程等,2012),转录组测序(tr-anscriptome sequencing)技术能够进行分析植物在特定的时间和空间内基因表达的情况和转录本的信息(李滢等,2010;林萍等,2011;魏利斌等,2012;郝大程等,2012;张争等,2012;杨楠等,2012;王晓锋等, 2013;贾新平等,2014;兰道亮等,2014;姜福星等, 2015a;2015b;张绍鹏等,2015)。转录组分析对已知基因组序列信息的物种和未知基因组序列的物种,均同样适用(王晓玥等,2014);研究对象和应用范围不但适用于模式植物和农作物,而且延伸到药用植物(张绍鹏等,2015),包括丹参、虎杖、樟树、地黄和白木香等(李滢等,2010;杨艳会等,2011;郝大程等,2012;张争等,2012;江香梅等,2014);对于探索植物药用成分的生物合成机制,有效地挖掘和鉴定次生代谢产物生物合成及调控相关的基因显示出优越的性能(王晓玥等,2014)。鉴于此,本研究以台湾金线莲的全草(根,茎和叶等主要营养器官)为材料,应用转录组测序技术对其进行高通量转录组测序分析,以期获得台湾金线莲发育过程中的转录组信息,为探析台湾金线莲的药用价值及抗逆、器官发育等机制提供分子数据,同时也分析金线莲SSR位点的特点和规律,为开发金线莲的SSR标记开发提供有效数据,促进台湾金线莲及金线莲属植物的研究开发。

1结果与分析

1.1RNA测序及序列拼接组装

对台湾金线莲Illumina HiSeq2000测序后数据初步分析(表1)。拼接得到Unigene(单基因簇) 173513条,最短201bp,最长22032bp(表2),碱基读序质量分数多数均在30以上,质量较高(图1),Unigene长度以200~500bp占多数(图2)。

1.2转录组数据的初步统计

参照林萍等对转录组Unigene基因数据处理的方法,基于BLAST进行基因相似性比对(林萍等,2011;杨艳会,2011;郝大程等,2012;江香梅等,2014;贾新平等,2014;姜福星等,2015a;2015b)。173513条U-nigene中,共有128054条Unigene获得了基因注释,占All-Unigene的73.80%;有45459条Unigene

A

原始数据

Rawdata

有效数据

Cleandata

B

52980844

44229406

C

5.35E+09

4.42E+09

D

91

97

E

83

91

F

43

43

G

3663

505

注:A:样本;B:读数;C:碱基;D:Q20值;E:Q30值;F:GC含量;G:N(ppm)

Note:A:Samples;B:Reads;C:Bases;D:Q20(%);E:Q30(%); F:GC(%);G:N(ppm)

表1测序原始和有效数据质量统计

Table1Raw data and available data

注:A:序列;B:碱基;C:最小;D:最大;E:平均;F:N50;G: (A+T)%;H:(C+G)%

Note:A:Sequences;B:Bases;C:Min;D:Max;E:Average;F: N50;G:(A+T)%;H:(C+G)%

A

173513

B

117900857

C

201

D

22032

E

679.49

F

1221

G

60.16

H

39.84表2Unigene数量与长度分布统计

Table2Distribution of number and quality of unigene

2744

图2Unigene 长度与数量统计图

Figure 2Distribution figure of number and length of Unigene

图1碱基质量分布图

Figure 1Distribution curve of reads base quality

(26.2%)未被注释。Nr 库中有58451条Unigene ,占总数的33.69%,

KEGG 次生代谢注释的信息最少,有2405条Unigene 得到了注释(表3)。1.3台湾金线莲的GO 分类分析

参照李滢等(2010)和姜福星等(2015a;2015b)参考文献的方法,

GO (Gene ontology,GO)方法是世界上通用的进行基因功能分类的基因本体论数据库(李滢等,2010;林萍等,2011;魏利斌等,2012;郝大程等,2012;张争等,2012;杨楠等,2012;王晓锋等,2013;贾新平等,2014;兰道亮等,2014;姜福星等,2015a;2015b;张绍鹏等,2015),用于全面描述不同生物中基因的生物学特征,便于从宏观上认识生物表

生物信息数据库Bioinformation database Nr COG GO KEGG 总计Total

注释基因数Gene annotated 5845121386458122405128054

百分数(%)Percentage (%)33.6912.3326.401.3973.80

表3Unigene 注释结果统计表Table 3Unigenes function annotated 达基因的功能分布特征。GO 功能比对发现,173513个Unigene (单基因簇)中,有45812条Unigene (54%)得到65472个GO 注释,平均每条Unigene 得到1.4个GO 注释,127701个Unigene (46%)未能比对到相似的同源基因及得到功能注释,这说明由于现在获得的台湾金线莲的基因信息严重缺乏,近一半Uni-gene 无法比对到同源基因。

台湾金线莲的Unigene 进行GO 功能可分为细

胞组分、分子功能和生物过程三大类,更加详细的划分49个小类别,如其他植物的GO 功能分类很相近。分子功能中绑定和催化活性最高,病毒和病毒部分最少;生物过程中细胞进程和代谢进程最高,细胞自噬最少;细胞组分中细胞和细胞部分最高,蛋白质标签最少,揭示了台湾金线莲基因GO 功能的基本特征(图3);

这与其他植物相比,略有差异(林萍等,2011;杨艳会,2011;郝大程等,2012;江香梅等,

2014;贾新平等,2014;姜福星等,2015a;2015b)。1.4台湾金线莲的COG 功能分类

参照林萍等对转录组Unigene 基因数据处理的方法(林萍等,2011;杨艳会,2011;郝大程等,2012;江香梅等,2014;姜福星等,2015a;2015b),对台湾金线莲Unigene 进行了COG 分类,共获得21386个Uni-gene 被注释,可分为22个类别;最多的是转录、核糖体和生成(3678个),占17.20%;其次,是一般功能预测类基因(3064个),占14.32%;第三,是氨基酸运输与代谢(1915个),占8.95%;第四,是能量生产与转化(1763个),8.24%;最少的三个是:RNA 加工与修饰(19个)、染色质结构与活性(16个)、细胞移动(3个),分别仅占0.08%、0.07%和0.01%(图4);说明了台湾金线莲Unigene 的COG 功能分类的总体情况,这与其他植物较相似(林萍等,2011;杨艳会,2011;郝大程等,2012;江香梅等,2014;贾新平等,2014;姜福等,2015a;2015b)。

台湾金线莲转录组特性研究

Study on the Characterization of the Transcriptome of Anoectochilus formosanus Taiwan

2745

分子植物育种

Molecular Plant Breeding

图3台湾金线莲Unigene的GO功能分类

注:1:细胞;2:细胞部分;3:膜;4:胞外区域;5:胞外区域部分;6:大分子复合体;7:膜性细胞腔;8:组织;9:组织部分;10:共质体;11:病毒;12:病毒部分;13:抗氧化;14:附属运输蛋白;15:绑定;16:催化;17:电子携带;18:酶调控;19:金属伴侣;20:分子传导;21:营养库;22:蛋白标签;23:结构分子活性;24:转录调控;25:运输;26:显微结构的形成;27:生物黏连;28:生物调控; 29:细胞自噬;30:细胞组分形成;31:细胞组分组织;32:细胞进程;33:死亡;34:发育;35:极性的建立;36:生长;37:免疫系统进程;38:定位;39:移动;40:代谢进程;41:多组织进程;42:多细胞组织进程;43:色素沉淀;44:生殖;45:生殖进程;46:对刺激的响应;47:节律进程;48:病毒

Figure3Classification chart of GO function

Note:1:Cell;2:Cellpart;3:Envelope;4:Extracellular region;5:Extracellular region part;6:Macromolecular complex;7:Membrane-en-closed lumen;8:Organelle;9:Organelle part;10:Symplast;11:Virion;12:Virion part;13:Antioxidant;14:Auxiliary transport pro-tein;15:Binding;16:Catalytrc;17:Electron carrier;18:Enzyme regulator;19:Metallo chaperone;20:Molecular transducer;21:Nu-trient reservoir;22:Proteintag;23:Structural molecure;24:Transcription regulator;25:Transporter;26:Anatomical structure forma-tion;27:Biological adhesion;28:Biological regulation;29:Cell killing;30:Cellular component biogenesis;31:Cellular component organization;32:Cellularprocess;33:Death;34:Developmental process;35:Establishment of localization;36:Growth;37:Im-munesystem process;38:Localization;39:Locomotion;40:Metabolicprocess;41:Multi organismprocess;42:Multicellular organis-mal process;43:Pigmentation;44:Reproduction;45:Reproductive process;46:Response to stimulus;47:Rhythmic process;48:Viral reproduction

1.5台湾金线莲的KEGG注释

台湾金线莲的KEGG代谢途径非常丰富,共有5224条Unigene,次生代谢2405条Unigene,调控次生代谢的转录因子有161条,803条Unigene参与了氨基酸(蛋白质)合成与代谢,1082条Unigene参与了碳元素和糖类的代谢,氨基糖和核苷酸糖282条,萜类441条,生物碱类114条,黄酮、黄酮醇和类黄酮130条;代谢产物更是多种多样,不但包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、赖氨酸、丙氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、不饱和脂肪酸、亚麻酸等蛋白质和脂类,还包括:硫代葡萄糖苷代谢途径、花青素、硒复合物、牛磺酸和亚牛磺酸、咖啡碱、可卡因、硫辛酸、吗啡因等药用活性成分(表4)。

挥发性物质至少包括酯类、烷烃烯类、苯环芳香类、成瘾性物质和酸等4类,其中酯类包括氨基苯甲酸乙酯、丁酸乙酯等,烷烃烯类包括氯代烷和氯烯烃、多环芳烃、柠檬烯和α-蒎烯、松香油、甲烷等,苯环芳香类包括聚苯乙烯、苯氯代环已烷和苯、甲苯、芳香化合物、萘等(表5),成瘾性物质包括咖啡碱、苯丙胺、烟碱、吗啡、可卡因、多巴胺等(表4);挥发性物质相关的次生代谢途径的分子分析,从分子水平为台湾金线莲挥发油和有效成分的研究提供了线索和信息。

KEGG分析也表明,其代谢途径中与微生物相关的至少有1379条(表4);包括金线莲在内的兰科植物很多与真菌共生,实验研究也证明,真菌与金线莲共生,能明显加快金线莲的生长发育、提高其有效成分的含量及增强其抵御病虫害和不良环境的能力,有待于从转录组数据中深入挖掘研究真菌与金线莲共生的分子机制(李标等,2012;Zhang et al.,2013; Jiang et al.,2015)。

台湾金线莲代谢途径的分析为探索挖掘其药用价值,加快在营养保健、医药化工等方面的研究开发提供了分子依据。

1.6台湾金线莲中黄酮和黄酮醇合成途径中关键酶的挖掘

黄酮是金线莲主要药用活性成分,也是进行种质资源创新和新品种选育的重要依据(何春年等,2004,中国药学杂志,39(2):81-84;Du et al.,2008)。本研究

2746

图4台湾金线莲的COG功能分类

注:A:RNA的生产与修饰;B:染色质的结构与变化;C:能量生产与转化;D:细胞周期调控细胞分裂染色体参与;E:氨基酸运输与代谢;F:核酸运输与代谢;G:糖类运输与代谢;H:辅酶运输与代谢;I:脂类运输与代谢;J:翻译,核糖体结构与合成;K:转录L复制,重组与修补;M:细胞壁,细胞膜,膜生物合成;N:细胞移动;O:翻译后修饰,蛋白质转化,伴侣;P:无机元素运输与代谢;Q:次生代谢物质合成,运输与代谢;R:一般功能预测;S:未知功能;T:信号传导机制;U:细胞内交通,分泌和囊泡运输;V:防御机制

Figure4Classification chart of COG function

Note:A:RNA processing and modification;B:chromatin struc-ture and dynamics;C:Energy production and conversation;D: Cell cycle control cell division chromosome parting;E:Amino acid transport and metabolism;F:Nucleotide transport and metabolism;G:Carbohydrate transportand metabolism;H:Coen-zyme transportand metabolism;I:Lipid transport andand metabolism;J:Transiation ribosomal structure and biogenesis;K: Transcription;L:Replication recombination and repair;M:Cell wall,memberane,envelope biogenesis;N:Cell motility;O:Post-translational modification,protein turnover chaperones;P:Inor-ganic ion transport and metabolism;Q:Secondary metabolites biosynthesis transport and catabolism;R:General function pre-diction only;S:Function unknown;T:Signal transduction mech-anisms;U:Intracellular trafficking secretion and vesicular trans-port;V:Denfense mechanisms

表明,台湾金线莲的KEGG代谢途径中,有20条U-nigene组成的黄酮和类黄酮代谢途径,关键酶主要有黄酮醇3-O-甲基转移酶(Flavonol3-O-methyltra-nsferase,F3-OMT)、类黄酮3'-单加氧酶(flavonoid 3'-monooxygenase,F3H)、类黄酮3'-羟化酶(flavonoid 3',5'-hydroxylas,F3'5'H)(表6)。

1.7SSR分析

使用MISA对台湾金线莲的173513个Unigene 进行微卫星位点分析,共搜索到21195个微卫星位点。微卫星的类型丰富,从单核苷酸至五核苷酸都含有,甚至还包括复合微卫星(表7)。其中,单核苷酸比例最大,为13126个,占61.93%;其次为三核苷酸,为3688个,占17.4%;再次为二核苷酸,为3309个,占15.61%;第四是c(复合微卫星),为943个,占4.45%;最少的是四核苷酸和五核苷酸,为115个和14个,分别占0.54%和0.06%(表7)。上述SSR特征分析,有助于进行台湾金线莲及其同属物种的SSR 遗传标记开发、品种鉴定、亲缘关系分析和遗传图谱的构建等研究(Zhang et al.,2010;Lv et al.,2015)。

2讨论

台湾金线莲神奇的疗效在于其含有较高活性的药用成分和丰富的营养保健物质(何春年等,2004,中国药学杂志,39(2):81-84;Du et al.,2008);本研究表明,台湾金线莲的KEGG代谢产物复杂多样,共有5224条Unigene与代谢有关,2405条参与次生代谢,161条基本转录因子参与次生代谢的调控,氨基糖和核苷酸糖282条,黄酮、黄酮醇和类黄酮130条,生物碱类114条,1082条Unigene参与了糖类(碳元素)的代谢;这表明以前的研究结果,金线莲中含有黄酮(包括类黄酮、槲皮素、山萘酚、异鼠李素)、生物碱及多糖等多种药用活性成分(何春年等,2004,中国药学杂志,39(2):81-84;钟添华等,2006;王常青等,2008; Du et al.,2008;杨秀伟等,2007;蒋元斌,2012;Zhang et al.,2013;蒋元斌等,2014)是建立在复杂多样的遗传基础之上的。

除此之外,还包括氨基酸相关的代谢途径803条,维生素相关的代谢途径有227条,参与了叶片挥发性物质的形成至少719条,这也与以前生理生化分析的结果,台湾金线莲中含有包括天门冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸和色氨酸等氨基酸和维生素(王振登等,1993;唐庆九等,1996;何春年等,2004,中国药学杂志,39(2):81-84)以及其叶片会散发出淡淡的清香,包括酯类、烷烃、亚油酸等化学成分(韩美华等,2006;柯伙钊等,2010,中成药,32(11): 2014-2017;陈焰等,2012,中国药业,21(6):21-22),相对应和吻合,表现出内在的一致性;分子数据和生理生化研究结果互相验证和相互支持,便于深入展开研究。

台湾金线莲不但具有极高的药用价值,而且叶片上有金黄色的条纹,非常美丽,也可以作为观赏花卉;这可能均与黄酮及其关键酶有关(周玉美等,2009)黄酮和糖苷均是台湾金线莲的重要的药用成分,并且天然黄酮类化合物多以苷类形式存在,与多种不同的糖以各种方式组成各种各样黄酮苷类,更说明了黄酮是台湾金线莲药用活性物质的重要成分(Zhang

台湾金线莲转录组特性研究

Study on the Characterization of the Transcriptome of Anoectochilus formosanus Taiwan

2747

分子植物育种

Molecular Plant Breeding

表4台湾金线莲KEGG注释中的代谢途径分析

Table4KEGG pathway analysis of Anoectochilus formosanus

编码ID.

ko01110 ko03022 ko00909 ko00900 ko00130 ko00904 ko00902 ko00950 ko00960 ko00040 ko01200 ko00710 ko00514 ko00523 ko00510 ko05130 ko05100 ko05120 ko05166新陈代谢途径

Metabolic pathways

次生代谢

Secondary metabolites

基本转录因子

Basal transcription factors

倍半萜和三萜皂苷

Sesquiterpenoid and

triterpenoid biosynthesis

萜类骨架

Terpenoid backbone biosynthesis

泛醌与萜醌

Ubiquinone and other terpenoid-

quinone biosynthesis

二萜

Diterpenoid biosynthesis

单萜

Monoterpenoid biosynthesis

异喹啉类生物碱

Isoquinoline alkaloid biosynthesis

烷、哌啶和吡啶生物碱

Tropane,piperidine and

pyridine alkaloid biosynthesis

戊糖和糖醛酸转换

Pentose and glucuronate

interconversions

碳代谢

Carbon metabolism

光合组织中碳固定

Carbon fixation in photosynthetic

organisms

其他类型多糖合成

Other types of O-glycan biosynthesis

聚酮糖

Polyketide sugar unit biosynthesis

多糖合成

N-Glycan biosynthesis

真菌侵染

Pathogenic Escherichia coli infection

表皮细胞的细胞入侵

Bacterial invasion of epithelial cells

表皮细胞侵染信号

Epithelial cell signaling in

Helicobacter pylori infection

HTLV-Ⅰ侵染

HTLV-Ⅰinfection

基因数量

Gene number

2405

161

53

161

156

63

8

50

64

157

495

176

10

3

241

47

46

53

385

编码

ID.

ko00380

ko00340

ko00270

ko00460

ko00260

ko00400

ko00310

ko04974

ko00053

ko00790

ko00740

ko00750

ko04977

ko00670

ko00591

ko00062

ko00785

ko05030

ko00100

ko00966

ko00982

新陈代谢途径

Metabolic pathways

色氨酸

Tryptophan metabolism

组氨酸

Histidine metabolism

半胱氨酸和蛋氨酸

Cysteine and methionine metabolism

氰基氨基酸

Cyanoamino acid metabolism

甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸

Glycine,serine and threonine

metabolism

苯丙氨酸,酪氨酸和色氨酸

Phenylalanine,tyrosine and trypto-

phan biosynthesis

赖氨酸

Lysine degradation

蛋白质的分解与吸收

Protein digestion and absorption

抗坏血酸

Ascorbate and aldarate metabolism

叶酸

Folate biosynthesis

维生素

B2Riboflavin metabolism

维生素

B6Vitamin B6metabolism

维生素的分解与吸收

Vitamin digestion and absorption

叶酸碳库

One carbon pool by folate

亚油酸

Linoleic acid metabolism

脂肪酸

Fatty acid elongation

硫辛酸

Lipoic acid metabolism

吗啡因

Morphine addiction

甾类化合物

Steroid hormone biosynthesis

硫代葡萄糖苷

Glucosinolate biosynthesis

细胞色素P450参与的药物代谢

Drug metabolism-cytochrome P450

基因数量

Gene number

77

69

144

133

127

127

95

31

104

59

20

30

14

56

61

94

13

5

205

5

85

2748

编码ID.

ko00945 ko00905 ko00940 ko00906 ko00450新陈代谢途径

Metabolic pathways

芪类、二芳基庚烷和姜醇

Stilbenoid,diarylheptanoid and

gingerol biosynthesis

油菜素甾醇

Brassinosteroid biosynthesis

苯基丙酸类合成路径

Phenylpropanoid biosynthesis

类黄酮

Flavonoid biosynthesis

硒复合物

Selenocompound metabolism

基因数量

Gene Number

63

40

287

110

35

续表4

Continuning table4

编码

ID.

ko00430

ko00230

ko00944

ko00232

ko00942

新陈代谢途径

Metabolic pathways

牛磺酸和亚牛磺酸

Taurine and hypotaurine

metabolism

咖啡碱

Caffeine metabolism

黄酮和黄酮醇

Flavone and flavonol biosynthesis

可卡因

Cocaine addiction

花青素

Anthocyanin biosynthesis

基因数量

Gene Number

23

570

20

8

2

表5台湾金线莲中挥发性气体途径

Table5Volatiles metabolic pathway in Anoectochilus formosanus

编码ID.

ko00626 ko00680 ko00643 ko00903 ko00623 ko00364 ko00281 ko01220 ko00362 ko00363代谢途径

Metabolic pathways

Naphthalene degradationn

甲烷

Methane metabolism

聚苯乙烯

Styrene degradation

柠檬烯和α-蒎烯

Limonene and pinene

degradation

甲苯

Polycyclic aromatic

hydrocarbon degradation

苯甲酸乙酯

Fluorobenzoate degradation

香叶醇

Geraniol degradation

芳香化合物的降解

Polycyclic aromatic

hydrocarbon degradation

安息香酸盐

Benzoate degradation

双酚

Bisphenol degradation

基因数

Gene number

20

146

15

56

3

3

5

27

10

32

代谢途径

Metabolic pathways

多环芳烃

Polycyclic aromatic hydrocarbon

degradation

氯代烷和氯烯烃

Chloroalkane and

chloroalkene degradation

氯代环已烷和苯

Chlorocyclohexane and

chlorobenzene degradation

氨基苯甲酸乙酯

Aminobenzoate degradation

丁酸乙酯

Butanoate metabolism

泛酸酯和CoA合成

Pantothenate and CoA

biosynthesis

松香油

Retinol metabolism

谷氨酸酯

D-Glutamine and D-glutamate

metabolism

多巴胺能

Dopaminergic synapseetabolism

编码

ID.

ko00624

ko00625

ko00361

ko00627

ko00650

ko00770

ko00830

ko00471

ko04728

基因数量

Gene number

44

44

5

45

38

71

59

2

94

et al.,2013)。本研究发现,台湾金线莲中的黄酮和黄酮醇代谢途径,主要包括3种关键酶:(1)F3'5'H属于细胞色素P450酶CYP75基因家族单加氧酶系,在茶树(Camellia spp)中是催化类黄酮B环5羟基化反应的唯一酶系,可能具有二氢黄酮催化活性(陈啸天, 2012);在杂种瓜叶菊(Pericallis hybrida)中同时具有F3'H和F3'5'H的双重活性,在其花色素形成中发挥重要作用,在其叶片中也有表达(Sun et al.,2013);(2)

台湾金线莲转录组特性研究

Study on the Characterization of the Transcriptome of Anoectochilus formosanus Taiwan

2749

分子植物育种

Molecular Plant Breeding

表6台湾金线莲中黄酮和黄酮醇合成途径的关键基因信息

Table6Key ezyme involved in flavone and flavonol metabolic in Anoectochilus formosanus

酶编号Patyway

E2.1.1.76

E1.14.13.21 EC:1.14.13.88同源编号

K05279

K05280

K13083

编码蛋白

Ezyme ID

黄酮醇3-O-甲基转移酶

Flavonol3-O-methyltransferase

类黄酮3'-单加氧酶

Flavonoid3'-monooxygenase

类黄酮3',5'-羟化酶

Flavonoid3',5'-hydroxylas

关键基因

Key gene

Flavonol3-O-methyltransferase

Flavonoid3'-monooxygenase

CYP75A(Cytochrome P450,family75,subfamily A)

(Flavonoid3',5'-hydroxylas)

表7台湾金线莲SSR不同重复基序分布及优势碱基组成Table7Distribution and compositions of the dominant repeat of the different repeat motif for SSR

重复基元长度Length of repeat motif

单核苷酸Mononucleotide 二核苷酸Dinucleotide

三核苷酸Trinucleotide

四核苷酸Tetranucleotide 五核苷酸Pentanucleotide 复合型Compound 数量

Number

13126

3309

3688

115

14

943

百分比(%)

Percentage

(%)

61.93

15.61

17.40

0.54

0.06

4.45

优势重复基序

Advantage

repeat motif

A/T;C/G

AG/CT;GT/AC

GCC/GGC

TGGT/ACCA

AGGGA/TCCCT

(A)10ctttacgc(A)10

注:C:复合微卫星

Note:C:Composite micro satellite

F3-OMT从古老的甲基化转移酶的活性中进化而来的,调节区域性和底物特定的O甲基化,用来生产具有特别生物活性的O甲基黄酮(Zhou et al.,2010),在多毛番茄(Solanum habrochaites)的毛状腺体中觉得高度甲基化杨梅酮的活性(Schmidt et al.,2012);(3)F3H参与了玉米(Zea mays)和武当玉兰(Magnolia sprengeri)中花色素的形成(Sharma et al.,2012;Shi et al.,2014),而且在高粱(Sorghum bicolor)中决定了病菌诱导的颜色的变化(Mizuno et al.,2014)。台湾金线莲中黄酮可能具有抵御病菌侵染和响应不良环境胁迫的作用,也可能参与了叶片色素及美丽的金黄色的条纹的形成,亟需研究证实。

台湾金线莲的分子遗传和基因信息的严重缺乏是制约其深入研究开发的瓶颈。本研究对台湾金线莲进行了转录组分析,为挖掘金线莲药用活性成分合成的关键基因,深入研究开发其药用价值;进一步开发金线莲属的分子标记,从而加强对金线莲资源的评价、保护和鉴定工作;及进行遗传育种改善金线莲的农艺性状等研究提供了分子支持和基础数据。

3材料与方法

3.1材料

四川农业大学园林研究所风景园林重点实验室组培的台湾金线莲栽培于苗圃内,选择已经移栽到温室生长5个月左右的多糖等有效成分达到峰值的优质植株8株(蒋元斌,2012;蒋元斌等,2014),用清水洗净,作为实验的材料。

3.2RNA提取

参照林萍和姜福星等人的方法(林萍等,2011;杨艳会,2011;郝大程等,2012;江香梅等,2014;兰道亮等,2014;姜福星等,2015a;2015b),使用Total RNA 提取试剂(TaKaRa,日本)分别提取台湾金线莲总RNA,每个RNA样本中加入10U DNaseⅠ(TaKaRa,日本) 37℃孵育30min以清除残留的基因组DNA,在每个样本的浓度被测定的基础上各取10ug等量混合组成一个RNA池(RNA pool,共30ug)。进而分别用紫外分光光度计和凝胶电泳进行检测RNA的质量和完整性。

3.3测序文库的构建、检测及测序

参照杨杰和姜福星等人的方法(杨艳会,2011;郝大程等,2012;江香梅等,2014;贾新平等,2014;兰道亮等,2014;姜福星等,2015a;姜福星等,2015b;杨杰等,2015),进行mRNA的分离、cDNA合成、连接接头、富集等步骤,进行测序文库的构建和测序。

3.4数据的预处理及组装

将测序数据的质量进行预处理和统计,去除接头

2750

以及低质量序列等,得到干净读序进行后续的生物信息学分析,并应用短片段序列组装软件对有效数据进行组装和拼接法(杨艳会,2011;郝大程等,2012;江香梅等,2014;贾新平等,2014;兰道亮等,2014姜福星等, 2015a;2015b;杨杰等,2015)。

3.5Unigene功能注释

参照杨杰和姜福星等人的方法(杨艳会,2011;郝大程等,2012;贾新平等,2014;江香梅等,2014;兰道亮等,2014;张绍鹏等,2015;姜福星等,2015a;2015b;杨杰等,2015),把目的序列比对到蛋白质数据库进行Blast比对(E值<1e-5),采用序列相似性最高的蛋白进行台湾金线莲基因的功能注释。

3.6GO分类

将在Nr数据库中获得注释的Unigene利用Blast2GO软件进行GO注释,并得到不同分类和层次所占数目,基本掌握台湾金线莲基因产物的分类情况(兰道亮等,2014;张绍鹏等,2015;姜福星等,2015a; 2015b;杨杰等,2015)。

3.7KEGG代谢路径分析

对功能基因进行KEGG映谢,分析其在代谢通路中作用(兰道亮等,2014;贾新平等,2014;姜福星等,2015a;2015b;杨杰等,2015)。

作者贡献

陈其兵、姜福星是本研究的实验设计和实验研究的执行人;姜福星完成数据分析,论文初稿的写作;魏丕伟、寇亚平、贾茵参与文献资料的检索、实验材料栽培、实验设计、试验结果分析;陈其兵是项目的构思者及负责人,指导实验设计,数据分析,论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢

本研究由四川省教育厅重点项目(15ZA0023)资助。参考文献

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Study on the Characterization of the Transcriptome of Anoectochilus formosanus Taiwan

2753

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