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宏基因组测序讲解

宏基因组测序

目的

研究藻类物种的分类，研究与特定环境与相关的代谢通路，以及通过不同样品的比较研究微生物内部，微生物与环境，与宿主的关系。技术简介

宏基因组( Metagenome)(也称微生物环境基因组Microbial Environmental Genome, 或元基因组) 。是由 Handelsman 等 1998 年提出的新名词，其定义为"the genomes of the total microbiota found in nature" , 即生境中全部微小生物遗传物质的总和。它包含了可培养的和未可培养的微生物的基因，目前主要指环境样品中的细菌和真菌的基因组总和。而所谓宏基因组学 (或元基因组学， metagenomics) 就是一种以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象，以功能基因筛选和/或测序分析为研究手段，以微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系及与环境之间的关系为研究目的的新的微生物研究方法。一般包括从环境样品中提取基因组 DNA, 进行高通量测序分析，或克隆DNA到合适的载体，导入宿主菌体，筛选目的转化子等工作。

目的的新的微生物研究方法。一般包括从环境样品中提取基因组 DNA, 进行高通量测序分析，或克隆DNA到合适的载体，导入宿主菌体，筛选目的转化子等工作。

特定生物种基因组研究使人们的认识单元实现了从单一基因到基因集合的转变，宏基因组研究将使人们摆脱物种界限，揭示更高更复杂层次上的生命运动规律。在目前的基因结构功能认识和基因操作技术背景下，细菌宏基因组成为研究和开发的主要对象。细菌宏基因组细菌人工染色体文库筛选和基因系统学分析使研究者能更有效地开发细菌基因资源，更深入地洞察细菌多样性。如宏基因组成为生物催化剂的新来源。

宏基因组学研究的策略和基本过程

研究策略

“宏基因组学”是一种整体性的研究策略，它建立在微生物基因组学的迅速发展和聚合酶链式反应广泛应用的基础之上，是一种不依赖于人工培养的微生物基因组分析技术，涵盖了生物信息统计分析和基因组两方面的意义和技术，其策略是从特定环境中直接分离所有微生物DNA，将大片段的DNA克隆到受体菌中表达，然后根据某些生物活性筛选有应用价值的克隆。包括两个方面[920]：①宏基因组文库的构建：宏基因组文库的构建沿用了分子克隆的基本原理和技术方法，并根据具体环境样品的特点和建库目的采用了一些特殊的步骤和对策。一般包括样品总DNA 的提取、与载体连接和在宿主细胞建立中克隆[17]。②宏基因组文库的筛选：根据其研究目的，宏基因组文库筛选通常有功能筛选(functional screening)和序列筛选(sequence based screening)两种方法。

2宏基因组学的研究步骤

基因组学的研究过程，一般包括从环境样品中提取基因组DNA，克隆DNA 到合适的载体，导入宿主菌体，筛选目的克隆等4个步骤。特别要指出的是，在基因组学研究领域中，其研究目标通常是测定单一物种的基因组序列；而在宏基因组学中，则是要测定由多种微生物组成的复杂群体(community)的混合基因组序

列。这种差别的关键就是，绝大多数细菌是不可培养的，因此没有足够的研究材料。

2.1 分离特定环境生物DNA

方法上不同于传统的先培养微生物再提取DNA的做法，而是首先直接收集能够代表特定生物环境生物多样性的样品；然后利用各种理化方法破碎微生物，使其释放DNA，再利用密度梯度离心等方法进行分离纯化。

2.2 纯化的大分子量DNA进行克隆

在对DNA 酶切或者超声打断处理，并与合适的载体DNA 进行连接，构建重组体。

2.3 将带有宏基因组DNA的载体通过转化方式转入模式微生物建立各自的无性繁殖系

例如转入大肠埃希菌中，使那些以前无法研究的不可培养微生物的DNA 在模式微生物中得到复制、表达，进而得到研究。所有带有宏基因组DNA 载体的模式微生物克隆构成宏基因组文库。

2.4 对宏基因组文库的DNA 进行分析

基于不同的研究目的，有很多分析方法，主要分为两类：一类为表型功能筛选，即利用模式微生物表型的变化筛选某些目的基因。例如从文库中筛选能表达抗菌物质的克隆。功能分析法根据重组克隆产生的新活性进行筛选，可用于检测编码新型酶的全部新基因或者获取新的生物活性物质。另一类为序列基因型分析，即对文库中所有或部分的DNA 进行测序分析，以应用于生态学研究。例如分析文库中16SrRNA序列，对所研究生态环境的多样性进行评估。一个典型的宏基因组分析涉及多个轮次，以确保从生态环境标本中分离到目的基因，及尽可能多地分析DNA序列所编码的信息。

3 宏基因组学的技术方法

宏基因组学是一种以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象，以功能基因筛选和测序分析为研究手段，以微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系及与环境之间的关系为研究目的的新的微生物研究方法。宏基因组学的研究策略和方法大致相同，现按照宏基因组学研究的基本过程和策略对

常用方法和技术予以简要介绍。

3.1 样品总DNA的提取及基因或基因组DNA的富集

提取的样品DNA必须可以代表特定环境中微生物的种类，尽可能代表自然状态下的微

生物原貌，获得高质量环境样品中的总DNA是宏基因组文库构建的关键之一。要采用合适的方法，既要尽可能地完全抽提出环境样品中的DNA，又要保持较大的片段以获得完整的目的基因或基因簇[45]。所以总的提取总是在最大提取量和最小剪切力之间折中。应严格操作，谨防污染，并且保持DNA 片段的完整和纯度。已有许多商品化宏基因组DNA提取试剂盒可用，同时很多实验室仍致力于宏基因组DNA提取方法的改进[68]。

常用的提取方法有直接裂解法和间接提取法(细胞提取法)。直接裂解法是将环境样品直接悬浮在裂解缓冲液中处理，继而抽提纯化，包括物理法(如冻融法、超声法、玻璃珠击打法、液氮研磨法等)和化学法、酶法等。不同直接裂解法的提取方法差别在于细胞破壁的方式不同。此法操作容易、成本低、DNA提取率高、重复性好，但由于强烈的机械剪切作用，所提取的DNA片段较小(1-50kb)，难以完全去除酚类物质。细胞提取法先采用物理方法将微生物细胞从环境中分离出来，然后采用较温和的方法抽提DNA，如先采用密度梯度离心分离微生物细胞，然后包埋在低熔点琼脂糖中裂解，脉冲场凝胶电泳回收DNA。此法可获得大片段DNA(20-500kb)且纯度高，但操作繁琐，成本高，有些微生物在分离过程中可能丢失，温和条件下一些细胞壁较厚的微生物DNA也不容易抽提出来。

为了更好地反映环境中的微生物种群并且提高阳性克隆的占有率，需要在克隆之前通过不同的方法对感兴趣的目的基因或基因组进行富集[911]，一个比较好的富集方法是稳定同位素示踪技术[12]。

抑制性消减杂交技术[13]是抑制性与消减杂交技术相结合的更简单、更快速的分离差异基因的方法。该方法不仅利用了消减杂交技术的消减富集，同时也利用了抑制性技术进行了高效率的动力学富集，所以该技术是一项富集特定基因、证实微生物之间基因不同的非常有用的技术方法。

3.2 宏基因组文库的建立

宏基因组文库的构建策略取决于研究的整体目标。偏重于低拷贝、低丰度基

因还是高拷贝、高丰度基因要取决于研究的目的是单个基因或基因产物还是整个操纵子及编码不同代谢途径的基因簇。基因文库的建立过程中需要选择合适的克隆载体和宿主菌株。传统的方法是直接利用表达载体构建宏基因文库，但是表达载体可插人的宏基因片段一般小于10kb。克隆中宿主菌株的选择主要考虑到转化效率、宏基因的表达、重组载体在宿主细胞中的稳定性以及目标性状的筛选等。目前大肠杆菌是最为常用的宿主[14]，此外，链霉菌和假单胞菌也可以作为构建文库的宿主，不同微生物种类所产生的活性物质有明显差异，不同的研究目标应选择不同的宿主菌株。

3.3 宏基因组文库的筛选

由于环境基因组的高度复杂性，需要通过高通量和高灵敏度的方法来筛选和鉴定文库中的有用基因。筛选技术大致可分为四类:①基于核酸序列差异分析；

②基于目的克隆功能的特殊代谢活性；③基于底物诱导基因的表达；④基于包括稳定性同位素和荧光原位杂交在内的其他技术。

.3.1 基于序列的筛选方法

通常根据已知相关功能基因的保守序列设计探针或PCR引物，通过杂交或PCR扩增筛选阳性克隆。用这种方法有可能筛选到某一类与已知序列相近的新基

因，这一策略可以分离已知基因家族的新成员和含有高度保守区的酶基因[15 16]。另一种方法是对含有16S rRNA等系统进化锚定基因的克隆进行测序或对文库随机测序[17]。优点是不必依赖宿主菌株来表达克隆基因，缺点是必须对相关基因序列有一定的了解，文库中那些和现有基因序列完全不一样的基因无法被筛选，故难以发现全新的活性物质，对鉴定新的基因成员有一定的局限性，也很难获得全序列。

直接序列分析法(sequence driven screening method)是对所构建宏基因组文库的克隆进行随机测序分析，显然可以得到最多的信息[1820]。也可用鸟枪法对宏基因组文库进行测序，但需要进行大量的测序和分析工作，需大量人力、物力及财力。虽然DNA序列分析技术不断发展，但与个体微生物基因相比，宏基因组文库包含着巨大的序列片段，但对这些序列片段进行后续的分析则极为困难，结合其他的筛选方法可以得到更多的信息。

用微阵列技术(基因芯片)进行初步筛选，可以很大程度上减少测序量和后续

的序列拼接等工作量。但微阵列技术在用于宏基因组文库筛选时，除了其本身由于交互杂交等导致的特异性低、灵敏度较差等缺点外，同样不能用于对未知功能基因的筛选，且检测不到环境中存在的那些低丰度微生物的序列[2122]。

3.3.2 基于功能的筛选方法

功能性筛选法是以活性测定为基础，通过建立和优化合适的方法从基因组文库中获得具有特殊功能的克隆，然后通过序列和生化分析研究这些克隆。由于基于活性的筛选不需要已知序列的信息，故能较快地找到可用于工农业和医药的蛋白质和天然产物。功能性筛选的方法有两种，一种是对具有特殊功能的克隆子进行直接检测，如利用其在选择性培养基上(如含有化学染料和不可溶的或发光的酶反应底物)的表型特征进行筛选[23]。这种方法具有较高的灵敏度，可检测到较少的目的克隆。另一种方法是基于异源基因的宿主菌株与其突变体在选择性条件下功能互补生长的特性进行[24]。

功能性筛选法的优点是筛选过程比较简单、快速，只要基因能表达，就可以根据基因表达特性进行筛选，不需要复杂的实验过程。不足之处是这种筛选方法依赖于目的基因在新的宿主中表达，但使用模式微生物并不能把所有的宏基因组DNA表达出来，而且要求克隆到基因或基因簇的全长，一旦克隆过程中破坏基因某个组件将使得基因没法表达，也就不能根据功能进行筛选，故检出的概率很低，工作量大，往往从上万个克隆中只能筛选到几个有用的克隆。

3.3.3 底物诱导基因表达筛选(substrate induced gene expression screening, SIGEX)

SIGEX是用于能利用各种底物诱导的分解代谢型基因的检出，并结合生物发光技术用

来筛选代谢相关基因及酶基因[25]。由于编码相关代谢基因或酶基因通常呈簇存在，通常与该物质诱导的启动子和同源转录调控序列毗邻，往往在有底物诱导的条件下才表达，反之则不表达。首先构建一个含有绿色荧光蛋白(GFP)的表达载体，这个载体可将宏基因组DNA克隆到GFP基因上游，使该基因的表达受到宏基因组DNA片段中的启动子调控。当外加目标底物时，可以影响GFP的表达，进而通过活细胞荧光分离技术(fluorescence activated cell sorting, FACS)，在添加特定底物的条件下对表达库进行筛选，就能够得到对该底物具有代谢活性

的克隆。

SIGEX在宏基因组研究中具有很多优势，它提供了一个有效的和经济的检测手段，大大增加了筛选的容量和效率，节省了时间，为高通量筛选提供了保障，而且不需要对在颜色筛选中使用的底物进行修改，勿需担心因修改底物而产生毒性；且可以从底物来推断得出未知的酶，继而推断基因的功能。而SIGEX法的不足之处是目标基因的结构性和适应性很敏感，同时，无法用于分析不能进入细胞质的底物，而且FACS对进样设备的要求也比较高；代谢特定底物的调控子和操纵子在位置上不一定都相邻；同时有些基因的表达除了受底物诱导外，还可能受其他因子的诱导，而有些基因并不需要诱导，是本底水平表达的，有些可诱导基因在新的宿主中有可能不可被诱导表达。但是考虑到宏基因组文库中含有大量的基因，其中必然有一部分是可诱导的，是可以被该技术检测到的。所以只要对这些不足之处进行优化，选择合适的条件，SIGEX法仍然是一种宏基因组文库筛选的有效方法，尤其适合于在工业上使用[26]。

3.3.4 基于稳定性同位素技术筛选方法

具有相同原子序数但不同中子数目且不具放射性的元素称为稳定同位素(stable isotope probing, SIP)。环境中的许多物质都可以用SIP来标记，鉴定和分析复杂样本中进行有特殊代谢功能的微生物[27]。

3.3.5 荧光原位杂交技术

荧光原位杂交(fluorescent in situ hybridization, FISH)是利用荧光标记的特异核酸探针与细胞内相应的靶DNA分子或RNA分子杂交，通过在荧光显微镜或共聚焦激光扫描仪下观察荧光信号，来确定与特异探针杂交后被染色的细胞。FISH技术已经用于不同生态系统的研究中，应用稳定同位素技术可以对环境中某些活性微生物的核酸进行富集，进而构建宏基因组文库，更有利于寻找未培养微生物的功能基因[28]。

3.3.6 其他筛选策略

常规的PCR、分子杂交、抗原抗体反应等技术也可以用于筛选，也有公司开发出了专门筛选某些酶、蛋白等的试剂盒，在食品工业、医药等领域有较好的应用前景。此外，在构建文库之前对样品有目的进行富集，然后提取样品DNA构建文库，这也可以提高目的克隆的数量。

当前宏基因组学技术中最大缺陷是文库的表达问题，模式微生物并不能把所有的宏基因组DNA表达出来，降低了表型筛选的效率。宏基因组表型筛选的效率很低，从上万个克隆中一般只能筛选到几个有用的克隆。这表明宏基因组学的提出虽然带来观念上极大的突破，但受限于技术瓶颈，还未在实际工作中产生理论上可能带来的巨大成果。但有理由相信，随着分子生物学技术的发展，宏基因组学研究必然成为今后若干年自然科学研究的一个重要领域

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宏基因组分析和诊断技术在急危重症感染应用的专家共识感染是急危重症患者死亡的主要原因之一。近年来，随着新发病原微生物的出现、耐药病原微生物的增多以及免疫抑制宿主的增加，感染的发病率和死亡率仍居高不下，脓毒症(严重感染)患者病死率高达50%[1-3]。最新调查研究发现，中国脓毒症相关性标化死亡率为66.7例/10万人口，全国每年共有脓毒症相关性死亡病例近103万例[3]。重症感染起病急、进展快、病原体复杂，短时间内能否明确致病病原微生物至关重要。传统的病原微生物检测方法主要包括形态学检测、培养分离、生化检测、免疫学和核酸检测。因操作简单、快速、技术要求不高，同时具有一定的诊断敏感性和特异性，目前仍在临床上广泛使用。但传统的检测方法在敏感性、特异性、时效性、信息量等方面存在局限，而且对于未知或者罕见的病原微生物，无法快速识别。基于宏基因组新一代测序技术(metagenomics next-generation sequencing，mNGS)不依赖于传统的微生物培养，直接对临床样本中的核酸进行高通量测序，然后与数据库进行比对分析，根据比对到的序列信息来判断样本包含的病原微生物种类，能够快速、客观地检测临床样本中的较多病原微生物(包括病毒、细菌、真菌、寄生虫)，且无需特异性扩增[4-8]，尤其适用于急危重症和疑难感染的诊断。为了规范运用mNGS进行病原微生物的诊断、正确解读检测结果和指导治疗，我们组织了急危重病、感染病学和病原微生物学相关领域的专家，制定了本共识。 1 mNGS分析和诊断技术是急危重症感染快速、精准诊疗的发展方向新一代测序技术是一个开放的分析和诊断系统，目前已经纳入的病原体有8000多种，其中包括3000余种细菌、4000余种病毒、200余种真菌和140种寄生虫，为疑难危重症及罕见病原微生物感染的诊断提供了有效的技术手段。自2008年成功应用于临床诊断新发病原体感染以来[9-10]，目前mNGS技术已经逐步用于临床疑难感染诊断，如华山医院张文宏团队[11]用mNGS协助确诊猪疱疹病毒的跨物种传播，并给予针对性治疗使患者痊愈，深圳市第三人民医院用mNGS确诊了一例罕见阿米巴脑炎[11-12]。 mNGS对脓毒症、免疫抑制宿主并发严重感染、重症肺部感染等疾病具有较高的临床应用价值，能够快速、精准地找到病原体；另外对于抗菌药物治疗方案的制定和治疗效果的评估具有一定的指导作用[9-16]。Long等[17]研究发现血培养联合mNGS诊断细菌或真菌感染，阳性率较单用血培养显著升高。以健康人群为基线，建立每种微生物在正常人群中的分布情况模型，进而计算脓毒症指数来评估检出微生物的核酸数量，Crumaz等[18]发现在脓毒症患者血液标本中病原菌的脓毒症指数绝对值、丰度显著升高，而且其变化与临床治疗效

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宏基因组测序技术检测标准简介：宏基因组测序介绍宏基因组学是以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象，通过现代基因组技术手段包括功能基因的筛选和测序分析，对环境中微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系以及环境之间的关系进行研究的新的微生物研究方法。随着高通量测序技术的发展，为宏基因组学研究提供了新的理想研究方法。高通量测序的方法无需分离环境中各种微生物，也无需构建克隆文库就可以直接对环境中所有微生物进行测序。可以真实客观的反映环境中微生物的多样性、种群结构、进化关系等。目前又可以分为针对16s DNA/18sDNA/ITS测序和针对宏基因组全序列的测序研究。下面就是对这两者的具体介绍。一、16s DNA/18s DNA/ITS测序 16sDNA是最常用的微生物物种分子鉴定的标签，，通过对样品中16sDNA测序可以鉴定其中微生物物种的丰度和分布情况。目前，普遍使用Roche 454平台来对环境样品进行16s DNA测序。因为16s DNA序列比较相似，读长短的话，难以进行有效的比对，而454平台的平均读长在400bp左右，可以很好的避免此类问题。二、宏基因组全测序在这种测序方式中，我们可以假定一个环境中的所有微生物就是一个整体，然后对其中所有的微生物进行测序。这样我们就可以研究样品中的功能基因以及其在环境中所起的作用而不用关心其来自哪个微生物。可以发现新的基因，可以进行基因的预测，甚至有可能得到某个细菌基因组的全序列。此外，该项测序不单可以针对DNA水平，也可以针对全RNA进行基因表达水平的研究。样品处理：

宏基因组样品收集主要有口腔，下呼吸道痰液，下呼吸道灌洗液，皮肤和粪便。样品采集遵照样品采集规范（人）所规定的操作来进行。尽量留足备份样品。核酸提取：宏基因组核酸提取主要有两种方法：膜过滤法和直接裂解提取。对于液体样品如痰液，灌洗液两种方法都适用，对于固体样品如粪便宜采用直接裂解的方法。核酸提取后用NanoDrop ND-1000测定，260/280 = ， 260/230 = ，电泳检测DNA 应是完整的一条带。测序Sequencing 1)16S/18S测序： Sanger测序：用于低通量的16S/18S DNA测序，提取宏基因组后，首先通过PCR将16S/18S 序列扩增出来，再将其连接到克隆载体上，导入感受态细胞，涂平板做蓝白斑筛选，选出阳性克隆提质粒，对质粒进行测序反应，测序反应后纯化后用ABI 3130或ABI 3730进行毛细管电泳测序。由于其测序准确率比较高，而通量非常低，现通常用做二代测序结果的验证。454 Platform： 454平台主要包括两种测序系统：454 GS FLX+ System和454 GS Junior System。454 GS FLX+ System测序读长可以达到600-1000bp，通量450-700M，GS Junior System测序读长在400bp左右，通量在35M。

宏基因组测序技术检测方法模板

宏基因组测序技术检测方法

宏基因组测序技术检测标准简介：宏基因组测序介绍宏基因组学是以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象，经过现代基因组技术手段包括功能基因的筛选和测序分析，对环境中微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系以及环境之间的关系进行研究的新的微生物研究方法。随着高通量测序技术的发展，为宏基因组学研究提供了新的理想研究方法。高通量测序的方法无需分离环境中各种微生物，也无需构建克隆文库就能够直接对环境中所有微生物进行测序。能够真实客观的反映环境中微生物的多样性、种群结构、进化关系等。当前又能够分为针对16s DNA/18sDNA/ITS测序和针对宏基因组全序列的测序研究。下面就是对这两者的具体介绍。一、16s DNA/18s DNA/ITS测序 16sDNA是最常见的微生物物种分子鉴定的标签，，经过对样品中16sDNA测序能够鉴定其中微生物物种的丰度和分布情况。当前，普遍使用Roche 454平台来对环境样品进行16s DNA测序。因为16s DNA序列比较相似，读长短的话，难以进行有效的比对，而454平台的平均读长在400bp左右，能够很好的避免此类问题。二、宏基因组全测序

在这种测序方式中，我们能够假定一个环境中的所有微生物就是一个整体，然后对其中所有的微生物进行测序。这样我们就能够研究样品中的功能基因以及其在环境中所起的作用而不用关心其来自哪个微生物。能够发现新的基因，能够进行基因的预测，甚至有可能得到某个细菌基因组的全序列。另外，该项测序不单能够针对DNA水平，也能够针对全RNA进行基因表示水平的研究。样品处理：宏基因组样品收集主要有口腔，下呼吸道痰液，下呼吸道灌洗液，皮肤和粪便。样品采集遵照样品采集规范（人）所规定的操作来进行。尽量留足备份样品。核酸提取：宏基因组核酸提取主要有两种方法：膜过滤法和直接裂解提取。对于液体样品如痰液，灌洗液两种方法都适用，对于固体样品如粪便宜采用直接裂解的方法。核酸提取后用NanoDrop ND-1000测定，260/280 = 1.8-2.0， 260/230 = 1.8-2.0，电泳检测DNA应是完整的一条带。测序Sequencing 1)16S/18S测序： Sanger测序：用于低通量的16S/18S DNA测序，提取宏基因组后，首先经过PCR将16S/18S序列扩增出来，再将其连接到克隆载体上，导

宏基因组测序讲解

宏基因组测序目的研究藻类物种的分类，研究与特定环境与相关的代谢通路，以及通过不同样品的比较研究微生物内部，微生物与环境，与宿主的关系。技术简介宏基因组( Metagenome)(也称微生物环境基因组Microbial Environmental Genome, 或元基因组) 。是由 Handelsman 等 1998 年提出的新名词，其定义为"the genomes of the total microbiota found in nature" , 即生境中全部微小生物遗传物质的总和。它包含了可培养的和未可培养的微生物的基因，目前主要指环境样品中的细菌和真菌的基因组总和。而所谓宏基因组学 (或元基因组学， metagenomics) 就是一种以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象，以功能基因筛选和/或测序分析为研究手段，以微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系及与环境之间的关系为研究目的的新的微生物研究方法。一般包括从环境样品中提取基因组 DNA, 进行高通量测序分析，或克隆DNA到合适的载体，导入宿主菌体，筛选目的转化子等工作。宏基因组( Metagenome)(也称微生物环境基因组Microbial Environmental Genome, 或元基因组) 。是由 Handelsman 等 1998 年提出的新名词，其定义为"the genomes of the total microbiota found in nature" , 即生境中全部微小生物遗传物质的总和。它包含了可培养的和未可培养的微生物的基因，目前主要指环境样品中的细菌和真菌的基因组总和。而所谓宏基因组学 (或元基因组学， metagenomics) 就是一种以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象，以功能基因筛选和/或测序分析为研究手段，以微生物多样

宏基因组测序技术检测方法

宏基因组测序技术检测标准简介：宏基因组测序介绍宏基因组学是以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象，通过现代基因组技术手段包括功能基因的筛选和测序分析，对环境中微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系以及环境之间的关系进行研究的新的微生物研究方法。随着高通量测序技术的发展，为宏基因组学研究提供了新的理想研究方法。高通量测序的方法无需分离环境中各种微生物，也无需构建克隆文库就可以直接对环境中所有微生物进行测序。可以真实客观的反映环境中微生物的多样性、种群结构、进化关系等。目前又可以分为针对16s DNA/18sDNA/ITS测序和针对宏基因组全序列的测序研究。下面就是对这两者的具体介绍。一、16s DNA/18s DNA/ITS测序 16sDNA是最常用的微生物物种分子鉴定的标签，，通过对样品中16sDNA 测序可以鉴定其中微生物物种的丰度和分布情况。目前，普遍使用Roche 454平台来对环境样品进行16s DNA测序。因为16s DNA序列比较相似，读长短的话，难以进行有效的比对，而454平台的平均读长在400bp左右，可以很好的避免此类问题。二、宏基因组全测序在这种测序方式中，我们可以假定一个环境中的所有微生物就是一个整体，然后对其中所有的微生物进行测序。这样我们就可以研究样品中的功能基因以及其在环境中所起的作用而不用关心其来自哪个微生物。可以发现新的基因，可以进行基因的预测，甚至有可能得到某个细菌基因组的全序列。此外，该项测序不单可以针对DNA水平，也可以针对全RNA进行基因表达水平的研究。样品处理：宏基因组样品收集主要有口腔，下呼吸道痰液，下呼吸道灌洗液，皮肤和粪便。样品采集遵照样品采集规范（人）所规定的操作来进行。尽量留足备份样品。

(完整word版)宏基因组测序讲解

宏基因组及其应用

宏基因组及其应用学习笔记吕涛15010906 一、宏基因组及宏基因组学 1.概念宏基因组( Metagenome)（也称微生物环境基因组Microbial Environmental Genome, 或元基因组）是由Handelsman 等1998 年提出的新名词，其定义为 “the genomes of the total microbiota found in nature” , 即环境中全部微小生物遗传物质的总和。它包含了可培养的和未可培养的微生物的基因，目前主要指环境样品中的细菌和真菌的基因组总和。 2.宏基因组学宏基因组( Metagenome)（也称微生物环境基因组Microbial Environmental Genome, 或元基因组）是由Handelsman 等1998 年提出的新名词，其定义为“the genomes of the total microbiota found in nature” , 即环境中全部微小生物遗传物质的总和。它包含了可培养的和未可培养的微生物的基因，目前主要指环境样品中的细菌和真菌的基因组总和。 3.发展历程环境基因组学——微生物基因组学——宏基因组学——人类基因组学人类基因组学：把人体内所有微生物菌群基因组的总和称为“人体宏基因组”(human metagenome)。人类宏基因组学(human metagenomics)研究人体宏基因组结构和功能、相互之间关系、作用规律和与疾病关系的学科。它不仅要把总体基因组序列信息都测定出来，而且还要研究与人体发育和健康有关的基因功能。人类宏基因组计划目标是：把人体内共生菌群的基因组序列信息都测定出来，而且要研究与人体发育和健康有关的基因功能。 4.研究步骤

宏基因组测序

宏基因组测序环境中超过99%的微生物是不可培养的，很多致力于研究微生物多样性的努力由于培养方法的限制而受到制约，为了克服由培养技术所带来的困难和限制，多种以DNA为基础的分子生物学的方法已经被开发。目前16s rDNA测序可以提供大量关于环境微生物的群落及种类信息，但是在种群中不同微生物的作用以及其携带的基因组信息基本不能体现出来。相比之下，宏基因组是一种新的，可用于快速分析微生物复杂基因组的方法，它提取环境中的全基因组DNA，构建DNA文库并进行高通量测序。对数据进行分析，不仅能够获得环境中微生物的组成及丰度信息，还可以通过相关功能及代谢通路注释，获得这些微生物全面的微生物基因组信息，以及在环境中可能的功能。技术参数样品准备测序策略推荐数据周期 3ug DNA 300bp DNA文库 HiSeq PE150测序一般测序数据量：5Gb clean data 大测序数据量：10Gb clean data 40个工作日建库方法技术流程

技术特点（1）无需分离培养，直接提取样本DNA测序；（2）群落多样性、种群结构、进化关系、功能组成、相互协作关系等多种分析；（3）高效、高通量，一次性获取样本中所有微生物组成等信息。部分结果展示进化树分析OTU维恩图抗生素类型统计图案例解析排泄物微生物宏基因组可作为结直肠癌标志物为了评估利用排泄物诊断结直肠癌的可行性，作者对来自于中国的74个结直肠癌患者和54个健康人的粪便样本进行宏基因组测序，发现除了已经证实的与结直肠癌相关的具核梭杆菌（Fusobacterium nucleatum）和消化链球菌（Peptostreptococcus stomatis）之外，微小微单胞菌（Parvimonas micra）和口臭致病菌（Solobacterium moorei）也与结直肠癌具有显著相关性。作者随后选择了20个微生物基因标志物，通过q-PCR发现，来自于具核梭杆菌的丁酰coA脱氢酶和来自于微小微单胞菌的RNA聚合酶亚基β在患者的粪便微生物的基因组中高度表达；利用这两个基因可以准确区分患有结直肠癌的患者和健康人群。这项研究为通过排泄物中微生物的宏基因组标志物对结直肠癌进行无创早期诊断奠定了坚实的基础。

宏基因组测序技术检测方法

宏基因组测序技术检测方法宏基因组测序技术检测标准简介：宏基因组测序介绍宏基因组学是以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象，通过现代基因组技术手段包括功能基因的筛选和测序分析，对环境中微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系以及环境之间的关系进行研究的新的微生物研究方法。随着高通量测序技术的发展，为宏基因组学研究提供了新的理想研究方法。高通量测序的方法无需分离环境中各种微生物，也无需构建克隆文库就可以直接对环境中所有微生物进行测序。可以真实客观的反映环境中微生物的多样性、种群结构、进化关系等。目前又可以分为针对16s DNA/18sDNA/ITS 测序和针对宏基因组全序列的测序研究。下面就是对这两者的具体介绍。一、16s DNA/18s DNA/ITS 测序 16sDNA 是最常用的微生物物种分子鉴定的标签，，通过对样品中 16sDNA 测序可以鉴定其中微生物物种的丰度和分布情况。目前，普遍使用Roche 454 平台来对环境样品进行16s DNA 测序。因为16s DNA 序列比较相似，读长短的话，难以进行有效的比对，而454 平台的平均读长在400bp 左右，可以很好的避免此类问题。

二、宏基因组全测序在这种测序方式中，我们可以假定一个环境中的所有微生物就是一个整体，然后对其中所有的微生物进行测序。这样我们就可以研究样品中的功能基因以及其在环境中所起的作用而不用关心其来自哪个微生物。可以发现新的基因，可以进行基因的预测，甚至有可能得到某个细菌基因组的全序列。此外，该项测序不单可以针对DNA 水平，也可以针对全RNA 进行基因表达水平的研究。样品处理：宏基因组样品收集主要有口腔，下呼吸道痰液，下呼吸道灌洗液，皮肤和粪便。样品采集遵照样品采集规范（人）所规定的操作来进行。尽量留足备份样品。核酸提取：宏基因组核酸提取主要有两种方法：膜过滤法和直接裂解提取。对于液体样品如痰液，灌洗液两种方法都适用，对于固体样品如粪便宜采用直接裂解的方法。核酸提取后用NanoDrop ND-1000测定，260/280 = 1.8-2.0 ，260/230 = 1.8-2.0 ，电泳检测DNA应是完整的一条带测序Sequencing 1) 16S/18S 测序： Sanger 测序：用于低通量的16S/18S DNA测序，提取宏基因组后，首先通过PCR将 16S/18S 序列扩增出来，再将其连接到克隆载体上，导入感受态细胞，涂平板做蓝白斑筛选，选出阳性克隆提质粒，对质粒进行测序反应，测序反应后纯化后用ABI 3130 或ABI 3730 进行毛细管电泳测序。由于其测序准确率比较高，而通量非常低，现通常用做二代测序结果的验证。 454 Platform ： 454平台主要包括两种测序系统：454 GS FLX+ System和454 GSJ unior System。 454 GSF LX+ System 测序读长可以达到600-1000bp，通量450-700M，GSJ

宏基因组测序技术检测方法修订稿

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宏基因组学的研究

宏基因组学研究进展及其应用摘要：本文先简要介绍了当前生物化学的一些研究热点，再针对宏基因组学展开论述，介绍了宏基因组学的产生背景和概念，当前的研究进展及应用。宏基因组学尝试通过免培方法获得微生物的纯培养，主要技术包括DNA的提取、文库的构建和目标基因克隆的筛选，可用于开发新型酶、发现新基因、筛选医药等方面。关键字：宏基因组学；宏基因组学基本策略；文库构建与筛选；宏基因组学研究进展及其应用引言：微生物是地球上种类最多、数量最大、分布最广的生物群。仅原核生物(细菌和古细菌)即构成地球生物总量的的25～50 %[1]。自然条件下，包括病毒在内的微生物,通过群落广泛参与C、N、O 和S等重要元素的循环转化，在人体的食物消化、毒素降解及机体免疫反应，环境污染物降解等方面发挥着重要作用[2]。人们对于微生物的研究主要是建立在纯培养基础上，后来人们发现通过纯培养方法估计的环境微生物多样性只占总量的0.1%~1%[3]，多达99%以上的微生物是不可培养的, 其中蕴含着巨大的应用潜能——其代谢产物中可能有众多具有应用开发价值的化合物[4]。为了研究不能培养的微生物，一个全新的理念——宏基因组学应运而生，该技术不需预先培养就能开发这些微生物基因组，目前已广泛应用于微生物活性物质的开发与利用、环境微生物种群分布及动态变化分析等方面的研究[5]。宏基因组学的提出为解决上述问题提供了一个可行途径。宏基因组学以生境中全部DNA作为研究对象，通过克隆、异源表达来筛选有用基因及其产物。由于突破了传统研究领域无法涵盖不可培养微生物的瓶颈，宏基因组学概念及研究方法一经提出，就被广泛接受。尽管在方法上还存在一定缺陷，但并不妨碍不同领域学者利用该方法来研究各种生境中微生物生态以及筛选功能基因的热情，有关宏基因组学研究的文章逐年增多[4]。 1.宏基因组学的概念宏基因组( metagenome) 的概念是指从生境样本中取得全部微生物的基因组, 而不是采用传统的培养微生物的基因组。宏基因组的样本既包括可培养的微生物，也包括更大量的传统方法无法研究的不可培养微生物[6]。而所谓宏基因组学(也称元基因组学Metagenomics 、微生物环境基因组学Microbial Environmental Genomics、生态基因组学Ecogenomics ) 就是一种以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象，以功能基因筛选和测序分析为研究手段，以微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系及与环境之间的关系为研究目的的新的微生物研究方法，一般包括克隆、构建文库和功能分析筛选等工作[7]。 2.宏基因组学的基本策略及方法 2.1宏基因组学的基本策略宏基因组学的研究还处于初期发展阶段，但其研究的基本过程和基本策略已基本清楚。在此要强调的是，宏基因组学研究有着明确的指导思想，它是在反向生物学原则指导下，基于特定生态环境基础上，依据整体、系统、动态变化

宏基因组的生物信息分析

万方数据

宏基因组的生物信息分析作者：赵勇，黄劲松，宋新蕊，陈禹保，童贻刚， ZHAO Yong， HUANG Jin-song， SONG Xin-rui， CHEN Yu-bao， TONG Yi-gang 作者单位：赵勇,黄劲松,宋新蕊,陈禹保,ZHAO Yong,HUANG Jin-song,SONG Xin-rui,CHEN Yu-bao(北京市计算中心,北京,100094)，童贻刚,TONG Yi-gang(军事医学科学院微生物流行病研究所,北京,100071) 刊名：生物信息学英文刊名：China Journal of Bioinformatics 年，卷(期)：2013,11(4) 参考文献(30条) 1.Chen K;Pachter L Bioinformatics for Whole-genome Shotgun Sequencing of Microbial Communities 2005(02) 2.Cole JR;Wang Q;Cardenas E;Fish J Chai B Farris RJ Kulam-Syed-Mohideen AS McGarrell DM Marsh T Garrity GM Tiedje JM The Ribosomal Database Project:Improved Alignments and New Tools for rRNA Analysis 2009(suppl 1) 3.Lev RE;Turnbaugh PJ;Klein S;Gordon JI Microbial Ecology:Human Gut Microbes Associated with Obesity 2006(7122) 4.Huber JA;Mark Welch DB;Morrison HG;Huse SM,Neal PR,Butterfield DA,Sogin ML Microbial Population Structures in The Deep Marine Biosphere[外文期刊] 2007(5847) 5.Ley RE;Hamady M;Lozupone C;Turnbaugh P J Ramey RR Bircher JS Schlegel ML Tucker TA Schrenzel MD Knight R Gordon JI Evolution of Mammals and Their Gut Microbes[外文期刊] 2008(5883) 6.Bartram AK;Lynch MD;Stearns JC;Moreno-Hagelsieb G,Neufeld JD Generation of Multimillion-sequence 16s rrna Gene Libraries From Complex Microbial Communities by Assembling Paired-End Illumina Reads 2011(11) 7.Mitreva M Structure,Function and Diversity of the Healthy Human Microbiome 2012 8.Diehl GE;Longman RS;Zhang JX;Breart B Galan C Cuesta A Schwab SR Littman DR Microbiota Restricts Trafficking of Bacteria to Mesenteric Lymph Nodes by CX (3) CR 1 (hi) Cells 2013(7435) 9.Rondon MR;August PR;Bettermann AD;Brady SF Grossman TH Liles MR Loiacono KA Lynch BA MacNeil IA Minor C Tiong CL Gilman M Osburne MS Clardy J Handelsman J Goodman RM Cloning the Soil Metagenome:A Strategy for Accessing the Genetic and Functional Diversity of Uncultured Microorganisms 2000(06) 10.Mardis E R Next-Generation DNA Sequencing Methods 2008 11.Sikkema-Raddatz B;Johansson LF;de Boer EN;Almomani R Boven LG van den Berg MP van Spaendonck-Zwarts KY van Tintelen JP Sijmons RH Jongbloed JD Sinke RJ Targeted Next-Generation Sequencing can Replace Sanger Sequencing in Clinical Diagnostics 2013(07) 12.Dinsdale EA;Edwards RA;Hall D;Angly F Breitbart M Brulc JM Furlan M Desnues C Haynes M Li L McDaniel L Moran MA Nelson KE Nilsson C Olson R Paul J Brito BR Ruan Y Swan BK Stevens R Valentine DL Thurber RV Wegley L White BA Rohwer F Functional Metagenomic Profiling of Nine Biomes 2008(7187) 13.Maurice CF;Haiser HJ;Turnbaugh PJ Xenobioties Shape the Physiology and Gene Expression of the Active Human Gut Microbiome 2013(01) 14.De Filippo C;Ramazzotti M;Fontana P;Cavalieri D Bioinformatic Approaches for Functional Annotation and Pathway Inference in Metagenomics Data 2012(06) 15.Sanli K;Karlsson FH;Nookaew I;Nielsen J FANTOM:Functional and Taxonomic Analysis of Metagenomes 2013(01) 16.Arumugam M;Harrington ED;Foerstner KU;Raes J Bork P SmashCommunity:A Metagenomic Annotation and Analysis Tool 2010(23) 17.Parks D H;Beiko R G Identifying Biologically Relevant Differences between Metagenomic Communities 2010(06) 18.Kembel SW;Cowan PD;Helmus MR;Cornwell WK,Morlon H,Ackerly DD,Blomberg SP,Webb CO Picante:R tools for Integrating Phylogenies and Ecology 2010(11) 19.Angiuoli SV;Matalka M;Gussman A;Galens K Vangala M Riley DR Arze C White JR White O Fricke WF CloVR:A Virtual Machine for Automated and Portable Sequence Analysis from the Desktop Using Cloud Computing 2011 20.Fischer MG;Suttle CA A Virophage at the Origin of Large DNA Transposons 2011(6026) 21.Boyer M;Yutin N;Pagnier I;Barrassi L Fournous G Espinosa L Robert C Azza S Sun S Rossmann MG Suzan-Monti M La Scola B Koonin EV Raoult D Giant Marseillevirus Highlights the Role of Amoebae as a Melting Pot in Emergence of