DsDNA使用TBK1-IRF3信号通路

DsDNA使用TBK1-IRF3信号通路

在我们对DNA免疫刺激效应理解上的下一步飞跃始于意识到当被直接导入细胞质时非病原菌来源的DNA也是有免疫刺激性的。在我们实验室的调查中揭示dsDNA，当用胞质转染法转染时是一个IFN-Ⅰ和趋化因子基因如Cxd10,Cd5和Cd2潜在的诱导物在小鼠和人的树突细胞以及间质细胞。关于免疫原性的条件在添加的CpGDNA和转染的dsDNA之间是不同的。如果不考虑这些序列，胞质dsDNA仍然是有刺激性的并且可以诱导IFN-Ⅰ即使当它是甲基化的。这不只限于病原来源的DNA，因为当转染时那些缺乏CpG岛的小牛胸腺和人造DNA和E.coli以及HSV-1有相同的刺激性。此外，之前被证明由于缺乏TLR9表达而对CpG无反应的小鼠胚胎成纤维细胞当用DNA转染时表现出IFN-Ⅰ的诱导效应。这种dsDNA的IFN-Ⅰ刺激效应依赖于它的长度。长的dsDNA诱导更强的IFN-Ⅰ反应。只有dsDNA是有刺激性的；ssDNA如互补DNA(cDNA)被发现是免疫惰性的。这种刺激效应也只限于B型（B-DNA）的dsDNA 而非Z型(Z-DNA)构象。B-DNA是一种dsDNA结构普遍出现的低能状态采用右手螺旋构象。相反，Z-DNA采用高能的左手螺旋结构在生理状态下出现较少。人造由AT重复聚（dA–dT）.聚（dT–dA）(聚（dA.dT）将来)dsDNA倾向于采用B型构象并且当转染入小鼠胚胎成纤维细胞时可以诱导潜在的IFN-Ⅰ反应。另一方面，由GC重复组成的人造dsDNA，聚（dG-dC）聚（dC-dG）聚（dG-dC）将来），采用Z型构象，当转染入小鼠胚胎成纤维细胞时没有刺激性。这些DNA的第二结构仍然是完整的即使和基于脂质体的转染试剂混合时。

我们也通过研究在那时已知的其他的核酸感受器和信号分子是否参与B-DNA诱导IFN-Ⅰ的反应来探究机制。在胞质内感受dsRNA的TLR通路和RIG-Ⅰ通路没有参与，基于在缺乏MyD88/TRIF和RIG-Ⅰ的小鼠胚胎成纤维细胞上的试验研究。尽管胞浆DNA诱导IFN-Ⅰ反应不依赖于RIG-Ⅰ信号，我们表明在HEK293细胞中IPS-1对产生IFNβ的最优反应是必需的。这些数据在出版那时是令人不解的，但是现在我们知道RNA酶Ⅲ可以从poly(dA:dT)到刺激RIG-Ⅰ充当RNA中介。这个通路存在于人的细胞中，但在小鼠的细胞中是多余的（在之后的章节中讨论）。随后，我们把我们的注意力转向TBK1，之前发现对于在感染期间通过病毒的dsRNA诱导IFN-Ⅰ是必需的。TBK1是非经典的IκB激酶和IKKα以及IKKβ相关，是NF-κB 活化的调节者。它在NF-κB活动和IFN-Ⅰ反应中起中介作用由TLR依赖和非依赖途径触发。TBK1也已证明对于当用CpGDNA刺激时类胞浆树突状细胞产生IFN-α是非必需的。和那个观察形成对比，我们表明IFNβ和其他的由B-DNA转染诱导的趋化因子反应在TBK1-/- 小鼠胚胎成纤维细胞是完全没有的。TBK1对于IRF3的二聚化是必须的，由B-DNA所诱导，但B-DNA 诱导NF-κB激活是多余的。因此TBK1-IRF3信号轴对于由胞浆B-DNA刺激诱导IFN-Ⅰ是至关重要的。

B-DNA的刺激效应也被发现是功能性的通过执行基因系列WT,TBK1-/-,IKKi-/-和TBK1-/-IKKi-/-基因双敲除小鼠胚胎成纤维细胞，由聚（dA:dT）所刺激。结果表明大多数的上调基因是干扰素诱导基因也是抗病毒相关基因如MX1和QASL2。因为这个原因，当用dsDNA预培养时，WT MEFs,而非TBK1-/- MEFs，能更好地免受水疱口炎病毒的威胁。除了越来越多的抗病毒反应外，TBK1依赖的通过DNA诱导IFN-Ⅰ的反应也被发现对DNA疫苗的功效至关重要。缺乏TBK1的小鼠不能诱导抗原特异性的CD4和CD8T细胞以及产生IFNγ脾细胞的增加频率，当用流行性感冒病毒DNA免疫时。

和我们的研究相似，Stetson et al.表明非微生物来源的dsDNA如果转入胞浆可以有刺激效应且由胞浆dsDNA引起的免疫激活特点不同于CpGDNA。作者们始于通过证明直接转入单核细胞增多性李斯特氏菌，嗜肺军团菌以及凋亡的哺乳动物细胞的DNA到巨噬细胞的胞液可以诱导潜在的IFNβ以及IL-6反应。这个反应不依赖于MyD88,TRIF和RIP2，因此不涉及TLR以及NOD1/2信号。通过进一步研究这个新的感受DNA的信号途径，他们合成了一个没有CpG岛的45bp的寡核苷酸并把它命名为干扰素刺激DNA（ISD）。ISD在细胞中不

能诱导任何细胞因子激活当被转染入免疫和非免疫细胞系。不同于CpG对浆细胞样树突状细胞的严格刺激，ISD能诱导所有细胞类型包括浆细胞样树突状细胞，常规树突状细胞，巨噬细胞和小鼠胚胎成纤维细胞的IFN-Ⅰ。ISD产生IFNβ不依赖于TLR和NOD1/2或DNA 修复机制的成员包括DNA-PK(Ku70)，ATM和ATR激酶，和PI-3K。更重要的是，他们表明ISD持续诱导稳健的IFNβ和IL-6,尽管用氯奎治疗巨噬细胞，这已知抑制CpG DNA激活TLR9所需的酸化作用。因此提供了除TLR9外检测DNA的可选途径。

鉴定内源DNA感受器

当TLR9非依赖途径被发现以后，DNA诱导炎症的TBK1-IRF3依赖通路，有一系列的报导鉴定识别dsDNA的胞内受体的文章发表。现在已知细胞检测DNA导致炎症反应不是存在于TLR9和病原来源DNA中CpG岛之间的直接对话。随着dsDNA能够诱导TLR9非依赖性的IFN-Ⅰ反应，大量的非细胞膜联系的胞内dsDNA检测器被鉴定。除了AIM2和Ku70以外，诱导的炎性反应共同鉴定的DNA感受器迄今为止是通过TBK1-IRF3信号轴诱导IFN-Ⅰ。通过KU70诱导IFN-Ⅲ产生，然而AIM2炎性体激活导致IL-1β和IL-18的产生。我们将会重点用早期做出这个发现的文章分别描述鉴定的胞内DNA感受器。

Z-DNA结合蛋白-1（ZBP-1）

ZBP-1，也被认为是DNA依赖的干扰素调节因子（DAI）和DLM-1的激活物，是继TLR9之后最早被发现的胞浆DNA感受器。在被发现是胞浆DNA感受器之前，ZBP-1被认为在调节mRNA代谢中起作用并且作为肿瘤相关的蛋白参与主体对抗细胞压力反应。这是一个IFN-可诱导的基因产物最初被报道通过两个结合域结合Z-DNA。没有其他的研究去研究它和其他形式的DNA的相互作用。在2006年，Takaoka和同事观测到ZBP-1的表达在L929细胞（小鼠成纤维细胞系）中显著上调，当被转染人造B-DNA时。他们表明当用B-DNA和其他来源的DNA包括细菌，小牛胸腺以及人造Z-DNA刺激时ZBP-1参与IFN-Ⅰ反应的诱导，通过指出在ZBP-1表达的L929细胞中IFN-Ⅰ产量上调。敲除ZBP-1的细胞当用dsDNA刺激时不能诱导IFN-Ⅰ分泌。ZBP-1对检测DNA是特异性的并且不参与RNA诱导的IFN-Ⅰ反应。由于通过检测DNA在诱导IFN-Ⅰ所起的作用，ZBP-1被发现参与DNA介导的抗病毒反应。提前用胞浆dsDNA刺激的ZBP-1缺陷的L929细胞被发现和WT细胞相比对脑心肌炎病毒感染抵抗力弱。此外，IFNβ的表达被表明在感染了单纯疱疹病毒-1（HSV-1）而非鸡新城疫病毒（NDV）的ZBP-1缺陷细胞中下调，这两种病毒分别是DNA和RNA病毒。和这个观察平行，ZBP-1缺陷的L929细胞和WTL929细胞相比产生高的HSV-1病毒滴定度，然而WT和ZBP-1-/-L929细胞对于NDV病毒的滴定度仍然相同。接下来，为了证明ZBP-1是DNA的受体，使用荧光共振能量转移（FRET）分析和免疫共沉淀分析表明它和B-DNA直接相互作用。显微镜检查试验表明ZBP-1主要位于细胞质内。

至于导致IFN-Ⅰ应答的信号通路，ZBP-1是利用TBK1-IRF3信号通路。它被表明在B-DNA 刺激后诱导IRF3的二聚化。此外，TBK1和IRF3被证明和ZBP-1有生理上的联系，当用B-DNA 刺激并用免疫共沉淀分析后。当ZBP-1,IRF3和TBK1之间的这种联系发生时，ZBP-1需要在丝氨酸352和353位置磷酸化。ZBP-1也可以通过B-DNA诱导介导NF-κB激活。详细的试验揭示ZBP-1包含两个受体相互作用蛋白（RIP）同型结构域（RHIMs）这可以募集含RHIM 激酶受体蛋白激酶1和3（RIP1和RIP3）激活NF-ΚB。RIP3和RIP1是两个蛋白，之前被鉴定对通过TLR3信号调节NF-ΚB至关重要。

ZBP-1死亡或难以死亡

ZBP-1在检测和诱发DNA刺激的炎性反应和对抗病原的免疫在这个发现在之后的报道中受到了质疑。早期设计的研究ZBP-1和通过DNA诱导IFN-Ⅰ的实验都是在ZBP-1沉默的L929细胞上操作的。然而当用MEF细胞替代时从这些实验获得的数据不能再现。此外，有其他的报导证明当用dsDNA转染或者用嗜肺军团菌感染人类细胞系HEK293和A549诱导IFN-

Ⅰ和IL-8时ZBP-1是不需要的。也有报导证明它不参与肺炎双球菌和单纯疱疹病毒1感染诱导IFN-Ⅰ。在我们的实验室，我们制造了ZBP-1-/-老鼠并研究它在dsDNA和DNA疫苗对固有和适应性免疫的影响中所起的作用。我们表明MEFs,GM-CSF和FLT-3配体培养的产生自ZBP-/-老鼠的树突状细胞当用dsDNA刺激时和WT细胞一样对普通水平死亡IL-6好，IFNβ和其他IFN-可诱导基因产生应答。我们也表明ZBP1小鼠和WT小鼠有着相同水平的抗体和T 细胞应答-/-当用DNA疫苗免疫时，不像TBK1缺陷型小鼠对DNA预防接种无反应。除了这些观察结果，在一个独立的报导中说ZBP-1可以被用作接种疫苗的佐剂。用ZBP-1表达的质粒电击转化导入小鼠可以增加IFN-Ⅰ以及其他细胞因子和共刺激分子的表达量促进疫苗反应。与此同时，联合免疫OVA和ZBP-1表达质粒促进抗OVA的免疫反应产生。它也可以产生肿瘤防护性反应当用表达肿瘤相关的抗原生存素质粒联合免疫时。因此，到目前为止还不清楚ZBP-1是否在DNA检测上扮演了一个重要角色。

TBK1和IKKε

TBK1和IKKε激酶的激活触发了一连串的信号通过转录因子包括IRF的成员及标准的NF-κB家族的磷酸化。最近的发现表明TBK1和IKKε在细胞中RAS诱导的转化中起作用。TBK1由RalB-Sec5效应物复合物募集和激活，这对RAS起中介作用的转化是必需的。TBK1对于抑制细胞凋亡是必需的在应答RAS激活时，可能通过参与v-akt小鼠胸腺瘤病毒致癌基因同系物（AKT）存活途径。相似的，IKKε也被鉴定为磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）-AKT通路的效应器，和MAP激酶-ERK激酶（MEK）合作去促进转化。通过siRNA抑制增值，黏附和一些肿瘤细胞系侵袭可以损害IKKε表达。在前列腺癌疾病模型中，观察到IKKε表达水平和恶性肿瘤存在相关。

Аαγε

干扰素基因刺激器（STING）依赖的胞浆DNA感受器和IFN-Ⅰ在细菌感染期间的反应

长久以来人们就知道向细胞内运送哺乳动物或细菌的dsDNA触发独立宿主的TLR9的促炎反应，并且微生物和宿主的DNA输送到胞液中刺激IFN-Ⅰ。此外，用细菌侵染在宿主细胞的胞液中复制诱导IFN-Ⅰ的产生。接下来的研究表明细菌表达分泌系统可以将微生物分子注入宿主细胞，或表达压片毒素它可以在吞菌作用后破坏噬菌体溶酶体膜也可以刺激IFN-Ⅰ反应。IFNα/β对胞浆DNA刺激或是细菌感染的应答诱导了一个相似的基因表达模式，并且同时依赖于TBK1激酶和转录因子IRF3，但不依赖TLRs。这些结果和其他的一些证据导出了这样一个个结论：通过胞内PRRs感知细菌DNA是在各种病菌感染期间激活IFN-Ⅰ反应的原因。然而，某些细菌似乎在一些细胞系通过不同的激活机制去刺激IFN-Ⅰ产生，例如，细菌第二信使c-di-GMP和c-di-AMP或通过细菌的RNA。

重要地是，由胞内微生物DNA诱导的IFN-Ⅰ反应，c-di-GMP和c-di-AMP需要分子STING（也被称作MPYS和MITA）。STING似乎也是一个衔接分子，可以从大多数胞内DNA感受器转运信号到TBK1和IRF3，是c-di-GMP和c-di-AMP的直接感受器（或共感受器）。STING是一个跨膜蛋白是内质网的组分。在细胞内DNA存在的情况下，STING迅速地从内质网区通过高尔基体定位于细胞核周围一个独特的核内体，并且激活转录因子IRF3/7以及NF-κB刺激IFN-Ⅰ产生。此外，STING也表明其激活STAT6依赖的趋化因子产生且诱导选择性自噬（如下）。STING缺陷的巨噬细胞，cDCs或MEFs不能触发在应对单核细胞增生李斯特菌，土拉热弗朗西丝（氏）菌，结核分支杆菌或一些dsDNA种类的IFN-Ⅰ反应。有趣的是，推定的在STING 上失去功能的突变已在大约3%的美国人上得到了鉴定，表明携带这些突变的人群展示出对细菌感染改变了的敏感性。

一些推定的胞浆DNA感受器已在最近的两三年得到了鉴定。第一个表明可以介导对细菌DNA 的IFN-Ⅰ反应的胞内宿主蛋白是DAI（DNA依赖的干扰素调节因子激活器；也成为Z-DNA结合蛋白-1）。然而，接下来的研究表明DAI不负责在大多数细胞系里IFNа/β对胞浆DNA刺

激或细菌感染时的反应。

其他的研究表明富含AT的DNA可以通过RIG-Ⅰ间接地刺激IFN-Ⅰ反应。一些研究的作者表明合成的或细菌DNA可以被转录成RNA并且这是RNA聚合酶Ⅲ依赖的。此外，他们表明转录成的RNA激活RIG-Ⅰ。RIG-Ⅰ信号通过衔接分子MAVS导致IRF3依赖的诱导IFN-Ⅰ基因。然而，这个通路并不在所有的细胞种类中运行或者可能在一些细胞中是多余的。例如，对（aA:dT）应答的IFN-Ⅰ在同时缺乏STING和MAVS的巨噬细胞中几乎完全没有，而这种情况不出现在只缺乏STING或MAVS的巨噬细胞中。此外，很多DNA序列不激活RNA聚合酶Ⅲ-RIG-Ⅰ通路，且关于这个通路在细菌感染中所起的作用的证据也是缺乏的。

第三个鉴定的可以刺激IFN- I反应的胞内DNA感受器是人体蛋白IFI16(γ-干扰素诱导蛋白16)。IFI16和AIM2密切相关并且是AIM2样受体和PYHIN家族的成员。已经表明IFI16结合到病毒和人造DNA上募集STING接头刺激TBK1-IRF3通路导致IFN- I产生。敲除鼠的p204，考虑到和人的IFI16结构对应，导致IFNβ在应对DNA和结核分支杆菌感染小鼠细胞时产量的减少。此外，IFI16也表明充当了一个核病原感受器激活在应对卡波济氏肉瘤—与疱疹病毒有关的炎性反应。然而，IFI16作为一种细菌DNA的感受器以及在细菌感染期间激活IFN-Ⅰ应答和/或炎性反应所起的作用还未知。IFI16在核仁的稳定水平可能预示着IFI16在DNA病毒感染而非细菌中所起的关键作用。

最近，其他的分子包括LRRFIP1，DHX9，DHX36，Ku70,LSm14A和DDX41已经表明有潜在的胞内DNA感受器功能。例如，LRRFIP1已经被表明绑定在poly(dAdT)和poly(dGdC)dsDNA上，且通过激活β-链蛋白增强在应答dsDNA以及单增李斯特菌时IFNβ转录。DHX36和DHX9是DexD/H 盒解旋酶的成员已经被表明绑定在浆细胞样树突状细胞的胞浆中且激活MyD88-依赖的信号转导。然而DHX36和IRF7激活以及随后的IFN-Ⅰ产生相关，DHX9主要介导NF-ΚB-依赖的IL-6和TNFα应答。此外，相关是我DexD/H盒解旋酶DDX41参与感受胞内人造或病毒DNA以及单增李斯特菌以及激活单细胞样树突状细胞和单核/巨噬细胞中STING-依赖的IFN-Ⅰ反应。然而，因为这些研究大多数只依赖于极低的数据，对于这些分子在DNA感知上所起作用的最终评价需要生成分别敲除的小鼠。此外，大多数这些分子在细菌感染尤其是在体内上的功能仍然未知。

最近被鉴定的推定的胞内DNA感受器是cyclic-GMP-AMP合酶。在俩篇配套文章中作者证明这些酶在转换由胞内DNA或DNA病毒感染刺激的信号到内源第二信使cyclic GMP-AMP所起的作用。作者进一步证明这个第二信使被STING感知，在之前关于细菌分子cyclic-di-GMP 的研究中。综合考虑，cyclic GMP-AMP合酶可能是寻找多时的不寻常的胞内DNA感受器。进一步的研究可以评价这个概念以及描述cyclic GMP-AMP合酶在感受细菌感染功能的特征。STING依赖的DNA感受器通路在细菌感染中的功能。

尽管涉及的上游受体分子在大多数细菌病原还没有发现且一些上述的DNA感受器的功能需要被测试，一些研究清楚证明检测DNA和IFN诱导的通路在细菌感染上的影响。

例如，嗜肺军团菌在巨噬细胞中刺激IFN-I产生依赖于细菌的Ⅳ分泌系统（T4SS）由dot/icm 基因编码。这个反应很大程度上依赖STING，TBK1和IRF3但不依赖TLRs和DAI。尽管感受军团菌RNA可能在某种程度上促成这个应答，检测如cyclic-di-GMP这样的军团菌第二信使可能也起到了一定作用，感受细菌DNA似乎是在军团菌感染期间触发IFN-I产生的主要机制。首先，军团菌DNA在感染期间可能通过T4SS易位到宿主胞液内，像之前所提到的那样。第二，将军团菌DNA输送到宿主细胞胞液内激活IFN-I产生和酶消化来自军团菌提取物的能抑制触发这个反应的DNA。第三，IFN-I对细菌的反应需要关键的胞内DNA（和cyclic-di-GMP）感知通路的衔接分子STING，如上所提到的那样。有趣地是，我们和其他人表明之后诱导的IFN-I在自分泌方式中起作用去刺激一个细胞自主抵抗通路帮助控制巨噬细胞中的嗜肺军团菌。IFN-I也和IFN-Ⅱ一起促进小鼠鼻内感染嗜肺军团菌的保护性宿主应答。

结核分支杆菌也被巨噬细胞内STING-依赖的胞内DNA感受通路所鉴定。当前的概念描述为细菌的ESX-1分泌系统可以穿孔包含分支杆菌的吞噬体膜将细菌的DNA泄漏到胞液内。这种分支杆菌DNA识别激活一个IRF/IFN-I依赖的转录程序产生对宿主有害的结果；以及一个宿主保护性的自噬途径。IFN-I的产生由分支杆菌DNA所刺激依赖于STING和IRF3，被胞液内DNAse Trex1反向调节。重要的是，IRF3-/-和IFNAR-/-小鼠对细菌更有抵抗力表明STING/IRF3-介导的胞浆DNA识别在结核分支杆菌发病上扮演了一个关键角色。自噬途径依赖于一个STING-介导的对分支杆菌DNA的识别以及一个随后的泛素和自噬衔接分子NDP52和p62的共存。重要地是，这个通路不依赖于IRF3和IFNs-I,有助于在巨噬细胞和小鼠上对分支杆菌的抵抗。这些结果表明胞内DNA感受途径在激活自噬中所起的新作用。

被STING-介导的巨噬细胞内胞内DNA感受通路所识别的其他细菌是链球菌包括A群和B群链球菌以及肺炎链球菌。这种识别依赖于细菌摄取以及吞噬体降解。此外，吞噬体膜被细菌孔毒素破坏允许细菌DNA转移到宿主细胞胞质溶胶。尽管上游PRR仍然未知，链球菌DNA 随后通过STING，TBK1和IRF3激活IFN-I反应。然而，其他类型的细胞似乎有别的机制去感知细菌及诱导IFNs-I。

Notch信号通路研究进展

224 中国医药生物技术 2009年6月第4卷第3期Chin Med Biotechnol, June 2009, V ol. 4, No. 3 DOI:10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2009.03.012 · 综述·Notch信号通路研究进展 王利祥，华子春 1917 年，Morgan 及其同事在果蝇体内发现一种基因，因其功能部分缺失可导致果蝇翅缘出现缺口，故命名该基因为 Notch。随后的研究发现，Notch 从无脊椎动物到脊椎动物的多个物种中表达，其家族成员的结构具有高度保守性，在细胞分化、发育中起着关键作用。迄今研究已阐明 Notch 信号通路的主要成员及核心转导过程，然而随着研究的深入，人们逐渐认识到该通路实际上处于十分复杂的调控网络之中，而这与其在发育过程中功能的多样性相符合。本文结合最新进展，系统阐述 Notch 信号通路的组成，功能，作用机制及调控，并揭示该通路异常与疾病的联系。 1 Notch 受体 Notch 受体是一个相对分子量约为 30 000 的 I 型膜蛋白，由胞外亚基和跨膜亚基组成，2 亚基之间通过 Ca2+ 依赖的非共价键结合形成异源二聚体。胞外亚基包含一组串联排列的 EGFR 和 3 个家族特异性的 LNR 重复序列。EGFR 在 Notch 受体与配体的结合中起关键作用，在果蝇中，Notch 受体的第 11 位和 12 位 EGFR 介导了其与配体的结合。LNR 位于 EGFR 的下游，富含半胱氨酸，介导了 2 亚基之间 Ca2+ 依赖的相互作用。跨膜亚基包括跨膜区、RAM 序列、锚蛋白重复序列、核定位序列、多聚谷氨酰胺序列以及 PEST 序列。RAM 结构域是 Notch 信号效应分子 CBF1/RBPJk 主要的结合部位。ANK 重复序列结构域是 Deltex、Mastermind 等的结合部位，这些蛋白对Notch 信号通路有修饰作用。PEST 结构域与泛素介导的Notch 胞内段降解有关[1]。 2 Notch 配体 Notch 配体与受体一样为 I 型跨膜蛋白。果蝇 Notch 配体有 2 个同源物 Delta 和 Serrate，线虫的 Notch 配体为 Lag 2，故又称 Notch 配体为 DSL 蛋白。脊椎动物体内也发现了多个 Notch 配体，与 Delta 同源性高的称为Delta 样分子，与 Serate 同源性高的被称作 Jagged。目前，发现人的 Notch 配体有 D ll l、3、4和 Jagged l、2。配体胞外 DSL 结构域在进化中高度保守，是配体与受体结合、激活 Notch 信号所必需的。Notch 配体的胞内域较短，仅70 个左右氨基酸残基，功能尚未阐明。近来研究发现，Delta 1 的胞内域能够诱导细胞的生长抑制[2]。有人推测，配体胞内段可能类似与受体胞内段，具有信号转导功能，但具体机制有待进一步研究。3 Notch 信号传递与效应因子 迄今研究发现主要有 6 种信号通路在多细胞生物的生长中发挥关键作用，分别是刺猬、骨形态发生蛋白、无翅、类固醇激素受体、Notch 和受体酪氨酸激酶。Notch 相对于其他信号通路结构较简单，没有第二信使的参与。现有研究提出了 Notch 信号活化的“三步蛋白水解模型”[3]。首先，Notch 以单链前体模式在内质网合成，经分泌运输途径，在高尔基体内被 Furin 样转化酶切割成相对分子质量为180 000 含胞外区的大片段和 120 000 含跨膜区和胞内区的小片段。两者通过 Ca2+依赖性的非共价键结合为异源二聚体，然后被转运到细胞膜。当 Notch 配体与受体结合，Notch 受体相继发生 2 次蛋白水解。第一次由 ADAM 金属蛋白酶家族的 ADAM 10/Kuz 或 ADAM 17/TACE 切割为 2 个片段。N 端裂解产物（胞外区）被配体表达细胞内吞，而 C 端裂解产物随后由早老素 1/2，Pen-2，Aph1 和Nicastrin 组成的γ-促分泌酶复合体酶切释放 Notch 受体的活化形式 NICD。 经典的 Notch 信号通路又称为 CBF-1/RBP-Jκ依赖途径。CBF-1/RBP-Jκ本身是 1 个转录抑制因子，能够特异性地与 DNA 序列“CGTGGGAA”相结合，并招募 SMRT，SKIP，I/II 型组蛋白去乙酰化酶等蛋白形成共抑制复合物，抑制下游基因的转录。当 Notch 信号激活后，NICD 通过上述酶切反应被释放进入胞核，通过 RAM 结构域及 ANK 重复序列与 CBF-1/RBP-Jκ结合使共抑制复合物解离，并募集 SKIP，MAML 1 组成共激活复合体，激活下游基因的转录。Notch 信号的靶基因多为碱性螺旋-环-螺旋转录抑制因子家族成员，如哺乳动物中的 HES、非洲爪蟾中的XHey-1，以及近来发现的 BLBP [3]。此外，存在非CBF-1/RBP-Jκ依赖的 Notch 信号转导途径。最近有研究报道，果蝇 Notch 结合蛋白 Deltex 是某些组织特异性非 Su （H）依赖性信号所必需的，同时发现 Deltex 也具有拮抗Notch 的功能 [4]。 4 Notch 信号途径功能 Notch 信号途径的功能最初是在果蝇神经系统发育的 基金项目：国家自然科学基金（30425009，30730030）；江苏省自然科学基金（BK2007715） 作者单位：210093 南京大学医药生物技术国家重点实验室 通讯作者：华子春，Email：zchua@https://www.wendangku.net/doc/f93010811.html, 收稿日期：2009-02-01

ERK5信号通路研究现状

World Journal of Cancer Research 世界肿瘤研究, 2014, 4, 41-46 Published Online October 2014 in Hans. https://www.wendangku.net/doc/f93010811.html,/journal/wjcr https://www.wendangku.net/doc/f93010811.html,/10.12677/wjcr.2014.44008 Review of the ERK5 Signaling Pathway Research Song Luo*, Shengfa Su, Weiwei Ouyang#, Bing Lu# Teaching and Research Section of Oncology, Guiyang Medical University, Guiyang Email: 4567436@https://www.wendangku.net/doc/f93010811.html,, #ouyangww103173@https://www.wendangku.net/doc/f93010811.html,, #lbgymaaaa@https://www.wendangku.net/doc/f93010811.html, Received: Sep. 25th, 2014; revised: Oct. 16th, 2014; accepted: Oct. 20th, 2014 Copyright ? 2014 by authors and Hans Publishers Inc. This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY). https://www.wendangku.net/doc/f93010811.html,/licenses/by/4.0/ Abstract Extracellular signal regulated kinase 5 (ERK5) is an important part of mitogen activated protein kinase (MAPK) system, and also is a new signal transduction pathway of MAPK signaling system, which has attracted much attention in recent years. ERK5 can be activated by many stimulating factors and plays an important role in cell survival, proliferation and differentiation. Furthermore, ERK5 is closely related to vascular development and proliferation, and other critical functions. This paper focuses on the origin, structure, property, physiological features of ERK5, and the relation-ship between ERK5 and tumor and non-oncologic diseases, and reviews the research direction in the future. Keywords ERK5, Signaling Pathways, MAPK ERK5信号通路研究现状 罗松*，苏胜发，欧阳伟炜#，卢冰# 贵阳医学院肿瘤学教研室，贵阳 Email: 4567436@https://www.wendangku.net/doc/f93010811.html,, #ouyangww103173@https://www.wendangku.net/doc/f93010811.html,, #lbgymaaaa@https://www.wendangku.net/doc/f93010811.html, 收稿日期：2014年9月25日；修回日期：2014年10月16日；录用日期：2014年10月20日 *第一作者。 #通讯作者。

常见的信号通路

1JAK-STAT信号通路 1)JAK与STAT蛋白 JAK-STAT信号通路是近年来发现的一条由细胞因子刺激的信号转导通路，参与细胞的增殖、分化、凋亡以及免疫调节等许多重要的生物学过程。与其它信号通路相比，这条信号通路的传递过程相对简单，它主要由三个成分组成，即酪氨酸激酶相关受体、酪氨酸激酶JAK和转录因子STAT。(1)酪氨酸激酶相关受体（tyrosinekinaseassociatedreceptor） 许多细胞因子和生长因子通过JAK-STAT信号通路来传导信号，这包括白介素2?7（IL-2?7）、GM-CSF（粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子）、GH（生 长激素）、EGF（表皮生长因子）、PDGF（血小板衍生因子）以及IFN（干扰素）等等。这些细胞因子和生长因子在细胞膜上有相应的受体。这些受体的共同特点是受体本身不具有激酶活性，但胞内段具有酪氨酸激酶JAK 的结合位点。受体与配体结合后，通过与之相结合的JAK的活化，来磷酸化各种靶蛋白的酪氨酸残基以实现信号从胞外到胞内的转递。 (2)酪氨酸激酶JAK（Januskinase） 很多酪氨酸激酶都是细胞膜受体，它们统称为酪氨酸激酶受体（receptor tyrosinekinase,RTK），而JAK却是一类非跨膜型的酪氨酸激酶。JAK是英文Januskinase的缩写，Janus在罗马神话中是掌管开始和终结的两面神。之所以称为两面神激酶，是因为JAK既能磷酸化与其相结合的细胞因子受体，又能磷酸、JAK1个成员：4蛋白家族共包括JAK结构域的信号分子。SH2化多个含特定

JAK2、JAK3以及Tyk2，它们在结构上有7个JAK同源结构域（JAKhomologydomain,JH），其中JH1结构域为激酶区、JH2结构域是“假”激酶区、JH6和JH7是受体结合区域。 (3)转录因子STAT（signaltransducerandactivatoroftranscription）STAT被称为“信号转导子和转录激活子”。顾名思义，STAT在信号转导和转录激活上发挥了关键性的作用。目前已发现STAT家族的六个成员，即STAT1-STAT6。STAT蛋白在结构上可分为以下几个功能区段：N-端保守序列、DNA结合区、SH3结构域、SH2结构域及C-端的转录激活区。其中，序列上最保守和功能上最重要的区段是SH2结构域，它具有与酪氨酸激酶Src的SH2结构域完全相同的核心序列“GTFLLRFSS”。 2)JAK-STAT信号通路 与其它信号通路相比，JAK-STAT信号通路的传递过程相对简单。信号传 递过程如下：细胞因子与相应的受体结合后引起受体分子的二聚化，这使得与受体偶联的JAK激酶相互接近并通过交互的酪氨酸磷酸化作用而活化。JAK激活后催化受体上的酪氨酸残基发生磷酸化修饰，继而这些磷酸化的酪氨酸位点与周围的氨基酸序列形成“停泊位点”（dockingsite），同时含有SH2结构域的STAT蛋白被招募到这个“停泊位点”。最后，激酶JAK 催化结合在受体上的STAT蛋白发生磷酸化修饰，活化的STAT蛋白以二 聚体的形式进入细胞核内与靶基因结合，调控基因的转录。值得一提的是，一种JAK激酶可以参与多种细胞因子的信号转导过程，一种细胞因子的信号通路也可以激活多个JAK激酶，但细胞因子对激活的STAT分子却具有一定的选择性。例如IL-4激活STAT6，而IL-12 。STAT4却特异性激活

(完整版)细胞信号转导研究方法

细胞信号转导途径研究方法 一、蛋白质表达水平和细胞内定位研究 1、信号蛋白分子表达水平及分子量检测: Western blot analysis. 蛋白质印迹法是将蛋白质混合样品经SDS-PAGE后,分离为不同条带，其中含有能与特异性抗体(或McAb)相应的待检测的蛋白质(抗原蛋白)，将PAGE胶上的蛋白条带转移到NC膜上此过程称为blotting，以利于随后的检测能够的进行，随后,将NC膜与抗血清一起孵育，使第一抗体与待检的抗原决定簇结合(特异大蛋白条带)，再与酶标的第二抗体反应,即检测样品的待测抗原并可对其定量。 基本流程： 检测示意图：

2、免疫荧光技术 Immunofluorescence （IF） 免疫荧光技术是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素制成荧光标记物，再用这种荧光抗体（或抗原）作为分子探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。在细胞或组织中形成的抗原抗体复合物上含有荧光素，利用荧光显微镜观察标本，荧光素受激发光的照射而发出明亮的荧光（黄绿色或桔红色），可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质、定位，以及利用定量技术测定含量。 采用流式细胞免疫荧光技术（FCM）可从单细胞水平检测不同细胞亚群中的蛋白质分子，用两种不同的荧光素分别标记抗不同蛋白质分子的抗体，可在同一细胞内同时检测两种不同的分子（Double IF），也可用多参数流式细胞术对胞内多种分子进行检测。 二、蛋白质与蛋白质相互作用的研究技术 1、免疫共沉淀（Co- Immunoprecipitation, Co-IP）

Co-IP是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“protein A”能特异性地结合到免疫球蛋白的FC片段的现象而开发出来的方法。目前多用精制的protein A预先结合固化在agarose的beads 上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的prorein A就能吸附抗原抗体达到沉淀抗原的目的。 当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。进一步进行Western Blot 和质谱分析。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合，也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。缺点：可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－蛋白质相互作用。 2、GST pull-down assay GST pull-down assay是将谷胱甘肽巯基转移酶（GST）融合蛋白（标记蛋白或者饵蛋白，GST, His6, Flag, biotin …）作为探针，与溶液中的特异性搭档蛋白(test protein或者prey被扑获蛋白)结合，然后根据谷胱甘肽琼脂糖球珠能够沉淀GST融合蛋白的能力来确定相互作用的蛋白。一般在发现抗体干扰蛋白质－蛋白质之间的相互作用时，可以启用GST沉降技术。该方法只是用于确定体外的相互作用。

代谢组研究利器之脂质组-定量脂质组

一、研究热点--脂质组 近年来，脂质组学研究非常热门，经常出现在CNS期刊上。 脂质是重要的生物大分子物质之一,在生物体的生命活动中起着重要作用。2003年韩贤林教授等首次提出脂质组学的概念，对生物体系脂质进行全面系统的研究分析。它主要研究生物体系（生物体、组织、细胞甚至亚细胞）受刺激或扰动后，脂质种类、亚种类或单个脂质分子的变化。通过系统的研究机体内脂类物质代谢的变化，从而揭示与其他分子间相互作用的机理。 脂质组学是代谢组学的一个分支。脂类代谢（如血浆中约70%的代谢物是脂类）是动植物的代谢中第一大类物质，是动植物代谢研究中最为关注的热点，参与能量运输、细胞间的信息通讯与网络调控等生长发育过程。 脂类作为脂质组学研究的内容，依据“脂质代谢途径研究计划”（LIPIDMAPS）可分为8个大的类别：1.脂肪酰，2.甘油脂，3.甘油磷脂，4.鞘脂，5.甾醇酯，6.丙烯醇脂，7.糖脂，8.聚酮。脂类物质不仅是我们人体的重要组成成分，而且不少疾病也与脂类异常代谢有关，如阿兹海默症、糖尿病、肥胖以及肿瘤发生发展等。 我们都知道细胞膜的主要成分是磷脂双分子层，大多数脂类参与构建了细胞膜和亚细胞膜。脂类既是结构分子，也是信号分子。一个典型的例子是磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸转化成二酰基甘油和三磷酸肌醇，后者作为第二信使，激活下游的激酶并诱导细胞内钙离子的释放。 脂质组学领域中最核心的研究手段是电喷雾电离-质谱技术，能对各种脂质尤其是磷脂进行高分辨率、高灵敏度、高通量的分析。 二、定量脂质组 脂类具有数目众多、结构多样的特点，这就给定量脂质组分析带来了一定的难度。定量脂质组学是通过一种或多种稳定同位素标记内标对脂质进行大规模绝对定量的一种方法。因此定量脂质组分析具有以下要点： 1.LC-MS/MS仪器进行脂质定量，最优的检测模式是SRM/MRM； 2.不同类别的脂质在仪器中响应强度不一样，变化趋势不一样，因此内标

蛋白质组学方法在细胞内信号转导研究中的应用

生物技术通讯 ＬＥＴＴＥＲＳＩＮＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹＶｏｌ．１８Ｎｏ．２Ｍａｒ．，２００７ 综述 文章编号：１００９－０００２（２００７）０２－０３３６－０３ 蛋白质组学方法在细胞内信号转导研究中的应用 李敏，周慧，崔银秋 吉林大学生命科学学院生物大分子实验室，吉林长春１３００２１ ［摘要］蛋白质组学的新技术为我们研究细胞内的信号转导过程提供了更广泛和崭新的思路，它克服了传统技术的局限 性，实现了对蛋白的高通量分析。简要综述了蛋白质组学技术在信号转导过程中信号分子的确定、定量，磷酸化等翻译后修 饰的识别，以及蛋白质之间相互作用研究等方面的应用。 ［关键词］蛋白质组学；信号转导 ［中图分类号］Ｑ２５FＱ５０３［文献标识码］Ａ ＡｐｐｌｙｉｎｇＰｒｏｔｅｏｍｉｃＭｅｔｈｏｄｓｔｏＣｅｌｌｕｌａｒＳｉｇｎａｌＴｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎＲｅｓｅａｒｃｈ ＬＩＭｉｎ，ＺＨＯＵＨｕｉ，ＣＵＩＹｉｎ－ｑｉｕ ＢｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅＬａｂ，ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ，ＪｉｌｉｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ１３００２１，Ｃｈｉｎａ ［Ａｂｓｔｒａｃｔ］Ｉｍｐｒｏｖｅｄｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓｔｈａｔｈａｖｅｅｍｅｒｇｅｄｉｎｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓｐｒｏｖｉｄｅｕｓｍｕｃｈｍｏｒｅｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅａｎｄｎｅｗｉｎ－ ｓｉｇｈｔｓｉｎｔｏｃｅｌｌｕｌａｒｓｉｇｎａｌｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎｒｅｓｅａｒｃｈ．Ｉｔｈａｓｏｖｅｒｃｏｍｅｔｈｅｌｉｍｉｔａｔｉｏｎｓｏｆｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌｍｅｔｈｏｄｓａｎｄｒｅａｌｉｚｅｄｔｈｅ ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔｐｒｏｔｅｉｎａｎａｌｙｓｉｓｍｏｄｅ．Ｉｎｔｈｉｓｌｅｔｔｅｒ，ｔｈｅａｐｐｌｙｉｎｇｏｆｐｒｏｔｅｏｍｉｃｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓｉｎｄｅｆｉｎｉｎｇａｎｄｑｕａｎｔｉｔａｔｉｎｇ ｓｉｇｎａｌｉｎｇｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇｐｏｓｔ－ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓｓｕｃｈａｓｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ，ａｎｄｐｒｏｔｅｉｎ－ｐｒｏｔｅｉｎｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓｒｅ－ ｓｅａｒｃｈｄｕｒｉｎｇｃｅｌｌｕｌａｒｓｉｇｎａｌｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎｗｅｒｅｒｅｖｉｅｗｅｄ． ［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓFｓｉｇｎａｌｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ２０世纪９０年代以来，对细胞内信号转导途径的研究逐渐成为国内外生物学界广泛关注的热点。由于信号的传递在细胞的增殖、分化和生存等过程中都起着十分关键的作用，因而逐渐成为解决许多重要理论及实践问题的基本思路和有力武器。近年来有关细胞信号转导研究的方法层出不穷。传统地，人们主要利用ＲＮＡ干扰技术、抗体免疫沉淀、３２Ｐ标记结合蛋白质印迹法（Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ）、ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）等方法来检测和鉴定信号传递过程中差异表达的信号分子及关键蛋白的磷酸化。这些方法和技术能够做小量的分析，但无法进行大规模的研究。随着双向电泳（ｔｗｏｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，２－ＤＥ）和质谱技术的不断完善与发展，蛋白质组学方法越来越多地被用于研究胞内信号转导过程。它弥补了传统方法的不足之处，实现了高通量大规模的研究模式。近年来，蛋白质组学方法应用于信号转导的研究，主要在对蛋白表达谱的检测和定量、翻译后修饰的识别，以及蛋白质之间相互作用图谱的绘制等方面。蛋白质组学方法为我们完整地绘制细胞内信号转导网络图提供了更为可靠的依据。以下就近年来该领域的一些新技术及应用做一简要综述。 １信号蛋白的寻找和确定 细胞受到外界的刺激后，首先吸引许多锚定蛋白、衔接蛋白的结合，引起蛋白的相互作用，并随之引发胞内的一系列信号蛋白的改变（如级联磷酸化事件的发生），最终信号传递到核基因，表达或阻抑表达一些特征蛋白，或者作用于某些特定的细胞器，引发其他生物学效应。由此可见，要了解一种信号途径的具体过程，首先要对该过程的特征信号分子及下游所表达的蛋白进行确定。目前，二维电泳结合质谱技术（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ或ＥＳＩ－ＭＳ）已经成为蛋白质组学的首选工具，来获得不同状态下的细胞全蛋白质组。许多研究通过选择性抑制或激活信号通路并筛选２－ＤＥ的效应分子成功地鉴定了信号转导过程中的靶标。本文作者所在研究室［１］利用２－ＤＥ结合ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ，对处于不同生理条件下的ＮＩＨ３Ｔ３细胞的全细胞裂解液进行双向电泳分离及软件分析。在我们筛选的ａＦＧＦ拮抗剂小肽存在的条件下，鉴定出３种表达量下调、１种表达量上升的蛋白，其中鸟苷酸结合蛋白α－１１亚单位和１Ｃ型核因子分别参与胞内ａＦＧＦ信号传导以及转录调控。近来人们又开发出许多以２－ＤＥ为基础的改进方法，包括从样本制备、分离到染色等各方面，来对蛋白进行更好的分离分析，如亚细胞分离、差异凝胶电泳（ＤＩＧＥ）技术等［２］。 ２－ＤＥ的优势是能够更直观地提供信号蛋白的相对分子质量、等电点、相对表达丰度等信息，但它在分离一些ｐＩ过大或过小、疏水性强的低丰度蛋白时有很大的困难。最近研究较多的多维蛋白质鉴定技术（ｍｕｌｔｉｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌｐｒｏｔｅｉｎｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｔｅｃｈ－ｎｉｑｕｅ，ＭｕｄＰＩＴ）［３］弥补了上述缺陷。ＭｕｄＰＩＴ能够更有效地检测疏水蛋白，且在分析来自胞内细胞器的蛋白时具有更高的效率。最常用的是二维液相色谱（２Ｄ－ＬＣ），它首先对蛋白复合物进行酶 ［收稿日期］２００６－０８－３０ ［基金项目］吉林省科技发展计划项目（２００４０４１１－３） ［作者简介］李敏（１９８２－），女，硕士研究生 ［通讯作者］崔银秋，（Ｅ－ｍａｉｌ）ｃｕｉｙｑ＠ｊｌｕ．ｅｄｕ．ｃｎ ３３６

信号通路研究思路

信号通路研究思路

证明一个药物能通过抑制P38表达而发挥保护细胞的作用，需要做的是： 要证明你的药物是通过抑制P38表达而发挥保护作用，首先要证明P38表达增加会导致损伤。 其次，要证明你的药物存在保护作用。 再次，证明你的药物可以抑制P38表达。 最后，证明你的药物是由于抑制了P38表达而发挥保护作用。 首先证明P38表达增加会导致损伤。 这里需要建立一个损伤模型。正如你提到的，钙离子导致P38mapk的增高，如果某种损伤可以通过钙离子导致P38mapk的增高，那么你就建立起了一个损伤模型。这时，对P38做个RNA干扰，使其表达下降，再来损伤刺激，如果这时损伤刺激不会导致损伤，那么可以说P38mapk的增高会导致损伤。 这里最好不要用P38的抑制剂SB来处理，因为这个抑制剂是针对P38活性的抑制剂，抑制的是P38的磷酸化，而不是表达量。 如果说明的问题是p38磷酸化水平增加而导致损伤，那么我建议用抑制剂。这时还可以用Dominant-negative。抑制剂的实验证实该药物不影响P38表达，而影响其活化。（应该首先考虑选用抑制剂，因为目前一些药物的作用机制不是抑制靶点的表达，而是抑制靶点的激活。如果在此应用RNAi的话，很可能会漏掉这个机制或增加实验步骤。） 其次，要证明你的药物存在保护作用。

当然就是用你的药物先处理一下，再来损伤刺激，如果这时损伤刺激不会导致损伤，那么可以说你的药物存在保护作用。 再次，证明你的药物可以抑制P38表达。 用你的药物先处理一下，再来损伤刺激，再检测P38表达，如果用药组相对于没有用药组P38表达下降，那么可以说你的药物可以抑制P38表达。 最后，证明你的药物是由于抑制了P38表达而发挥保护作用。 这一步看似不必要，其实是最重要的步骤，而国内的文章往往忽略了这一关键环节。 这里建议还是用RNA干扰P38表达，再用你的药物处理，再进行损伤刺激，如果用药组与没有用药组的损伤程度一致，那么才可以说你的药物是由于抑制了P38表达而发挥保护作用。 抑制剂也有其局限性，有时是“致命”的，主要原因是抑制剂缺乏特异性。虽然我们在文章里看到用抑制剂的时候都说是什么什么的特异性抑制剂，但真的那么特异吗？其实往往是作者为了写文章发文章的需要而夸大了抑制剂的特异性。细胞里无数的信号通路，谁也不能保证抑制剂在作用于靶分子时不会影响其他信号通路。其实无论什么抑制剂，对剂量的要求都相对比较苛刻，为什么？就是因为一旦浓度高了，就不知道会干扰到其他哪些信号通路，从而产生很多说不清道不明的现象。 PI3K的抑制剂---LY294002和wortmannin,它们都能抑制PI3K和相关的激酶，但LY294002的浓度达到200μM常用来抑制DNA依赖的蛋白激酶（DNA-PK）；wortmannin在浓度超过3μM常用来抑制运动失调性毛细血管扩张基因

常见的信号通路

1 JAK-STAT信号通路 1) JAK与STAT蛋白 JAK-STAT信号通路是近年来发现的一条由细胞因子刺激的信号转导通路，参与细胞的增殖、分化、凋亡以及免疫调节等许多重要的生物学过程。与其它信号通路相比，这条信号通路的传递过程相对简单，它主要由三个成分组成，即酪氨酸激酶相关受体、酪氨酸激酶JAK和转录因子STAT。 (1) 酪氨酸激酶相关受体（tyrosine kinase associated receptor） 许多细胞因子和生长因子通过JAK-STAT信号通路来传导信号，这包括白介素2?7（IL-2?7）、GM-CSF（粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子）、GH（生长激素）、EGF（表皮生长因子）、PDGF （血小板衍生因子）以及IFN（干扰素）等等。这些细胞因子和生长因子在细胞膜上有相应的受体。这些受体的共同特点是受体本身不具有激酶活性，但胞内段具有酪氨酸激酶JAK的结合位点。受体与配体结合后，通过与之相结合的JAK的活化，来磷酸化各种靶蛋白的酪氨酸残基以实现信号从胞外到胞内的转递。 (2) 酪氨酸激酶JAK（Janus kinase） 很多酪氨酸激酶都是细胞膜受体，它们统称为酪氨酸激酶受体（receptor tyrosine kinase, RTK），而JAK却是一类非跨膜型的酪氨酸激酶。JAK是英文Janus kinase的缩写，Janus在罗马神话中是掌管开始和终结的两面神。之所以称为两面神激酶，是因为JAK既能磷酸化与其相结合的细胞因子受体，又能磷酸化多个含特定SH2结构域的信号分子。JAK蛋白家族共包括4个成员：JAK1、JAK2、JAK3以及Tyk2，它们在结构上有7个JAK同源结构域（JAK homology domain, JH），其中JH1结构域为激酶区、JH2结构域是“假”激酶区、JH6和JH7是受体结合区域。 (3) 转录因子STAT（signal transducer and activator of transcription）STAT被称为“信号转导子和转录激活子”。顾名思义，STAT在信号转导和转录激活上发挥了关键性的作用。目前已发现STAT家族的六个成员，即STAT1-STAT6。STAT蛋白在结构上可分为以下几个功能区段：N-端保守序列、DNA结合区、SH3

ERK信号转导通路

ERK信号转导通路 在MAPK家族中，ERK是最先被发现并被了解最多的成员。ERK包括了两种异构体ERKl 和ERK2(分别为P44和P42)。两个磷酸化受体位点即酪氨酸和苏氨酸被谷氨酸残基分隔开来，故其磷酸化位点基序是TEY。目前认为，P38和JNK属于“应激诱导”的MAPK，而ERK被认为是与细胞增殖、转化和分化相关的MAPK。 ERK级联反应包括典型的3个层次MAPKs的序贯激活过程。Raf蛋白(MAPKKK)的激活能磷酸化MEKl／2(MAPKK)，并使后者激活，从而使随后的ERKl／2(MAPK)发生双重磷酸化而被缉获。ERK的激活对于Ras诱导的细胞反应、转录因子(如Elkl、cEtsl和c—Ets2)的激活以及激酶(如P90rskl、MNKl和MNK2)的激活是至关重要的。 ERK通路的激活包括了以下3种方式：酪氨酸激酶受体对Ras的激活、Ca2+对Ras的激活以及PKC对ERK通路的激活。生长因子与细胞表面的受体酪氨酸激酶(RTK)结合，诱发生长因子受体胞质中的酪氨酸残基自身磷酸化，导致受体二聚体化与活化。细胞表面的生长因子受体具有募集Grb2和SOS复合物的能力。SOS在与生长因子受体结合的过程中移位至胞质，并与Ras相互作用，促进Ras与GTP结合，使Ras活化。此外，Ca2+可通过不同的作用机制激活Ras蛋白：①通过l型电压依赖性的钙离子通道流人细胞内，经由Src家族蛋白激酶的介导，导致表皮生长因子受体(EGFR)酪氨酸磷酸化，进而通过Shc—Grb2—SOS复合物激活Ras；②通过Ca2+敏感性的Ras鸟嘌呤核苷酸释放因子(Ras—GRF)和Ca2+—钙调蛋白复合物与Ras—GRF结合，通过诱导Ras进行GTP交换而激活Ras；③在大鼠嗜铬细胞瘤PCI2细胞中，胞质Ca2+的升高，可诱发酪氨酸磷酸化，激活蛋白酪氨酸激酶(PYK2)。PYK2与Grb2和SOS形成复合物，同时伴随着Shc的激活。活化的PYK2通过直接募集Srb2—SOS复合物，或间接通过Shc而激活Ras。Ras是一种G蛋白，可通过与Grb2—SOS复合物发生相互作用而被激活。在这一过程中，SOS催化鸟嘌吟二磷酸盐发生转位，从而形成Ras—GTP复合体，使Ras激活，成为具有功能活性的Ras蛋白。Ras被激活后将Raf募集于细胞膜，随后Raf 发生磷酸化作用和寡聚化作用。PKC的同工酶也可以磷酸化并激活Raf—1蛋白激酶，使Raf —1发生自身磷酸化。 Raf家族属于MAPKKK，是高度保守的丝氨酸—苏氨酸激酶，通过与Ras蛋白的相互作用而被缉获。Raf家族成员包括A—Raf、B—Raf和Raf—1(即c—Raf或c—Raf—1)。每一异构体包括3个保守区域，称为CRl、CR2和CR3。前面的两个保守区域位于氨基末端，并含有调节Raf催化区域的部分，其激酶区域位于CR3。Raf被激活后使MEKl／2磷酸化，最终使ERKl／2发生磷酸化而被激活。激活的ERKl／2转位至核内，通过使P90RSK、MSK以及转录因子ELK—1、Stat3磷酸化而激活转录，引起细胞生长、增殖与分化。

信号通路研究思路

证明一个药物能通过抑制P38表达而发挥保护细胞的作用，需要做的是： 要证明你的药物是通过抑制P38表达而发挥保护作用，首先要证明P38表达增加会导致损伤。 其次，要证明你的药物存在保护作用。 再次，证明你的药物可以抑制P38表达。 最后，证明你的药物是由于抑制了P38表达而发挥保护作用。 首先证明P38表达增加会导致损伤。 这里需要建立一个损伤模型。正如你提到的，钙离子导致P38mapk的增高，如果某种损伤可以通过钙离子导致P38mapk的增高，那么你就建立起了一个损伤模型。这时，对P38做个RNA干扰，使其表达下降，再来损伤刺激，如果这时损伤刺激不会导致损伤，那么可以说P38mapk的增高会导致损伤。 这里最好不要用P38的抑制剂SB来处理，因为这个抑制剂是针对P38活性的抑制剂，抑制的是P38的磷酸化，而不是表达量。 如果说明的问题是p38磷酸化水平增加而导致损伤，那么我建议用抑制剂。这时还可以用Dominant-negative。抑制剂的实验证实该药物不影响P38表达，而影响其活化。（应该首先考虑选用抑制剂，因为目前一些药物的作用机制不是抑制靶点的表达，而是抑制靶点的激活。如果在此应用RNAi的话，很可能会漏掉这个机制或增加实验步骤。） 其次，要证明你的药物存在保护作用。 当然就是用你的药物先处理一下，再来损伤刺激，如果这时损伤刺激不会导致损伤，那么可以说你的药物存在保护作用。 再次，证明你的药物可以抑制P38表达。 用你的药物先处理一下，再来损伤刺激，再检测P38表达，如果用药组相对于没有用药组P38表达下降，那么可以说你的药物可以抑制P38表达。 最后，证明你的药物是由于抑制了P38表达而发挥保护作用。 这一步看似不必要，其实是最重要的步骤，而国内的文章往往忽略了这一关键环节。 这里建议还是用RNA干扰P38表达，再用你的药物处理，再进行损伤刺激，如果用药组与没有用药组的损伤程度一致，那么才可以说你的药物是由于抑制了P38表达而发挥保护作用。 抑制剂也有其局限性，有时是“致命”的，主要原因是抑制剂缺乏特异性。虽然我们在文章里看到用抑制剂的时候都说是什么什么的特异性抑制剂，但真的那么特异吗？其实往往是作者为了写文章发文章的需要而夸大了抑制剂的特异性。细胞里无数的信号通路，谁也不能保证抑制剂在作用于靶分子时不会影响其他信号通路。其实无论什么抑制剂，对剂量的要求都相对比较苛刻，为什么？就是因为一旦浓度高了，就不知道会干扰到其他哪些信号通路，从而产生很多说不清道不明的现象。 PI3K的抑制剂---LY294002和wortmannin,它们都能抑制PI3K和相关的激酶，但LY294002的浓度达到200μM常用来抑制DNA依赖的蛋白激酶（DNA-PK）；wortmannin在浓度超过3μM常用来抑制运动失调性毛细血管扩张基因突变（ATM)以及DNA-PK。相对而言，MEK1/2

生物化学代谢复习之糖代谢、脂质代谢

一、糖代谢 (一)糖的无氧氧化 1.基本概念糖酵解：一分子葡萄糖在胞质中可裂解生成两分子丙酮酸的过程称之为糖酵解，是葡萄糖无氧氧化和有氧氧化的共同起始途径。 糖的无氧氧化：在不能利用氧或氧供应不足时，机体分解葡萄糖生成乳酸的过程称为糖的无氧氧化，也称为乳酸发酵。 2.糖酵解的基本过程①葡萄糖在己糖激酶的催化下消耗1分子ATP生成葡糖-6-磷酸。②葡糖-6-磷酸异构为果糖-6-磷酸。 ③果糖-6-磷酸在磷酸果糖激酶-1的催化下消耗1分子的ATP生成果糖-1,6-二磷酸。 ④果糖-1,6-二磷酸在醛缩酶的催化下裂解为1分子磷酸二羟丙酮和1分子3-磷酸甘油醛。⑤磷酸二羟丙酮异构为3-磷酸甘油醛。(前面的步骤相当于1分子葡萄糖裂解产生了2分子3-磷酸甘油醛) ⑥3-磷酸甘油醛在3-磷酸甘油醛脱氢酶的催化下与1分子无机磷酸结合，脱下的氢由NAD+携带，生成1,3-二磷酸甘油酸(高能化合物)。⑦1,3-二磷酸甘油酸在磷酸甘油酸激酶的催化下水解高能磷酸键(底物水平磷酸化)，产生ATP，生成3-磷酸甘油酸。⑧3-磷酸甘油酸变位为2-磷酸甘油酸。⑨2-磷酸甘油酸脱水生成磷酸烯醇式丙酮酸(高能化合物) 。⑩磷酸烯醇式丙酮酸在丙酮酸激酶的催化下生成丙酮酸，产生1分子A TP(底物水平磷酸化)。 该过程需要关注的几点：(1)三个限速反应：①③⑩，同时催化这三个反应的酶为关键酶(己糖激酶、磷酸果糖激酶-1、丙酮酸激酶) (2)该过程有两次底物水平磷酸化，包含了两个高能化合物(3)调节糖酵解流量最关键的酶是磷酸果糖激酶-1 (4)能量的产生与消耗 思考：1.1分子葡萄糖完全分解产生2分子丙酮酸可以产生多少个ATP？ 2.糖原分子中葡萄糖酵解时可以净产生多少个ATP？ 3.丙酮酸在在乳酸脱氢酶的作用下，由NADH+H+提供氢，使丙酮酸还原为乳酸 4.糖的无氧氧化的生理意义：①迅速提供能量，这对肌肉收缩很重要②成熟红细胞没有线粒体，只能依赖无氧氧化③神经细胞、白细胞、骨髓细胞等代谢极为活跃，即使不缺氧也常由糖的无氧氧化提供部分能量 (二)糖的有氧氧化 1.基本概念糖的有氧氧化是指机体利用氧将葡萄糖彻底氧化为CO2和H2O的反应过程。这个过程是体内糖分解供能的主要方式。 2.糖的有氧氧化的三个阶段 (1)同糖酵解(2)丙酮酸进入线粒体，丙酮酸在丙酮酸脱氢酶复合体(由转乙酰酶、二氢硫辛酸胺脱氢酶、丙酮酸脱氢酶组成)的催化下与辅酶A反应氧化脱羧，脱下的氢由NAD+携带，生成乙酰CoA和CO2。(参与的辅酶有TPP、硫辛酸、FAD、NAD+、CoA) (3)三羧酸循环(柠檬酸循环) ①乙酰CoA与草酰乙酸在柠檬酸合酶的催化下生成柠檬酸，反应所需的能量来自乙酰CoA。 ②柠檬酸经酶-顺乌头酸复合体异构为异柠檬酸。③异柠檬酸在异柠檬酸脱氢酶的催化下氧化脱羧，脱下的氢由NAD+携带，反应生成α-酮戊二酸及CO2。 ④α-酮戊二酸在α-酮戊二酸脱氢酶复合体的催化下与辅酶A反应氧化脱羧，脱下的氢由NAD+携带，反应生成琥珀酰CoA及CO2。 ⑤琥珀酰CoA在琥珀酰CoA合成酶的催化下水解掉高能硫酯键，与GDP磷酸化偶联，生成琥珀酸、GTP及CoA。 ⑥琥珀酸在琥珀酸脱氢酶的催化下生成延胡索酸，脱下的氢由FAD携带。 ⑦延胡索酸加水生成苹果酸。 ⑧苹果酸在苹果酸脱氢酶的催化下生成草酰乙酸，脱下的氢由NAD+携带。 该过程需要关注的几点：(1)三个限速反应：①③④，同时催化这三个反应的酶为关键酶(柠檬酸合酶、异柠檬酸脱氢酶、α-酮戊二酸脱氢酶复合体)丙酮酸脱氢酶复合体也是关键酶(2)该过程只有一步水平磷酸化，只有一个高能化合物(当然乙酰CoA也是高能化合物) (3)生成三个NADH+H+和一个FADH2 (4)两次氧化脱羧(5)能量的产生与消耗 思考：1分子葡萄糖完全分解生成CO2和H2O可以产生多少ATP？(两种情况均思考)

参与细胞信号转导通路的蛋白简写及全拼

参与细胞信号转导通路的蛋白简写及全拼 4E-BP eIF4E binding protein Abl Ableson protein tyrosine kinase ACTR A histone acetyltransferase AIF Programmed cell death protein 8 ANT Adenine nucleotide translocation channel Apaf-1 Apoptotic protease activating factor 1 APP beta-Amyloid precursor protein APPs Acute phase proteins ASIP Agouti switch protein ASK Apoptosis signal-regulating kinase (e.g., ASK1) ATF-2 Activating transcription factor 2 ATM Ataxia telangiectasia?mutated protein kinase ATR ATM and Rad3?related protein kinase Bam32 B-cell adaptor molecule 32 kDa BCAP B-cell adaptor for PI3K Bcl-10 B-cell leukemia 10 protein Bfl-1 Bcl-2-related protein A1 Bid A BH3 domain?only death agonist protein Bimp1 B-lymphocyte-induced maturation protein 1 BLNK B-cell linker protein BRCA Breast cancer growth suppressor protein Btk Brutonís tyrosine kinase C3G Guanine nucleotide?releasing factor 2 CAD Caspase-activated deoxyribonuclease Cam Calmodulin CaMK Calcium/calmodulin-dependent kinase CAP c-Cbl-associated protein Cas p130CAS, Crk-associated substrate Caspase Cysteine proteases with aspartate specificity CBL Cellular homologue of the v-Cbl oncogene CBP CREB binding protein CD19 B-lymphocyte antigen CD19 CD22 B-cell receptor CD22 CD40 B-cell surface antigen CD40 CD45 Leukocyte common antigen, a phospho-tyrosine phosphatase CD5 Lymphocyte antigen CD5 cdc2 Cell division cycle protein 2, CDK1 cdc34 Cell division cycle protein 34, a ubiquitin conjugating (E2) enzyme cdc42 Cell division cycle protein 42, a G-protein CDK Cyclin-dependent kinase Chk Checkpoint kinase CHOP C/EBP homologous protein 10

肿瘤常见信号通路

1 JAK-STAT 信号通路 1) JAK 与STAT 蛋白 JAK-STAT 信号通路是近年来发现的一条由细胞因子刺激的信号转导通路，参与细胞的增殖、分化、凋亡以及免疫调节等许多重要的生物学过程。与其它信号通路相比，这条信号通路的传递过程相对简单，它主要由三个成分组成，即酪氨酸激酶相关受体、酪氨酸激酶JAK和转录因子STAT。 (1) 酪氨酸激酶相关受体( tyrosine kinase associated receptor ) 许多细胞因子和生长因子通过JAK-STAT 信号通路来传导信号，这包括白介素2?7 (IL-2?7 )、GM-CSF (粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子)、GH (生长激素)、EGF (表皮生长因子)、PDGF (血小板衍生因子)以及IFN (干扰素)等等。这些细胞 因子和生长因子在细胞膜上有相应的受体。这些受体的共同特点是受体本身不具有激酶活性，但胞内段具有酪氨酸激酶JAK 的结合位点。受体与配体结合后，通过与之相结合的JAK 的活化，来磷酸化各种靶蛋白的酪氨酸残基以实现信号从胞外到胞内的转递。 (2) 酪氨酸激酶JAK ( Janus kinase ) 很多酪氨酸激酶都是细胞膜受体，它们统称为酪氨酸激酶受体( receptor tyrosine kinase, RTK )，而JAK 却是一类非跨膜型的酪氨酸激酶。JAK 是英文Janus kinase 的缩写，Janus 在罗马神话中是掌管开始和终结的两面神。之所以称为两面神激酶，是因为JAK既能磷酸化与其相结合的细胞因子受体，又能磷酸化多个含特定 SH2结构域的信号分子。JAK蛋白家族共包括4个成员：JAK1、JAK2、JAK3以及Tyk2，它们在结构上有7个JAK同源结构域(JAK homology domain, JH )，其中JH1结构域为激酶区、JH2结构域是“假”激酶区、JH6和JH7是受体结合区域。 (3) 转录因子STAT ( signal transducer and activator of transcription ) STAT 被称为“信号转导子和转录激活子”。顾名思义，STAT在信号转导和转录激活上发挥了关键性 的作用。目前已发现STAT家族的六个成员，即STAT1-STAT6。STAT蛋白在结构上可分为以下几个功能区段：N-端保守序列、DNA结合区、SH3结构域、SH2结构域及C-端的转录激活区。其中，序列上最保守和功能上最重要的区段是SH2结构域，它具 有与酪氨酸激酶Src的SH2结构域完全相同的核心序列“ GTFLLRFSS ”。 2) JAK-STAT 信号通路 与其它信号通路相比，JAK-STAT 信号通路的传递过程相对简单。信号传递过程如下：细胞因子与相应的受体结合后引起受体分子的二聚化，这使得与受体偶联的JAK激酶相互接近并通过交互的酪氨酸磷酸化作用而活化。JAK激活后催化受体上的酪氨酸残 基发生磷酸化修饰，继而这些磷酸化的酪氨酸位点与周围的氨基酸序列形成“停泊位