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原生质体制备和再生的影响因素

原生质体制备和再生的影响因素
原生质体制备和再生的影响因素

原生质体制备和再生的影响因素

【摘要】以酿酒酵母YS5为出发菌株,经蜗牛酶酶解获得原生质体后,用紫外线进行诱变处理,通过一级筛选得到了61株诱变菌株,将这些诱变株直接进行发酵,利用气相色谱对发酵液酒精产量进行分析。结果表明,经过紫外线照射30s后,通过筛选获得了一株酒精发酵较高产菌株,酒精产率达到了10.36%(v/v),比出发菌株提高了3.6%。

【关键词】酿酒酵母;原生质体;紫外诱变;甘蔗汁发酵

酵母细胞的融合及酵母原生质体的诱变的一个重要前提就是如何制备大量的原生质体,原生质体制备率受到各种条件的影响,如菌龄、酶浓度、温度、预处理等的影响,因此确定不同因素对酵母原生质体的影响及优化不同因素,可以大大提高产率。

1.菌体菌龄对原生质体制备的影响

微生物的生理状态是决定原生质体产量的主要因素之一,特别是菌龄,明显影响原生质体释放的频率。不同时期的菌体,对各种溶壁酶的敏感性不同,原生质体的形成率与再生率也有很大差异。

较年轻的菌体细胞制备原生质体较为容易,而且此阶段的原生质体再生率也较高。处于对数生长期的菌体代谢活性高而稳定、细胞壁对酶的作用较为敏感,且大小比较一致,生长适应能力强,故通常取处于对数生长期的菌体制备原生质体。有研究表明对数生长早期形成率最高,对数生长中期时再生率最高,对数生长晚期的再生率也比对数生长中期的低。这是由于细胞壁越稚嫩,越易被酶破坏,对数生长早期菌体幼小,代谢活性高而稳定、细胞壁对酶的作用较为敏感,且大小比较一致,故生活适应能力强;对数生长中期幼小菌体对不利因素抵抗能力差,一旦失去细胞壁,较难恢复;对数生长晚期的原生质体存在着很大比例的非活性个体。菌体如果进入稳定期,细胞壁结构趋于稳定和老化,不易去壁形成原生质体,原生质体形成率显著降低,而且再生率也有所下降。

微生物的菌龄是随着菌种和培养条件而异,酵母菌菌液中加入β-巯基乙醇可以破坏细胞壁组分中的二巯基,处于对数生长期的酵母菌菌体代谢极为旺盛,细胞壁易被瓦解,其细胞壁对蜗牛酶较为敏感,易于酶解脱壁,且酵母菌制备原生质体时,要使菌体同步化才能大幅度的提高制备率。

2.稳定剂对原生质体制备的影响

原生质体由于剥除了细胞壁,失去其特有的保护作用,细胞对外界环境变的十分敏感,尤其对渗透压。如果把它悬浮在蒸馏水或等渗溶液中,会吸水膨胀并破裂,所以必须在一定浓度的高渗溶液中进行酶解、破壁、才能形成和保持稳定的原生质体。

拟南芥原生质体制备转化方法整理

溶液配制 1、纤维素酶解液:

2、PEG4000溶液(一次配置可以保存五天,但是最好现用现配,每个样品需100μl PEG4000溶液,可根据实验样品量调整溶液配置总量)

3、W5 溶液 4、MM G溶液

5、WI溶液 拟南芥原生质体制备转化方法整理 一、土培室播种种植的拟南芥。 二、生长良好情况下在未开花前用于取材叶片制备原生质体。 三、剪取中部生长良好的叶片用刀片切成0.5 -1 mm宽的叶条。 四、将切好叶条掷入预先配置好的酶解液中(每5-10 ml酶解液大约需10-20片叶子)。并用镊子帮助使叶子完全浸入酶解液。

五、用真空泵于黑暗中抽30分钟。(此时可配制PEG4000溶液,200和1000 ul 枪头去尖使操作时吸打缓和。) 六、在室温中无须摇动继续黑暗条件下酶解至少3个小时。当酶解液变绿时轻轻摇晃培养皿促使原生质体释放出来。(此时预冷一定量W5溶液) 七、显微镜下检查溶液中的原生质体,拟南芥叶肉原生质体大小大约30-50 um。 八、在过滤除去未溶解的叶片前用等量的W5溶液稀释含有原生质体的酶液。 九、先用W5溶液润湿35-75 um的尼龙膜或60-100目筛子,然后用它过滤含有原生质体的酶解液。 十、用30毫升的圆底离心管100g,1-2分钟离心沉淀原生质体。尽量去除上清然后用10ml 冰上预冷的W5溶液轻柔重悬原生质体。 十一、在冰上静至原生质体30分钟。 以下操作在室温23℃下进行

十二、100g离心八至十分钟使原生质体沉淀在管底。在不碰触原生质体沉淀的情况下尽量去除W5溶液。然后用适量MMG溶液(1m)重悬原生质体,使之最终浓度在2X105个/ml。 十三、加入10 ul DNA(10-20微克约5-10kb的质粒DNA)至2ml离心管中。 十四、加入100 ul原生质体(2x104个),轻柔混合。 十五、加入110 ul PEG溶液,轻柔拍打离心管完全混合(每次大约可以转化6-10个样品)。 十六、诱导转化混合物5-15分钟(转化时间视实验情况而定,要表达量更高也许需要更高转化时间)。 十七、室温下用400-440 ul W5溶液稀释转化混合液,然后轻柔颠倒摇动离心管使之混合完好以终止转化反应。 十八、室温下用台式离心机100g离心2分钟然后去除上清。再加入1ml W5溶液悬浮清洗一次,100g离心两分钟去上清。

原生质体制备

1.影响原生质体数量和活力的因素 (1)细胞壁降解酶的种类和组合 不同植物种类或同一植物种的不同器官以及它们的培养细胞,由于它们的细胞壁结构组成不同,分解细胞壁所需的酶类也不同。例如,叶片及其培养细胞用纤维素酶和果胶酶,根尖细胞以果胶酶为主附加纤维素酶或粗制纤维素酶(Driselase酶),花粉母细胞和四分体期小孢子用蜗牛酶和胼胝质酶,成熟花粉用果胶酶和纤维素醇。 (2)渗造压稳定剂 用酶法降解细胞壁前,为防止原生质体的破坏,一般需先用高渗液处理细胞,使细胞处于微弱的质壁分离状态,有利于完整原生质体的释放。这种高渗液称为渗透压稳定剂。常用的滲透压稳定剂有甘露醇、山梨醇、蔗糖、葡萄糖、盐类(KCI、MgSO4.7H2O)等。在降解细胞壁时,渗透压稳定剂往往和酶制剂混合使用。滲透压稳定剂中,用得最多的是甘露醇,常用于烟草、胡萝ト、柑橘、蚕豆原生质体制备;蔗糖常用于烟草、月季等;山梨醇常用于油菜原生质体制备。滲透压稳定剂种类及浓度的选择应根据植物种类而异,例如胡萝ト用0.56mol /L甘露醇,月季用14%蔗糖,柑橘用0.8mol/L甘露醇,蚕豆用0.7mol/L甘露醇,烟草的四分体用7%熊糖,烟草的成熟花粉用13%甘露醇。 (3)质膜稳定剂 质膜稳定剂可以增加完整原生质体数量、防止质膜破坏,促进原生质体胞壁再生和细胞分裂形成细胞团。如在分离烟草原生质体时,在酶液中加人入葡聚糖硫酸钾,一旦洗净确液进行培养,原生质体很快长壁并持续细胞分裂形成细胞团。而未加葡聚糖硫酸钾的对照,原生质体经一周培养即解体。常用的原生质膜稳定剂有葡聚糖硫酸钾、MES、氯化钙、磷酸二氢钾等。 (4)pH的影响 分离原生质体时,酶液的pH是值得注意的问题。因为降解酶的活力和细胞活力最适pH是不一致的低pH时(<4.5),酶的活力强,原生质体分离速度快,但细胞活力差,破坏的细胞较多;pH偏高时,酶活力差,原生质体分离速度慢,完整的原生质体数目较多。分离原生质体时,酶液的pH因植物种类不同而有差异,如胡萝ト为5.5、月季为5.5~6.0、烟草为5.4~5.8、柑橘为5.6、蚕豆为5.6~5.7。 (5)温度影响 制备生质体时,一般在26土1℃条件下酶解。 (6)植物材料的生理状态 一般应选择植物体细胞分裂旺盛的部分进行取材。采用那些颗粒细小、疏松易碎的胚性愈伤组织和由其建立的胚性悬浮细胞系,更容易获得高质量的原生质体。要得到良好的供体材料,必要时应对材料进行预处理及预培养。 2.植物原生质体的纯化 材料经过一段时间的酶解后,需要将酶解混合物中破碎的原生质体、未去壁的细胞、细胞器及其他碎片去除出去。纯化原生质体的常用方法有过滤、离心、飘浮法,在实际操作中一般联合运用这三种方法。 1)过滤法用滤网过滤酶解混合物,滤去未被酶解的细胞、细胞团及组织块 2)离心法利用比重原理,在具有一定渗透压的溶液中,先进行过滤然后低速离心,使纯净完整的原生质体沉积于离心管底部。 3)飘浮法采用比原生质体比重大的高渗溶液(如蔗糖、Ficoll溶液),使原生质体漂浮在溶液表面。

青霉菌的原生质体制备技术研究

青霉菌的原生质体制备技术研究 薛康平任富亮邢建广王越甲 摘要:实验证明青霉菌原生质体形成最佳条件是用马铃薯液体培养基,液体震荡培养温度28℃, 培养42h,蜗牛酶的浓度为5mg/ml,酶解3.5h ,酶解温度33℃ ,稳定剂采用0.7mol/LNacl,此条件下能够制备最大量的青霉菌原生质体。 关键词:青霉菌原生质体蜗牛酶 1原生质体简介 细胞壁被酶水解剥离,剩下有原生质膜包围着的原生质部分称为原生质体Weibull 等于1953年首次用溶菌酶处理巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)细胞获得原生质体。其形状随不同菌类而异,革兰氏阴性菌经酶水解后细胞壁尚有残余部分,细胞具刚性,保持球形,称为原生质球或球质体;革兰氏阳性菌细胞壁去除彻底,失去刚性,原生质体类似于球体。不论原生质体或原生质球都基本保持原细胞结构,活性和功能,只是因为它们去掉了细胞壁,对渗透压特别敏感。 原生质体诱变是一种行之有效的育种新技术,它是以微生物原生质体为育种材料,采用物理或化学诱变剂处理,然后分离到再生培养基中再生,并从再生菌落中筛选高产突变菌株。Kim等于1983年首先采用该法诱变玫瑰色小单 孢菌(Micromonospora rosaria)取得成功以来,应用逐渐广泛,已在抗生素,酶制剂,有机酸及维生素等高产突变株的选育中起到重要的作用。 丝状真菌原生质体的提取方法有三种:机械法,非酶分离法和酶法。采用前二种方法制备的原生质体效果差,活性低,仅适用于一些特定菌株,因此并未得到推广。在实际工作中,最有效和最常用的是酶法,该法时间短,效果好。到目前为止,适合于原生质体分离的各种酶类已经得到开发和应用。 酶法分离原生质体的方法:首先选择原始亲株,经过遗传标记筛选,得到直接亲本,采用培养皿平板玻璃纸或摇瓶震荡法培养,取年轻的菌体转入到高渗溶液中,加入有关水解酶,在一定条件下(温度,pH值等)酶解细胞壁[7]。酶解后释放的原生质体和残存菌丝片断的混合液经G-2和G-3砂芯漏斗过滤,除去大部分菌丝碎片。滤液进一步低速离心10min,洗涤后弃去上清液,沉淀 悬浮于同一种高渗溶液中,即可得到纯化的原生质体。酶法分离原生质体的本

原生质体的分离和培养

第十一章原生质体的分离和培养 1 引言 植物原生质体培养和细胞融合是植物细胞工程的核心技术,它是20世纪60年代初,人们为了克服植物远缘杂交的不亲和性,利用远缘遗传基因资源改良品种而开发完善起来的一门技术。植物原生质体是遗传转化的理想受体,能够比较容易地摄取外来遗传物质,如外源DNA、染色体、病毒、细胞器等,为高等植物在细胞水平或分子水平上的遗传操作提供了理想的实验体系。 原生质体是指用特殊方法脱去植物细胞壁的、裸露的、有生活力的原生质团。就单个细胞而言,除了没有细胞壁外,它具有活细胞的一切特征。1960年英国植物生理学家Cocking首次利用纤维素酶等从番茄根细胞分离原生质体获得成功。1971年Takebe等培养烟草叶片原生质体获得再生植株,首次证实了原生质体的全能性。1972年美国科学家Carl.son等利用细胞融合技术,首次获得两种不同烟草原生质体融合的体细胞杂种。1974年高国楠等开发出了PEG(聚乙二醇)融合方法。1978年德国科学家Melchers等把马铃薯和番茄的原生质体进行融合,获得了体细胞杂种——马铃薯番茄。1981年Zimmermann开发出了高压脉冲法,即电融合技术。 植物原生质体培养和细胞融合技术已经成熟,并成为品种改良和创造育种亲本资源的重要途径。迄今已在多种作物上获得了原生质体植株和种、属间杂种植株,也为细胞生物学、植物生理学及体细胞遗传学的研究做出了重要贡献。

第一节植物原生质体分离 一、原生质体分离 (一)植物细胞膜电特性和膜电位 植物细胞膜是一个由脂类和蛋白质等构成的双层分子层膜,其物理性质类似于一个双电层,细胞的内外层带的是同种电荷。不同植物的细胞膜电位不同,同种植物细胞倍性不同以及在不同外界离子环境下,其细胞膜的膜电位也不同(表7-1、表7-2)。了解植物细胞膜的电特性对细胞融合的研究很有-必要。 原核生物遗传饰变过去几十年取得了很大进展,转导和转化现已成为对微生物进行遗传操作的标准方法。利用微生物进行遗传操作研究的优点是:①这些单细胞和单染色体系统既简单又容易控制;②它们的复制周期很短。在真核生物中将遗传物质由一个个体转移给另一个个体的传统方法是有性杂交,它所能进行的范围极为有限,尤其在动物中是这样。就是在植物中,虽然远缘杂交并非不可能,但由于有性不亲合性的障碍,有时在选定的亲本之间也难以获得完全的杂种(见第9章和第10章),这是通过杂交进行作物改良的一个严重障碍。在这点上细胞融合为远缘杂交提供了一个很有潜力的新途径(体细胞杂交)。无论是在植物中还是在动物中,细胞融合必须穿越质膜才能完成。植物与动物不同,在质膜之外还有一层坚硬的纤维素壁,相邻的细胞被一层主要由果胶质构成的基质粘连在一起。主要由于这个原因,体细胞遗传学在动物中的发展远远超过了在植物中的发展。只是自1960年以来,由于Cocking证实了通过酶解细胞壁可以获得大量

细胞原生质体的制备

细胞原生质体的制备 —植物原生质体分离和活性鉴定 一、实验目的 1.学习植物细胞原生质体分离纯化的方法。 2.了解原生质体活性鉴定的原理。 3.了解植物原生质体分离、融合和培养的基本原理及其过程 二、实验原理 去掉植物细胞壁的方法可以是机械的人工操作,也可以利用酶解法。较早利用机械法制备原生质体的 酶解法分离原生质体是一个常用的技术,其原理是植物细胞壁主要由纤维素、半纤维素和果胶质组成,因而使用纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶能降解细胞壁成分,除去细胞壁,即可得到原生质体。由于原生质体内部与外界环境之间仅隔一层薄薄的细胞膜,必须保持在渗透压平衡的溶液中才能保持其完整性。其次,还应当考虑取材、酶的种类和纯度、酶液的渗透压、酶解时间及温度等因素对分离原生质体的影响。 测定原生质体的活性有多种方法。荧光素双醋酸酯(FDA)染色是常用的一种方法,FAD 本身无荧光,无极性,可透过完整的原生质膜。一旦进入原生质体后,由于受到酯酶分解而产生具有荧光的极性物质荧光素。它不能自由出入原生质膜,因此有活力的细胞能产生荧光,无活力的原生质体不能分解FAD无荧光产生。 PEG作为一种高分子化合物,20~50%的浓度能对原生质体产生瞬间

冲击效应,原生质体很快发生收缩与粘连,随后用高Ca高pH法进行清洗.使原生质体融合得以完成。 PEG诱导融合的机理:PEG由于含有醚键而具负极性,与水、蛋白质和碳水化合物等一些正极化基团能形成氢键,当PEG分子足够长时,可阼为邻近原生质表面之间的分子桥而使之粘连。PEG也能连接Ca2+等阳离子,Ca2+可在一些负极化基团和PEG之间形成桥,因而促进粘连。在洗涤过程中,连接在原生质体膜上的PEG分子可被洗脱.这样将引起电荷的紊乱和再分布.从而引起原生质体融合:高Ca高pH由于增加了质膜的流动性,因而也大大提高了融合频率,洗涤时的渗透压冲击对融合也可能起作用。 原生质体分离纯化或融合后,在适当的培养基上应用合适的培养方法,能够再生细胞壁,并启动细胞持续分裂,直至形成细胞团,长成愈伤组织或胚状体,再分化发育成苗。其中,选择合适的培养基及培养方法是原生质体培养中最基础也是最关键的环节。 三、实验用品 1.材料:绿豆,烟草幼苗叶片,油菜或菠菜或烟草等。 2.试剂: 酶解液(绿豆):1%(W/V) 纤维素酶,1% (W/V)果胶酶,0.7mol/L 甘露醇;10mmol/L CaCl,2.2H2O,0.7mmol/L KH2PO4,pH 6.8~ 7.0。 13%CPW洗涤液(绿豆):27.2mg/L KH2PO4,101.0 mg/L KNO3,

水稻原生质体分离及转化

水稻原生质体分离及转化 作者:植物逆境与光合实验室|发表日期:2014-04-11 实验目的:用于做荧光定位、BIFC、Co-IP实验 实验材料和试剂: 生长8-10 d的水稻组培幼苗、酶解液、mmg溶液、PEG-CaCl2溶液、W5溶液、5 mL移液枪、5 mL枪头、12 mL BD管、1.5 mL EP管、100 mL锥形瓶、圆形培养皿、滤网(20 mm×20 mm)、离心机、摇床等。 溶液的配制: 母液的配制: 1、0.2 M MES(pH 5.7) 2、0.8 M Mannitol(甘露醇) 3、1 M CaCl2 4、2 M KCl 5、2 M MgCl2 6、10% BSA [Fluka PEG 4000 81240] 以下如有上述母液,则都是使用的母液 酶解液:20 mL ×2 MES 0.5

mL 1 mL Mannitol 7.5 mL 15 mL Cellucose(纤维素酶)0.15 g 0.3 g Macerozyme(离析酶)0.075 g 0.15 g ddH2O 1.8 mL 3.6 mL 55℃10 min 冷却至RT后加入200 uL CaCl2 加入200 uL 10% BSA Mmg: 20 mL ×2 MES 0.2 mL 0.4 mL Mannitol 5 mL 10 mL MgCl2 0.075 mL 0.15 mL ddH2O 4.725 mL 9.45 mL

PEG-CaCl2: 20 mL ×2 Mannitol 2.5 mL 5 mL CaCl2 1 mL 2 mL PEG4000 4 g 8 g ddH2O 3 mL 6 mL W5: 200 mL MES 2 mL NaCl 1.8 g CaCl2?2H2O 3.67525 g KCl 0.5 mL ddH2O 197.5 mL 具体实验步骤: 1、从培养基上切取培养8-10 d的水稻幼苗,去除幼苗外层包裹的叶子。 2、用干净的刀片将幼苗切成很细的粉末状碎片(越细越好,有利于酶解),大概切到水稻幼苗茎秆的中间段即可(剩余未切割的部分可以扔掉)。

原生质体细胞融合技术

食品生物技术课程论文原生质体细胞融合技术

原生质体细胞融合技术 摘要:细胞融合技术作为细胞工程的一项核心基础技术己在农业、医药、环保等领域得到了迅速发展和应用。综述了细胞融合技术中的常用方法:细胞融合仙台病毒诱导法、细胞融合PEG(聚乙二醇)诱导法、细胞融合电场诱导法、细胞融合激光诱导法;以及最新研究进展:基于微流控芯片的细胞融合技术、高通量细胞融合芯片、空间细胞融合技术、离子束细胞融合技术、非对称细胞融合技术等,并对它们的优缺进行简要的评述。 关键词:原生质体细胞融合技术影响因素融合方法发展 正文: 原生质体融合也称细胞杂交、细胞融合或体细胞杂交,是指细胞通过介导和培养,在离体条件下用人工方法将不同种的细胞通过无性方式融合成一个核或多核的杂合细胞的过程。利用现代科学技术,把来自于不同种生物的单个细胞融合成一个细胞,这个新细胞得到了来自两个细胞的遗传物质,具有新的遗传或生物特性。原生质体融合技术起源于20世纪60年代。1960年法国的Karski研究小组在两种不同类型的动物细胞混合培养中发现了自发融合现象。1974年匈牙利的Ferenczy 等采用离心力诱导的方法,报道了白地霉营养缺陷型突变株的原生质体融合,从而使原生质体融合技术成为微生物育种的一项新技术,并从微生物种内融合扩展到界间的融合。目前,通过原生质体融合进行体细胞杂交已成为细胞工程研究的重要内容之一。细胞融合核技术不仅为核质相互关系、基因调控、遗传互补、肿瘤发生、基因定位、衰老控制等理念领域的研究提供了有力的手段,而且在遗传学、动植物远缘杂交育种、发生生物学、免疫医学以及医药、食品、农业等方而都有广泛的应用价值。特别是在单克隆抗体的制备、哺乳动物的克隆以及抗癌疫苗的研发等技术中细胞融合技术已成为关键技术。 1 原生质体融合技术 微生物原生质体融合技术的整个过程包括:原生质体的制备,原生质体融合,原生质体再生。 1. 1 原生质体制备与再生过程中的影响因素 制备原生质体的最大障碍就是细胞壁,现在去除细胞壁的主要方法是使用酶法,使用的酶主要为蜗牛酶或溶菌酶,具体根据所用微生物的种类而定。影响原生质体制备的因素很多,不同的微生物有其较为适当的形成条件。在菌龄选择上,多采用对数生长中后期的细菌,这主要是由于对数生长期细菌的细胞壁中肤聚糖含量最低,细胞壁对酶的作用最敏感。对双亲灭活米曲霉进行原生质体制备的过程中,用纤维素酶、溶壁酶、蜗牛酶混合浓度比为5:3: 1的酶液混合使用能提高去壁效果。使用微生物产生的酶复合物或商品酶的混合液比单独使用

水稻原生质体制备及转化方法

原生质体制备及转化 1.去皮的日本晴种子在75%的酒精中消毒1 min。然后用 2.5%的次氯酸钠消毒20 min。用无菌水洗至少5次,然后在1/2 MS培养基上,12 h光照(大约150umol m-1 s-1)十二小时黑暗,26 ℃培养7-10天,提前一天烧好去尖的黄蓝枪头备用。 2.取40-60棵水稻幼苗的茎和叶鞘的绿色组织。 3.将一捆水稻植株(大概10棵幼苗)用剃刀一起切成大约0.5 mm的小段。 4.将小片段立刻放进0.6 M的甘露醇中,黑暗中放置10 min。 5.用100目钢制滤网去掉甘露醇,将小片段放在加入15mL酶液的25mL锥形瓶中, (1.5% Cellulase RS,0.75% Macerozyme R-10,0.6 M甘露醇,pH5.7的10mM MES,10mM CaCl2,0.1% BSA),28℃摇床中轻轻摇晃(50rpm),黑暗孵育4-6 h。 6.此时配置40%的PEG4000,酶消化后,分三次加入等体积15mL的W5溶液(154 mM NaCl,125mM CaCl2,5 mM KCl,pH 5.7的2mM MES)。用手充分摇晃10s。 7.用400目钢制滤网过滤得到原生质体在圆底管中。 8.80g离心(升降速度设为1档)5min,缓慢吸走上清液。 9.沿壁缓慢加入4mL W5溶液,轻轻悬浮,再离心80g,5min,弃上清 10.沿壁缓慢加入4mL Mmg溶液,离心80g,5min,弃上清 11.再加Mmg溶液,补至每个样品100μl原生质体 12.分装2mL离心管,每100μl原生质体,加入20μl质粒和120μl新鲜制备的 40%的PEG4000,混匀 13.28℃避光静置转化20--25min 14.加1.5 mL W5溶液混匀,80g离心3min,弃上清。 15.重复步骤14 16.加2mL W5溶液重悬,轻轻混匀,移到细胞培养板,锡箔纸包裹避光28℃避 光静置培养15-20小时 17.培养完成后,将培养板中沉淀的原生质体轻轻混匀,吸到2 mL离心管中,80g 离心3min,弃上清,保留100μl上清液 18.共聚焦显微镜观察拍照 配制溶液方法:

原生质体

原生质体(Protoplast):指采用机械或酶解法去掉细胞壁的裸露细胞。 一、原生质体的应用 由于没有细胞壁,原生质体为作物遗传改良和植物学研究提供了极为有利的试验材料。原生质体可以用于下面几种研究。 用作细胞杂交服务于作物改良用作遗传转化的对象 研究细胞壁的发生过程筛选突变体 膜的结构、运输、激素接受位点等的研究用于分离细胞器和大分子 种质资源保存 二、原生质体分离、纯化 原生质体分离的最基本原则是保证原生质体不受伤害及不损害它的再生能力。 (一)分离方法 机械法分离 缺点:产量极低;应用的材料受限制;操作极费力 酶法分离 Cocking最早开展这方面研究 克服了机械法分离的缺陷,可分为直接法和顺序法两种。 酶法可在短时间内获得大量原生质体,缺点是:不纯的酶制剂所含杂质对原生质体可能有不同程度的毒害作用。 (二)影响原生质体分离的因素(酶法) 从理论上讲,只要用适当的酶处理,就能从任何活组织中分离得到原生质体。但是对于原生质体培养来说,要得到活性高、能进行分裂、形成愈伤组织、最后再生完整植株的原生质体则受许多因素的影响。原生质体分离时主要应考虑取材、酶的种类、纯度、酶液的渗透压、酶解时间、温度等。 1. 外植体来源: 生长旺盛、生命力强的组织和细胞是获得高活力原生质体的关键,并影响着原生质体的复壁、分裂、愈伤组织形成乃至植株再生。用于原生质体分离的植物外植体有叶片、叶柄、茎尖、根、子叶、茎段、胚、愈伤组织、悬浮培养物(Suspension cultures)、原球茎、花瓣和叶表皮等。叶肉细胞是常用的材料,因为叶片很易获得而且能充分供应。取材时,一般用刚展开的幼嫩叶片。另一个分离原生质体的常用材料是愈伤组织或悬浮细胞,采用其作材料可以避免植株生长环境的不良影响,可以常年供应,易于控制新生细胞的年龄,处理时操作方便,无需消毒. 选用悬浮细胞作材料时,需每隔3-5天继代一次,培养一段时间使细胞处于旺盛生长状态。一般在继代后的第三天游离原生质体。 2. 酶液组成和浓度: 纤维素,占壁干重的25-50% 植物细胞壁由三个主要成分构成 半纤维素, 平均53% 果胶质, 5%

微生物原生质体制备及再生的影响因素

文章篇号:1007-2764(2006)03-0263-093 微生物原生质体制备及再生的影响因素 谭文辉,李燕萍,许杨 (南昌大学中德联合研究院 食品科学教育部重点实验室,江西南昌 330047) 摘要:原生质体的制备及再生,是原生质体技术的前提和基础。本文较全面地介绍了影响微生物原生质体制备及再生的因素,以期在原生质体形成和再生的最佳条件下制备原生质体,为进一步实验打下良好的基础。 关键词:原生质体;制备;再生 Factors Affect the Formation and Regeneration of Protoplasts of Microorganism Tan Wen-hui, Li Y an-ping, Xu Y ang (The Key Laboratory of Food Science of Ministry of Education (Nanchang University); Sino-Germany Joint Research Institute, Nanchang 330047, China) Abstract: Formation and regeneration of protoplasts is the precondition and foundation of protoplasts technology. The factors that affect the formation and regeneration of protoplasts from microorganism were investigated to find the optimum condition of formation and regeneration of protoplasts. It is important to make the good foundation for further research. Keywords: Protoplasts; Formation; Regeneration 原生质是有组织的生活物质,是细胞生命活动的物质基础,所有的原生质有相似的基本组成成分和特性。原生质体是由原生质特化而来,细胞内由原生质组成的各种结构,统称为原生质体,它们彼此联系、相互影响而构成一个有机整体,担负着细胞的所有生命活动[1]。 原生质体技术的关键是对细胞壁进行消化,以形成大量的原生质体,并使原生质体能高频率的再生细胞壁,回复到正常细胞状态。当细胞壁去除后,原生质体具有以下特征:一是无细胞壁障碍,可对膜和细胞器进行基础研究,同时可进行遗传操作;二是具有全能性,能在人工条件控制下,进行大量快速繁殖;三是可诱导融合,形成杂种细胞,为体细胞杂交提供实验材料[2]。因此,原生质体技术无论在理论上或实践上都日益受到重视。 1 原生质体的制备 收稿日期:2006-03-29 作者简介:在读硕士,研究方向为食品生物技术 国家自然科学基金资助(30460006)项目,江西省自然科学基金资助(0530081)项目 通讯作者:许杨,教授、博导 人们曾探索使用研磨等机械方法和超声波等物理方法来制备原生质体,效果都不理想。目前,制备原生质体大都是利用酶解法脱去细胞壁。但由于各种微生物细胞壁组成的差异,制备原生质体的条件也各不相同。 1.1 菌龄对原生质体形成的影响 菌体的不同生理状态,直接影响到细胞壁的结构、菌体的代谢水平及菌体的活力等。酵母菌原生质体制备一般取对数生长期的单倍体细胞,此时细胞代谢活跃,生长率高,群体细胞的化学组成、形态及生理特征比较一致[3]。孙传宝等报道,对数生长期以前的菌丝体细胞壁结构对降解酶不敏感,酶解过程中更多的是将细胞壁最外层葡聚糖部分降解,造成菌丝体断裂,内含物溢出。到了对数生长后期,菌丝体原生质体释放量较高,但菌丝体体内有大量液泡产生,且原生质膜内皱较多,故释放的原生质体体积较大[4]。 1.2 培养基成分对原生质体分离的影响 培养基成分不同可导致新合成细胞壁结构的差异,这种差异又导致了细胞壁对酶敏感度反应不一,从而使菌丝细胞释放的原生质体量有差异[5]。据报道,在链霉菌(Streptomyces rimosus)的培养基中加入氨基乙酸,可有效促进菌丝体细胞壁形成对裂解酶敏感 263

植物组织培养 第十章 原生质体培养

第十章原生质体培养 ?教学目的与要求: ?深入了解植物细胞结构功能与细胞全能性表达的关系,掌握原生质体的分离以 及培养过程中渗透压和激素的调控原理与技术。 第一节、原生质体研究概况 一、原生质体的概念 ?原生质体(p r o t o p l a s t):指除去细胞壁的细胞或是说一个被质膜所包围的裸露 细胞。 二、原生质体研究进展 ?据统计,目前已有49个科,146个属的320多种植物经原生质体培养得到了再 生植株(1993)。其趋势仍以农作物和经济作物为主,但从一年生向多年生、草本向木本、高等植物向低等植物扩展。 三、原生质体研究的意义 ?1、除去了细胞壁为植物细胞之间的融合扫平了障碍,同时叶为制造新杂种开辟 了道路。2、原生质体可摄入外源D N A,细胞器、细菌或病毒颗粒,这些特性与植物全能性相结合为高等植物的遗传饰变打下基础。3、获得细胞无性系和选育突变体的优良起始材料。 第二节、原生质体的制备 1、用于分离原生质体的材料准备 ?无菌试管苗叶片 ?上胚轴和子叶 ?培养细胞 2、酶处理 ?原生质体分离常用的商品酶 ?纤维素酶类 ?果胶酶类 ?半纤维素酶 酶溶剂及其渗透压 ?酶溶剂:原生质体培养基或特殊配制。 ?渗透压调节剂:葡萄糖、甘露醇、山梨醇等。 ?酶浓度及酶解时间 ?酶解时间 ?酶浓度酶解温度 3、原生质体的收集和纯化 ?飘浮法:常用的飘浮剂有蔗糖、P e r c o l l、F i c o l l。 ?P e r c o l l是一种包有乙烯吡咯烷酮的硅胶颗粒。渗透压很低(<20m o s m/k g H2O), 粘度也很小,可形成高达1.3g/m l密度,采用预先形成的密度梯度时可在低离心力(200~1000g)于数分至数十分钟内达到满意的细胞分离结果。由于P e r c o l l 扩散常数低,所形成的梯度十分稳定。此外,P e r c o l l不穿透生物膜,对细胞无毒害,因此广泛用于分离细胞、亚细胞成分、细菌及病毒,还可将受损细胞及其碎片与完好的活细胞分离。

灭蚊真菌贵阳腐霉原生质体的制备和再生研究

灭蚊真菌贵阳腐霉原生质体的制备和再 生研究 (作者:___________单位: ___________邮编: ___________) 【摘要】目的:建立贵阳腐霉原生质体的制备和再生系统,为该菌的基因工程和细胞工程改良提供适宜的真菌状态。方法:对影响原生质体形成的各因素,包括菌龄、消化酶的种类和比例、消化时间以及渗透压稳定剂的成分和浓度进行实验比较。结果:以1 %纤维素酶与1 %溶壁酶1∶1组合联合脱壁,0.6 mol/L的甘露醇作渗透压稳定剂,酶解采用KPYG2培养基培养52~54 h的贵阳腐霉菌菌丝,消化5 h所获得的原生质体数最多,原生质体浓度可达到6.48×106个/ml;在0.6 mol/L甘露醇作渗透压稳定剂的KPYG2培养基上,原生质体再生率为0.043%。结论:本实验所总结的原生质体制备方法可以获得在基因转化或细胞突变诱导所需的原生质体浓度。【关键词】真菌;贵阳腐霉;原生质体;生物灭蚊;渗透压[Abstract]Objective: To provide a suitable fungal material for protoplast-mediated genetic transformation and mutation induction of Pythium guiyangense Su. Methods: Conditions for the fungal

protoplast preparation and regeneration including mycelium incubation time, various compounding of enzymes and osmotic stabilizers were examined. Results: Under the conditions as following: mixture of 1% lywallzyme and 1%cellulose (1:1)as digestive enzyme solution; 0.6mol/L D-Mannitol as osmotic stabilizer, and 5h, of digestive time the obtained protoplast amount reached 6.48×106 each milliliter. A regeneration rate of 0.043% was obtained. Conclusion: A satisfied concentration of P. guiyangense protoplasts can be achieved with the preparation system developed in this research. [Key words]fungi; Pythium guiyangense Su; protoplasts; mosquito biocontrol; osmotic pressure 丝状真菌贵阳腐霉(Pythium guiyangense Su)具有灭蚊能力强,繁殖能力快,易于人工培养以及对其他非靶生物相对安全等优点[1],具有良好的开发前景,但同时也存在着杀虫速度慢,毒力不稳定等缺点,利用基因工程技术和细胞工程技术对该菌株进行改良势在必行,而制备贵阳腐霉的原生质体是重要的基础工作之一。由于不同真菌的细胞壁的成分和结构不一样,其原生质体制备和再生所需要的条件也不一样,需要作大量的实验来总结和筛选适合某一特定真菌的制备条件。2007年5~12月对贵阳腐霉原生质体的制备和再生进行研究,报道如下。 1 材料与方法

拟南芥原生质体的制备及转化

拟南芥原生质体制备转化操作流程 主要试剂 1. 纤维素酶解液: 试剂 15ml酶液体系 1.1-1.5﹪Cellulase R10 (YaKult Honsha)0.225g干粉 2.0.2-0.4﹪Mecerozyme R10 (YaKult Honsha)0.045g干粉 3.0.4M mannitol1.09g干粉 4.20mM KCl1 ml 0.3 M KCl母液 5.20mM MES,pH5.7,1 ml 0.3 M MES,pH5.7母液 6.加入10ml 水 7.55℃水浴加热10分钟(钝化酶,提高酶的可溶性),冷却至室温后加入以下试剂8.10mM CaCl,1 ml 0.15M CaCl2 9.5 mM β-Mercaptoethanol(可选用)1ml 75mM β-Mercaptoethanol母液(Sigma A-6793) 10.0.1﹪BSA,1 ml 1.5﹪BSA(4℃保存) 11.用0.45μm滤膜过滤后使用,酶液是淡棕色的澄清溶液。 2. PEG溶液(40%, v/v)(一次配置可以保存五天,但是最好现用现配,每个样品需100ul PEG4000溶液,可根据实验样品量调整溶液配置总量) PEG4000( Fluka, #81240)……………1g………………………………….4g 水…………………………………………………0.75ml…………………………..3g 0.8 M Mannitol…………………………..0.625ml…………………………2.5ml 1 M CaCl2或Ca(NO3)2………………..0.25ml………………………….1ml 约1.2ml 3. W5 溶液(1000ml) 154mM NaCl, NaCl9g 125mM CaCl2, CaCl2.H2O18.4g 5mM KCl, KCl0.37g 2mM MES(PH 5.7),MES0.39g pH to 5.8 with KOH,高温高压灭菌20分钟,室温保存。 4. MMG溶液 MaMg溶液(500ml) 15mM MgCl2,MgCl0.71g 4 mM MES(PH5.7)MES0.39g 0.4 M mannitol,Mannitol36.5g 用KOH调pH 5.7,高温高压灭菌20分钟,室温保存。 5. WI溶液 WI(200ml) 0.5M mannitol,mannitol18.217g 4mM MES,pH5.7,MES0.156g

真菌原生质体融合技术

大型真菌原生质体融合技术研究进展 1 发展史 由于原生质体技术的形成,去除了细胞壁的障碍,使得种内、种间甚至属间杂交成为可能。原生质体融合起源于60年代,而真菌原生质体融合的第一篇报道是以白地霉(Geotrichum candidum Link)营养缺陷型突变株为材料,采用离心方法进行原生质体融合,其融合率低于10-6。之后,人们又利用一些化学试剂,如NaNO2,Ca(NO3)2,NaCl,KCl等进行融合,效果得到改进。1976年安(Ann)等把用聚乙二醇(PEG)诱导植物原生质体融合的方法引入到真菌原生质体的融 合中来,使融合率达到10-2量级。PEG诱导原生质体融合的成功,推动了真菌原生质体融合的发展。1979年匈牙利的佩斯蒂(Pesti)首先报道了融合育种提高青霉素产量,从而开创了原生质体融合在实际工作中的应用。 日本、英国、加拿大、中国等对双孢蘑菇、香菇、木耳、平菇等食用菌原生质体的分离、再生、融合做了大量卓有成效的工作。在过去的几十年中,人们已从54种食用菌中分离到原生质体;已进行了种内10种、种间19种,属间5种、目间3种的原生质体融合研究。然而PEG等化学方法诱导原生质体融合对细胞损伤大,有残留毒性。1979年森达(Senda),1980年齐默尔曼(Zimmermann)等人报道了电场诱导细胞融合的新技术,电融合技术操作简单、无化学毒性,对细胞损伤小,融合率高。以后几年里,人们把这种新的融合手段从动、植物扩展到微生物的原生质体融合研究中,导致了原生质体融合技术的新突破。1988年张闻迪等又报道了激光诱导动物细胞融合。1998年又有报道螯合剂对原生质体融合具有促进作用。 2 原生质体融合中亲本的选择标记 原生质体融合前首先必须对亲本进行遗传标记,从而有利于挑选融合子。在融合中,可采用营养缺陷型、抗药性、灭活原生质体、荧光染色、形态差异和自然生态标记等方法。

原生质体制备

原生质体的制备: 1、选取3-4周长势良好的植株的展开叶片(通常选取第5~7片真叶)。 2、用新的锋利的刀子从叶片的中部切0.5-1 mm叶条,比较理想的情况下,每克新鲜叶片中大约含有107个原生质体(大约100-150个叶条在5-10 ml酶溶液中消化)。对于常规实验,10-20个叶条消化在5-10 ml酶溶液中将得到0.5-1×106个原生质体,足够25-100个样品使用。 3、快速而温柔的转移叶条到准备好的酶溶液中(10-20叶条在5-10 ml酶液中),用平头镊子将叶条完全淹没。 4、用真空泵将叶条在黑暗中真空30 min。 5、室温下在黑暗中至少消化3 h(继续消化,不要摇晃)。经过轻微转动后酶溶液应该变成绿色,这表明原生质体已经被释放。 6、用显微镜检查原生质体的释放(拟南芥叶肉的原生质体的大小大约为30-50μm)。 7、用等体积的W5溶液稀释酶溶液,通过过滤去除没有消化的叶片组织。 8、用水洗去75 μm尼龙过滤器中的酒精(通常浸泡在95%乙醇中)并去除过量的水,用W5溶液润洗过滤器后过滤原生质体。 9、将原生质体溶液转移到30 mL圆底离心管中,100×g离心5 min,尽可能的去除上清液。 10、用计数板进行细胞计数,每2×105个原生质体加入1 mL W5溶液,在冰,上静置30 min。 11、室温下沉降原生质体15 min,去除W5溶液,每2×105个原生质体加入1 mL MMG溶液重悬浮。 12、在2 mL离心管中分别加入10 mL DNA(5-10 kb的质粒DNA 10-20 mg)和100 mL原生质体(2×104个原生质体细胞),轻轻混匀。 13、加入110 mL PEG溶液,轻弹试管完全混匀。 14、室温下孵育转染混合物15 min(反应5 min足够)。 15、室温下,用400-440 mL W5溶液稀释转染混合物,轻轻摇动或倒置离心管混匀来停止转染过程。 16、室温下,100×g离心2 min,去除上清液。 17、在六孔板中,每孔用1 mL WI溶液重悬浮原生质体。 18、室温下(20-25℃)孵育原生质体一段时间。 19、重悬浮,通过100×g离心2 min收获原生质体。 20、去除上清液并观察GFP成像。

植物原生质体培养

原生质体的培养 1. 原生质体的分离与纯化 原生质体培养的意义 (1)再生植株由原生质体再生生成植株,不论在进行有关细胞生物学或生物合成和代谢的实验研究上,还是在组织培养实践中,都有一定的优点:①可利用均一的分化细胞群体; ②因无细胞壁,试剂对细胞作用更为直接,其反应能直接测量,以使反应产物能较快的分离出来;③在理论和实践中,可极大节省空间,如在一个三角瓶就能培养210个细胞,但在大田种植需要4亩地;④可缩短实验周期,如悬浮培养时仅需1~2个小时。 原生质体培养可在遗传学方面进行基因互补,不亲和性,连锁群和基因鉴定,分析基因的激活和失活水平的研究。在研究分化问题时,用一个均一的原生质体群体可以筛选数以千计的不同。营养和激素条件,探索诱导单细胞的分化条件等。 (2)用于远缘体细胞融合,进行体细胞杂交。这是一种新的远缘杂交方法,为人们提供新的育种方法。两个亲缘关系较远的植株用一般杂交方法是不容易成功的,而用细胞融合的方法却成为可能。首先,两个原生质体融合形成异核体,异核体再再生细胞壁,进行有丝分裂,发生核融合,产生杂种细胞,由此可培养新的杂种。 一、原生质体(protoplast)的分离 (一)材料来源 原生质体是通过质壁分离与细胞壁分开的部分,是能存活的植物细胞的最小单位。自从1960年用酶法制备大量植物原生质体首次获得成功以来,原生质体培养成为生物技术最重要的进展之一。通过大量的试验表明,没有细胞壁的原生质体仍然具有"全能性",可以经过离体培养得到再生植株。原生质体的分离研究较早,1892年Klereker首先用机械的方法分离得到了原生质体,但数量少且易受损伤。1960年,英国植物生理学家Cocking首先用酶解法从番茄幼苗的根分离原生质体获得成功。他使用一种由疣孢漆斑菌培养物制备的高浓度的纤维素酶溶液降解细胞壁。然而,直至1960年纤维素酶和离析酶成为商品酶投入市场以后,植物原生质体研究才成为一个热门的领域。至今从植物体的几乎每一部分都可分离得到原生质体。并且能从烟草、胡萝、矮牵牛、茄子、番茄等70种植物的原生质体再生成完整的植株。此外,原生质体融合,体细胞杂交的技术也得到广泛的应用。 (二)分离方法 1.机械分离法 1982年,Klercker第一次用机械方法从Stratiots aloides中获得原生质体.他们的做法是首先使细胞发生质壁分离,然后切开细胞壁释放出原生质体. 2.酶法分离 (1)酶的种类及特点 构成植物细胞壁的三个主要成分是: ①纤维素酶类:占细胞壁干重的25%至50%不等。 ②半纤维素酶类:平均约占细胞壁干重的53%左右。 ③果胶酶类:一般占细胞壁的5%。分离原生质体最常用的酶有纤维素酶、半纤维素 酶和果胶酶。

细菌原生质体融合步骤

细菌原生质体融合实验步骤 一、实验目的 了解原生质体融合技术的原理。 学习并掌握以细菌为材料的原生质体融合技术。 二、实验原理 原核微生物基因重组主要可通过转化、转导、接合等途径,但有些微生物不适于采用这些途径,从而使育种工作受到一定的限制。1978 年第三届国际工业微生物遗传学讨论会上,有人提出微生物细胞原生质体融合这一新的基因重组手段。由于它具有许多特殊优点,所以,目前已为国内外微生物育种工作所广泛研究和应用。 (一)、原生质体融合的优点 (1)、克服种属间杂交的“不育性”,可以进行远缘杂交。由于用酶解除去细胞壁,因此,即使相同接合型的真菌或不同种属间的微生物,皆可发生原生质体融合,产生重组子。 (2)、基因重组频率高,重组类型多。原生质体融合时,由于聚乙二醇(PEG)起促融合的作用,使细胞相互聚集,可以提高基因重组率。原生质体融合后,两个亲株的整套基因组(包括细胞核、细胞质)相互接触,发生多位点的交换,从而产生各种各样的基因组合,获得多种类型的重组子。 (3) 可将由其他育种方法获得的优良性状,经原生质体融合而组合到一个菌株中。 (4) 存在着两个以上亲株同时参与融合,可形成多种性状的融合子。 (二)、原生质体融合步骤 (1)、选择亲本选择两个具有育种价值并带有选择性遗传标记的菌株作为亲本。 (2)、制备原生质体经溶菌酶除去细胞壁,释放出原生质体,并置高渗液中维持其稳定。 (3)、促融合聚乙二醇加入到原生质体以促进融合。聚乙二醇为一种表面活性剂,能强制性的促进原生质体融合。在有Ca2+ 、Mg2+离子存在时,更能促进融合。 (4)、原生质体再生原生质体已失去细胞壁,虽有生物活性,但在普通培养基上不生长,必须涂布在再生培养基上,使之再生。 (5)、检出融合子利用选择培养基上的遗传标记,确定是否为融合子。 (6)、融合子筛选产生的融合子中可能有杂合双倍体和单倍重组体不同的类型,前者性能不稳定,要选出性能稳定的单倍重组体,反复筛选出生产性能良好的融合子。 (三)、原生质体再生率和融合率计算 三、实验材料 (一)、菌种: 枯草芽孢杆菌T4412 ade- his-、枯草芽孢杆菌TT2 ade-pro- (二)、培养基(配制方法见下一页附录): (1)、完全培养基(CM,液体); (2)、完全培养基(CM,固体) 液体培养基中加入2.0%琼脂; (3)、基本培养基(MM); (4)、补充基本培养基(SM) 在基本培养基中加入20 g/mL 的腺嘌呤及2%的纯化琼脂,75 Pa 灭菌20min; (5)、再生补充基本培养基(SMR) 在补充基本培养基中加入0.5 mol/L 蔗糖,1.0%纯化琼脂作上层平板,2.0%纯化琼脂作底层平板、75 Pa 灭菌20 min。 (6)、酪蛋白培养基(测蛋白酶活性用)。 (三)、缓冲液:

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