不同pH值对酶联免疫法检测生猪尿样中瘦肉精含量的影响
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不同pH值对酶联免疫法检测生猪尿样中瘦肉精含量的影响
作者：李谦李选统郑飞腾罗淑贤潘国山
来源：《现代农业科技》2012年第01期
摘要意大利试剂盒与三方圆试剂盒检测生猪尿样的瘦肉精含量及pH值，试验结果表明，在一定pH值范围内瘦肉精含量与样品pH值呈极显著负相关关系；不同试剂盒对样品的pH值要求不同，样品pH值的变化对其检测结果影响的总体趋势相同，但影响程度不同；在试剂盒所对应的推荐pH值范围以内，样品pH值的变化对检测结果的影响较小，反之，样品pH值每调节1个单位所得的检测结果间显著差异。
关键词 pH值；酶联免疫法；生猪尿样；瘦肉精；试剂盒
中图分类号 S859.84 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2012）01-0286-03
Effect of Different pH Value on Content of Clenbuterol Hydrochloride in Pig Urine Detected with Enzyme Linked Immunoassay
LI Qian LI Xuan-tong * ZHENG Fei-teng LUO Shu-xian PAN Guo-shan
（Xiaolan Town Agricultural Service Center of Zhongshan City in Guangdong Province，Zhongshan Guangdong 528415）
Abstract The Italian reagent box and three surrounding area reagent box were used to detect the clenbuterol hydrochloride content and the pH value of pig urine. Results showed that，there was a negative correlation between the clenbuterol hydrochloride content and the pH value of samples in certain pH scope. The different reagent boxes demanded different pH of sample，the test results were effected by the sample pH，and there was the same change trend，while there were different influence degree.The change of sample pH value was small among the recommendation pH scope of the reagent box，while the sample pH value had the remarkable difference to the test result with pH regulation of each unit out of the recommendation pH scope of the reagent box.
Key words pH value；enzyme linked immunoassay；pig urine；clenbuterol hydrochloride；reagent box
β-兴奋剂（俗称瘦肉精）是一类高选择性的兴奋剂和激素，具有水解脂肪、合成代谢和对非条纹肌肉组织的松弛作用[1]，近年来被一些人非法添加至饲料中以提高脂肪型动物的瘦肉
率和加速动物的生长[2]。人食用了饲喂瘦肉精作为添加剂的动物生产的禽畜产品后，残留的
酶联免疫法
酶联免疫吸附试验（又称酵素免疫分析法，Enzyme-linked immunoassay，简称ELISA）利用抗原抗体之间专一性键结之特性，对检体进行检测；由于结合于固体承载物(一般为塑胶孔盘)上之抗原或抗体仍可具有免疫活性，因此设计其键结机制后，配合酵素呈色反应，即可显示特定抗原或抗体是否存在，并可利用呈色之深浅进行定量分析。根据待测样品与键结机制的不同，ELISA可设计出各种不同类型的检测方式，主要以三明治法（sandwich）、间接法（indirect）、以及竞争法（Competitive）三种为主，以下为各种方法之介绍. 三明治法 常用于检测大分子抗原，一般之操作步骤为: 1.将具有专一性之抗体固著（coating）于塑胶孔盘上，完成后洗去多余抗体 2.加入待测检体，检体中若含有待测之抗原，则其会与塑胶孔盘上的抗体进行专 一性键结 3.洗去多余待测检体，加入另一种对抗原专一之一次抗体，与待测抗原进行键结 4.洗去多余未键结一次抗体，加入带有酵素之二次抗体，与一次抗体键结 5.洗去多余未键结二次抗体，加入酵素受质使酵素呈色，以肉眼或仪器读取呈色 结果 三明治法分别以两种抗体对检体中的抗原进行两次专一性辨认，因此专一性相当高，但此待测抗原必须是多价抗原，如此才可获得两种以上的专一性抗体，以分别进行夹心；而且此法需要足够的表位空间以进行抗原抗体的夹心，所以并不适用于半抗原或小分子抗原等分子量较小之标的。 间接法 间接法常用于检测抗体，一般之操作步骤为： 1.将已知之抗原固著于塑胶孔盘上，完成后洗去多余之抗原 2.加入待测检体，检体中若含有待测之一次抗体，则其会与塑胶孔盘上的抗原进 行专一性键结 3.洗去多余待测检体，加入带有酵素之二次抗体，与待测之一次抗体键结 4.洗去多余未键结二次抗体，加入酵素受质使酵素呈色，藉仪器（ELISA reader） 测定塑胶盘中的吸光值（OD值），以评估有色终产物的含量即可测量待测抗原 的含量。 竞争法 竞争法是一种较少用到的ELISA检测机制，一般用于检测小分子抗原，其操作步骤为： 1.将具有专一性之抗体固著于塑胶孔盘上，完成后洗去多余抗体 2.加入待测检体，使检体中的待测抗原与塑胶孔盘上的抗体进行专一性键结 3.加入带有酵素之抗原，此抗原也可与塑胶孔盘上的抗体进行专一性键结，由于 塑胶孔盘上固著的抗体数量有限，因此当检体中抗原的量越多，则带有酵素之
酶联免疫检测技术的应用
酶联免疫检测技术的应用 真菌毒素的检测：黄曲霉毒素 B 1 、M 1 以及T-2 毒素，脱氧雪腐镰刀菌烯醇(呕吐毒素DON )，二乙酰草镰刀菌烯醇(DAS )，玉米赤霉烯酮，赫曲霉毒素A ( OA )。 农药的检测：主要有除草剂与杀虫剂两大类，例如杀暝松( FN )、甲氟磷酸异已酶( SOMAN )、草不绿( Alachor)、西维因( Carbaryl )、多菌灵及克菌丹( Captan )等。 其他类的检测：盐酸克伦特罗，河豚毒素，植物毒素如罌粟硷、吗啡、藻类毒素，苯并( a)芘，抗生素，激素类以及一些营养物质和食品添加剂如麸蛋白( Gliaclin )，酱油蛋白( Soy protein )，花生蛋白(Peanut protein )，牛乳清蛋白( Borine Whey Protein )等。 随着食品工业的发展，对分析检测的要求越来越高，从而也使ELISA 方法将更趋完善。一方面为提高ELISA方法的灵敏度和特异性，制备单克隆抗体的技术的发展，将和ELISA 法互相结合，从而使食品卫生分析达到DNA分子结构水平，促使食品工业的健康发展。 1 放射免疫分析(RIA) 放射免疫法(Radioimmunoassay,RIA)优点是特异性强、灵敏度高、精确、简便易行。它包括以标记抗原(Antigen,Ag)为特点的放射免疫分析(Radioimmunoassay,RIA)和以标记抗体(Antibody,Ab)为特点的免疫放射分析(Immunoradiometric assay,IRMA)。前者以液相竞争结合法居多，既测大分子抗原又测小分子抗原；后者以固相法测大分子抗原为主。 最早建立的农药免疫法中，RIA占了很大比重，建立了狄氏剂、艾氏剂、2,4-D 和2,4，5-T、对硫磷和百草枯等农药的放射免疫法。但由于进行RIA需使用昂贵的计数器，存在放射性防护和废物处理等问题，其应用受到较大限制。1982年后发表的农药免疫分析文章，主要是酶免疫分析法。 2 酶免疫法(EIA) 酶免疫法(Enzyme Immunoassay,EIA)是将抗原、抗体的特异性免疫反应和酶的高效催化作用有机结合起来的一种免疫分析方法。酶免疫法的检测原理与放射免疫法类似，通过测定结合于固相的酶的活力来测定被测定物的量。用作标记物的酶有辣根过氧化物酶(HorseradishPeroxidase,HRP)和碱性磷酸酶(AlkalinePhosphatase)。酶标试剂制备容易、稳定、价廉。酶免疫分析的灵敏度接近放射免疫技术，而可借助于简单的仪器作定量测定，是目前农药监测中应用最广泛的免疫分析技术。 EIA法包括酶联免疫吸附分析法(Enzyme-Linked Immunosorbent
酶联免疫吸附试验方法类型及反应原理
酶联免疫吸附试验方法类型及反应原理 ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有3种必要的试剂：①固相的抗原或抗体；②酶标记的抗原或抗体；③酶作用的底物。根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具备条件，可设计出各种不同类型的检测方法。 （一）双抗体夹心法 双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，操作步骤如下： （1）将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体：洗涤除去未结合的抗体及杂质。 （2）加受检标本：使之与固相抗体接触反应一段时问，让标本中的抗原与固相载体上的抗体结合，形成固相抗原复合物。洗涤除去其他未结合的物质。 （3）加酶标抗体：使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检物质的量成正相关。 （4）加底物：夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物。根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量。 根据同样原理，将大分子抗原分别制备固医学教丨育网整理相抗原和酶标抗原结合物，即可用双抗原夹心法测定标本中的抗体。 （二）双位点一步法 在双抗体夹心法测定抗原时，如应用针对抗原分子上两个不同抗原决定簇的单克隆抗体分别作为固相抗体和酶标抗体，则在测定时可使标本的加入和酶标抗体的加入两步并作一步。这种双位点一步法不但简化了操作，缩短了反应时间，如应用高亲和力的单克隆抗体，测定的敏感性和特异性也显著提高。单克隆抗体的应用使测定抗原的ELISA提高到新水平。 在一步法测定中，应注意钩状效应（hookeffect），类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象。当标本中待测抗原浓度相当高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而不再医学教丨育网整理形成夹心复合物，所得结果将低于实际含量。钩状效应严重时甚至可出现假阴性结果。 （三）间接法测抗体 间接法是检测抗体最常用的方法，其原理为利用酶标记的抗抗体以检测已与固相结合的受检抗体，故称为间接法。操作步骤如下： （1）将特异性抗原与固相载体连接，形成固相抗原：洗涤除去未结合的抗原及杂质。
酶联免疫法检测试剂注册技术审查指导原则
附件1 酶联免疫法检测试剂注册技术审查指导原则 一、前言 本指导原则主要针对酶联免疫类检测试剂的主要原材料、生产工艺及反应体系、产品质量控制等环节提出指导性技术要求。 本指导原则系对酶联免疫法检测试剂的一般要求，申请人应依据产品特性确定其中的具体内容是否适用，若不适用，需详细阐述其理由及相应的科学依据。 本指导原则是对申请人和审查人员的指导性文件，但不包括注册审批所涉及的行政事项，亦不作为法规强制执行，如果有能够满足相关法规要求的其他方法，也可以采用，但是需要提供详细的研究资料和验证资料。应在遵循相关法规的前提下使用本指导原则。 本指导原则是在现行法规和标准体系以及当前认知水平下制订的，随着法规和标准的不断完善、科学技术的不断发展，其相关内容也将进行适时的调整。 二、适用范围 本指导原则适用于有关病原微生物检测的第三类体外诊断试剂的注册技术审查。其他酶联免疫法检测试剂（如作为二类管理的体外诊断试剂）可参考本指导原则执行。 三、基本要求 （一）基本原则 1.研制、生产用的各种原料、辅料等应制定其相应的质量标准，并应符合有关法规的要求。
2.试剂生产企业应具备相应的专业技术人员、仪器设备以及适宜的生产环境，获得《医疗器械生产许可证》；同时，应按照《体外诊断试剂生产实施细则（试行）》的要求建立相应的质量管理体系，形成文件和记录，加以实施并保持有效运行；还应通过《体外诊断试剂生产企业质量管理体系考核评定标准（试行）》的考核。企业应对试剂的使用范围做出明确规定，并经国家药品监督管理部门批准。 3.诊断试剂的研制应当按照科学、规范的原则，各反应条件的选择和确定应符合基本的科学原理。 4.试剂在研制、生产过程中所用的各种材料及工艺，应充分考虑可能涉及的安全性方面的事宜。 5.生产和质量控制的总体目标：保证试剂使用安全、质量稳定、工艺可控、检测有效。 （二）原材料质量控制 1.主要生物原料 与产品质量最密切相关的生物原料主要包括各种天然抗原、重组抗原、单克隆抗体、多克隆抗体以及多肽类、激素类等生物原科。这类原料可用于包被酶标反应板、标记相关酶（如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等）、中和反应用抗原或抗体、制备校准品（标准品）等。使用前应按照工艺要求对这类生物原料进行质量检验，以保证其达到规定的质量标准。主要生物原料若为企业自己生产，其工艺必须相对稳定；若购买，其供应商要求相对固定，不能随意变更供应商，如果主要原料（包括工艺）或其供应商有变更，应依据国家相关法规的要求进行变更申请。 主要生物原料的常规检验项目一般包括： （1）外观 肉眼观察，大部分生物原料为澄清均一的液体，不含异物、浑浊或摇不散的沉淀或颗粒；或者为白色粉末，不含其他颜色的杂质；特殊生
酶联免疫分析法
酶联免疫分析法 生工121 徐娜 酶联免疫分析法是目前分析化学领域中的前沿课题，它是一种特殊的试剂分析方法，是在免疫酶技术的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术，特别是在食品和饲料中有毒有害物质的检测应用极为广泛。 酶联免疫分析法是把抗原抗体的免疫反应和酶的高效催化作用原理有机地结合起来的一种检测技术。该技术的原理主要有三点：第一、抗原或抗体能结合到固相载体的表面仍具有其免役活性；第二、抗体或抗原与酶结合所形成的结合物仍保持免疫活性和酶的活性；第三，结合物与相应的抗原或抗体反应后，结合的酶仍能催化底物生成有色物质，而颜色的深浅可定量抗体或抗原的含量。 酶联免疫法在医药、食品加工业、农牧渔业等领域有着广泛的应用：如乙型肝炎、莱姆病，急性心肌梗死的早期诊断，定量检测内毒素，HIV抗体初筛，SARS 病毒的快速检测；检测食品中的病毒，残留农药，微生物及其其它成分；检测香蕉有关病毒，小麦黄花叶病毒，检测水产品中氯霉素的残留量，禽脑脊髓抗体等。 一、医学临床中的应用 医学中，检测各种抗原和抗体，为临床疾病的辅助诊断和早期诊断提供了特异性、敏感性强的试验基础。 1、乙型肝炎、原发性肝癌的血清学检测：用血清学方法检测肝炎病毒的抗原或抗体，一直受到各级医疗卫生机构检验科室的高度重视。尤其是对乙型肝炎，甲型肝炎，丙型肝炎的血清学检测，更因为试剂盒的推出而得到广泛开展。上述各种肝炎病毒抗原或抗体的检测方法，绝大部分都是酶联免疫分析法。 2、简化莱姆病的诊断：由于在作出博氏疏螺旋体感染诊断前要进行双重测试，因此莱姆病的测试可能花费很长时间。采用由关键的疏螺旋体抗原决定簇构成的重组蛋白开发出一种新的酶联免疫测定方法。该测试比最常用的商业全细胞酶联免疫测定法特异，而敏感性相同，并且在20分钟就会产生结果。 3、急性心肌梗死的早期诊断：急性心肌梗死为一多发病，病情严重。目前对此病的策略是尽早的确诊并迅速积极的治疗。约有四分之一或更多的患者，在初诊时心电图并不显示典型心肌梗死心电图异常，无Q波。心肌坏死时释放出的Mb可直接快速血液循环。Mb是最早出现的心肌梗死生化标志物，但它在血中滞留时间短。为此，刘宏伟等研制出只需30分钟的酶联免疫快速法，为早期诊断心肌梗死提供了依据。 4、定量检测内毒素：临床上，细菌感染的患者常发生内毒素血症，死亡率高达20%——30%，检测标本中的LPS对早期诊断和防治有重要意义。用优化后的双抗体夹心法检测LPS敏感性为50ng/L,特异性与准确性均高于仪器比浊法和试验定性法。此为内毒素血症提供了一种简便，快速，准确，特异性的诊断参考。 5、快速检测SARS病毒：SARS病毒引起传染性非典型肺炎，发病快，传染性强。2003年4月，北京基因组研究所与军事医学科学院研制出诊断非典的酶联免疫分析法检测试剂，为控制疫情蔓延提供了新的诊断手段。 二、在食品分析中的应用 1、检测食品中的毒素：采用辣根过氧化氢酶标记高亲和力的黄曲霉素B1抗体，建立了直接竞争抑制酶联免疫快速筛选法。该法检测B1抗体的线性范围
胶体金法与酶联免疫法相结合快速检测克伦特罗
胶体金法与酶联免疫法相结合 快速检测克伦特罗 苏存举,陈福生3,高志贤3①,苗颂②,刘楠①,冯屹 (华中农业大学食品科技学院,武汉430070) 摘要:目的研究胶体金免疫层析法(GIC A)与酶联免疫吸附法(E LIS A)相结合,以建立对饲养、屠宰、流通各环节的畜尿克伦特罗(Clenbutero1,C L)定性和定量检测的方法。方法用柠檬酸三钠还原氯金酸,制备20nm粒径的胶体金,胶体金标记单抗后喷涂到玻璃纤维膜上,特异性抗原(C L2BS A)以线状包被在硝酸纤维素膜上,制成快速检测试纸条。用E LIS A进行定量。结果对 G C2MS不确定的36份阴性样品和24份阳性样品用GIC A方法检测,其阴性符合率为97%,阳性 符合率为96%。同样样品用E LIS A方法检测,其符合率为100%。最低检测限为5.0ng/m L;用GIC A法只需在试纸条上滴加4～5滴样液5～10min就可出结果;在2个月的随机抽查中,试纸条的检测结果没有变化。结论本方法准确性高、稳定性好,操作过程简单,适合于作现场大规模、高通量检测。因此本方法具有广泛的应用及推广价值。 关键词: 胶体金; 克伦特罗; 酶联免疫吸附法 中图分类号:R155.5 文献标识码:A 文章编号:1001-5248(2008)03-0176-04 克伦特罗(Clenbutero1,C L)俗称“瘦肉精”,是β2肾2上腺受体激动剂。在家畜养殖中加入C L可以提高瘦肉率或者加速动物的生长。C L作为药物使用时可以治疗哮喘等疾病,但是如果用作家畜生长调节剂,其剂量通常是治疗疾病剂量的5～10倍,这样就可能残留于食品中而引起人体的不良反应,主要包括心跳过快和四肢肌肉颤动等中枢神经中毒后的失控症状,甚至导致死亡〔1〕。目前已有多种方法用于对C L的残留分析,主要包括酶联免疫检测法(E LIS A)、高效液相色谱法(HP LC)、气相色谱2质谱联用法(G C2MS)、液相色谱2质谱联用法(LC2MS)等,主要是依靠特殊仪器进行分析,不能适应市场监督需要快速、简便、价廉的要求。而E LIS A分析法操作简便、检测快捷、灵敏度高、特异性强,适用基层日常应用〔2〕。胶体金免疫层析法(GIC A)解决了以往在现场不能进行快速和定性检测的难题。因此, 基金项目:国家科技支撑计划(2006BAK02A09) 天津市科技攻关基金项目课题(N o.06VFG ZSH02200) 作者简介:苏存举(1981-),男,硕士研究生。从事食品安全快速检测研究。 3通讯作者 ①军事医学科学院卫生学环境医学研究所 ②山东大学将E LIS A和GIC A相结合应用于C L筛选检测已成为各地开展C L检测工作的主要技术手段。 1 材料与方法 1.1 材料 氯金酸为上海化学试剂厂产品;克伦特罗标准品为Sigma公司产品;克伦特罗单克隆抗体为浙江台州金芯生物工程公司产品;硝酸纤维膜(NC)、玻璃纤维膜、吸水纸、PVC背板均为美国Mill2 pore公司产品;克伦特罗检测试剂盒为江苏微生物研究所产品;其他试剂为国产分析纯。 1.2 仪器 紫外可见光分光光度计,Du2530型, Beckman公司;透射电镜,H27500型,日本HIT ACHI 公司;原子力显微镜,SPM29500型,日本岛津公司;磁力恒温搅拌器,79.3型,上海市曹行无线电元件厂;点膜机,Bio2Dot公司;普通离心机,TG L21613型,上海安亭科学仪器公司;纯水制备装置,AS D型,军事医学科学院卫生装备研究所。 1.3 方法 1.3.1 胶体金的制备 按照文献〔324〕采用柠檬酸三钠还原法制备20nm胶体金颗粒〔5〕。取0.01%氯金酸水溶液100m L,用恒温电磁搅拌器加热至沸腾,一次性加入l%柠檬酸三钠水溶液 2.52m L,再加热
ELISA检测方法有哪些
ELISA检测方法有哪些？ 酶联免疫吸附测定（Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay，ELISA）是研究蛋白抗体的重要方法。它是采用抗原与抗体的特异结合将被测物质与酶标抗体进行直接或间接结合，然后通过标记酶与底物产生颜色反应进行定性和定量分析。那么，它与其它检测方法的灵敏度及您了解吗？跟着小编往下看 ELISA通常分为四种类型：直接法、间接法、竞争法、夹心法等，直接上图： 直接法（Direct ELISA）仅需要抗原和酶标一抗，操作简便，可避免交叉反应，然而该方法要求酶标一抗有较高的特异性要求，同时也并非所有的一抗适合标记处理。直接法在实际运用中并不多见，它并不能对样本中抗体进行定量分析，因为样本中抗体是非酶标抗体，无法进行后续显色，但是该法经过改进就是竞争性ELISA方法，见后文。 间接法（Indirect ELISA）使用了二抗增加信号强度，也使抗体的选择多样化，然而间接法容易产生交叉反应。间接法只能用于测定抗体，主要用于疾病的诊断，其优点是只需要改变包被抗原，酶标抗体是通用的。 夹心法（Sandwich ELISA）分为双抗体夹心法和双抗原夹心法： 双抗体夹心法中抗原被两个抗体——捕捉抗体和检测抗体，结合于不同位点。捕捉抗体固定于载体上，检测抗体通过结合抗原进行显色分析。应用于双抗体夹心法检测的抗体需是单抗，而且对同一抗原结合位点不同，如此才能避免交叉反应或两种抗体竞争性结合同一位点。夹心法具有高灵敏度、高专一性的优势，但该法只适用于有多个结合位点的抗原检测，主要用于检测各种大分子抗原——例如在医学检测中测定HBsAg、HBeAg、AFP等。由于双抗体夹心法特异性高，在检测过程中有时会将样本和酶标抗体同时加入进行反应（一步法），此时如果样本中抗原含量过高会导致其与固相抗体和酶标抗体均有结合而不形成“夹心复合物”，
植物NADPH酶联免疫分析(ELISA)
植物NADPH酶联免疫分析（ELISA） 试剂盒使用说明书 本试剂仅供研究使用目的：本试剂盒用于测定植物组织，细胞及其它相关样本中植物NADPH含量。 实验原理： 本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中植物NADPH水平。用纯化的植物NADPH抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入植物NADPH，再与HRP标记的NADPH抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的植物NADPH呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中植物NADPH浓度。 标本要求： 1．标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融 2．不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。 操作步骤： 1.标准品的稀释与加样：在酶标包被板上设标准品孔10孔，在第一、第二孔中分别加标 准品100μl，然后在第一、第二孔中加标准品稀释液50μl，混匀；然后从第一孔、第二孔中各取100μl分别加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分别加标准品稀释液50μl，
混匀；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl弃掉，再各取50μl分别加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液50ul，混匀；混匀后从第五、第六孔中各取50μl分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第七、第八孔中分别取50μl加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第九第十孔中各取50μl弃掉。（稀释后各孔加样量都为50μl，浓度分别为120U/L，80U/L ，40U/L，20U/L，10U/L）。 2.加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、待测样 品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。 3.温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。 4.配液：将30（48T的20倍）倍浓缩洗涤液用蒸馏水30（48T的20倍）倍稀释后备用。 5.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此 重复5次，拍干。 6.加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。 7.温育：操作同3。 8.洗涤：操作同5。 9.显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色 15分钟. 10.终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。 11.测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。测定应在加终止 液后15分钟以内进行。 注意事项： 1．试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。 2．浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。 3．各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差。一次加样时间最好控制在5分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。 4．请每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔。如标本中待测物质含量过高（样本OD值大于标准品孔第一孔的OD值），请先用样品稀释液稀释一定倍数（n倍）后再测定，计算时请最后乘以总稀释倍数（×n×5）。 5．封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。 6．底物请避光保存。 7．严格按照说明书的操作进行，试验结果判定必须以酶标仪读数为准. 8．所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。 9．本试剂不同批号组分不得混用。 10. 如与英文说明书有异，以英文说明书为准。
酶联免疫吸附测定法
酶联免疫吸附测定法（ELISA） 1.定义 (3) 2.原理 (3) 2.1抗原抗体反应 (3) 2.2免疫测定在临床检验中的应用 (5) 3.ELISA的类型 (5) 3.1双抗体夹心法测抗原： (6) 3.2双抗原夹心法测抗体 (6) 3.3间接法测抗体 (6) 3.4竞争法测抗体 (7) 3.5竞争性测抗原 (7) 3.6捕获包被法测抗体 (7) 3.7ABS-ELISA法 (8) 4.ELISA试剂的组成 (9) 4.1固相载体： (9) 4.2包被的方式 (9) 4.3包被用抗原：天然抗原、重组抗原、合成多肽抗原。 (10) 4.4包被的条件： (10) 4.5洗涤液： (10) 4.7酶的催化性； (11) 4.8结合物的制备 (11) 4.9结合物的保存 (12) 4.10酶的底物 (12) 4.11酶反应终止液 (12) 4.12参考标准品 (13) 4.13加样： (13) 4.14保温 (13)
4.15保温方式： (13) 4.16室温温育的反应 (13) 4.17洗涤 (14) 4.18显色 (14) 4.19比色 (14) 4.20酶标比色仪 (15) 4.21结果判定 (15) 4.22定量测定 (16) 4.23ELISA的操作要点 (16)
1.定义 酶联免疫吸附测定法（Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay），简称ELISA，采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接，然后通过酶与底物产生颜色反应，对受检物质进行定性或定量分析的一种检测方法。 2.原理 采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接，然后通过酶与底物产生颜色反应，可对受检物质的定性或定量分析。 2.1抗原抗体反应 2.1.1可逆性 抗原与抗体结合形成抗原抗体复合物的过程是一种动态平衡，其反应式为： Ag+Ab→Ag·Ab 抗体的亲和力（affinity），可以用平衡常数K表示：K=[Ag·Ab]／[Ag][Ab]，Ag·Ab的解离程度与K值有关。高亲和力抗体的抗原结合点与抗原的决定簇在空间构型上非常适合，两者结合牢固，不易解离。解离后的抗原和抗体均能保持原有的结构和活性。 2.1.2特异性 抗原抗体的结合发生在抗原的决定簇与抗体的结合位点之间。化学结构和空间构型互补关系，具有高度的特异性。因此，在很多时候，测定某一特定的物质不需分离待测物。2.1.3最适比例 只有当抗原抗体的浓度比例是当时，才出现可见反应。 以沉淀反应为例（Ab量固定，Ag量递增）
ELISA检测方法
ELISA（酶联免疫吸附测定，enzyme linked immunosorbent assay）指将可溶性的抗原或抗体结合到聚苯乙烯等固相载体上，利用抗原抗体结合专一性进行免疫反应的定性和定量检测方法。 基本原理： ①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。 ②使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。 ③在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。 ④加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅有无定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，故可极大地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。 双抗夹心法 夹心法常用于检测大分子抗原，一般的操作步骤为: ①将具有专一性的抗体固著于塑胶孔盘上，完成后洗去多余抗体； ②加入待测检体，检体中若含有待测的抗原，则其会与塑胶孔盘上的抗体进行专一性键结； ③洗去多余待测检体，加入另一种对抗原专一的一次抗体，与待测抗原进行键结； ④洗去多余未键结一次抗体，加入带有酶的二次抗体，与一次抗体键结； ⑤洗去多余未键结二次抗体，加入酶底物使酵素呈色，以肉眼或仪器读取呈色结果。 间接法 间接法常用于检测抗体，一般的操作步骤为： ①将已知的抗原固著于塑胶孔盘上，完成后洗去多余的抗原。
②加入待测检体，检体中若含有待测的一次抗体，则其会与塑胶孔盘上的抗原进行专一性键结。 ③洗去多余待测检体，加入带有酶的二次抗体，与待测的一次抗体键结。 ④洗去多余未键结二次抗体，加入酶底物使酶呈色，藉仪器（ELISA reader）测定塑胶盘中的吸光值（OD值），以评估有色终产物的含量即可测量待测抗体的含量。 竞争法 竞争法是一种较少用到的ELISA检测机制，一般用于检测小分子抗原，其操作步骤为： ①将具有专一性的抗体固著于塑胶孔盘上，完成后洗去多余抗体； ②加入待测检体，使检体中的待测抗原与塑胶孔盘上的抗体进行专一性键结； ③加入带有酶的抗原，此抗原也可与塑胶孔盘上的抗体进行专一性键结，由于塑胶孔盘上固著的抗体数量有限，因此当检体中抗原的量越多，则带有酶的抗原可键结的固著抗体就越少，亦即，两种抗原皆竞相与塑胶孔盘上抗体键结，即所谓竞争法之由来。 ④洗去检体与带有酶的抗原，加入酶底物使酶呈色，当检体中抗原量越多，代表塑胶孔盘内留下之带有酶的抗原越少，显色也就越浅。 注：当需要侦测无法获得两种以上单一性抗体的抗原，或是不易得到足够的纯化抗体以固著于孔盘上时，一般会考虑使用竞争法ELISA。
农药残留检测酶联免疫抗体及快速检测试剂盒项目商业计划书131210
农药残留检测酶联免疫抗体及快速检测试剂盒项目 商业计划书 2013年12月8日
目录 1.项目概述 (1) 1.1项目背景 (1) 1.2项目简介 (2) 1.2.1农药残留检测技术及发展 (2) 1.2.2项目概述 (3) 2.农药残留检测行业和市场分析 (4) 2.1农药残留检测行业 (4) 2.2市场需求分析 (5) 2.3竞争和优势分析 (6) 2.4本项目的目标市场 (7) 2.5项目风险 (8) 3.产品与服务 (10) 3.1 酶联免疫检测方法 (10) 3.2酶联免疫技术优势 (11) 3.3 本项目的技术创新点及所处水平 (11) 3.4.本项目目前现有的主要技术产品 (12) 4.项目商业模式 (13) 4.1经营主体 (13) 4.2盈利模式 (13) 4.3销售体系 (14) 4.4营销策略 (14) 5.项目投资和融资情况说明 (15) 51资金需求情况 (15) 5.2资金使用计划及进度 (15) 5.3融资方案 (16) 5.3.1融资形式 (16) 5.3.2退出机制 (16) 6.财务预测与分析 (17) 6.1项目投资估算 (17) 6.1.1固定资产投资估算 (17) 6.1.2运行成本估算 (18) 6.2项目效益分析 (19) 6.2.1财务现金流分析 (19) 6.3.2敏感性分析 (19) 7.项目环境与社会效益评价 (21)
1.项目概述 1.1项目背景 随着我国经济的快速发展和生活水平的提高，人们再对食品安全有了更高的要求同时，由于我国在市场经济建设过程中由于制度建设和监管水平等多种原因导致我国食品安全问题日益严重。引起食品安全问题的原因很多，农副产品中农药残留问题是影响食品安全的重要因素之一。 农药残留是指农药使用后残存于环境、生物体和食品中的农药母体、衍生物、代谢物、降解物和杂质的总称。造成蔬菜农药残留量超标的主要是一些国家禁止在蔬菜生产中使用的有机磷农药和氨基甲酸酯类农药，如甲胺磷、氧化乐果、甲拌磷、对硫磷、甲基对硫磷等。食用含有大量高毒、剧毒农药残留引起的食物会导致人、畜急性中毒事故。长期食用农药残留超标的农副产品，虽然不会导致急性中毒，但可能引起人和动物的慢性中毒，导致疾病的发生，甚至影响到下一代。农产品中的农药残留量超标不仅影响人民身体健康，而且影响我国农产品在国际市场的竞争力。在世界贸易一体化的今天，农药最高残留限量也成为各贸易国之间重要的技术壁垒，对此已经引起我国政府高度重视和社会公众的广泛关注。为了加强农产品中农药残留的控制和监测工作，全面提高我国农产品质量，适应我国农业和农村经济发展新阶段的需求，农业部制定了农副产品中的农药最高残留量国家标准来规范农药的使用。世界各国对农产品安全生产和质量控制越来越严格，除严格限制使用高毒、高残留农药外，对农药残留实施快速检测是行之有效的办法。
人C反应蛋白CRP酶联免疫分析试剂盒使用方法
人C-反应蛋白(CRP)酶联免疫分析试剂盒使用方法 检测范围：96T 30μg/L -800μg/L 使用目的： 本试剂盒用于测定人血清、血浆及相关液体样本中C-反应蛋白(CRP)含量。 实验原理 本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人C-反应蛋白(CRP)水平。用纯化的人C-反应蛋白(CRP)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入C-反应蛋白(CRP)，再与HRP标记的C-反应蛋白(CRP)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的C-反应蛋白(CRP)呈正相关。用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中C-反应蛋白(CRP)浓度。 试剂盒组成 标本要求 1．标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融 2．不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。 操作步骤 1.标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照下列图表在小试管中进行稀 待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样50μl，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。 3.温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。 4.配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用 5.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此 重复5次，拍干。 6.加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。 7.温育：操作同3。 8.洗涤：操作同5。 9.显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色
酶联免疫(ELISA)使用试剂盒检测过程中值得关注的问题
酶联免疫（ELISA）使用试剂盒检测过程中值得关注的问题 1、仪器质控 为使仪器保持最佳工作状态，应建立维护和校正仪器的标准操作程序（SOP），所要控制的仪器包括移液器（加样枪）、温箱、洗板机和酶标仪。 ◎移液器：ELISA加样量小（20-200μl），其准确性直接影响实验结果，利用称重法检查：低、中、高三个刻度分别吸取指示量的水，万分之一天平称重后计算吸量是否准确，一般应在±5%以内； ◎恒温箱：经常检查恒温箱温度计所示的温度和水中（或温箱内）实测温度是否一致，允许有±1℃的误差；◎洗板机：每个厂家设置洗板后的残留液有各自的规定，一般不超过2μl；人工扣板时，垫纸不湿；定期检查管孔是否堵塞； ◎酶标仪：经常维护其光学部分，防止滤光片霉变，定期检测校正，使其保持良好的工作性能。 2、试剂盒选择 ◎应尽量选择正规厂家，产品经相应政府部门审核认可，试剂应从灵敏度、特异性、精密度、稳定性、简便性、安全性及经济性全面评价。 ◎灵敏度：有二层含义，1）为试剂检出被检物质的最低量的能力；2）为试剂对大量样品中阳性检出的能力。 ◎特异性：常用交叉反应率表示。含有与待测物相近结构部份的物质可能存在交叉反应，使测定结果升高，可能导致假阳性，所以交叉反应是评价其质量的关键指标。 ◎精密度：ELISA试剂一般指其批内CV%，其值应小于15%；定量试剂应同时考察线性范围。 ◎准确度：通过添加回收实验进行评价。 ◎简便性：指在不影响试剂的前三项指标的前题下，实验和测定步骤越少越好，在定性实验中结果判断简
单明了，定量试验结果计算也应简单。 ◎安全性：指试剂对操作者和环境安全无害无传染性。 ◎经济性：试剂在同等质量条件下通过大规模生产或技术进步降低成本，而市场价格比较合理。 ◎试剂评价：需要有权威的确证方法和确证的样品进行检测。 3、样本前处理注意事项 3.1 均质 组织样本:肉、肝食品类切细，用绞肉机反复绞碎，混合均匀。 水产样本：去除样品的非食用部分，食用部分切细，用均质器均浆；原料表面较脏时,需适当用蒸馏水清洗。蛋类：鲜蛋去壳，蛋黄和蛋白充分混匀。 水果、蔬菜类：先用水洗去泥沙，然后除去表面的水分，取食用部分。 3.2 振荡提取 将提取溶剂加入到装有样品的具塞容器中，振荡，使提取溶剂与容器内的样品充分接触以深入到样本组织内部，提取待测组分。 3.2.1振荡方式：振荡器上进行上下、往返式振荡、手摇式上下振荡。 3.2.2 在组织样本中加入有机溶剂之间提取时，应边加边振荡，防止组织凝结成团，不利于提取。 3.3. 在用有机溶剂提取过程中，如果出现乳化现象，解决的方法有：①用细头轻轻的搅拌，破坏乳化后，再重复离心。②再加入适量的提取剂，重新振荡。注意离心后要保证样本的稀释倍数不变。 3.4 浓缩 由于净化过程中引入的溶剂，可能会降低待测组分的浓度或者不适宜直接分析，需要去除全部有机溶剂。即试剂盒前处理步骤中把样本在60℃氮气下吹干，再用复溶液溶解干燥残留物。 浓缩方式： 氮气吹干除杂、压缩空气吹干除杂。 注意： 3.4.1在吹干样本之前，用甲醇清洗针头，防止杂质干扰。 3.4.2在吹样本时，针头应在液面上空，避免与样本接触，防止产生交叉污染。 3.4.3样本吹干后应立即取下，避免吹的时间过长，影响最终检测结果。 3.4.4不同的药物，吹干后样本的保质期不同，提倡待样本回到室温后立即复溶。 3.5 净化 经过提取的待测组分中通常含有一些会干扰试剂盒中抗原抗体反应的杂质或者是含有与待测物结构相似 的杂质。将待测组分与杂质分离的过程，我们称为试剂盒中样本的净化。在我们现有的试剂盒前处理方法中涉及到的最常见的净化是：液液分配法。 比如：用复溶液溶解干燥残留物之前先加入适量的正己烷，在加入正己烷和复溶液涡动后如果出现乳化现象，可以60℃水浴加热，至乳化现象消失或减弱后，加大离心转速进行离心。 实例： A、氟喹诺酮类药物试剂盒现有的水产样本前处理方法中，用二氯甲烷作为提取剂。 注意：
酶联免疫检测方法的影响因素
酶联免疫检测方法的影响因素 发表时间：2012-03-14T15:11:15.000Z 来源：《中外健康文摘》2011年47期供稿作者：敬晓云 [导读] 创造一个良好的工作环境，实验室工作人员应团结友爱，互相关心，互相学习自然心情舒畅，工作情绪高涨。敬晓云（四川省南充市西充县中医医院检验科四川南充637200） 【中图分类号】R446【文献标识码】A【文章编号】1672-5085（2011）47-0258-01 酶联免疫（EIJISA）是检验科目前常用的免疫学检测方法之一，其操作方便、简单，不须要特殊设备，使其在各级医院都可应用。但如果忽视了影响其结果的因素，难免会造成假阴性或假阳性的结果。因此了解影响结果的因素，是减少差错事故发生很必要的。 1 实验室操作人员的基本素质因素 实验室人员的素质主要包括五个方面：思想素质、文化素质、技术素质、心理素质、身体素质。因为我们是为人服务的，所以我们的职业道德水平直接关系到人们的生命健康和生命安全。如果在工作中出现了张冠李戴，就有可能造成严重后果。其次文化素质和技术素质很重要，我们必须熟练掌握本专业的基本理论和操作技术。还要不断努力学习新的理论知识，努力提高业务水平。有良好的心理素质勇于面对工作中的挫折，在繁忙工作中有条不紊。所以人员素质问题对检验结果有重要的影响因素。 2 标本处理因素 实验室人员收到标本后应：“三查七对”，对不符合要求的标本和申请单拒收，合格标本及时分离血清，避免溶血。提取血清时不能混有大量纤维蛋白或细胞成分，对不能及时检测的标本要妥善保存于4℃冰箱，做好原始记录。从冰箱取出的标本要预温至室温，对冰冻的样品要融化好，充分混匀再用。 3 操作过程的影响因素 3.1 操作前应对实验的物理参数有充分的了解，如环境温度（保持在18～25℃），反应孵育温度和孵育时间、洗涤的次数等，各种条件必须符合要求。 3.2 正确使用加样器，加样器应垂直加入标本或试剂，避免摩擦包被板底部。加样过程中避免液体外溅，血清残留在反应孔壁上，加样器吸头要一次性使用，加样次序要与说明书一致，否则易发生错误，造成实验重复性差。 3.3 手工洗板加洗液时冲击力不能太大，洗涤次数不超过说明推荐的次数，洗涤液在反应孔内滞留的时间不宜太长。不要让洗液造成孔间污染，导致假阴性和假阳性。 3.4 要保证加液量一致，我们在使用时感觉加样器比滴瓶加样准确，滴瓶加液量不准造成显色不一，造成判断错误。 3.5 显色液的量不可过多，加样的工作环境不能阳光直射，加显色液后避光反应，显色液量要合适。 4 试剂的影响因素 应选用有国家批准文号，质量保证的产品。试剂要妥善保存于4℃冰箱内，在使用时先恢复至室温，不同批号的试剂组分不宜交叉使用。试剂打开后要在一周内用完，剩余试剂下次用时先检查是否变质，显色剂如被污染变化将造成全部显色，导致错误结果。过期试剂不宜，应做好双份质控品的监测，确保结果的可靠性。 5 采取措施，避免差错事故的发生 创造一个良好的工作环境，实验室工作人员应团结友爱，互相关心，互相学习自然心情舒畅，工作情绪高涨。再就是建立完善的质量保证体系，以书面的形式发给每位成员以及临床科室，做到人人熟悉，人人重视影响实验结果的因素，并在操作过程中时刻注意，将质控贯穿到整个实验过程中。制定一系列的制度，用制度管人，明确责任，这样才能提高质量，避免错误结果的发生。
酶联免疫法
酶联免疫吸附实验ELISA 一．实验目的 酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay 简称ELISA）是在免疫酶技术（immunoenzymatic techniques）的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术,ELISA过程包括抗原（抗体）吸附在固相载体上称为包被，加待测抗体（抗原）, 再加相应酶标记抗体（抗原）,生成抗原（抗体）－－待测抗体（抗原）－－酶标记抗体的复合物，再与该酶的底物反应生成有色产物。借助分光光度计的光吸收计算抗体（抗原）的量。待测抗体（抗原）的定量与有色产生成正比。 二．实验原理 用于免疫酶技术的酶有很多，如过氧化物酶，碱性磷酸酯酶，β－Ｄ－半乳糖苷酶，葡萄糖氧化酶，碳酸酐酶，乙酰胆碱酯酶，6－磷酸葡萄糖脱氧酶等。常用于ELISA法的酶有辣根过氧化物酶，碱性磷酸酯酶等，其中尤以辣根过氧化物酶为多。由于酶摧化的是氧化还原反应，在呈色后须立刻测定，否则空气中的氧化作用使颜色加深，无法准确地定量。 辣根过氧化物酶（HRP）是一种糖蛋白，每个分子含有一个氯化血红素（protonhemin）区作辅基。酶的浓度和纯度常以辅基的含量表示。氯化血红素辅基的最大吸收峰是403nm，HRP酶蛋白的最大吸收峰
是275nm，所以酶的浓度和纯度计算式是（已知HRP的A（1cm 403nm 1%）＝25，式中1％指HRP百分浓度为100ml含酶蛋白1g，即10mg/ml，所以，酶浓度以mg/ml 计算是HRP的A（1cm 403nm mg/ml=2.5）HRP纯度（RZ）=A403nm/A275nm纯度RZ（Ｒeinheit Zahl）值越大说明酶内所含杂质越少。高纯度HRP的RZ值在3.0左右，最高可达3.4。用于ELISA检测的HRP的RZ值要求在3.0以上。 ELISA的基本原理有三条： （1）抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体表面，可能是蛋白和聚苯乙烯表面间的疏水性部分相互吸附，并保持其免疫学活性；（2）抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物，而此种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性； （3）酶结合物与相应抗原或抗体结合后，可根据加入底物的颜色反应来判定是否有免疫反应的存在，而且颜色反应的深浅是与标本中相应抗原或抗体的量成正比例的，因此，可以按底物显色的程度显示试验结果。 ELISA法是免疫诊断中的一项新技术，现已成功地应用于多种病原微生物所引起的传染病、寄生虫病及非传染病等方面的免疫诊断。也已应用于大分子抗原和小分子抗原的定量测定，根据已经使用的结果，认为ELISA法具有灵敏、特异、简单、快速、稳定及易于自动化操作等特点。不仅适用于临床标本的检查，而且由于一天之内可以检查几百甚至上千份标本,因此，也适合于血清流行病学调查。本法不仅
大肠杆菌内毒素酶联免疫分析试剂盒使用方法
大肠杆菌内毒素酶联免疫分析试剂盒使用方法 检测范围：96T 0.03Eu/L – 0.8Eu/L 使用目的： 本试剂盒用于测定大肠杆菌样本中内毒素含量。 实验原理 本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中大肠杆菌内毒素水平。用纯化的大肠杆菌内毒素抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入内毒素，再与HRP标记的内毒素抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB 在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的内毒素呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中大肠杆菌内毒素浓度。 标本要求 1．标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融 2．不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。 操作步骤 1.标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照下列图表在小试管中进行稀 释。 2.加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准孔、 待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样50μl，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。 3.温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。 4.配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用 5.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此 重复5次，拍干。 6.加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。 7.温育：操作同3。 8.洗涤：操作同5。