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HPLC法测定重组人干扰素_2b注射液中吐温80的含量

中国生物制品学杂志2012年5月第25卷第5期Chin J Biologicals May 2012,Vol.25No.5

重组人干扰素α2b 注射液中添加吐温80作为保护剂。国外曾有报道,吐温80可导致严重的过敏反应,也可产生呼吸困难、恶心、呕吐、皮疹等不良反应。因此,测定重组人干扰素α2b 注射液中吐温80的含量,可为临床安全用药提供参考,并为该品种质量评价提供科学依据。

有关吐温80的含量测定已有文献报道[1-5]。《中国药典》中也收录了比色法测定吐温80含量的方法[5]。虽然该方法对于设备要求较低,但其耗时较长,准确性及重复性较差,在检测过程中使用了对环境有害的试剂[2]。本实验建立了重组人干扰素α2b 注射液中吐温80含量的HPLC 测定方法,并进行了验证,现报道如下。

1.材料与方法

1.1主要试剂及仪器

吐温80对照品(批号:K40665361)购自Merk 公司;磷酸氢二钠、磷酸二氢钠购自国药集团化学试剂有限公司;氯化钠购自上海市四赫维化工有限公司;重组人干扰素α2b 注射液为安徽安科生物工程(集团)股份有限公司产品;Waters 1525高效液相色谱仪、Waters 1489紫外-可见检测器购自美国Wa-ters 公司;TSKgel G2000SWXL 色谱柱(7.8mm ×300mm ,5μm )购自日本TOSSOH 公司。1.2色谱条件

流动相:10mmol /L 磷酸盐缓冲液(pH 7.0),10mmol /L 氯化钠,0.25mg /ml 吐温80,经0.22μm 微孔滤膜过滤[2];流速:1.0ml /min ;柱温:30℃;检测波长:235nm ;进样量:200μl 。1.3方法的验证

1.3.1专属性验证:分别取浓度为1.0mg /ml 的吐

·技术方法

·HPLC 法测定重组人干扰素α2b 注射液中吐温80的含量

赵辉1,2△,李增礼2△,周乐春2,储成风2,倪晓燕2,王荣海1,2,宋礼华1,

2

【摘要】目的采用HPLC 法测定重组人干扰素α2b 注射液中吐温80的含量。方法按设置的色谱条件对检测重组人干扰素α2b 注射液中吐温80含量的HPLC 方法进行专属性验证、

系统适应性验证、线性范围测定、实验内重复性验证、日间重复性验证、

最低检测限测定、准确性验证,并对3批重组人干扰素α2b 注射液中吐温80的含量进行检测。结果该测定方法具有专属性;系统适应性良好;线性范围为0.03125~2.5mg /ml ,R 2=0.9997,线性关系良好;实验内重复性,峰面积和浓度的RSD 值分别为0.71%和0.56%;日间重复性,保留时间和峰面积的RSD 值分别为0.47%和2.76%;最低检测限为10mg /L ;加样回收率分别为101.99%、99.96%和102.2%,RSD =1.16%;3批人干扰素α2b 注射液中吐温80的相对含量分别为0.940、0.936和0.950mg /ml ,分别为标示量的94.0%、93.6%和95.0%。结论本方法准确、快速、可靠,可用于重组人干扰素α2b 注射液中吐温80含量的测定。

【关键词】色谱法,高压液相;聚山梨醇酯类;干扰素α2b

【中国图书分类号】O652.63R392-33【文献标识码】A 【文章编号】1004-5503(2012)05-623-03

Determination of Tween 80content in recombinant human interferon α2b injection by HPLC

ZHAO Hui *,LI Zeng-li ,ZHOU Le-chun ,CHU Cheng-feng ,NI Xiao-yan ,WANG Rong-hai ,SONG Li-hua

(*Anhui Biological Institute ,Hefei 230088,China )

【Abstract 】Objective To determine the Tween 80content in recombinant human interferon α2b injection by HPLC .Methods Under designed condition ,HPLC was verified for specificity ,systemic suitability ,intra-and inter-reproducibility and accuracy ,and determined for linear range and minimum detection limit .The Tween 80contents in three batches of recombinant human interferon α2b injection were determined by HPLC method .Results The HPLC method showed good specificity ,suitability and linearity (R 2=0.9998),of which the linear range was 0.03125~2.5mg /ml .In intra-reproducibility test ,the RSD s of peak area and concen-tration were 0.71%and 0.56%respectively .In inter-reproducibility test ,the RSD s of retention time and peak area were 0.47%and

2.76%respectively .The recovery rates of three batches of samples loaded were 101.99%、

99.96%and 102.2%respectively ,with a RSD of 1.16%.The Tween 80contents in three batches of interferon α2b injection were 0.940、0.936and 0.950mg /ml ,which were 94.0%、93.6%and 95.0%of stated amounts ,respectively.Conclusion HPLC method was accurate ,rapid and reliable ,which might be used for determination of Tween 80content in recombinant human interferon α2b injection .【Key words 】Chromatography ,high pressure liquid ;Polysorbate 80;Interferon α2b

基金项目:国家“重大新药创制”科技重大专项(2008ZX09203-003).作者单位:1安徽省生物研究所(合肥230088);2安徽安科生物工程

(集团)股份有限公司(合肥230088).

通讯作者:王荣海,E-mail :Wangrh@ankebio.com △:共享第一作者

623··

DOI :10.13200/j.cjb.2012.05.104.zhaoh.034

温80标准液和重组人干扰素α2b注射液(含1.0mg/ml 吐温80),进行HPLC检测,验证色谱峰的专属性[6-7]。

1.3.2系统适应性验证:取浓度为0.75mg/ml的吐温80标准液10ml,待基线平稳后连续测定6次,记录色谱峰的保留时间、峰面积、高度测量值,并计算其相对标准偏差(RSD)。

1.3.3线性范围的检测:用超纯水稀释吐温80标准品,浓度分别为0.03125、0.0625、0.125、0.25、0.5、0.75、1.0、1.25、

2.5mg/ml,各取200μl,连续上样9次,以峰面积为纵坐标,质量浓度为横坐标,绘制标准曲线,计算其回归方程。

1.3.4实验内重复性验证:取6支同一批次重组人干扰素α2b注射液,进样检测及分析,记录样品峰面积和浓度,并计算其RSD值。

1.3.5日间重复性验证:取线性范围下浓度为1.0mg/ml 的吐温80标准液10ml,分5d进样5次,记录样品保留时间和峰面积,并计算其RSD值。

1.3.6最低检测限的测定:取浓度为1.0mg/ml 的吐温80标准液,等倍稀释后,上样检测,确定其最低检测限。

1.3.7准确性验证:向已知吐温80浓度的重组人干扰素α2b注射液中加入浓度分别为1.0、0.5、

0.15mg/ml的吐温80标准液,充分混匀,配制成

1.205、0.919、0.726mg/ml三个水平,每个水平重复进样3次,计算回收率及RSD值。

1.4重组人干扰素α2b注射液中吐温80含量的测定

按照1.2项色谱条件对重组人干扰素α2b注射液中吐温80含量进行测定,共3批。按照面积归一法计算各批次样品中吐温80的相对含量。

2.结果

2.1方法的验证

2.1.1方法的专属性:吐温80标准液的保留时间为4.220min,重组人干扰素α2b注射液于4.262min 处出现吸收峰,与吐温80保留时间差值为0.042,远小于±0.2,且能够与其他色谱峰完全分离,符合可接受标准,见图1。表明该方法检测吐温80具有专属性。

2.1.2系统的适应性:吐温80标准品的色谱峰保留时间、峰面积、高度测量值的相对标准偏差分别为0.0178%、0.5345%和0.4038%,表明该分析系统适应性良好。

2.1.3线性范围:吐温80标准品在0.03125~2.5mg/ml的范围内线性关系良好。见图2。2.1.4实验内重复性:峰面积和浓度的RSD值分别为0.71%和0.56%,表明该方法精密度良好。

2.1.5日间重复性:5次进样所得各峰的保留时间分别为4.224、4.229、4.230、4.271、4.254min,峰面积分别为8336006、8584723、8489321、8721586、8116416,其保留时间和峰面积的RSD值分别为0.47%和2.76%,表明该方法的日间重复性良好。2.1.6最低检测限:最低检测限为10mg/L。

2.1.7准确性:加样回收率分别为101.99%、99.96%、102.02%,RSD值为1.16%,表明该方法准确可靠。

2.2重组人干扰素α2b注射液中的吐温80含量

3批次样品中吐温80的相对含量分别为0.940、0.936和0.950mg/ml,分别为标示量的94.0%、93.6%和95.0%,见表1。

图1吐温80标准液(A)和重组人干扰素α2b注射液(B)的HPLC分析

Fig1.HPLC profile of Tween80standard(A)and recom-binant human interferonα2b injection(B)

图2吐温80的标准曲线

Fig2.Standard curve of Tween80

(下转第629页)

0.40

0.35

0.30

12.0014.00

0.00

0.25

0.20

0.15

0.10

0.05

0.004.006.00

2.008.0010.00

B

A

U

时间(min)

4.262

0.00

4.006.00

时间(min)

2.008.0010.00

0.25

0.20

0.15

0.10

0.05

0.00

A

A

U

4.220

吐温80浓度(mg/ml)

3.0

y=1E+07x-3E+06

R2=0.9997

30000000

25000000

20000000

10000000

15000000

5000000

-5000000

0.51.01.52.02.5

(上接第624页)

表1三批重组人干扰素α2b 注射液中的吐温80含量

Tab 1.Tween 80contents in three batches of recombinant hu-man interferon α2b

相对含量(mg /ml )标示浓度(mg /ml )标示量的百分比201010090.9401.094.0

201010120.936

1.093.6201010140.9501.095.0

3.讨论

本实验采用HPLC 法测定重组人干扰素α2b 注

射液中吐温80的含量。在实验中,通过在流动相中

分别加入浓度为1.00、0.50、0.25和0.10g /L 的吐温80,发现当供试品中吐温80浓度低于流动相中的吐温80浓度时,出现负峰,高于流动相中的吐温80浓度时,出现正的吸收峰。结合标准品在含有不同浓度吐温80的流动相中色谱峰的特点、线性关系和样品中吐温80的含量等条件,发现流动相中吐温80的浓度为0.25mg /L 时,在235nm 的检测波长下,吐温80在0.03125~2.5mg /ml 范围内线性关系良好,R 2=0.9997。实验内和日间重复性实验测定结果表明,该方法精密度较高;最低检测限可达到10mg /L ;回收率测定结果表明,该方法准确可靠。

然而,由于供试品色谱峰的峰面积受流动相中

吐温80的质量浓度影响比较大,

因此,建议在测定样品中吐温80的含量时采用外标法,结果会更加准

确可靠。另外,

由于不同企业蛋白药物注射液中添加的吐温80含量各不相同,在测定时,流动相中吐温80的质量浓度可根据样品中吐温80的质量浓度适当调整,以确保样品中吐温80的质量浓度不与流动相中吐温80的质量浓度太接近,以致影响测定的准确性。

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(收稿日期:2011-11-02)

批次

6小鼠引起了骨髓抑制,可作为研究辐射损伤的模型。本实验建立了较全面评价骨髓抑制的体系,为进一步筛选抗骨髓抑制的药物奠定了基础,也为从细胞损伤与衰老角度研究抗放射致骨髓抑制提供了新思路。

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(收稿日期:2011-07-12)