金黄色葡萄球菌对喹诺酮类耐药的主动外排机制的研究
实验研究
金黄色葡萄球菌对喹诺酮类耐药的主动外排机制的研究
吴青萍,廖朝峰
(广东省深圳市宝安区人民医院,广东深圳
518101)
[摘要] 目的 对临床分离株中主动外排机制介导耐药的流行情况进行调查,为临床合理用药、耐药性控制及新型敏感抗菌药物的开发提供理论依据。方法 将金黄色葡萄球菌(金葡菌)标准株AT CC25923及对喹诺酮类敏感临床株接种于含4 M I C 氧氟沙星的MH 琼脂平板上(含或不含20mg/L 的利血平),观察利血平对诱导耐药出现的抑制作用,并测定诱导耐药株对溴乙啶、氧氟沙星、环丙沙星的M IC(含或不含20mg/L 的利血平),观察利血平对诱导耐药株M IC 的影响,用利血平抑制试验法测定临床上耐喹诺酮类金葡菌中主动外排机制的流行性。结果 利血平可抑制喹诺酮类对金葡菌的诱导耐药率,可降低诱导耐药率的M IC 。利血平抑制试
验是检测金葡菌中主动外排机制简单直观的方法,临床上耐喹诺酮类金葡菌中约50%存在主动外排机制。结论 主动外排是临床上金葡菌对喹诺酮类耐药的一种重要机制,利血平可抑制喹诺酮类对金葡菌的诱导耐药率,并可降低耐药菌的M IC,与喹诺酮类可起协同抗菌作用。
[关键词] 金黄色葡萄球菌;敏感性;喹诺酮;主动外排机制
[中图分类号] R0378.11 [文献标识码] A [文章编号] 1008-8849(2005)13-1686-03
Study of active ef flux mechanism in staphylococcus aureus resistant to Quinolone
WU Q ing ping,LIA O Chao feng
(Bao an District People s Hospital,Shenzhen 518101,Guangdong,China)
Abstract:Objective It is to investigate the popular instance of t he activ e efflux mechanism in clinical dissociat ive strain in or der to offer theoretical basis on clinical rational administration,r esistance control and the development of neot ype aeschynomenous antibacter ials.Methods Staphylococcus aureus standar d strain AT CC25923and clinic aeschynomenous strain to Quinolone were inoculated onto MH ag ar plate containing 4 M IC Oflox acin (containing 20mg/L Reserpine or not).T he inhibiting action of Reser pine on induction resistance w as observed.T he M IC of the induction resistance str ain on ethidium bromide (EB),O floxacin and Ciproflox acin (containing 20mg/L Reser pine or not)w as determined.T he influence of Reser pine on the M IC of the induction r esistance str ain was observed.T he po pular instance of t he active efflux mechanism in resis tance Quinolone staphylococcus aureus o n clinic was surv ey ed w ith Reser pine inhibition test.Results R eserpine can restrain the induction resistance rate of Quinolone on staphy lococcus aureus and can debase t he M IC of t he induction resistance rate.Reserpine inhibition test w as a simple and dir ect met hod deter mining the active efflux mechanism in staphylococcus aureus.T he active efflux mechanism was existed on about 50%str ains of resistance Quinolone staphylococcus aur eus on clinic.C on clusion Active efflux is an impo rtant mechanism of staphy lococcus aureus r esi stant to quinolone on clinic.Reserpine can re str ain the induct ion resistance rate of Quinolone on staphylococcus aureus and debase the M IC of the resistance str ain.Reser pine and Quino lone hav e cooperativity.
Key words:staphyloco ccus aur eus;sensibility ;Q uinolone;activ e efflux mechanism
[作者简介] 吴青萍(1964!),女,主管药师。
金黄色葡萄球菌(金葡菌)是一种重要的社区和医院获得性病原菌,它可引起人体多部位的严重感染。近年来耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(M RSA)大量出现,并且对头孢菌素及氨基糖甙类等抗菌药耐药菌逐年增多,严重限制了临床上抗菌药物的选择范围[1]。喹诺酮类药物曾一度成为耐药金葡菌感染的有效治疗药物,但进入临床不久,对喹诺酮耐药的金葡
菌便大量出现[2]。为探讨主动外排机制在金葡菌对喹诺酮耐药中的作用并研究对抗其耐药的方法,笔者通过利血平抑制试验,观察利血平对诱导耐药株的出现及对已存在的耐药性是否有抑制作用,并检测临床分离金葡菌中主动外排机制的流行情况。1 实验资料
1 1 药物与试剂 氧氟沙星标准品由浙江裕康公司提供,纯度99.1%;环丙沙星水剂0.2% 200mL/袋,购自德国拜耳
公司;利血平标准品及溴乙啶粉由深圳晶美生物制品公司生
产;M H琼脂购自法国梅里埃公司,药液配制参照中华人民共和国药典。
1 2 菌株 金葡菌标准株AT CC25923由广东省临床检验中心购得,临床株取自宝安区人民医院2003年7!12月的临床分离金葡菌。
1 3 试验方法
1 3 1 试验1 利血平对诱导耐药株出现的抑制试验:金葡菌AT CC25923以108CFU接种于M H琼脂培养基中,培养基中分别加入3 及4 M IC(即0.75,1.0mg/L的氧氟沙星),其中+Reserpine组M H琼脂中含20mg/L的利血平,-Re serpine组不含利血平,于35#培养48h观察琼脂平板上的诱导耐药株形成的菌落数,重复4次。另取2块MH平板,一块加入50mg/L的利血平,另一块不加利血平,同样接种A T CC25923108CFU/平板,观察利血平对金葡菌生长是否有抑制作用。
1 3
2 试验2 利血平对诱导耐药性的抑制试验:取
A T CC25923C以2 109CF U接种于含氧氟沙星2mg/L的M H琼脂中培养48h,取100株生长明显的诱导耐药菌株以琼脂稀释法测定溴乙啶、氧氟沙星、环丙沙星的M IC(加入或不加入利血平20mg/L),观察利血平对诱导耐药株耐药性的抑制作用。
1 3 3 试验3 检测临床分离耐药金葡菌中主动外排机制的流行情况:采用美国产DADE半自动微生物分析仪,采用微量稀释法测定菌株对环丙沙星及氧氟沙星M IC。筛选氧氟沙星敏感株200株,环丙沙星耐药株100株,后者采用琼脂稀释法测定其对环丙沙星的确切M IC。+Reserine组加入利血平20mg/L,-R eserpine组不加,观察其M IC下降情况,判断临床株主动外排机制的流行情况。
1 3 4 试验4 利血平对临床氧氟沙星敏感金葡菌株诱导耐药率的抑制试验:取上述临床选取的对环丙沙星敏感株200株,采取琼脂稀释法测定具体M IC;并接种于含4 M I C 环丙沙星的MH琼脂平血(含或不含20mg/L的利血平),48 h后观察菌落数,评估利血平对临床株诱导耐药率是否有抑制作用。
1 4 统计学方法 试验1及试验4中数据均采用同体比较的t检验。
2 结 果
2 1 试验1结果 见表1。+Reserpine组琼脂平板上菌落计数显著高于-Reserpine组(P<0.001),表明利血平对氧氟沙星诱导耐药株的出现有抑制作用,而单独用50mg/L的利血平对A T CC25923的生长无抑制作用(加利血平平板与不加利血平平板上的细菌均大片生长)。
表1 利血平对AT CC25923氧氟沙星诱导耐药菌落数 个试验次数12345
+Reserpine620732 2 试验2结果 氧氟沙星诱导耐药株S1~S10对溴乙啶M I C值为0.25~4mg/L,对氧氟沙星M IC为2~16mg/L,对环丙沙星M I C值为0.5~4mg/L,其中S2、S4、S7、S8、S9、S10对氧氟沙星及环丙沙星耐药,其中除S10外都对溴乙啶耐药,表明3种药物存在明显交叉耐药;溴乙啶试验中+R eserpine组除S2、S5、S9外的其他耐药菌的MIC值较-Reserpine组有4~16倍的下降,而氧氟沙星及环丙沙星+Reserpine组中,同样除S2、S5、S9外,其余耐药菌株的M IC较-Reserpine组中有4~ 16倍的下降,结果基本一致。
2 3 试验3结果 临床选取的200株环丙沙星耐药株中有100株加入20mg/L的利血平后,M IC下降4~8倍,其余10株则下降2倍。
2 4 试验4结果 见表2及表3。M IC为0.125的菌株+ Reserpine组与-Reserpine组菌株菌计数有显著性差异(P< 0.01),M IC为0.25的菌株+Reserpine组与-Reserpine组菌落计数亦有显著性差异(P<0.05),表明利血平对临床环丙沙星敏感金葡菌株诱导耐药的出现亦有抑制作用。
表2 利血平对临床氧氟沙星敏感株(M IC0.125)
诱导耐药的菌落数个临床敏感株CS1CS2CS3CS4CS5
+Reserpine502857
-Reserpine4112692933
表3 利血平对临床氧氟沙星敏感株(M IC0.25)
诱导耐药的菌落数个临床敏感株CS6CS7CS8CS9CS10
+Reserpine612320
-Reserpine204882662
3 讨 论
1996年M ar kham已证实了利血平可抑制诺氟沙星对金葡菌SA1199(含norA变异基因)的诱导耐药[3],1999年又证实了利血平对环丙沙星诱导肺炎链球菌耐药的抑制作用[4],本研究中证实了利血平20mg/L对氧氟沙星诱导金葡菌标准株AT CC25923及临床选取敏感株的耐药均可产生显著的抑制作用,而单独使用50mg/L的利血平对AT CC25923的生长无抑制作用,推测可能是利血平通过抑制金葡菌中NA的表达而生产抑制作用,而非自身的抗菌作用产生的效果。
本研究中采用琼脂稀释法测定了溴乙啶、氧氟沙星、环丙沙星对氧氟沙星诱导耐药株的M IC,结果显示3种药物间存在明显的交叉耐药性,且这种耐药机制可被利血平抑制,并且在诱导耐药性中出现率很高,占70%,表明3药之间存在相同的耐药机制。1995年A hmedk证明了枯草杆菌中的主动外排泵Bmr可由利血平阻断[5],1998年Brenw ald又证实利血平抑制实验和检测肺炎链球菌中的主动外排机制[6],据此推测金葡菌中存在这种由氧氟沙星诱导的低水平耐药可能由主动外排所致[7]。
Brenwald使用利血平抑制试验检测到273株耐
喹诺酮的肺炎链球菌中45.4%存在主动外排机制[6],而临床金葡菌中主动外排机制的流行率未经报道,未探讨临床对喹诺酮耐药金葡菌中主动外排机制的流行情况。笔者选取了200株临床分离的环丙沙星耐药金葡菌株,使用利血平抑制法检测到100株(即50%)细菌存在主动外排所致耐药,提示主动外排机制为临床上金葡菌耐药的一种重要原因。
综上所述,主动外排机制是临床上金黄色葡萄球菌对喹诺酮类耐药的一种重要的机制,它虽只导致一种低水平耐药(M IC上升4~16倍),但很易由喹诺酮类诱导产生,往往是临床治疗失败的原因[8],原来用于降低血压的生物碱利血平不仅可抑制喹诺酮类的诱导耐药率,而且对于已产生耐药的菌株可降低其M IC,对抗其主动外排所致耐药,因治疗浓度(20mg/L)不良反应过大,不适用于临床,但可为开发同类药物提供理论基础,寻求一种简单易行的方法检测主动外排机制对临床防治耐药菌及实验室工作都很重要。以往对主动外排机制对临床防治耐药菌及实验室工作都很重要。以往对主动外排机制的检测多采用同位素标准记法或直接检测外排基因或蛋白,方法繁杂,不适用于临床。利血平抑制试验被证实为一种敏感且特异性较高的、简便易行的检测金葡菌中主动外排机制的方法,可为试验室及临床工作借鉴。
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[收稿日期] 2005-02-15
(上接第1685页)感率为77%[9]。颈部血管超声检查可用于颈动脉狭窄、闭塞,颈动脉瘤,颈动静脉瘘,颈部外伤伴发的血管病变[10],能直接观察血管内径及内膜情况,更能方便地提供血流动力学的信息,预知缺血性卒中的可能,为临床选择治疗方法提供依据,说明颈动脉彩色多普勒超声对脑梗死患者是一项重要的辅助检查手段,其显示情况可作为综合判断脑梗死患者动脉硬化的客观指标,指导脑梗死二级预防,降低脑梗死的高复发率。
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[收稿日期] 2005-04-01
金黄色葡萄球菌的耐药性分析
金黄色葡萄球菌的耐药性分析 目的：了解医院住院患者金黄色葡萄球菌感染分布及耐药情况，为临床合理用药提供参考依据。方法：收集2013年1月至2014年12月临床分离的106株金黄色葡萄球菌，采用纸片扩散法（K-B法）测定15种抗菌药物的敏感情况。结果：106株金黄色葡萄球菌，其中MRSA为66株（62.3%），MSSA40株（37.7%），金黄色葡萄球菌对多种抗菌药物呈普遍耐药。结论：MRSA对大部分抗菌药物具有较高的敏感性，而MSSA表现为多重耐药性，未发现耐万古霉素MRSA菌株，医院金黄色葡萄球菌对多种抗菌药物耐药。 标签：金黄色葡萄球菌；耐甲氧西林金黄色葡萄球菌；耐药性 金黄色葡萄球菌是重要的医院感染菌，能引起皮肤软组织[1]、内脏器[2]、全身感染[2]。由于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）同时对多种抗生素耐药，使治疗由它所引起的感染和控制其传播变得十分困难。本文将分析我院近2年中106株金黄色葡萄球菌医院感染病历的临床分布及药敏情况。 1 材料与方法 1.1 菌株来源 106株金黄色葡萄球菌来自2013年1月至2014年12月本院临床各科室送检的住院患者的标本，包括呼吸道分泌物、创面分泌物、尿液、胸水、腹水等。 1.2 分离鉴定 按照《全国临床检验操作规程》第3版进行细菌的分离鉴定，药敏纸片及M-H琼脂均为法国生物梅里埃公司配套产品。 1.3 药敏试验 采用K-B琼脂纸片扩散法检测对15种抗生药物的耐药性。 1.4 质控菌株 金黄色葡萄球菌ACTT25923购于内蒙古临床检验中心。 2 结果 2.1 标本分布 106株金黄色葡萄球菌主要来自呼吸道分泌物（占53.5%），创面分泌物（占21.4%）、尿液（占9.4%）、胸水（占8.6%）、腹水（占4.0%）、其它（占3.1%）。
金黄色葡萄球菌
金黄色葡萄球菌 金黄色葡萄球菌革兰氏染色显微照片 金黄色葡萄球菌 (Staphyloccocus aureus Rosenbach) 是人类的一种重要病原菌，隶属于葡萄球菌属（Staphylococcus），有“嗜肉菌"的别称，是革兰氏阳性菌的代表，可引起许多严重感染。而对于金黄色葡萄球菌在速冻食品中的存在量，卫生部于2011年11月24日公布食品安全国家标准《速冻面米制品》，允许金葡菌限量存在。 目录 简介 流行病学 引发病症 球菌检验 球菌控制 感染处理 限量存在 简介 金黄色葡萄球菌细胞壁含90%的肽聚糖和10%的磷壁酸。其肽聚糖的网状结构比革兰氏阴性菌致密，染色时结晶紫附着后不被酒精脱色故而呈现紫色，相反，阴性菌没有细胞壁结构，所以紫色被酒精冲掉然后附着了沙黄的红色。金黄色葡萄球菌与青霉素的发现有很大的渊源。当年弗莱明就是在他的金黄色葡萄球菌的培养皿中发现有些球菌被杀死了，于是发现了青霉素。而研究也表明青霉素只对以金黄色葡萄球菌为代表的革兰氏阳性菌作用明显。这也是由肽聚糖层的厚度和结构造成的。新出现的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，被称作超级细菌，几乎能抵抗人类现在所有的药物，但是万古霉素可以对付它。典型的金黄色葡萄球菌为球型，直径0.8μm 左右，显微镜下排列成葡萄串状。
显微图像 金黄色葡萄球菌无芽胞、鞭毛，大多数无荚膜，革兰氏染色阳性。金黄色葡萄球菌营养要求不高，在普通培养基上生长良好，需氧或兼性厌氧，最适生长温度37°C，最适生长pH7.4,干燥环境下可存活数周。平板上菌落厚、有光泽、圆形凸起，直径1~2mm。血平板菌落周围形成透明的溶血环。金黄色葡萄球菌有高度的耐盐性，可在10~15%NaCl肉汤中生长。可分解葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖，产酸不产气。甲基红反应阳性，VP反应弱阳性。许多菌株可分解精氨酸，水解尿素，还原硝酸盐，液化明胶。金黄色葡萄球菌具有较强的抵抗力，对磺胺类药物敏感性低，但对青霉素、红霉素等高度敏感。对碱性染料敏感，十万分之一的龙胆紫液即可抑制其生长。 流行病学 金黄色葡萄球菌在自然界中无处不在，空气、水、灰尘及人和动物的排泄物中都可找到。因而，食品受其污染的机会很多。美国疾病控制中心报告，由金黄色葡萄球菌引起的感染占第二位，仅次于大肠杆菌。金黄色葡萄球菌肠毒素是个世界性卫生难题，在美国由金黄色葡萄球菌肠毒素引起的食物中毒，占整个细菌性食物中毒的33%，加拿大则更多，占到45%，我国每年发生的此类中毒事件也非常多。 金黄色葡萄球菌的流行病学一般有如下特点：季节分布，多见于春夏季；中毒食品种类多，如奶、肉、蛋、鱼及其制品。此外，剩饭、油煎蛋、糯米糕及凉粉等引起的中毒事件也有报道。上呼吸道感染患者鼻腔带菌率83%，所以人畜化脓性感染部位，常成为污染源。 一般说，金黄色葡萄球菌可通过以下途径污染食品：食品加工人员、炊事员或销售人员带菌，造成食品污染；食品在加工前本身带菌，或在加工过程中受到了污染，产生了肠毒素，引起食物中毒；熟食制品包装不密封，运输过程中受到污染；奶牛患化脓性乳腺炎或禽畜局部化脓时，对肉体其他部位的污染。金黄色葡萄球菌是人类化脓感染中最常见的病原菌，可引起局部化脓感染，也可引起肺炎、伪膜性肠炎、心包炎等，甚至败血症、脓毒症等全身感染。金黄色葡萄球菌的致病力强弱主要取决于其产生的毒素和侵袭性酶：
金黄色葡萄球菌检测方法
金黄色葡萄球菌检测方 法 Revised as of 23 November 2020
金黄色葡萄球菌检测方法 1.纸片法 目前广泛应用的一种方法，用纸片、膜、胶片等作为培养基载体，将特定的培养基和显色物质附着在上面，通过观察微生物在测试片上面的生长、显色来测定食品中微生物。采用快速测试片检测具有显着的优点：可测定少量检品，不需要配制试剂，不需要大量的玻璃器皿，操作简便迅速；易于消毒保存，便于运输携带方便，价格低廉；除纸片外无其他任何废液废物，大大减少了工作量；可以在取样时同时接种，结果更能反映当时样本中真实细菌数，防止延长接种时间时细菌繁殖造成的污染。 技术优点：操作简单使用方便，避免了繁琐的操作。 技术缺点：用时间比较长，无法准确定性及计数。 此方法现在应用于快速检测领域，美国3M公司Petrifilm为载体的测试片应用最为广泛。但其也存在一些问题：Petrifilm测试片上覆盖了一层薄膜，当样品粘液过多时会出现菌落的扩散和融合，影响计数；Petrifilm测试片面积较小，当菌量大于250cfu时，准确计数较困难；待测样品中含有的某些有机物可能使显色减缓。使目视效果下降，导致计数偏低。 2.免疫学方法 各种免疫学方法的基本原理都是抗原抗体反应。抗原抗体反应是指抗原与相应抗体之间所发生的特异性结合反应。金黄色葡萄球菌特异的抗原能激发机体产生相应的特异性抗体。在免疫检测中，可利用单克隆抗体检测金黄色葡萄球菌的特异抗原，也可利用金黄色葡萄球菌抗原检测体内产生的特异抗体，两种方法均能判断机体的感染状况。目前对于金黄色葡萄球菌的测定主要进行了肠毒素的测定，方法以酶联免疫吸附实验为主，有胶体金方法，也有用亲和素一生物素乳胶凝集实验和免疫荧光实验，但都有一定的局限性。 免疫学方法包括下面两个部分： （1）抗原抗体技术分析：抗原抗体技术是免疫技术中的核心部分，对于金黄色葡萄球菌检测全菌免疫筛选抗体是很困难的事情，现在目前市场有的大多都是对金黄色葡萄球菌毒素类进行免疫得到的抗体，金黄色葡萄球菌毒素有12种，军事医学科学院生产的金黄色葡萄球菌毒素A、B、C的抗体。毒素抗体优势在于敏感度高，易于检查，缺点毒素种类多，检测其中几种不具有普遍性。毒素分离工艺复杂，要得到纯毒素成本比较高。 （2）免疫学方法技术分析：上述免疫学技术应用最多的是酶联免疫技术和胶体金侧向层析技术。酶联免疫技术广泛应用于实验室检测，由于一次可以检测多个样本，此技术多用于体外诊断，目前也广泛用于食品安全。胶体金技术由于操作简单，检测适度快等优势，在食品安全领域广泛用于现场快速检测。 基于免疫学方法的技术主要分为：酶联免疫技术、胶体金侧向层析技术、免疫荧光技术、免疫沉淀技术、乳胶凝集技术、免疫磁珠技术。 3.分子生物学方法 金黄色葡萄球菌的致病力强弱主要取决于其产生的毒素和侵袭性酶：肠毒素、血浆凝固酶、溶血素、杀白细胞素、表皮溶解毒素、毒性体克综合重量毒素I 等。而这些致病因子基因的鉴定(包括耐药性相关基因、毒素基因、酶基因及多
喹诺酮类抗菌药耐药新机制
喹 诺 酮 类 抗 菌 药 耐 药 新 机 制 刘健华,陈杖榴 (华南农业大学兽医学院广东省兽药研制与安全评价重点实验室,广东广州510642)中图分类号:S859.7 文献标识码:E 文章编号:052926005(2007)0120054202 近年来喹诺酮类的耐药性问题备受关注。细菌对喹诺酮类的耐药机制过去普遍认为主要起因于染色体基因突变(靶位改变、主动外排和膜孔蛋白缺失),而不存在水平传播的可转移基因。近年来开始出现一些新的喹诺酮耐药机制,包括qn r、m f pA和氨基糖苷乙酰转移酶的变异基因(aac(6’)2Ib2cr)介导的喹诺酮耐药性,其中qn r和aac(6’)2Ib2cr位于质粒上,使得喹诺酮耐药性在人畜病原菌间的迅速扩散成为可能,更加严重地威胁感染性疾病的治疗。 收稿日期:2006207205 作者简介:刘健华(19732),女,副教授,博士,从事兽药安全评价和细菌耐药性研究;E2m a il:jh liu@scau.ed https://www.wendangku.net/doc/fa5064319.html, 通讯作者:陈杖榴,E2m a il:chenz l@scau.ed https://www.wendangku.net/doc/fa5064319.html, 现就近年来新出现的喹诺酮类耐药机制综述如下。1 qn r介导的耐药机制 1.1 qn r的发现及对喹诺酮类的作用机制 1998年M artinez等[1]首次报道从美国阿拉巴马州伯明翰医学中心分离的一株肺炎克雷伯氏菌中获得了一个有广泛宿主菌可转移喹诺酮类耐药性的质粒pM G252。将该质粒转入外膜孔蛋白缺失的肺炎克雷伯氏菌可使其对环丙沙星的M I C升高8～16倍,转入外膜孔蛋白正常的肺炎克雷伯氏菌可使其对环丙沙星的M I C升高32倍。含有该质粒的E.coli转化子其耐药性突变的频率比不含该质粒的菌株高100倍,且对环丙沙星的M I C从0.008m g L上升到0.25m g L。这一质粒在其他肠杆菌(如E.coli、伤寒 的检测准确性好。尿样经萃取处理后可去除一些干扰因素,其检测结果应更为可靠,对检测结果不相符的尿样进行萃取处理前后的检测试验说明,TCC、B I O 和DN试剂盒对低含量或阴性尿样的直接检测均存在非特异反应的情况。而CER试剂盒对阴阳性尿样的检测(包括经萃取处理的尿样)均呈阳性。分析认为,有两方面因素,一方面可能该试剂盒本身不适合用于尿样的直接检测;另一方面,该试剂盒的反应活性偏低,也可能影响了检测结果的准确性。我们共采用了6盒CER试剂(含3个批次),在试剂盒提供的操作程序的基础上,延长了个别反应步骤的时间,但不同试剂盒的0ng m l标准的OD值均只达到0.9～1.0ng m l。除了试剂盒自身因素,试剂在销售和运输过程中若储藏不当也可能造成反应活性偏低。 3.4 在实践工作中,确定合理阳性阈值对于EL ISA 结果判定非常重要。一般而言,将阳性阈值定得较高,可减少非特异反应的情况,但也可能造成一些低残留水平的样品漏检,给进出口把关带来风险。对阳性阈值的确定,需综合考虑所检测药物在动物体内的残留规律、试剂盒本身的特点、样品的前处理方法、把关要求等因素。 3.5 尿样的质量和前处理方法对检测结果也有较大影响。我们发现,一些用原液测得含量为10～50ng m l的尿样,经10倍稀释后用同一试剂盒测得含量为0,说明稀释处理可减少一些干扰因素。为保证检测质量,尿样应新鲜采集并注意低温保存。对尿样采用本研究介绍的有机溶剂萃取法或试剂盒提供的酶消化法进行前处理,也可进一步减少干扰因素。 4 小结 综上所述,根据本研究比对试验结果,并综合考虑试剂盒检测原理、质量、标准品设置、操作是否便利等因素,4种试剂盒当中,本研究推荐选用B I O试剂盒进行活动物莱克多巴胺残留快速检测。但B I O试剂盒对经简单处理的尿样的检测也存在非特异反应的情况。实际检测工作中,除通过设定合理阳性阈值、对尿样进行必要的前处理等方法以尽可能较少非特异干扰因素之外,还可对检测呈阳性的样品另用不同试剂盒检测,综合有关检测结果进行判定,必要时应采用色谱等方法对EL ISA结果进行确证。 参考文献: [1] 吴时清,陈茹,林志雄,等.应用竞争酶联免疫吸附技术检测供 港澳活猪中克伦特罗残留量[J].现代商检科技,1999,9(4):172 18. [2] 于洪侠,杨曙明.莱克多巴胺残留检测方法研究进展[J].中国 兽药杂志,2004,38(11):44247. [3] Shelver W L,K i m H J,L i Q X.D evelopm ent of a monoclonal antibody2based enzym e2linked i m m uo so rbent asssy fo r beta2 adrenergic agonist zilpatero l[J].J A gric Food Chem.2005,53 (9):327323280. [4] Sm ith D J.Shelver W L.T issue residues of ractopam ine and urinary excreti on of ractopam ine and m etabo lites in ani m al treated fo r7days w ith dietary ractopam ine[J].J A ni m Sci, 2002,80:124021249. [5] D ick son L C,M ac N eil J D,L ee S,et a l.D eter m inati on of be2 ta2agonist residues in bovine urine using liquid ch rom atogra2 phy2tandem m ass spectrom etry[J].J AOA C Int,2005,88(1): 46256.
金黄色葡萄球菌的测定
金黄色葡萄球菌的测定 1 卫生学意义 金黄色葡萄球菌定性检验（增菌培养法）：适用于检查含有受损伤的金黄色葡萄球菌的加工食品。 2 检验方法 2.1 术语与定义 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）为一种革兰氏染色阳性球形细菌。显微镜下排列成葡萄串状，金黄色葡萄球菌无芽孢、鞭毛，大多数无荚膜。是常见的引起食物中毒的致病菌。常见于皮肤表面及上呼吸道黏膜。 2.2 设备和材料 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下： （1）恒温培养箱：36℃±1℃。 （2）冰箱：2℃～5℃。 （3）恒温水浴箱：37℃～65℃。 （4）天平：感量0.1g。 （5）无菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸头。 （6）无菌锥形瓶：容量100mL、500mL。 （7）无菌培养皿：直径90mm。 （8）pH计或pH比色管或精密pH试纸。 2.3 培养基和试剂 （1）7.5%氯化钠肉汤 1）成分：蛋白胨：10.0g；牛肉膏：5.0g；氯化钠：75g；蒸馏水：1000mL；pH：7.4； 2）制法：将上述成分加热溶解，调节pH，分装，每瓶225mL，121℃高压灭菌15min。 （2）B－P琼脂平板 1）成分：胰蛋白胨：10.0g；牛肉膏：5.0 g；酵母膏：1.0g；丙酮酸钠：10.0g；甘氨酸：12.0g；氯化锂（LiCl·6H2O）：5.0g；琼脂：20.0g；蒸馏水：950mL；pH：7.0±0.2 2）增菌剂的配法：30%卵黄盐水50mL与经过除菌过滤的1%亚碲酸钾溶液10mL 混合，保存于冰箱内。 3）制法：将各成分加到蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解，调节pH。分装每
金黄色葡萄球菌耐药的现状及临床治疗对策
金黄色葡萄球菌耐药的现状及临床治疗对策 孙宏莉徐英春 单位：中国医学科学院中国协和医科大学北京协和医院 摘要：金黄色葡萄球菌，尤其是甲氧西林或苯唑西林耐药的金黄色葡萄球菌（MRSA）是引起院内感染的多重耐药菌。目前MRSA已逐渐成为全世界院内感染的主要病原菌。目前在许 多国家仍在增长，MRSA几乎对所有?-内酰胺类抗生素耐药，甚至累及到红霉素，环丙沙 星和庆大霉素。本文对金黄色葡萄球菌的耐药现状、耐药机制以及金黄色葡萄球菌感染的 危险因素和治疗对策进行了简要介绍。 关键词：金黄色葡萄球菌耐药现状耐药机制危险因素治疗对策 答 1. 甲氧西林或苯唑西林耐药的金黄色葡萄球菌（ MRSA ）是引起院内感染的多重耐药菌。是吗？ A.是 B.不是 2. 根据 NCCLS 判定标准，对于金黄色葡萄球菌，万古霉素的MIC≤4ug/ml 时为敏感。对吗？ A.不对 B.对 金黄色葡萄球菌，尤其是甲氧西林或苯唑西林耐药的金黄色葡萄球菌（ MRSA ）是引起院内感染的多重耐药菌。在第一个耐青霉素酶的β－内酰胺类抗生素甲氧西林用于临床治疗葡萄球菌感染不久， 1961 年在英国发现了世界首例 MRSA 。从此， MRSA 逐渐成为全世界院内感染的主要病原菌。目前在许多国家仍在增长， MRSA 几乎对所有β- 内酰胺类抗生素耐药，甚至累及到红霉素，环丙沙星和庆大霉素。 1996年在日本首次发现了MRSA对万古霉素敏感性下降的菌株，即万古霉素中介的金黄色葡萄球菌（VISA）。VISA 的出现预示着万古霉素治疗葡萄球菌感染的临床疗效下降，随之万古霉素耐药的金黄色葡萄球菌（VRSA）临床株是否会分离到，成为人们监测和关注的热点。如果葡萄球菌一旦对万古霉素耐药，临床将如何治疗？
细菌对氟喹诺酮类药物耐药机制的研究进展
龙源期刊网 https://www.wendangku.net/doc/fa5064319.html, 细菌对氟喹诺酮类药物耐药机制的研究进展作者：方可华于锋英 来源：《上海医药》2011年第05期 中图分类号：R978.19 文献标识码：A 文章编号：1006-1533(2011)05-0227-02 喹诺酮类药物是一类由萘啶酸发展起来的合成抗菌药，其中氟喹诺酮类药物于20世纪80年代起陆续上市，属于第三代喹诺酮类药物，具有抗菌谱广、抗菌活性高、组织穿透性强等特点且可单药使用，对革兰阳性菌和革兰阴性菌均显示有良好的抗菌活性，广泛应用于临床各种感染性疾病的治疗。近年来，随着氟喹诺酮类药物在临床中的广泛使用，对其耐药菌株也在世界各地频繁出现。下面就细菌对氟喹诺酮类药物的耐药机制研究进展作一简要介绍。 细菌对氟喹诺酮类药物耐药的机制主要有—— 1）靶点的改变。 喹诺酮类药物的作用机制是针对细菌DNA复制过程中所需的拓扑异构酶。拓扑异构酶Ⅱ和拓扑异构酶Ⅳ是喹诺酮类药物的主要作用靶点。拓扑异构酶Ⅱ是由2个A亚基和2个B亚 基组成的四聚体，分别为gyrA和gyrB[1, 2]。拓扑异构酶Ⅳ是由2个C亚基和2个E亚基组成的四聚体，分别由parC和parE基因编码[3]。在对喹诺酮类药物耐药的革兰阴性菌中，gyrA 的改变最常见，其次是gyrB。对喹诺酮类药物耐药的革兰阳性菌，拓扑异构酶Ⅳ的改变是主 要的，且parC的改变比parE更常见[4]。研究发现，革兰阴性菌对喹诺酮类药物耐药主要是由于gyrA和parC变异所致，其中变异位点最常见于gyrA的丝氨酸Ser83和天冬氨酸Asp87以 及parC的丝氨酸Ser80和谷氨酸Glu84，其它位点的变异频率较低[5, 6]。 2）耐药性质粒。 不同研究人员先后在世界各地不同种属的细菌中发现了耐喹诺酮类药物质粒。该质粒可在不同菌属间广泛传播，从而引起了人们的高度重视。其中，整合子介导的多重耐药机制因可引起耐药基因高效、快速转移而备受重视。质粒作为一种可移动基因元件，通过整合酶的作用捕获外来的耐药基因(包括对氨基糖苷类、喹喏酮类、磺胺类和消毒剂等药物耐药的基因)。整合子-基因盒系统是新的可移动基因元件，能捕获和整合细菌的耐药基因，是细菌多重耐药形成和传播的主要内在机制[7~9]。杜艳等[10]研究认为，克雷伯菌的多重耐药与I类整合子密切相关。I类整合子广泛存在于产ESBLs肺炎克雷伯菌中，携带I类整合子的细菌更易表现出对氨基糖苷类、喹诺酮类及头孢菌素类药物的耐药性，说明整合子对细菌耐药性的传播确实有一定作用。因此，整合子系统介导的细菌耐药机制越来越引起研究者们的关注，尤其是对多重耐药细菌的研究意义更大。
金黄色葡萄球菌是人类化脓感染中最常见的病原菌
金黄色葡萄球菌是人类化脓感染中最常见的病原菌，可引起局部化脓感染，也可引起肺炎、伪膜性肠炎、心包炎等，甚至败血症、脓毒症等全身感染。它在自然界中无处不在，空气、水、灰尘及人和动物的排泄物中都可找到。因此，它很容易就能够污染一些食物来源，从而引发疾病。特别是金黄色葡萄球菌肠毒素，它是个世界性卫生难题，在美国由金黄色葡萄球菌肠毒素引起的食物中毒，占整个细菌性食物中毒的33%，加拿大则更多，占到45%，中国金黄色葡萄球菌引起的食物中毒事件也时有发生。误食金葡菌污染的食品,可引起呕吐和腹泻等症状。因此，在本篇文献中，我们选取了关于金黄色葡萄球菌肠毒素的一部分内容进行了较为细致的思考。 文中提到，肠毒素能够引起人和哺乳动物肠胃道毒性反应。但是，金葡菌肠毒素同时也是一种典型的超级抗原。在免疫反应中，只需极微量，就能通过一种独特的机制，使之产生大量细胞因子和细胞毒性物质。从而抑制异常分裂的癌症细胞生长而可能起到治疗癌症的效果。 那么，肠毒素治疗肿瘤的机制是什么呢？ 首先，肠毒素是一种超级抗原。超抗原是一类只需极低浓度就能激活大量T细胞克隆或B细胞克隆、产生极强免疫效应的物质。它远超普通抗原的多克隆激活能力，可视其为具非特异性免疫原性但无免疫反应性的抗原。它在体内能够活化CD4 + T细胞，这种细胞能分泌多种细胞因子。它们不仅能够直接或间接地杀伤肿瘤细胞，而且可以增加肿瘤细胞表达MHC 抗原分子，增强肿瘤细胞刺激宿主免疫系统的能力; 另一方面，这些细胞因子又刺激T细胞进一步增殖分化，而增殖分化的T细胞又将产生更多的细胞因子与细胞毒作用，共同导致肿瘤细胞的破坏溶解，从而形成级联效应，达到对肿瘤的治疗作用。 除了对肿瘤的治疗作用，肠毒素在一定浓度和不同途径给予时，还具备着非特异性促进人和哺乳动物细胞的有丝分裂效果。特别是对损伤部位的组织有促进分裂和生长作用，能够致使损伤组织快速愈合。故有利于对损伤组织的治疗。但这种反应作用的机制我们小组尚且还无法解释，希望在之后的课程中能够有所启发。
实验七--食品中金黄色葡萄球菌的检验
实验七食品中金黄色葡萄球菌的检验 一、实验目的要求 1、了解食品的质量与金黄色葡萄球菌检验的意义。 2、掌握金黄色葡萄球菌的生物学特性。 3、掌握金黄色葡萄球菌检验的生化试验的操作方法和结果的判断。 4、掌握食品中金黄色葡萄球菌检验的方法和技术。 二、原理 葡萄球菌在自然界分布极广，空气、土壤、水、饲料、食品(剩饭、糕点、牛奶、肉品等)以及人和动物的体表粘膜等处均有存在，大部分是不致病，也有一些致病的球菌。金黄色葡萄球菌是葡萄球菌属一个种。可引起皮肤组织炎症，还能产生肠毒素。如果在食品中大量生长繁殖，产生毒素，人误食了含有毒素的食品，就会发生食物中毒，故食品中存在金黄色葡萄球菌对人的健康是一种潜在危险，检查食品中金黄色葡萄球菌及数量具有实际意义。 金黄色葡萄球菌能产生凝固酶，使血浆凝固，多数致病菌株能产生溶血毒素，使血琼脂平板菌落周围出现溶血环，在试管中出现溶血反应。这些是鉴定致病性金黄色葡萄球菌的重要指标。 三、试剂和仪器 （一）最先准备的器材 规格名称数量用途 1、500ml广口瓶1个稀释样品 2、500ml三角瓶1个制生理盐水 3、250ml三角瓶3个制培养基等 4、10×100mm试管6支血浆凝固酶试验 5、1ml移液管2支 6、10ml移液管 2 支 7、直径为90 mm平皿12套制血平板B-P平板 8、250ml量筒1支 （二）应灭菌的其它器材 剪刀1把不锈钢汤匙1把称量纸适量 （三）应制备的培养基 培养基总量所用容器 1.无菌水50ml/瓶1瓶250ml三角瓶（全班共用） 2.0.85%生理盐水70ml/瓶1瓶250ml三角瓶（全班共用） 3.0.85%生理盐225ml/瓶1瓶500ml三角瓶 4.7.5%NaCl肉汤50ml/瓶1瓶250ml三角瓶
喹诺酮类抗菌药物耐药机制
喹诺酮类抗菌药物的分类、药效和临床应用 1喹诺酮类抗菌药物的临床分类 1．1第一代喹诺酮类 1．1．1第一代喹诺酮类的抗菌特点：第一代喹诺酮类药物奈啶酸、吡咯酸等，因其抗菌谱窄，仅对大肠杆菌、变形杆菌属、沙门菌属、志贺菌属的部分菌株具有抗菌作用，且作用弱，对敏感菌株的MIC90也多在4mgL-1以上；对绿脓杆菌、不动杆菌属、葡萄球菌属等均无抗菌作用。 1．1．2第一代喹诺酮类的常见品种及临床应用：第一代喹诺酮类常见品种有奈啶酸、噁喹酸及吡咯酸等，主要用于敏感细菌所致的尿路感染。目前此类药物已被抗菌作用强、毒性低的其他抗菌药物所替代。 1．2第二代喹诺酮类 1．2．1第二代喹诺酮类的抗菌特点：第二代喹诺酮类较第一代喹诺酮类抗菌活性强，对革兰阴性杆菌作用包括了部分绿脓杆菌，可达到有效尿药浓度，临床应用不良反应明显较第一代喹诺酮类少见。 1．2．2第二代喹诺酮类的常见品种及临床应用：第二代喹诺酮类有新噁酸、噻喹酸、噁噻喹酸、吡喹酸、吡哌酸等。临床上主要用于肾盂肾炎、尿路感染及肠道感染的治疗。 1．2．3典型药物实例：吡哌酸（吡卜酸，Pipemidic Acid,Dolcol,Pipram,PPA）抗菌谱较广，对革兰阴性杆菌如大肠杆菌、绿脓杆菌、变形杆菌、痢疾杆菌等有较好的抗菌作用，对绿脓杆菌、变形杆菌的抗菌作用比对奈啶酸、头孢氨苄及羧苄西林强；作用机制是抑制细胞DNA的复制和转录。吡哌酸一般采用口服给药，口服后部分吸收，成人单次口服0.5g和 1.0g后，血药峰浓度为 3.8mgL-1和5.4mgL-1,半衰期为3.1h；本品吸收后可分布于肾、肝等组织，胆汁中药物浓度高于血浆浓度；本品主要经肾排泄，给药后24h58％～68%的药物从尿液中排出，部分自粪便排出。吡哌酸在临床主要用于尿路感染和肠道感染的治疗，本品与庆大霉素、卡那霉素、多黏菌素、青霉素等抗生素联用有协同作用，对绿脓杆菌、大肠杆菌、变形杆菌的作用增强。 1．3第三代喹诺酮类 第三代喹诺酮类是20世纪70年代后期以后开发上市的药物，为一系列新型氟取代的4-氟喹诺酮类结构类似物。第三代喹诺酮类药物的分子中均有氟原子，因此称为氟喹诺酮类。在化学结构上，基本母环的3位有一个羧基，6位通常由氟取代，多数7位有一个哌嗪环。 1．3．1第三代喹诺酮类的抗菌特点：第三代喹诺酮类药物抗菌谱较第一，第二代药物有很大拓宽，抗菌作用显著增强，对肺炎克雷伯菌、产气杆菌、阴沟杆菌、变形杆菌属、沙门菌属、志贺菌属、枸橼酸杆菌属和沙雷菌属等肠杆菌科细菌有强大抗菌作用，MIC90为0.03~2mgL-1。流感杆菌也对此类药物高度敏感，MIC90多低于0.06mgL-1。对不动杆菌属和绿脓杆菌等假单胞菌的抗菌作用较对肠杆菌科细菌为差，但仍优于吡哌酸，MIC90多在0.5mg~8mgL-1之间。氟喹诺酮类对革兰阳性球菌亦有抗菌作用，但其抗菌活性明显较对肠杆菌科细菌为差。在几种氟喹诺酮类药物中仍以左旋氧氟沙星抗菌活性相对较强，环丙沙星和氧氟沙星相似或稍弱，其他几种氟喹诺酮类药物均弱于上述3个品种。本类药物对某些厌氧菌、支原体也有效，且不易产生耐药性，口服吸收完全，不良反映轻微。1．3．2第三代喹诺酮类常见药物：诺氟沙星、培氟沙星（Pefloxacin，甲氟哌酸）、依诺沙星（Enoxacin,氟啶酸）、氧氟沙星（ofloxacin，氟嗪酸）、环丙沙星
金黄色葡萄球菌危害程度评估报告
金黄色葡萄球菌的危害程度评估报告 一、生物学特性 金黄色葡萄球菌是人类的一种重要病原菌，隶属于葡萄球菌属，可引起多种严重感染。金黄色葡萄球菌为球型，直径0.8μm左右，显微镜下排列成葡萄串状。金黄色葡萄球菌无芽胞、鞭毛，大多数无荚膜，革兰氏染色阳性。金黄色葡萄球菌营养要求不高，在普通培养基上生长良好，需氧或兼性厌氧，最适生长温度37°C，最适生长pH 7.4。平板上菌落厚、有光泽、圆形凸起，直径1-2mm。血平板菌落周围形成透明的溶血环。金黄色葡萄球菌有高度的耐盐性，可在10-15%NaCl肉汤中生长。可分解葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖，产酸不产气。甲基红反应阳性，VP反应弱阳性。许多菌株可分解精氨酸，水解尿素，还原硝酸盐，液化明胶。 二、危害程度分类 根据中华人民共和国卫生部制定《人间传染的病原微生物名录》该菌危害程度为第三类。 三、致病性和感染剂量 金黄色葡萄球菌是人类化脓感染中最常见的病原菌，可引起局部化脓感染，也可引起肺炎、伪膜性肠炎、心包炎等，甚至败血症、脓毒症等全身感染。金黄色葡萄球菌的致病力强弱主要取决于其产生的毒素和侵袭性酶，有报道目前出现越来越多的耐药菌株，MRSA即耐甲氧西林金黄色葡萄球，菌致病性也随着变强。 四、暴露的潜在后果 暴露后可能引起感染，菌量大时可使实验人员出现皮肤软组织感染、全身性感染、呼吸道感染、中毒、肠炎等。被感染后，成为传染源，可能对周围及环境造成污染，应及时得到治疗和控制。 五、感染途径 通过污染食品和水源经口传播，也可通过呼吸道和接触传播。 六、微生物在环境中的稳定性 葡萄球菌是无芽胞菌中抵抗力最强者，而干燥可达数月，加热80℃30min才被杀死。5％石炭酸，0.1％升汞10～15min死亡。1:100000～1:200000龙胆紫溶液能抑制其生长。对磺胺增效剂、青霉素、红霉素等较敏感，但耐药株逐年增多，MRSA即为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。 七、浓度和浓缩标本的容量
金黄色葡萄球菌及其检验
我们以SN标准中的最近似值(MPN)测定法来进行讲解： 这种方法适用于检测认为带有大量竞争菌的食品及其原料和未经处理的食品中的少量金黄色葡萄球菌。 1、样品制备： 固体或半固体食品: 以无菌操作称取25g样品,放入装有225mL灭菌生理盐水的灭菌均质杯内,于8000r/min均质1～2min,制成1:10样品匀液。 液体食品: 用灭菌吸管吸取25mL样品,放入装有225mL灭菌生理盐水的灭菌玻璃瓶内 (瓶内预置适当数量的玻璃珠),经充分振摇制成1:10样品匀液。 供计数检验时,可按十进位递增稀释法将样品匀液再进行适当稀释。 2、选三个连续稀释度，从每个稀释度分别取1 mL稀释样品液，接种3管含10％氯化钠why?还记得么？金黄色葡萄球菌有高度的耐盐性，可在10-15%NaCl肉汤中生长。因此，这事实上是一种选择性的增菌。胰蛋白胨大豆肉汤。样品的最高稀释度必须达到能获得阴性终点,置36±1℃培养48 h。 3、用3 mm接种环,从有细菌生长的各管中移取1 环,划线接种于表面干燥的Baird- Parker琼脂平板,置36±1℃培养45～48h。 4、从有细菌生长的每一平板上至少挑取1个可疑金黄色葡萄球菌菌落,移种到肉汤培养基中,置36±1℃培养20～24 h。 5、取肉汤培养物0.3mL同0.5mL凝固酶试验兔血浆于8mm×100mm试管内充分混合,置36±1℃培养,定时观察是否有凝块形成,至少观察6 h,以内容物完全凝固,使试管倒置或倾斜时不流动者为阳性。试验中需同时做巳知阳性和阴性对照。对可疑结果,应进行革兰氏染色、镜检和其他辅助试验{如耐热核酸酶试验等} 加以证实。 6、报告结果：根据凝固酶试验结果查最近似值(MPN)表,报告金黄色葡萄球菌的MPN/g (mL)。 附：怎样在平板上进行细菌的划线分离。 1.斜线法 2.曲线法 3.方格法 4.放射法 5.四格法
实验5 金黄色葡萄球菌的检验
实验5 金黄色葡萄球菌的检验 1 目的和要求 （1）掌握金黄色葡萄球菌的检验方法 （2）了解金黄色葡萄球菌各检验步骤的依据及原理 2 基本原理 金黄色葡萄球菌进入人体内，可引起局部的痈疾和蜂窝组织炎，还可以引起肺炎、心肌炎、骨骼炎、肾盂肾炎等系统化脓性感染，甚至可发展成败血症。此外，食品中生长金黄色葡萄球菌是食品卫生中的一种潜在危险，因为金黄色葡萄球菌在是中会产生肠毒素，食用后将引起食物中毒，这在我国细菌性食物中毒事件中，仅次于沙门氏菌和副溶血弧菌。因此，检验食品中金黄色葡萄球菌是实际意义。绝大多数金黄色葡萄球菌在血琼脂平板上产生金黄色色素，菌落周围有透明的溶血圈，在厌氧条件下能分解甘露醇产酸，产生血浆凝固酶和耐热的DNA酶。 3 实验材料 3.1 检样乳与乳制品（如奶粉、消毒乳）、肉制品、饮料 3.2 菌种金黄色葡萄球菌、藤黄八叠球菌斜面培养物。 3.3 培养基7.5%氯化钠肉汤、肉浸液肉汤、血琼脂平板、Baird-Parker氏培养基 3.4 试剂与染色剂无菌生理盐水、兔血浆、革兰氏染色液等。 3.5 仪器与其他用具无菌吸管（1mL、5、10）、无菌试管、载玻片、接种环、酒精灯、显微镜、均质器、恒温箱等。 4 检样程序 5 操作步骤 5.1 5.1.1样品的处理
称取25 g 样品至盛有225 mL 7.5 %氯化钠肉汤或10 %氯化钠胰酪胨大豆肉汤的无菌均质杯内，8000 r/min～10000 r/min 均质 1 min～2 min，或放入盛有225 mL 7.5 %氯化钠肉汤或10 %氯化钠胰酪胨大豆肉汤的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1 min～2 min。若样品为液态，吸取25 mL 样品至盛有225 mL 7.5 %氯化钠肉汤或10 %氯化钠胰酪胨大豆肉汤的无菌锥形瓶(瓶内可预臵适当数量的无菌玻璃珠)中，振荡混匀。 5.1.2 增菌和分离培养 5.1.2.1 将上述样品匀液于36 ℃±1 ℃培养18 h～24 h。金黄色葡萄球菌在7.5%氯化钠肉汤中呈混浊生长，污染严重时在10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤内呈混浊生长。 5.1.2.2 将上述培养物，分别划线接种到Baird-Parker 平板和血平板，血平板36 ℃±1 ℃培养18 h～24 h。Baird-Parker 平板36 ℃±1 ℃培养18 h～24 h 或45 h～48 h。 5.1.2.3 金黄色葡萄球菌在Baird-Parker 平板上，菌落直径为2 mm～3 mm，颜色呈灰色到黑色，边缘为淡色，周围为一混浊带，在其外层有一透明圈。用接种针接触菌落有似奶油至树胶样的硬度，偶然会遇到非脂肪溶解的类似菌落；但无混浊带及透明圈。长期保存的冷冻或干燥食品中所分离的菌落比典型菌落所产生的黑色较淡些，外观可能粗糙并干燥。在血平板上，形成菌落较大，圆形、光滑凸起、湿润、金黄色（有时为白色），菌落周围可见完全透明溶血圈。挑取上述菌落进行革兰氏染色镜检及血浆凝固酶试验。 5.1.3 鉴定 5.1.3.1 染色镜检：金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性球菌，排列呈葡萄球状，无芽胞，无荚膜，直径约为0.5 μm～1 μm。 5.1.3.2 血浆凝固酶试验：挑取、Baird-Parker平板或血平板上可疑菌落1个或以上，分别接种到5 mL BHI和营养琼脂小斜面，36 ℃±1℃培养18 h～24 h。 取新鲜配臵兔血浆0.5 mL，放入小试管中，再加入BHI 培养物0.2 mL～0.3 mL，振荡摇匀，臵36℃±1℃温箱或水浴箱内，每半小时观察一次，观察 6 h，如呈现凝固（即将试管倾斜或倒臵时，呈现凝块）或凝固体积大于原体积的一半，被判定为阳性结果。同时以血浆凝固酶试验阳性和阴性葡萄球菌菌株的肉汤培养物作为对照。也可用商品化的试剂，按说明书操作，进行血浆凝固酶试验。 结果如可疑，挑取营养琼脂小斜面的菌落到 5 mL BHI，36 ℃±1℃培养18 h～48 h，重复试验。 病原性葡萄球菌多数产生血浆凝固酶，非病原性的一般不产生。因此，该法是判定葡萄球菌有无致病性的重要指标。 5.2 金黄色葡萄球菌Baird-Parker平板计数 5.2.1 样品的稀释 5.2.1.1固体和半固体样品：称取25 g样品臵盛有225 mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，8000r/min～10000 r/min均质1 min～2 min，或臵盛有225 mL稀释液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min～2 min，制成1:10的样品匀液。 5.2.1.2 液体样品：以无菌吸管吸取25 mL样品臵盛有225 mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶(瓶内预臵适当数量的无菌玻璃珠)中，充分混匀，制成1:10的样品匀液。 5.2.1.3 用1 mL 无菌吸管或微量移液器吸取1:10 样品匀液1 mL，沿管壁缓慢注于盛有9 mL 稀释液的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用 1 支1 mL 无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1:100 的样品匀液。 5.2.1.4 按5.2.1.3 操作程序，制备10 倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用1 次1 mL 无菌吸管或吸头。 5.2.2 样品的接种
金黄色葡萄球菌的耐药性研究
金黄色葡萄球菌的耐药性研究 一、金黄色葡萄球菌的分离及培养 称取10g土样，在无菌条件下，放入无菌的三角瓶中，加入90ml的蒸馏水，再加入0.2mg复方磺胺甲恶唑振荡10min，使土样充分混合，利用金黄色葡萄球菌对磺胺类药物敏感性低的特性，杀死其他细菌。从三角瓶中取1ml上清液放入一支无菌试管（15*150mm）中按10倍梯度稀释成10-5的土壤稀释液后，分别取200μL涂布于牛肉膏蛋白胨培养基上，置于37℃培养箱中恒温培养24h。利用高盐培养基抑制其它细菌的生长，从而分离得到金黄色葡萄球菌。 二、金黄色葡萄球菌的鉴定 1.菌落形态：菌落较小，圆形，直径1-2mm，较湿，较透明，边缘整齐，隆起，略带淡绿色。 2.染色观察：从平板上挑取可疑性菌落进行革兰氏染色，金黄色葡萄球菌为革兰氏阴性菌，显微镜下呈单个或葡萄状排列，无芽孢、荚膜，单个菌体直径为0.5-1μm。 革兰氏染色： 1.涂片：取灭过菌的载玻片于实验台上，用移液枪吸取10μL待检样品滴在载玻片的中央，用烧红冷却后的接种环将液滴涂步成一均匀的薄层，涂布面不宜过大。 2.干燥：将标本面向上，手持载玻片一端的两侧，小心地在酒精灯上高处微微加热，使水分蒸发，但切勿紧靠火焰或加热时间过长，以防标本烧枯而变形。 3.固定：固定常常利用高温，手持载玻片的一端，标本向上，在酒精灯火焰处尽快的来回通过2-3次，共约2-3秒钟，并不时以载玻片背面加热触及皮肤，不觉得烫为宜（不超过60℃），放置待冷后，进行染色。 4.初染：在涂片薄膜上滴加草酸铵结晶紫1-2滴，使染色液覆盖涂片，染色约为1min。
5.水洗：斜置载玻片，在自来水龙头下用小股水流冲洗，直至洗下的水呈无色为止。 6.媒染：用100-1000μL移液枪吸取300μL碘液滴在涂片薄膜上，使染色液覆盖涂片，染色约1min。 7.水洗：重复步骤5。 8.脱色：斜置载玻片，滴加95％的乙醇脱色，至流出的乙醇不显紫色为止，大约需时20-30s，随即水洗。 9.复染：在涂片薄膜上滴加沙黄染液1-2滴，使染色液覆盖涂片，染色约1min。 10.水洗：重复步骤5。 11.干燥、观察：用吸水纸吸掉水分，待标本片干后置显微镜下，用低倍镜观察，发现目的物后，滴一滴浸油在玻片上，用油镜观察细菌的形态及颜色，紫色为革兰氏阳性菌，红色为革兰氏阴性菌。 三、实验中所需培养基配方及制法 （1）科玛嘉金葡萄球菌显色培养基：琼脂15.0g/L 蛋白胨及盐分65g/L 色素2.5g/L PH 6.9+0.2 金黄色葡萄球菌在科玛嘉黄色葡萄球菌显色培养基上，菌落颜色为紫红色、粉色或粉红色。 （2）广东环凯显色培养基：蛋白胨大豆胨和酵母粉氯化钠琼脂显色剂 金黄色葡萄球菌在广东环凯显色培养基上，菌落颜色为粉红——紫红色。 （3）13％NaCl牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏5g 蛋白胨10g 氯化钠130g 琼脂15g 水1000ml PH 7.4-7.6 （4）MH肉汤培养基：乳糖5g 胰蛋白胨20g SDS 0.5g 氯化钠5g 磷酸氢二钠（无水）5.74 磷酸二氢钾（无水）1g 微量元素溶液0.5mL 蒸馏水1000mL
金黄色葡萄球菌的概况
金黄色葡萄球菌的概况 摘要：本文旨在讲述金黄色葡萄球菌的目前现状，以及其主要检测方法，代谢物肠毒素检测方法，耐药检测和幼儿园发病原因，这些对金葡菌的检测、治疗和预防起到了很好的帮助。关键词：金黄色葡萄球菌；检测；肠毒素；耐药；发病 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，SA）是食品卫生标准中规定不得检出的常见食物中毒致病菌，是食品卫生微生物常规检测项目之一[1]。SA是葡萄球菌属，革兰染色阳性，呈葡萄状排列。当衰老、死亡、被吞噬后常转为阴性。无鞭毛、无芽胞、体外培养一般不形成荚膜。在浓汁及液体培养基中常单个、成对、或短链状排列。在普通培养基上即可生长，当加入血液或其他营养物质生长的更好。需氧或兼性厌氧。最适pH7.4，最适温度28-38℃，致病菌在37℃生长最好。某些菌株耐盐性特强，在100-150g/L氯化钠培养基中都能生长。在某些影响细胞壁形成物质的作用下可形成L型。触酶试验阳性。多数菌株分解葡萄糖、麦芽糖、蔗糖，产酸不产气，致病菌株可分解甘露醇。SA能产生大量核酸酶，该酶可耐受100℃30min不破坏，降解DNA和RNA的能力较强。此酶对检测葡萄球菌的致病性与血浆凝固酶具有同等价值。 由于致病金黄葡萄球菌能分泌肠毒素，因此一旦细菌污染食品，并在合适的温度环境下，细菌可以大量繁殖并产生肠毒素，从而引起消费者食物中毒[2]。金黄色葡萄球菌是一种能引起食物中毒的重要细菌。根据美国疾病控制中心的一些报告，由SA引起的食物中毒居第二位，仅次于大肠杆菌，在细菌性食物中毒中的比例为33％。加拿大的发生率更高，占细菌性食物中毒的45％[3]。中国每年发生SA中毒事件也屡见不鲜，因此造成每年的经济损失相当惨重，目前世界各国都把SA定为重要的食品卫生法定检测项目。在1960年，人们将一种半合成的青霉素-甲氧西林第一次应用于临床，而且仅仅一年之后，在英国就发现了首例耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（Methicillin-resistance Staphylococcus aureus,MRSA），再后来，在世界范围内MRSA便以惊人的速度蔓延开去，继而发展成为医院内最最常见的微生物病原菌，与乙型肝炎、艾滋病同为当今世界三大感染顽疾[4]。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌是医院内重要感染的致病菌，其发病率和病死率在世界各地均很高，美国疾病控制中心在2003年做了大量工作，根据统计了解，每年因为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染，大约有数十万人住院接受治疗，在医院内由SA引起耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染，其分离程度已经高达80%以上，而且呈向社区扩散的趋势[5]。1996年，日本报告了第一例对万古霉素敏感性下降的金葡菌[6] ，人们把万古霉素认为是治疗SA的最后防线，最为经济有效的药物，不过在20世纪90年代后期又出现了耐万古霉素的SA，开始表现为万古霉素中介金黄色葡萄球菌（vancomycin intermediate-susceptible staphylococcus aureus ，VISA），美国、英国、德国、意大利、韩国等相继报道检出了VISA[7]，；1997年美国分离了2例VISA[8]同期，在欧洲与亚洲多个国家均有类似报到[9]。 国内外对SA的检测方法，主要有传统分离培养及生化鉴定、显色培养基鉴定、酶联免疫(ELISA)、PCR、美国3M公司的petrifilm培养片等方法。现行国标检测食品中的SA主要是采用传统的分离培养之后进行生化鉴定，整个检测过程获得最终结果需时5天左右。而且免疫学的ELISA法所用的抗体基本上全部依赖国外进口，试剂也相对昂贵；但传统的PCR法却需要提取DNA，加大了人力、物力的消耗，成本提高。对于SA的检测，很多研究者都来检测致使其食物中毒的肠毒素基因[10]，尤其是用于食物中毒事故的调查，所以对于研发一种快速、便捷的检测方法是目前食品安全检测的当务之急。 SA的常规检验检验程序：检样处理→增菌→分离→分纯→溶血试验→革兰染色镜检→血浆凝固酶试验→肠毒素检验[11]。常规检验具有操作简便，所需设备简单，成本相对较低的优点，但其操作繁琐，检测时间较长，且灵敏度较低[12]。