细胞培养经验谈

细胞培养经验谈

1.如果财力允许，培养基一定要买已经配好的，因为pH值对细胞影响很大，并且很多时候对于新手来说，即使细胞培养失败你是找不出合理的理由的。所以尽最大可能减少不稳定因素的影响！

2.我通过实践证明培养基最好是DMEM与1640混合再一起使用，比例大概就是1：1,这样你会发现即使培养多种细胞你只需这一种培养基就可以完全应付了！

3.我总体认为培养基最好不要加抗生素，首先它对细胞有影响，其次很容易失效。其实我们细胞室相当简陋，并且应用的人还是很多的。

4.灭过菌的东西最好是一周内使用，超过时限就需要再一次灭菌！！！

5.对待细胞的态度一定好，这样它才会好好对你。

6.还是关于培养基，如果不是买液体的，那么其pH问题一定要给予充分重视！！！配置过程中的调节我就不说了，能用pH计最好！

3票

1原代培养可以用下带双抗的培养基，但是后期就不要用了，因为污染了，整瓶的抗生素可能也纠正不过来，对细胞毒性比较大。

2原代培养可以考虑消化法和组织块法同步进行。如养神经胶质细胞，或神经元细胞，消化时间过长，细胞就会伤心而去，简单消化种植，剩余组织块采用组织块法贴壁效果更好，而且更纯。

3换液不要过频，但是也不要过少，要看细胞的状态、种类和增殖速度。

4消化传代时候，吹打细胞最好用大口径的吸管或者一次性耗材末端可以剪去一个小口子，这样吹打起泡沫最少，对细胞损伤最小。否则细胞损失太大。

5培养基ph一定要取少量检测，如同上面大哥所说，ph对细胞影响太大。

6养比较难养的细胞，如果神经元细胞等，不能偷工减料，必须用好培养基和及其特殊培养基，否则效果真的很差。

1.培养基用的最多应该是DMEM，或者1640吧。其实不管哪种培养基，里面都有指示剂的。就是说能从培养基的颜色，大概判断出培养基pH的变化。比如说放久的DMEM，颜色已经成了紫红色，而你的细胞是要偏酸性的，那就考虑换瓶培养基吧，或者再调一下pH。给你的细胞一个适合的pH生长环境。

2.消化传代时候，手法一定要轻柔，不要在瓶底吹出大片的泡泡，那对细胞的生长不好。再就是选择胰酶，根据细胞的特性，看是否需要在里面加EDTA。另外个人认为，加了胰酶消化时候，最好在细胞表面润了一层后，快速把多余的胰酶吸出来，然后在培养箱里面消化一下，时间识细胞的特性而定。37度是酶活性最强的时候，减少消化时间，对细胞也是一种保护。

3.出了消化传代，有时候我们还要给细胞换液。如果细胞的生长密度不够，但是培养基已经偏淡，担心营养不够时候，可以给细胞“半量换液”，即弃掉一半旧的培养基，再加一半新的

进去。这样做的原因，一方面是给细胞适应的缓冲环境；另一方面就是细胞生长过程中可能会分泌某些生长因子，促进生长。我们的经验是，半量换液明显优于全部换成新的液体。4.细胞培养室的污染一直是洪水猛兽，所以实验前后的杀菌消毒很重要，另外要注意操作过程中的规范，减少中间环节的文艺。个人认为抗生素的作用不大，还影响细胞的生长，我们那时候原代培养的细胞都没有在培养基里面加抗生素，养的也很好。

5.每天观察细胞状态的时候，留意看一下培养箱里的所有的培养基的颜色，就是我们在第1条里说到的培养基的颜色会指示大概的pH范围。因为我们那时候就因为培养箱出了问题，CO2的通入不够，大家养的细胞大都奄奄一息的。从出现状况到最后问题的解决真是花了一段时间，因为刚开始都是往培养液及自身找问题，而忽视了培养箱的麻烦。

1 培养箱：培养箱其实很重要，我以前用过国产的培养箱，参数控制不佳，里面的平板也不平，细胞生长不均并且很容易死掉，但是优点就是便宜，如果养要求不高的肿瘤细胞也可参考，现在我们用的进口培养箱，细胞生长的很壮。另外重要的是，培养箱里一定要一直保持有水存在，一方面可调节PH,另一方面控制二氧化碳浓度，对细胞生长很有好处，我现在用的培养箱一缺水，二氧化碳浓度就不准，细胞状态就不好。

2 不要频繁开培养箱的门。细胞在稳定的环境内才能生长良好，所以尽量不要频繁开门，我知道有的实验室学生很多，所以开门次数也多，这样对细胞生长也会有影响，所以尽量避免。

3 细胞传代。我在培养细胞时发现有的细胞传代几次后就很难消化下来了，这是由于贴壁紧密的、没被消化下来的细胞经过几次传代逐渐被养起来，所以建议传代时尽量换新培养瓶，培养消化下来的细胞。

4 培养液的选择。尽量选择指定培养液养细胞，不同的培养液营养成分略有差别，对细胞生长，分化也有影响，如果指定培养液养不活时，细胞最好扔掉，因为它可能已经衰老，不能有效传代，若换另一种培养液可能细胞性质有所改变

5 细胞刚复苏或外地送来的细胞，要培养1－2天再换液或观察，使细胞适应新的环境，并且用原来实验室的培养液养到增值后再换自己的培养液

先说到这里，希望对大家有帮助

1.配好的培养基放-20度保存，冻融使用时会有白色沉淀，在显微镜下是黑色点点。

培养细胞的一点体会：

1.1640培养液

我一直用GIBCOL 1640培养基，粉剂，自己配制。PH值不用测，也不用调。-20℃存放，复融后会有少量沉淀产生，对细胞生长有不利影响。2～8℃存放3个月内使用没有问题。有人建议存放久了补加谷氨酰胺，我的习惯是在配制1640的时候就加进去。

2.胰酶消化

配制好的胰酶-20℃存放，提前1天2～8℃融化并在此温度存放。临用前室温放置30～60分钟。加入细胞后37℃消化3～5分钟，目测或镜下观察，待消化好以后，倒掉胰酶，加入培养液传代。有的细胞可以不用倒掉胰酶，对于此类细胞，消化时轻拍细胞瓶，待细胞全部从瓶底脱落后补加培养液再传代。

3.冻存与复苏

细胞冻存管规格为2ml，加入细胞时体积应在1.8ml左右，太少液氮容易进入冻存管，导致细胞死亡。复苏时水温37～40℃，离心去除DMSO,有的细胞可以不离心，直接转入细胞瓶中培养。

4.细胞污染

细胞培养最怕污染，要控制细菌、霉菌污染，必须对细胞培养的每一个环节都认真对待。对于细菌污染，常用的抗生素有庆大霉素、阿米卡星等，

霉菌污染，则可用制霉菌素。如果是杂交瘤细胞则可接种小鼠来净化细胞。

不知其中的原因，建议大家以后配好的培养基（我们买很好的培养基也出现这

种状况）尤其是DMEM，置4度保存就可以了。一般放一两个月没问题。如果担

心培养基状况不好可以课题组内合用，既保证质量又避免不必要的损失。

2. 对于难以消化打散的细胞，个人认为用加有EDTA的胰酶消化最好。因为EDTA有

助细胞分离。而且此种细胞最好是一天换一次液三四天传一次代，即使没长满也

得传代了，因为太久不利于细胞消化吹散。

3. 培养细胞的用具我一般是两个星期灭一次菌，pbs是灭一点用一点，一般是一个

星期灭一次。高压灭菌的培养瓶不建议用棉球塞口，因为会是细小的棉絮调入瓶

内。一般直接用两层牛皮纸包装扎好高压就可以了。

4. 酒精灯芯烧过后的碎屑要避免使其飞入瓶内。

5 每天观察细胞生长状况，并记录细胞生长状况，观察时载物台桌面等凡是培养瓶

触及的地方都用酒精棉球擦一次，防止污染。

6关于冻存细胞的一些题外话，我一般短时间内要用的细胞都只放在-80度冰箱，长期

保存的细胞株才放液氮。但是为了避免一些不必要的损失，建议大家做两手准备，

两边都存放一点，如果液氮出事了，冰箱里面的可以用来复苏传代，如果冰箱出事了

液氮里面还有，省去再一次搜罗细胞的麻烦。

7 发现问题一定要及时查找原因，及时解决。可以通过图书馆、网络论坛、电话等方式

寻找解决的方法。

2、细胞的传代

(1) 细胞丰度达到80 ~ 90 %时，去除所有培养基。

(2) 用5 ml无钙、镁PBS洗3次，去除多余的培养基和血清(血清中含胰酶的抑制剂)。

(3) 加2 ml Trypsin（EDTA）溶液，37℃作用5 ~ 19 min直至细胞悬起（用显微镜观察确定大多数细胞已变圆）。

(4) 弃胰酶，加5 ml 完全培养基终止胰酶作用，用吸管快速吹打几次，使溶液中的细胞团散开。

(5) 如要继续培养，将2 ml上述的细胞悬液转移至一个新的T-75培养瓶中，并加8 ml新鲜的完全培养基(如希望细胞快速生长，可提高细胞浓度)。

将细胞瓶在37℃、5％ CO2恒温饱和湿度细胞培养箱内培养。

(7) 重复(1) ~ 可持续培养或扩增细胞。

3、细胞的冻存

(1) 冻存细胞前步骤同细胞传代（1）~（4）。

(2) 4℃，250g 离心5 min，小心吸去上清。

(3) 冻存液的组成：DMEM 营养液中加入10％的DMSO和20％的FBS，现配现用。

(4) 用预冷的冻存培养基调整细胞浓度为3×106/ml，并悬浮细胞。

(5) 将细胞悬液按1ml/管，分装到冻存管中，-20℃，2 h。

转入-80℃，过夜，然后转入液氮中长期保存。

4、细胞计数

(1) 用0.25% 胰蛋白酶-EDTA消化细胞，待细胞变圆，用吸管吸取培养基吹打细胞，制成单个细胞悬液。

(2) 将细胞悬液用培养基作适当稀释，然后用吸管吸取少许混合均匀的细胞悬液，滴加于计数板上盖玻片一端，让液体自动进入盖玻片下方的计数室内。

(3) 滴加细胞悬液后约静置1分钟，在显微镜下计数四角大方格内的细胞数。压线细胞只计左侧和上方的，然后按下式计算：细胞数/ml ＝4个大格细胞总数/ 4 × 10000。

刚刚开始养细胞，前段时间同时养了四种细胞，真是忙得焦头烂额，现在总算有点头绪了，小小的总结一下：

1 消化细胞的时候，一定要格外留意细胞的状态变化。当在显微镜下观察到细胞圆缩，细胞间隙变大；晃动细胞瓶的时候，好像有部分细胞要被胰酶冲刷下来，这个时候就要倒掉胰酶，加入新鲜的培养基，将细胞从瓶壁上吹下来。消化时间，最好不要太长，太长时间会造成细胞出现沙粒样物质，形态也没有原来正常了。消化时间太短，就需要花更多的时间将细胞从瓶壁上吹下来，十来分钟都是常有的事啊！很麻烦~所以，消化时间的控制非常重要。

2 传代的时候细胞一定要吹散，然后将新传的细胞连带细胞瓶来回做上十次左右的“米”运动，这样细胞才能够长得均匀，一致。有些细胞如果不吹散、晃匀，就会成簇生长；后来再传代时，不好消化，不好吹散……恶性循环，细胞状态不好，试验结果就大受影响！

3 胰酶最好分到1.5mlEP管中，每管1ml。特别适合于实验室有很多人同时在养细胞的情况，这样可以避免交叉污染。分好的胰酶，-20度冻存，用之前放在37度培养箱中，解冻一段时间就可以了，很方便。

4 完全培养基最好少量配制，两星期内用完最好，因为完全培养基放久了，PH 值会发生改变，虽然可以添加谷氨酸之类的物质，把PH再调回来，但是细胞还是会没有原来养的好了~

5 装培养基的瓶子，瓶盖一定要拧紧，要不然PH很容易改变。

6 每次要使用培养基之前最好将培养基提前从4度中取出，让它在室温里平衡一段时间，这样比较好。

7 对于HepG2，MDCK这一类比较好养的细胞，最好还是按照ATCC推荐的MEM培养基来养，貌似用DMEM或者1640来养，细胞长得很快，形态变化得也很快，到了最后形态就和最开始养的HepG2、MDCK完全不一样了。会不会是传代快，变异

的也快？呵呵，瞎猜的~

8 每天都得要留心观察细胞生长情况，及早发现问题，及早处理，这非常重要。

我的细胞培养经历总结

1、培养无菌观念。包括试验前的试剂、器材、房间、操作台，试验过程中的无菌操作（含穿无菌衣、戴口罩和手套）和加适当的抗生素、试验后垃圾及时处理（避免污染后续试验）等，这一关是初学者必须过的。

2、避免细胞之间污染。尤其在做多个细胞株试验时，做到一种细胞、一种器材和试剂瓶等，防止细胞交叉污染。

3、选择正确的培养基。不同的细胞可能培养基不同，甚至不同的文献可能对相同的细胞培养基成分也是可能不同的。如我当时培养神经干细胞，有文献就选用neurobase培养基，而我的试验目的主要是做抗氧化和氧化方面的，而这种培养基中含有抗氧化剂成分，此时，我就不得不选择另外一种不含抗氧化剂的培养基。

4、做原代培养细胞提取要注意时间短、操作固定。这是我的教训的总结，短时间的操作，会保证大量存活的细胞；操作固定，主要为了重复试验和后续试验结果的一致。

5、做悬浮细胞组化时，要尽可能先解决玻片上的细胞数量。这一步很重要，必须有足够数量的细胞，才有可能得到更加具有代表性的试验结果。

6、做细胞相关实验时，切记要做复孔和不同处理之间交叉蛇形分布等。，以尽可能减少实验系统误差和提高实验准确性。

7、培养细胞一定要有责任心和耐心。有时尽管要3天后换液和加营养成分，但建议最好每天都要看看它，以防止出现培养箱缺水、缺二氧化碳、停电、温度不够等异常现象，也好及时解决这些意外，避免重复试验带来的更大痛苦。

我的细胞培养相关链接：

【资源】神经干细胞培养大全（2008年6月整理最新版）

https://www.wendangku.net/doc/f45852548.html,/bbs/post/view?bid=156&id=12158894&sty=3

【整理总结】细胞培养技术大全（方法、问题及注意事项）

https://www.wendangku.net/doc/f45852548.html,/bbs/post/view?bid=66&id=11949857&sty=2

【方法】nature protocol：小鼠神经干细胞培养方法Mouse neural stem cells culture procedure

https://www.wendangku.net/doc/f45852548.html,/bbs/post/view?bid=156&id=11916378&sty=3

【讨论】小鼠神经干细胞培养的注意事项

https://www.wendangku.net/doc/f45852548.html,/bbs/post/view?bid=156&id=11947583&sty=3

【交流】有关神经干细胞原代培养和传代方面的问题

https://www.wendangku.net/doc/f45852548.html,/bbs/post/view?bid=156&id=12144724&sty=3

【讨论】神经干细胞、神经元、神经胶质细胞计数方法探讨

https://www.wendangku.net/doc/f45852548.html,/bbs/post/view?bid=156&id=11652592&sty=3

【求助】神经干细胞原代培养问题请教：

https://www.wendangku.net/doc/f45852548.html,/bbs/post/view?bid=156&id=12287671&sty=1

【经验】从神经干细胞图片来看我的神经干细胞培养历程

https://www.wendangku.net/doc/f45852548.html,/bbs/post/view?bid=156&id=12347864&tpg=1&ppg=1&sty=1&age=0

欢迎大家指正，多多交流！

预防细胞污染要特别注意的几点：

1、从物品、用品消毒灭菌着手

细胞培养所用物品清洗、消毒要彻底，各种溶液灭菌除菌要仔细，并在无菌试验阴性后才能使用，并且需要尽快使用，特别注意容易染菌的液体如培养基，琼脂糖，血清等需要在低温保存，减少染菌的几率。操作室及剩余的无菌器材要定期清洁消毒灭菌。。

2、从操作者做起

（1）操作者责任心要强，要细心稳重，操作技术要熟练。在制定好实验步骤后，头脑清醒的进无菌室进行实验。备好一切所需要的试剂和培养瓶，防止在操作过程中来回跑动寻找，增加染菌的几率。在实验前要用肥皂洗手或用5%新洁尔灭浸泡5分钟，按规定穿隔离衣。进入后关好门，坐下来尽量少走动。工作开始要先用5%新洁尔灭擦手、擦带进的培养基瓶壁，和无菌操作台。严格遵守无菌操作规则。事先要严格检查器材、溶液和培养物，不要把污染品或未经消毒的物品带入无菌室内，更不能随便使用，以免造成大批污染。尽量减少在超净台中物品的放置，特别注意不能将物品放置在流通空气的虑孔上，以免降低整个超净台的工作效率。

（2）操作者动作要轻，必须在火焰周围无菌区内打开瓶口，并将瓶口转动烧灼，注意火苗要旺盛，如果酒精灯中的酒精用尽要及时补充。要尽量使用侵斜试剂瓶45°的管架，减少垂直放置培养瓶造成染菌的机会。操作时尽量不要谈话，若打喷嚏或咳嗽应转向背面。

（3）操作时要常更换吸管，切勿一根吸管做到底。一旦发现吸管口接触了手和其他污染物品应弃去。实验完毕及时收拾，保持实验室清洁整齐，最后用消毒水浸泡的纱布擦台面。（4）操作过程中头脑清醒，动作敏捷果断，打开的培养瓶和瓶口应远离操作者手势范围，避免影响垂直的空气流将操作者身上的病菌带到培养细胞中。废液钢尽量避免使用敞口的容器，倾倒时要抬高一点，防止在倾倒废液时溅起的液体污染瓶口。

（5）防止细胞交叉污染

在进行多种细胞培养操作时，所用器具要严格区分，最好做上标记便于辨别。并按顺序进行操作，避免一起进行时易发生混乱。在进行换液或传代操作时，注射器和滴管不要触及细胞培养瓶瓶口，以免把细胞带到培养液中污染其他细胞。所有细胞一旦购置，或从别处引入，或自己建立，均应及早留种冻存，一旦发生污染可弃之复苏，重新培养。

培养细胞有将近2年的时间了。同一种细胞用过两种方法培养。事实证明这两种方法用来培养绝大部分神经元细胞都是可行的。特别是非常难养的耳蜗听觉神经细胞。在养细胞过程中有以下几点需要注意（特指急性分离的神经元细胞）：

1、涂胶。如果是用dish培养，那么laminin是很好的选择。用去离子水将laminin配制成1 mg/mL浓度，分装，-20摄氏度冻存。如果用玻片养，那么可以选择多聚赖氨酸，或者多聚鸟氨酸+laminin。多聚赖氨酸一定要选择固体物质，自行用PBS配制成1 mg/mL浓度（因

为买直接配好的用的是一般的水配制，效果不好），每次稀释10倍运用。要特别注意的是，多聚赖氨酸对细胞是有毒的。进口玻片冲洗时可以冲洗干净，而国产玻片质量不好，需要提前一两天涂胶，并且冲洗2次左右。而多聚鸟氨酸无毒，但要加用laminin效果较好。

2、培养基。我用的培养基是自己配制的，配方也是比较传统的配方，包括神经生长因子，抗生素等等。用下来并没觉得有什么不好。但PH的问题确实要重视。刚开始配制时我用的装培养基的瓶子是普通的带黑色瓶塞的玻璃瓶。这种瓶子密封性不好，再加上多次开启瓶盖加液以及楼主说的烧瓶口的原因（我现在也不烧瓶口）。培养基非常容易变碱，这对细胞是一种刺激。

经过一段时间，我改变了方法。我将培养基分装在15毫升的离心管里，每管10ml左右的培液（根据个人每次养细胞所需培液量分装），用封口膜封好，冻到-4摄氏度冰箱里。每次用一只拿出来就行。这样就完全解决了培养基变碱的问题。

3、消化。消化对细胞是有一定影响的。特别是进口胰酶，要严格按照消化时间终止消化，或者提前1-2分钟终止。我曾经试过超过2分钟终止的。细胞已经死了很多，无论传代还是原代。

4、吹打。可以准备3个或2个口径由大到小的玻璃吹打管，吹打时一定要避免气泡产生。总之一句话，科研工作来不得一点马虎。不是凑合凑合就完事的。由于我做的是电生理方面。对细胞状态要求特别高，从中得到了一些启示。我们在养细胞不管用培液还是消化酶，都要认真计算，恰到好处。吹打时力度要适中。养细胞是一门有学问的技术，要不断的从失败中总结经验。这也是我们做好任何后续实验的基础，要认真对待。

细胞培养之个人浅谈：

1.二氧化碳培养箱：细胞培养条件很重要，要时刻关注二氧化碳培养箱的温度时候达到要求，温度探头测温是否准确，我曾经遇到一个实验室的二氧化碳培养箱温度显示是37℃,但实际温度只有20多度，细胞状态都不是很好，而且要注意培养箱是否缺水，缺水也是导致温度不能达标的一个原因，如果培养箱使用时间过长，还要注意定期检测培养箱的CO2浓度，因为使用时间长的培养箱的二氧化碳探头可能已经不敏感了。

2.培养基：实验用细胞培养的培养基配制一定要注意PH值问题，要根据培养基说明书要求添加碳酸氢钠，同时调节PH值至适宜范围，而且如果实验用量不大，要将配置好的培养基分瓶使用，以免经常开盖使培养基变碱。同时在进行细胞实验前要先将使用的培养基及胰酶等预热，以免培养基温度过低对细胞产生影响。如果是生产用的培养基，一般都有确定添加的量，对于PH值则不必须每次都进行调节。

3.细胞复苏及冻存：细胞要采取快复苏慢冻存的原理，对于复苏的细胞要尽量快的将其放入37℃水浴中复苏，也可采取用手温度复苏，但要注意冻存管有的时候会喷，小心不要对着面部，以免受伤。冻存一般采取4℃1小时，-20℃1小时，-70℃1小时再放入液氮罐中。冻存液可用：10%DMSO、20%FBS、70%培养基冻存，如果细胞比较珍贵，且复苏存活率可能较低，可用10%DMSO、90%FBS冻存。

4.胰酶消化：我们所用的胰酶-EDTA均为GIBCO现成的，可以将其分装为小瓶使用，将适量胰酶-EDTA加入培养瓶或培养板浸润细胞后，即可将胰酶吸出，放置37℃1~2min即可将细胞消化下来，GIBCO的胰酶比较好用。如果为自己配制的，则需要注意消化时间，可对光观察培养瓶或培养板，如果细胞间出现空隙即可。

5.对于状态不好的细胞：对于一些状态不好的细胞，可适当的加量血清浓度进

行培养，调节好后即降低血清浓度至10%，更换培养液时，可不将所有培养液替换，留一半换一半，因为细胞培养时会产生一些细胞生长因子，如果细胞状态不好，完全更换培养基会使细胞需要重新适应培养环境，也会影响细胞状态。或可以配制一些条件培养基：细胞生长到对数生长期时的培养基，冻存保存，如果细胞状态不好时可用条件培养基进行培养，即可调整细胞状态。

6.污染：实验用细胞可以加Amp及链霉素双抗进行培养，如果出现真菌感染，可添加100μg/ml诺氟沙星及氟康唑进行处理，如果有支原体感染，应丢弃，如果细胞比较珍贵，需要去除支原体，可以使用Mycoplasma Removal Agent、cyprofloxacin或BM-Cyclin去除支原体污染。

1.复苏时细胞解冻的时间越短越好。可以用适当大小的烧杯盛干净的水，在水浴中加热到37°后，将冻存管在烧杯中快速搅动化冻。

2.培养时一般不常规加抗生素。只要操作规范，一般不会污染。而且在试验处理中，我们并不能排除抗生素可能产生的干扰。

3.每种细胞都有其最适宜的培养基，网络如此发达，都可以查到。建议还是用最推荐的培养基，该用哪种用哪种，养好细胞是试验成功的第一步。

基础：

1.玻璃吸管和玻璃培养瓶的消毒:1)高压蒸汽灭菌15分钟以上;2)干烤消毒140度2小时以上;

2.无菌工作台先清洗后用75%酒精擦拭干净,紫外线照射40分钟以上;各种培养板照射3小时以上;

3.培养基(pH7.2)和血清配制好后要做无菌试验:将血清按10%加入培养基内,用无菌的玻璃离心管或玻璃瓶取完全培养基5-10ml置培养箱内培养2-3天,肉眼见无浑浊或沉淀等异物.分装后置-20度保存;

4.消化液(pH7.8)或其它加入液,应用高压蒸汽灭菌或一次性无菌滤器过滤除菌,分装成支置-20度保存;

5.培养箱应先用清水清洗后用75%酒精擦拭一遍(如有紫外线的应照射1小时以上,如有高温灭菌的应按程序来菌).至少每月一次.

6.进入操作时应注意先清洗双手及手腕,然后用75%酒精擦拭,操作时注意无菌台内空间层次.手及物品不要在暴露的瓶口上方来往,如果数量较多,培养瓶应放在与酒精灯平行地方便于操作,瓶与瓶之间应相隔一定的距离,开瓶(盖)时应先用75%酒精反复擦拭或用灯烧,开开后应用灯先烧口,然后烧盖.用完后同样操作.整个操作过程尽量在无菌台靠里面一点.

复苏:

1.应遵守慢冻快融的原则.先将水温锅调至37-37.5度,取出冻存的细胞迅速放入后交细胞面浸至水面以下不断摇动至融化.

2.在无菌台内将完全培养基加入50ml的小培养瓶内,约5ml左右,然后用无菌吸管从冻存管内取出细胞,置培养并内轻轻摇晃,使细胞均匀后置培养箱内培养.

传代:

1.贴壁细胞:

对于贴壁细胞应先吸(倒)尽培养基,吸的越干净越好,以免中和后加入的消化液,使强度减弱.50ml培养瓶加入消化液约0.6ml,按此比例进行消化,(根据配制强度经验),晃动使消化液铺均匀置37度培养箱约2分钟,镜下见细胞收缩变圆或少数脱落后,轻轻振动瓶底使细胞全

部脱落,加入2-3ml完全培养基后,轻轻吹打,使细胞基本成单个悬浮,然后分置其它无菌培养瓶内,加入完全培养基后继续培养或实验.

将长成致密单层细胞的细胞瓶中原来的培养液弃去；

加入0.25％胰酶溶液，视细胞瓶的大小加入体积为0.5ml或更多，以使充分浸润；

一般消化时间约为1至3分钟，肉眼观察瓶壁半透明的细胞层，当见到出现细针孔空隙时，弃去胰酶溶液，并加入适量的细胞培养液终止消化；

视实验要求分入多瓶继续培养，一般为一传二到一传四的比例。

这里，胰酶消化的程度是一个关键：消化过度则对细胞的活性损伤较大，并有部分细胞漂浮，随弃去的胰酶流失；消化不足则细胞难于从瓶壁上吹下，反复吹打同样也会损伤细胞活性。影响消化速度的因素较多，主要有胰酶溶液的活性（配制条件、冻存或4℃保存时间长短、是否反复冻融、化冻后存放时间及温度等）、消化时的温度（气温、细胞培养瓶及胰酶溶液的温度）以及所加胰酶溶液的多少等。

2.悬浮细胞:

一般传代可直接将细胞原液分置其它培养瓶内,加入完全培养基继续培养,如要高浓度可先

离心500rpm,5min后加入完全培养基,轻轻吹匀后,分置其它培养瓶内加入完全培养基继续

培养.

细胞培养室无菌操作规则

体外培养细胞缺乏抗感染能力，所以防止污染是决定培养成功或失败的首要条件。因而，为在一切操作中最大可能的保证无菌，每一项工作都必须做到有条不紊和完全可靠。

【培养前准备】在开始实验前要制定好实验计划和操作程序，有关数据的计算要事先做好。根据实验要求，准备各种所需器材和物品，清点无误后将其放置操作场所（培养室、超净台）内，然后开始消毒，这可以避免开始实验后，因物品不全往返拿取而增加感染机会。

【操作野消毒】无菌培养室每周都要用0.2％新洁尔灭拖洗地面一次，紫外线照射消毒30－50min，超净工作台台面每次实验前要用75％酒精擦洗。然后紫外线消毒30min。在工作台消毒时切勿将培养细胞和培养用液同时照射紫外线，消毒时工作台面上用品不要过多或重叠放置，否则会遮挡射线降低消毒效果。一些操作用具如移液器、废液缸、污物盒、试管架等用75％酒精擦洗后置于台内同时紫外线消毒。

【洗手和着装】进入细胞培养室必须着消毒手术衣。如果实验过程中手触及可能污染的物品和出入培养室都要重新用消毒液洗手。进入原代培养室需彻底洗手还要戴口罩、着消毒衣帽。

【火焰消毒】在无菌环境中进行培养或作其他无菌工作时，首先要点燃酒精灯。以后一切操作，如安装吸管帽÷打开和封闭瓶口等，都需在火焰近处并经过烧灼进行。但要注意：金属器械不能在火焰中烧的时间过长，以防退火，烧过的金属镊要待冷却后才能挟取组织，以免造成组织损伤。吸取过营养液后的吸管不能再用火焰烧灼，因残留在吸管头中培养液能烧焦形成炭膜，再用时会把有害物质带入培养液中。开启、关闭长有细胞的培养瓶时，火焰灭菌时间要短，防止因温度过高烧死细胞。另外胶塞过火焰时也不能时间长，以免烧焦产生有毒气体，危害培养细胞。

【操作】进行培养时，动作要准确敏捷，但又不必太快，以免空气流动，增加污染机会，不能用手触及已消毒器皿，如已接触，要用火焰烧灼消毒或取备用更换。为拿取方便，工作台面上的物品要有合理的布局，原则上应是右手使用的东西放置在右侧，左手物品在左侧，酒精灯置于中央，工作由始至终要保持一定顺序性，组织或细胞在未做处理之前，勿过早暴露在空气中。同样，培养液在未使用前，不要过早开瓶；用过之后如不再重复使用，应立即封闭瓶口。瓶口直立可增加落菌机会，因此操作时应将瓶口倾斜。吸取培养液、PBS、细胞悬液及其他用液时，均应分别使用吸管，不能混用，以防扩大污染或导致细胞交叉污染。工作中不能向操作野讲话或咳嗽，以免唾沫把细菌或支原体带入工作台面发生污染。操作前用酒精擦拭超净台面及双手。手或相对较脏的物品不能经过开放的瓶口上方，瓶口最易污染，加液时如吸管尖碰到瓶口，则应将吸管丢掉。

只谈谈自己养细胞的经验吧，教科书上的不讲了，养细胞时间不长，大家互相学习。

实验前准备：利用紫外消毒30分钟

1、试验中使用的一些试剂提前拿到室温回温，进实验台又需要消毒，于是自作主张开紫外的时候放到细胞室，一举两得。紫外线穿透率极低，不能过白纸，所以对试剂影响不大。（试剂一般3-4此用完。）pbs，我一直放在细胞房不拿出来的。

2、实验前用2%新洁尔灭泡手，感觉比酒精损伤小点。中间离开回来，才用酒精喷手。

3、实验器材的消毒周期。一般使用3-4次即消毒，每周所有物品保证消毒一次。

实验过程中

1、不同细胞株使用专门的试剂，尽量不要混用。

2、培养液不加抗生素，使用前检验比较可信后才使用。小包装，我是100一瓶，一周内肯定用完。开口也就3-4次吧。

3、传代时：胰酶+EDTA消化后，我按书上是离心的，只用800rpm，3min，这样细胞状态比较好，且倒掉上清后，加新的培养基不用吸管吹吸，轻轻震荡两下就行了，分装到新瓶中培养。

实验结束：

1、及时清洗，开30分钟紫外，保持清洁。特别是病毒试验后。

“不长”的细胞——养BT474人乳腺癌细胞初体验

[实验室手记] ：

课题需要养BT474乳腺癌细胞。老板把任务交给我的时候，我满口答应。一来我养过一些细胞，没碰到过什么困难；二来众所周知，“癌”细胞，都是很好养的，生长快、适应强、生命力强。

收到赠送的细胞后，我上网查了一下。ATCC推荐使用Hybri-care medium培养基，此培养基只有ATCC在卖，算是官方指定产品。其它网站各有说法，一般是采用RPMI 1640或者DMEM＋10％ FBS。我用RPMI 1640＋10％ FBS。第一天复苏，一切顺利；第二天换液前，显微镜下观察，绝大多数细胞还在漂着，我没有在意。也许是冻存条件不太好，死亡细胞比较多，但是既然是“癌”细胞，只要有少数贴壁，就会很快长起来的。我换了培养基，显微镜下看到还是有些细胞贴壁的，大约是复苏数目的10％，继续温箱培养。

接下来，问题来了。我每天观察，每2－3天换液，但是这些细胞就想冬眠的青蛙，一动不动。连续一个星期，细胞似乎变大，变扁，透明，但是数量似乎没有

增加。我开始着急了，发信给细胞株的馈赠者，对方只回了一句话：参考ATCC 网站。问师兄、老板，都没有养过这种细胞。在网上搜索，几乎没有这方面的信息。我越来越着急，甚至开始和老板商量重新购买一支。

但是经过搜索，看到一个网站这样记录：The cells are very difficult to culture, grow slowly and after trypsinization are difficult to disaggregate; after thawing the cells look very suffering and need about two weeks to recover。（网址

http://www.biotech.ist.unige.it/cldb/cl4997.html）。略微放了一点心。也许，两周以后，细胞会醒过来，快快长。

静下心来，仔细观察细胞，结合网上零星的描述，发现原来细胞不是变大，而是在缓慢分裂，形成了一个个集落。因为靠得很紧，看上去像是细胞在变大。我在师兄的建议下，将FBS增加到20％，减少移动的频率，耐心地等待。终于，BT474慢慢长起来了，并且越长越快，在一个月左右的时间，达到了实验要求。

后来，我反复做过几次传代、冻存、复苏，原来正如上面英文所说，BT474细胞最困难的就是复苏后两周，难以贴壁，生长缓慢，要到等过了两周以后，细胞就会恢复过来，生长加快。

第一次养的BT474细胞，就像一个难产的婴儿，虽然经历磨难，但总算哇哇坠地了。

[点评]：

癌细胞给人的印象就是“皮实”、“好养”，但是凡是都有例外，BT474就是一个例外。所以我们每接触一个新的细胞类型，都不应该掉以轻心，要利用好周围的资源，多查、多问、小心谨慎，尽量做到万无一失。

[安全小贴士]：

1．培养基。

我的建议是，有条件的用Hybri-care medium；否则用RPMI 1640或DMEM＋10% FBS 应该都可以。从实践角度，我用了RPMI 1640＋10% FBS＋P&S, 证实可以。2．复苏。

BT474在刚解冻时，非常脆弱，贴壁慢，生长慢。不能按照常规方法，第二天换液。我的建议是：培养皿加入尽量多的培养基来稀释DMSO等毒性物质，然后给它充足的时间贴壁。我是加入15-20 ml培养基，静置3天不去碰它，第四天换液。这样细胞贴壁的比例会明显增加。

复苏以后，细胞基本不长，要耐心等待，大约2周以后，细胞就会恢复过来，生长就会明显加快了。增倍时间是72小时左右。

3．换液。

因为刚开始细胞生长很慢，即使一周不换液，颜色也不会有明显变化。但是，我的BT474细胞在生长过程中释放出很多细小的碎片，如果换液不够勤，这些碎片会越来越多。我的做法是，每1-2天换一次液，每次换7.5 ml。

4．传代。

按照常规的方法弃培养基、PBS冲洗、胰酶消化、离心、弃上清、打散、种植即可。胰酶消化比较容易，室温（我怕污染，一般不放温箱，就在超净台上放置）大概5分钟左右即可消化下来。传代的细胞生命力比冻存细胞强得多，我传代后静置2天，贴壁率很好。

5．冻存。

细胞复苏的时候，显得非常脆弱，这里面可能是冷冻的作用，也可能是DMSO的毒性。ATCC建议冻存液中的DMSO浓度是5%。我的做法是：RPMI 1640+20% FBS ＋5% DMSO作为冻存液。

[危害的补救措施]

BT474最需要的就是时间，一定要耐心对待，切不可焦急烦躁，甚至半途而废。

[图片] 图1. 传代两天后换液，这个贴壁的数量已经不错了。扁的细胞已经开始分裂，圆形的相对较慢。