层析技术(纸层析、薄层层析、离子交换层析)实验报告

实验报告

课程名称：分子医学实验指导老师：成绩：

实验名称：层析技术（纸层析、薄层层析、离子交换层析）同组学生姓名：

一、实验目的和要求（必填）

三、主要仪器设备（必填）

五、实验数据记录和处理

七、讨论、心得

二、实验内容和原理（必填）

四、操作方法和实验步骤

六、实验结果与分析（必填）

纸层析法——转氨基作用验证

一、实验目的和要求

1、了解纸层析技术的基本原理。

2、掌握纸层析法。

二、实验内容和原理

体内α-氨基酸的α-氨基在氨基转移酶的作用下，移换至α-酮酸的过程，称氨基移换作用。此类酶各有一定的特异性，普遍存在于动物各组织中。

本实验是将谷氨酸与丙酮酸在肝匀浆中的谷氨酸-丙酮酸氨基转移酶(简称谷-丙转氨酶)的作用下进行氨基移换反应，然后用纸层析法检查反应体系中丙氨酸的生成。其反应过程如下：

由于谷氨酸、丙酮酸在肝匀浆中可循其他代谢途径分解和转化，影响氨基移换过程的观察，因此在反应体系中添加一碘醋酸(或一溴醋酸)以抑制谷氨酸和丙酮酸的其他代谢过程。

三、试剂、器材与实验材料

试剂：1%谷氨酸钾溶液、1%丙酮酸钠溶液、0.25%一碘醋酸钾溶液、5%HAc溶液、0.01mol/L,PH7.4磷酸缓

冲溶液、展开剂、0.1%丙氨酸溶液、0.1%谷氨酸钾溶液0.1%茚三酮乙醇溶液

器材：烘箱、剪刀、镊子、天平、研钵、滴管、烧杯、恒温水浴箱、10cm*20cm层析滤纸、层析缸、喷雾器、电吹风机、15mm*100mm试管及试管架

实验材料：小白鼠

四、操作方法和实验步骤

1、肝匀浆的制备

取小白鼠1只，颈椎脱臼法处死后，取出肝脏，经0.9% NaCl溶液洗去血污后，称取肝脏约1 g，置研钵中加入玻璃砂少许(或用玻璃匀浆器研磨)，然后加0.01 mol/L，pH=7.4磷酸缓冲溶液1ml磨成匀浆，之后再加入4ml磷酸缓冲液。

2、转氨酶反应

取短离心管2只编号(1、2)，各加肝匀浆10滴，先将2号管置沸水浴中5分钟。两管各加1%谷氨酸钾溶液10滴，1%丙酮酸钠溶液10滴，0.25%一碘醋酸钾溶液5滴，同置40℃水浴中保温30分钟。取出，向两管各加5% HAc溶液2滴，再同置沸水浴中5分钟，冷却后离心(2000 r/min，5 min)，将上清液移入另外同样编号的1.5ml小塑料离心管中备用。

3、层析验证

在10 cm×20 cm滤纸上，距短边2.5 cm处用铅笔轻轻画一线(原线)，在原线上，每隔1.5cm处用铅笔作记号，并在线下底边注明1、2、谷氨酸、丙氨酸记号。用毛细管分别吸取1号液、2号液在层析滤纸上点样，注意斑点不可太大，一般直径约0.3 cm为宜，约5 min等干后，在1、2号原点上，再重复点两次次(注意，不可调错)，然后分别点上谷氨酸、丙氨酸，作为对照，干后置层析缸中展开1.5～2h。（注意：点样处切勿浸入展开剂中。）取出滤纸晾干，喷以0.1%茚三酮乙醇溶液，电吹风吹干，观察层析出现的斑点并解释之。

五、实验结果

转氨基作用纸层析得到的斑块形状呈向外火舌状，上端尖锐下端较钝，略呈三角状。分析原因亦可能是抖动引起，流动相与固定相都容易受震动，产生上升时速度不匀。

标准组3、4号分别为Glu和Ala，其中Glu层析出的点在下方，Ala在上方。

1号对照组仅出现与谷氨酸高度相同的斑块，无丙氨酸。

2号实验组出现两种高度的斑点，高度与3、4号对应，说明Glu与Ala同时存在。

分析：1号中酶沸水浴变性不能实现转氨基作用，结合1号出现Glu与Ala两块斑点，转氨基作用得到验证。

六、讨论

1.点样三次，毛细管末端如果有破裂点样会有困难。

2.点样处勿进入展开剂中，否则样品会溶解在展开集中，影响实验结果。

3.不同组的层析板或纸不要有接触以免相互污染。

4.纸层析法是以纸为载体的分配层析法。一般以滤纸纤维上吸附的水分为固定相，由水饱和的相对于固定相流动的有机溶剂为流动相。因此，纸层析也可以看作是溶质在固定相和流动相之间连续萃取的过程。如果混合物中的各种成分在溶剂之间的分配系数足够大，它们就得到分离。样品经层析后，常用比移值Rf(ratio of fronts)来表示各组分在层谱中的位置。Rf值与待分离物质的性质存在一定关系，在一定条件下是常数。

5.纸的选择和溶剂的选择：Whatman1号滤纸常用于分析性的工作；较厚的Whatman3MM滤纸，最好用于大量物质的分离。但其分离效果较1号纸差；Whatman4号和5号滤纸用于快速分离，但斑点边缘不清。选择溶剂与选择滤纸主要凭经验，取决于要研究的对象，所选溶剂最好能使样品中混合物的Rf值介于0-1之间。另外，在一些特殊的分离过程中，PH也是重要的，许多溶剂因含有醋酸或氨水而具有强酸或强碱环境。

6.茚三酮（茚三酮水化物）是一种强氧化剂，PH值在4-8之间，与所有的α-氨基酸反应呈紫色。该反应很灵敏，所以常用来检测层析谱上的氨基酸。此外，茚三酮与许多非氨基酸的含氮成分亦可以发生反应，这些化合物包括一级和二级脂肪族胺类，以及某些非芳香族含氮杂环化合物。亚氨基酸如脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应呈黄色。

薄层层析分离脂类

一、实验目的和要求

掌握薄层层析的方法。

二、实验内容和原理

薄层层析法是将固定相支持物均匀地铺在玻璃板上成为薄层，然后将要分析的样品点加到薄层上，用合适的溶剂展开而达到分离的目的。常用的固相支持物有硅胶、氧化铝、硅藻土、氢氧化钙、磷酸钙等；

本实验以硅胶G作固定相。脂类硅胶薄层层析的基本原理主要是通过硅胶对不同的脂类物质具有不同的吸附能力。在展开剂（移动相）展开过程中脂类物质在两相之间重复进行吸附-解吸-再吸附-再解吸,使各种脂类物质随展开剂移行，结果，与固定相（硅胶）吸附能力弱的和/或在移动相中溶解度大的脂类物质随展开剂移行到较远的距离，而与固定相吸附能力强的和/或在移动相中溶解度小的脂类物质，在展开过程中移行慢，落在后面，这样展开一段时间后就可以将各种脂类物质彼此分离开来。

三、试剂与器材

试剂：硅胶G、展开剂、胆固醇标准液、三磷酸甘油酯标准液、卵磷脂标准液、试样、显色剂、0.3%羧甲基纤维素

器材：8cm*12cm玻片、研钵及杵、烘箱、层析用标准缸、喷雾器

四、实验步骤

1．层析薄板的制作

称取硅胶G 2g置研钵中加入0.3%羧甲基纤维素8mL，研匀后迅速倒在8 cm×12 cm玻片上，水平放置，可用杵稍加涂抹使硅胶在玻璃上分布均匀，放置到硅胶凝固后，置100℃烘箱中烘干备用。

2．点样

分别用毛细玻管吸取各种脂质的标准液及试样，在薄板的一端1.5 cm高度处取间距为1 cm点样三次，待溶剂蒸发后置于盛有展开剂的标本缸中，点样一端起点以下，浸入展开剂中。注意：点样处切勿浸入展开剂中。

3. 观察

约半小时后，当展开剂上升至适当高度（接近薄板上端）将薄板取出电吹风吹干，喷以磷钼酸显色剂，再次吹干或烘箱烘干。比较各种脂质和试样所显斑点位置，作图记录之，计算Rf值，即斑点中心至原点的距离（cm）／展开剂扩展前沿至原点的距离（cm）。

五、实验结果

从左至右分别编号为1~5

三个标准点：1~3

1：胆固醇，居于三者中间

2：三油酸甘油酯，处在最上面

3：卵磷脂，处于最下面，基本不动

二个试样点：4~5

4：菜油，仅出现与2基本相平的点，说

明有三油酸甘油酯

5：卵黄，出现三个点，最下面那个点与

3点相平，为卵磷脂。而上面2个点理论

上应该是胆固醇和三油酸甘油酯。但是，

从图中我们可以发现，5号点中的上面两

个点相对另外两个点要高。

编号 1 2 3 4 5

卵磷脂0cm 0cm

胆固醇0.3cm 0.9cm

三油酸甘油酯1．0cm 1.1cm 1.5cm

出现上述现象的原因：可能是由于5号样品点由于边缘效应或制版不均匀使得5号样品点跑得比较快或者由于样品点里多种因素影响了样品点内部的几个点的溶解度，从而影响了跑得速度，从而与标准点不一。同时，我们发现样品3,4中的点较大，可以得出样品中的成分浓度较大。

我们也发现，薄层上出现许多深色小点，怀疑是制板时厚度不匀或者是硅胶G的分布不均问题。

展开剂前沿至原点的距离为11.6cm

Rf（卵磷脂）=0；

Rf(胆固醇)=0.3/11.6=0.0259

Rf(三油酸甘油酯)=1/11.6=0.0862

由于很多因素，使得我们测出的Rf值与理论值相差甚远，但是我们能从图中看出，我们的分离效果还是不错的。

六、讨论

1.薄层层析技术特别适用于分离样品中含量很低的物质，其原理主要是吸附层析（亦包含分配作用）。用硅胶G作吸附剂的特点之一是含有一种粘合剂（本实验用石膏做作粘合剂），以便将硅胶更好地粘在玻璃板上，可用于上行或下行展层。

2.以硅胶G为固定相的薄层层析可用于各种小分子化合物（如脂类、氨基酸、多肽、维生素、核苷酸、糖类、生物碱、酚类等）的分析、分离，而且几乎都以脂溶剂作流动相。这一技术对同分异构体的分离具有独到的用处。

3.点样三次，毛细管末端如果有破裂点样会有困难。

4.点样处勿进入展开剂中，否则样品会溶解在展开集中，影响实验结果。

5.不同组的层析板或纸不要有接触以免相互污染。

6.制板后放入80-100摄氏度的烘箱烘烤30min,目的是除去水分，这一过程称为活化。在活化时要尽量避免温度升高或降低，时间不宜过长，否则薄层容易脱落。从烘箱取板前必须关闭电源，待稍冷后小心取出，不要碰破薄层，还要防止灼伤。

离子交换层析分离混合氨基酸

一、实验目的和要求

掌握离子交换层析法的原理和操作方法。

二、实验内容和原理

离子交换层析是利用离子交换剂上的可交换离子与周围介质中被分离的各种离子间的亲和力的不同，经过交换平衡达到分离目的的一种柱层析法。氨基酸是两性电解质，每一种氨基酸都有它特定的等电点，各种氨基酸在pH小于其等电点的溶液中以阳离子的形式存在，可以与阳离子交换剂进行交换，再慢慢增大洗脱液的pH，氨基酸将依照其等电点由小到大的顺序逐渐洗脱，此时分部收集各洗脱组分，即可将各种氨基酸一一分离。

本实验以天冬氨酸和精氨酸为例，利用磺酸型阳离子交换树脂将其从混合物中分离。天冬氨酸是酸性氨基酸，pI=2.98；精氨酸是碱性氨基酸，pI=10.76。根据其等电点，我们选择0.1M柠檬酸缓冲液（pH2.2），将它们都吸附在阳离子交换剂上，再用0.1M柠檬酸缓冲液（pH 5.0）洗脱天冬氨酸，用0.1M NaOH溶液洗脱精氨酸。

三、试剂与器材

试剂：磺酸型阳离子树脂、0.1M柠檬酸缓冲液（PH2.2)、混合氨基酸溶液、0.5M柠檬酸缓冲液(PH5.0)、0.1M柠檬酸缓冲液（PH5.0)、0.1MNaOH、2MNaOH、2MHCl、0.2%茚三酮溶液、0.2%酸性茚三酮溶液

器材：层析柱、乳胶管、“再”形夹、玻璃纤维、橡皮塞、PH试纸、沸水浴、烧杯、试管及试管架

四、实验步骤

1．装柱

取加入填料的层析柱一支，夹好“再”形夹，用铁丝将树脂悬液搅匀，使树脂内不残留气泡，树脂自由沉降后打开“再”形夹，缓慢放出液体，当液面慢慢降至树脂面时，关闭下端“再”形夹。（注意在整个操作过程中，应防止液面低于树脂面，当液面低于树脂面时，空气进入树脂内形成气泡 )

2.洗柱

用0.1M，pH2.2柠檬酸缓冲液5ml洗柱，洗柱快结束时调整流速为5滴/min（20滴为1ml）

3.加样

将混合氨基酸溶液0.2ml沿层析柱内壁缓缓加入，打开“再”形夹，使样品液缓缓流进柱床，流速为5滴/min。样品全部进入柱床后，用0.1M，pH2.2柠檬酸缓冲液2ml，分两次先后加入洗柱。

4．洗脱及分段收集

用0.1M，pH5.0柠檬酸缓冲液洗脱，边加洗脱液边收集，并调节流速至10滴/min，每管收集1ml。所有收集管分次用茚三酮反应检测氨基酸。

5．洗脱及分段收集

待第一个氨基酸被洗脱后，（茚三酮反应检测连续两管呈阴性），立即改用0.1M NaOH以同样流速及收集体积洗脱，并对各管收集液进行氨基酸检测。

五、实验结果

编号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 颜色- - - - - - - - - - - - - ++ ++ ++ + - - -

编号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

此在这四支试管中洗脱下来的为天冬氨酸，其中14、15、16号中含量较多。由于第一次水浴时，我们发现14,15号管有颜色，因而担心天冬氨酸没有洗脱净，所以又多加了5支试管再次进行脱色，并加热看颜色。

0.1M NaOH洗脱茚三酮反应有颜色的试管：7, 8,9号，颜色较浅。在这两只试管中洗脱下的为精氨酸。在承接后十五支试管（洗脱精氨酸）时，对十五支试管沸水浴加热需要较长时间才能显出颜色，而且颜色较浅。分析原因：精氨酸浓度较低，或是精氨酸本身性质所决定。

六、讨论

1.茚三酮反应颜色较浅，原因主要是水浴时间不够，还没有完全反应，应当等试管变为紫色时再取出。

2.在整个实验操作过程中，应防止液面低于树脂面，当液面低于树脂面时，空气进入树脂内形成气泡，影响洗脱和收集。

3.在整个实验操作中要控制好流速，使得混合氨基酸能充分洗脱和分离。

葡聚糖凝胶层析实验报告

葡聚糖凝胶层析实验报告 一、实验目的 1、学习凝胶(Gel)层析法的基本原理； 2、掌握葡聚糖凝胶（Sephadex）柱层析的操作技术。 二、实验原理 凝胶层析又称排阻层析，凝胶过滤，渗透层析或分子筛层析等。 对于某种型号的凝胶，一些大分子不能进入凝胶颗粒内部而完全被排 阻在外，只能沿着颗粒间的缝隙流出柱外（所用洗脱液的体积为外水 体积）；而一些小分子不被排阻，可自由扩散，渗透进入凝胶内部的 筛孔，尔后又被流出的洗脱液带走（所用洗脱液的体积为内水体积）。 分子越小，进入凝胶内部越深，所走的路程越多，故小分子最后流出 柱外，而大分子先从柱中流出。一些中等大小的分子介于大分子与小 分子之间，只能进入一部分凝胶较大的孔隙，亦即部分排阻，因此这 些分子从柱中流出的顺序也介于大、小分子之间。这样样品经过凝胶 层析后，分子便按照从大到小的顺序依次流出，达到分离的目的。 三、仪器、材料和试剂 1、仪器：内直径为1cm，外直径为1.5cm的层析柱，恒流泵、收集器、酶标仪、试管、烧杯、移液枪。 2、材料与试剂：交联葡聚糖、双蒸水、蛋白溶液样品。 四、实验步骤 1、装柱

将交联葡聚糖溶液用玻璃棒引流导入层析柱中，要注意，不能让柱子中有气泡，可以边装边用玻璃棒搅拌。 2、上样 装好柱后，用移液枪将柱子中上面的水吸出，再用移液枪将1ml 的蛋白溶液加入层析柱中。 3、洗脱和收集 打开恒流泵和收集器装置，待样品刚好渗入到凝胶中时，再向层析柱中加入3-4ml的蒸馏水，此时盖上层析柱的上盖，将上盖的细管插入到盛有双蒸水的烧杯中，调节恒流泵的速度和收集器时间，开始洗脱收集。 4、样品的检测 收集一段时间后，将样品取出，依次编号，依次加入200μl到酶标版上，选用一个孔加入双蒸水作为对照，用酶标仪在280nm下测检测。 五、实验结果及分析 1、实验结果： 2、蛋白质样品洗脱曲线：

薄层色谱TLC(点板)的基本原理

薄层色谱(点板)的基本原理 ★★ 薄层色谱，或称薄层层析(thin—1ayer chromatography)，是以涂布于支持板上的支持物作为固定相，以合适的溶剂为流动相，对混合样品进行分离、鉴定和定量的一种层析分离技术。这是一种快速分离诸如脂肪酸、类固醇、氨基酸、核苷酸、生物碱及其他多种物质的特别有效的层析方法，从50年代发展起来至今，仍被广泛采用。 (一)基本原理 薄层层析是把支持物均匀涂布于支持板(常用玻璃板，也可用涤纶布等)上形成薄层，然后用相应的溶剂进行展开。薄层层析可根据作为固定相的支持物不同，分为薄层吸附层析(吸附剂)、薄层分配层析(纤维素)、薄层离子交换层析(离子交换剂)、薄层凝胶层析(分子筛凝胶)等。一般实验中应用较多的是以吸附剂为固定相的薄层吸附层析。 吸附是表面的一个重要性质。任何两个相都可以形成表面，吸附就是其中一个相的物质或溶解于其中的溶质在此表面上的密集现象。在固体与气体之间、固体与液体之间、吸附液体与气体之间的表面上，都可能发生吸附现象。

物质分子之所以能在固体表面停留，这是因为固体表面的分子(离子或原子)和固体内部分子所受的吸引力不相等。在固体内部，分子之间相互作用的力是对称的，其力场互相抵消。而处于固体表面的分子所受的力是不对称的，向内的一面受到固体内部分子的作用力大，而表面层所受的作用力小，因而气体或溶质分子在运动中遇到固体表面时受到这种剩余力的影响，就会被吸引而停留下来。吸附过程是可逆的，被吸附物在一定条件下可以解吸出来。在单位时间内被吸附于吸附剂的某一表面积上的分子和同一单位时间内离开此表面的分子之间可以建立动态平衡，称为吸附平衡。吸附层析过程就是不断地产生平衡与不平衡、吸附与解吸的动态平衡过程。 例如用硅胶和氧化铝作支持剂，其主要原理是吸附力与分配系数的不同，使混合物得以分离。当溶剂沿着吸附剂移动时，带着样品中的各组分一起移动，同时发生连续吸附与解吸作用以及反复分配作用。由于各组分在溶剂中的溶解度不同，以及吸附剂对它们的吸附能力的差异，最终将混合物分离成一系列斑点。如作为标准的化合物在层析薄板上一起展开，则可以根据这些已知化合物的Rf值（后面介绍Rf值）对各斑点的组分进行鉴定，同时也可以进一步采用某些方法

有机化学实验十柱色谱

实验十柱色谱 一．实验目的： 1. 学习柱色谱的原理及方法。 二．实验重点和难点： 1.学习柱色谱的原理及方法。 实验类型：基础性实验学时：4学时 三．实验装置和药品： 主要实验仪器：色谱柱(或25mL碱式滴定管) 25mL锥形瓶 普通漏斗玻璃棉或脱脂棉量筒试管电子天平烧杯 主要化学试剂：石油醚（600C—900C）丙酮中性氧化铝(100--200目) 500g 菠菜色素95%乙醇 四．实验装置图： 五．实验原理： 柱色谱法是色谱方法之一。 图 1 柱色谱装置色谱法是分离、纯化和鉴定有机化合物的重要方法之一。 (一)色谱法的基本原理： 是利用混合物中各组分在某一物质中的吸附或溶解性能(即分配) 的不同，或其它亲 和作用的性能的差异，使混合物的溶液流经该种物质，进行反复的吸附或分配等作用，从 而将各组分分开。 (二)色谱法的分类： 1.根据组分在固定相中的作用原理不同，可分为吸附善谱、分配色谱、离子交换色谱、排阻色谱等。 2.根据操作条件的不同，可分为柱色谱、纸色谱、薄层色谱、气相色谱及高效液相 色谱等类型。 (三)柱色谱原理： 柱色谱是化合物在液相和固相之间的分配，属于固--液吸附层析。 图1就是一般柱色谱装置。柱内装有”活性”固体(固定相) 如氧化铝或硅胶等。液 体样品从柱顶加入流经吸附柱时，即被吸附在柱的上端，然后从柱顶加入洗脱溶剂冲洗。由于固定相对各组分吸附能力不同，以不同速度沿柱下移，形成若干色带。再用溶剂洗脱，吸附能力最弱的组分随溶剂首先流出，分别收集各组分，再逐个鉴定。 1.吸附剂：常用的吸附剂有：氧化铝、硅胶、氧化镁、碳酸钙和活性炭等。吸附剂一般 要经过纯化和活性处理。选择吸附剂的首要条件是与被吸附物及展开剂均无化学作用。吸 附能力与颗粒大小有关。颗粒太粗，流速快分离效果不好。颗粒小，表面积大，吸附能力 就高，但流速慢，因此应根据实际分离需要而定。色谱用的氧化铝可分酸性、中性和碱性 三种。 2.溶质的结构与吸附能力的关系：化合物的吸附能力与分子极性有关。分子极性越强，

离子交换柱层析原理

离子交换层析介质的应用 离子交换层析分离纯化生物大分子的过程，主要是利用各种分子的可离解性、离子的净电荷、表面电荷分布的电性差异而进行选择分离的。现已成为分离纯化生化制品、蛋白质、多肽等物质中使用最频繁的纯化技术之一。 子交换层析（Ion Exchange Chromatography 简称为IEC）是以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。离子交换层析是目前生物化学领域中常用的一种层析方法，广泛的应用于各种生化物质如氨基酸、蛋白、糖类、核苷酸等的分离纯化。 1.离子交换层析的基本原理： 离子交换层析是通过带电的溶质分子与离子交换层析介质中可交换离子进行交换而达到分离纯化的方法，也可以认为是蛋白质分子中带电的氨基酸与带相反电荷的介质的骨架相互作用而达到分离纯化的方法。 离子交换层析法主要依赖电荷间的相互作用，利用带电分子中电荷的微小差异而进行分离，具有较高的分离容量。几乎所有的生物大分子都是极性的，都可使其带电，所以离子交换层析法已广泛用于生物大分子的分离、中等纯化及精制的各个步骤中。 由于离子交换层析法分辨率高，工作容量大，并容易操作，因此它不但在医药、化工、食品等领域成为独立的操作单元，也已成为蛋白质、多肽、核酸及大部分发酵产物分离纯化的一种重要的方法。目前，在生化分离中约有75%的工艺采用离子交换层析法。 2.离子交换层析介质： 离子交换层析的固定相是离子交换剂，它是由一类不溶于水的惰性高分子聚合物基质通过一定的化学反应共价结合上某种电荷基团形成的。离子交换剂可以分为三部分：高分子聚合物基质、电荷基团和平衡离子。电荷基团与高分子聚合物共价结合，形成一个带电的可进行离子交换的基团。平衡离子是结合于电荷基团上的相反离子，它能与溶液中其它的离子基团发生可逆的交换反应。平衡离子带正电的离子交换剂能与带正电的离子基团发生交换作用，称为阳离子交换剂；平衡离子带负电的离子交换剂与带负电的离子基团发生交换作用，称为阴离子交换剂。在一定条件下，溶液中的某种离子基团可以把平衡离子置换出来，并通过电荷基团结合到固定相上，而平衡离子则进入流动相，这就是离子交换层析的基本置换反应。通过在不同条件下的多次置换反应，就可以对溶液中不同的离子基团进行分离。下面以阴离子交换剂为例简单介绍离子交换层析的基本分离过程。 阴离子交换剂的电荷基团带正电，装柱平衡后，与缓冲溶液中的带负电的平衡离子结合。待分离溶液中可能有正电基团、负电基团和中性基团。加样后，负电基团可以与平衡离子进行可逆的置换反应，而结合到离子交换剂上。而正电基团和中性基团则不能与离子交换剂结合，随流动相流出而被去除。通过选择合适的洗脱方式和洗脱液，如增加离子强度的梯度洗脱。随着洗脱液离子强度的增加，洗脱液中的离子可

薄层色谱法和有机化合物元素的定性分析

实验四 薄层色谱法和有机化合物元素的定性分析 （一）薄层色谱法 课时数：3学时 教学目标： 本项目是有机化学实验基本操作技能之一，通过本项目学习使学生了解薄层色谱法的原理，掌握层析板的制备技术，学习色谱分离鉴定方法，学会应用层析法来分离和鉴别有机化合物，鉴定有机化合物的纯度，为以后合成实验打下基础。 教学内容： 一、实验目的： 1、 解薄层色谱法的原理和方法，掌握层析板的制备技术； 2、 学会应用层析法来分离和鉴别有机化合物，鉴定有机化合物的纯度。 二、实验原理： 1、色谱法定义：是一种物理的分离方法，其原理是利用混合物中各组分的物理化学性质的 差别，使各成分在某一条件下流过吸附剂时，由于其物理性质的不同而得到分离。目前常用的色谱法有：薄层色谱法、柱色谱法、纸色谱法、气相色谱法、高效液相色谱法。 ⑴薄层色谱（TLC ）属于固－液吸附色谱，固定相是吸附剂，流动相是展开剂。它是利用各种化合物的吸附能力不同，在薄层板上随展开剂上移时的解吸程度不同，从而达到分离的目的。 ⑵柱色谱是利用层析柱将混合物各组分分离开的操作过程。 ⑶纸色谱是以滤纸为载体，让样品溶液在纸上展开达到分离的目的。 ⑷气相色谱是以气体作为流动相的色谱法。 ⑸高效液相色谱是选用颗粒很细的高效固定相，采用高压泵输送流动相，分离、分析过程通过仪器完成。 2、比移值R f ：是表示色谱图上斑点位置的一个数值，良好的分离R f 应在0.15－0.75之间。 R f ＝ 影响R f 的因素： ⑴ 吸附剂的吸附能力：与其极性、粒度、活性有关。吸附能力越强，比移值越小。 ⑵ 展开剂的极性：展开剂极性越强，解吸能力越强，则比移值越大。 ⑶ 样品的极性、能否与吸附剂形成氢键：样品极性越强，与吸附剂表面基团形成氢键， 则吸附越强，比移值越小。 ⑷ 温度、薄板的厚度 在上述因素固定的情况下。比移值对每一种化合物来说是一个特定的数值。 三、实验流程图： 制作薄板 划底线 点样 展开 划前沿线 显色：紫外光，I 2 当样品本身无色时需显色 化合物样点移动的距离 展开剂前沿移动的距离 3ml 1％CMC ＋8ml H 2O ＋5g GF 254 ，晾干，105-110℃活化0.5h 距薄板底端约1cm 处，铅笔 直径1－2mm ，间距约1cm 液面不超过0.5cm ，先饱和数分钟 当展开剂上升到距薄板顶端约1cm

实验_柱色谱

实验 10 柱色谱分离实验报告 --亚甲基蓝与荧光黄的分离 一实验目的 学习并掌握色谱法的原理及其应用。 学习并掌握柱色谱的实验操作技能。 二实验原理 色谱法亦称色层法，层析法等，是分离，纯化和鉴定有机化合物的重要方法之一。色谱法的基本原理是利用混合物各组分在某一物质中的吸附或溶解性能（即分配）的不同，或其它亲和作用性能的差异，混合物的溶液流经该种物质，进行反复的吸附或分配等作用，从而将各组分分开。 色谱分离法的分类 （按操作条件的不同）

色谱分离法的分类 （按组分在固定相中的作用原理不同） 色谱法的应用 色谱法在有机化学中的应用主要包括以下几个方面： （1）分离混合物 （2）精致提纯化合物 （3）利用比移值（Rf）鉴定化合物 (4)跟踪反应进程 柱色谱常用的有吸附色谱和分配色谱两类。前者常用氧化铝或硅胶为吸附剂。后者以硅胶，硅藻土和纤维素为支持剂，以吸收大量的液体为固定相。 当加入的洗脱剂流下时，由于不同化合物吸附能力不同，因而以不同的速度沿柱向下流动，继续洗脱时，吸附能力弱的组分随溶剂首先流出。在连续洗脱过程中，不同组分或不同色带就能分别收集，从而达到分离纯化的目的。

1 吸附剂 常用的吸附剂：氧化铝，硅胶，氧化镁，碳酸钙，活性炭或纤维素粉。选择吸附剂的首要条件：不与被分离物或展开剂发生化学反应。 吸附能力与以下几点有关： （1）吸附剂颗粒大小 （2）吸附剂含水量 柱色谱 2 溶剂 通常根据被分离物中各组分的极性、溶解度和吸附活性等来考虑。先将带分离的样品溶于尽量少的非极性溶剂中，从柱顶流入柱中，依次增大溶剂的极性，将不同化合物依次洗脱。 常用洗脱剂的极性： 石油醚＜环己烷＜四氯化碳＜甲苯＜苯＜二氯甲烷＜氯仿＜乙醚＜乙酸乙酯＜丙酮＜乙醇＜甲醇＜水＜乙酸 三实验步骤及注意事项 （1）取一支色谱柱，在柱子的收缩部塞一小团脱脂棉花，注意松紧要适度。然后在棉花上铺一层粗硅胶或石英砂。 （2）将色谱柱垂直固定在铁架台上，往柱内加适量70%乙醇溶液，打开活塞，赶走气泡。 （3）再向柱中倒入适量70%乙醇溶液，打开活塞，控制滴速为1滴／秒，用小锥型瓶承接，同时通过漏斗慢慢装入5gAl2O3，使其逐渐沉入底部。 【在装吸附剂的过程中，应用质软的物体如试管夹、吸耳球等轻轻敲击柱身，促使吸附剂装填紧密，排除气泡。最终应使吸附剂的上端平整，无凹凸面。】（4）加完吸附剂后，在吸附剂上再盖一张直径大小合适的小滤纸。 （5）当溶剂的液面刚好流至滤纸面时关闭二通活塞，立即用移液管加入1mL亚甲基蓝和荧光黄的乙醇混合液，尽量免待分离混合液粘附在柱的内壁上。 （6）打开二通活塞，等柱内的溶剂恰好流到滤纸面时，关闭二通活塞，向柱内加入70%乙醇，打开二通活塞进行洗脱。 （7）用锥形瓶收集蓝色的亚甲基蓝溶液。【洗脱时切勿使溶剂流干！】 （8）当蓝色溶液收集完后，等柱内的70%乙醇溶液恰好流到滤纸面时，关闭二通活塞，加入适量2%氨水作为洗脱剂。打开二通活塞收集黄绿色的荧光黄溶液，直到其完全被洗出。 （9）用量筒分别量取所分离出来的亚甲基蓝和荧光黄溶液的体积后，倒入指定的回收瓶中。 （10）分离结束后，应先让溶剂尽量流干，然后倒置，用吸耳球从活塞口向管内挤压空气，将吸附剂从柱顶挤压出。使用过的吸附剂倒入垃圾桶里，切勿倒入水槽，以免堵塞水槽。 四操作注意事项 特别注意：有机溶剂对身体特有害别是心肺；肝脏等所有过柱操作都要在通风橱里进行！！！柱色谱是以硅胶或氧化铝作固定相的吸附柱。下面我就几年来过柱的体会写些心得，希望对大家能有所帮助。 1、柱子可以分为：加压，常压，减压压力可以增加淋洗剂的流动速度，减少产品收集的时间，但是会减低柱子的塔板数。所以其他条件相同的时候，常压柱是效率最高的，但是时间

离子交换实验

实验报告 课程名称： 水处理工程实验 指导老师： 胡宏 成绩：__________________ 实验名称： 离子交换实验 类型：________________同组学生姓名： 陈巧丽、林蓓等 一、实验目的和要求（必填） 二、实验内容和原理（必填） 三、主要仪器设备（必填） 四、操作方法和实验步骤 五、实验数据记录和处理 六、实验结果与分析（必填） 七、讨论、心得 一、实验目的和要求 离子交换法是一种借助于离子交换剂上的离子和废水中的离子进行交换反应而除去废水中有害离子的方法。离子交换是一种特殊吸附过程，通常是可逆性化学吸附；其特点是吸附水中离子化物质，并进行等电荷的离子交换。 离子交换剂分无机的离子交换剂如天然沸石，人工合成沸石，及有机的离子交换剂如磺化煤和各种离 子交换树脂。 在应用离子交换法进行水处理时，需要根据离子交换树脂的性能设计离子交换设备，决定交换设备的运行周期和再生处理。通过本实验希望达到下述目的： 1) 加深对离子交换基本理论的理解；学会离子交换树脂的鉴别； 2) 学会离子交换设备操作方法； 3) 学会使用手持式盐度计，掌握pH 计、电导率仪的校正及测量方法。 二、实验内容和原理 由于离子交换树脂具有交换基因，其中的可游离交换离子能与水中的同性离子进行等当量交换。 用酸性阳离子交换树脂除去水中阳离子，反应式如下： nRH + M +n → Rn M + nH + M ——阳离子 专业： 环境工程 姓名： 王 义 学号： 71 日期： 2010-4-2 装 订 线

n——离子价数 R——交换树脂 用碱性阴离子交换树脂除去水中的阴离子，反应式如下： nROH + Y?n→ R n Y + nOH- Y——阴离子 离子交换法是固体吸附的一种特殊形式，因此也可以用解吸法来解吸，进行树脂再生。 本实验采用自来水为进水，进行离子交换处理。因为自来水中含有较多量的阴、阳离子，如Clˉ， NH4+，Ca2+，Mg2+，Fe3+，Al3+，K+，Na+等。在某些工农业生产、科研、医疗卫生等工作中所用的水，以及某些废水深度处理过程中，都需要除去水中的这些离子。而采用离子交换树脂来达到目的是可行的方法。 本实验采用测量水中电导率值或盐度的方法来间接地、近似地表示离子的去除情况。 三、主要仪器设备 离子交换树脂的鉴别： 30ml试管数支、吸管1支、5ml移液管数支，废液缸一个；溶液、5mol/L NH4OH溶液、1 溶液、10%CuSO4溶液，酚酞指示剂、甲基红指示剂； 离子交换树脂对水中离子的交换作用： 烧杯50ml 5只，METTLER TOLEDO 326电导率仪1台、PHS-9V型酸度计一台、手握式盐度计一支，清水、模拟废水，流量计，砂滤柱、阳树脂柱、阴树脂柱、混树脂柱装置一套。 交换柱有效值：Φ=9cm，h=100cm。 图1 离子交换实验装置流程图

实验报告总结(精选8篇)

《实验报告总结》 实验报告总结（一）： 一个长学期的电路原理，让我学到了很多东西，从最开始的什么都不懂，到此刻的略懂一二。 在学习知识上面，开始的时候完全是老师讲什么就做什么，感觉速度还是比较快的，跟理论也没什么差距。但是之后就觉得越来越麻烦了。从最开始的误差分析，实验报告写了很多，但是真正掌握的确不多，到最后的回转器，负阻，感觉都是理论没有很好的跟上实践，很多状况下是在实验出现象以后在去想理论。在实验这门课中给我最大的感受就是，必须要先弄清楚原理，在做实验，这样又快又好。 在养成习惯方面，最开始的时候我做实验都是没有什么条理，想到哪里就做到哪里。比如说测量三相电，有很多种状况，有中线，无中线，三角形接线法还是Y形接线法，在这个实验中，如果选取恰当的顺序就能够减少很多接线，做实验就应要有良好的习惯，就应在做实验之前想好这个实验要求什么，有几个步骤，就应怎样安排才最合理，其实这也映射到做事情，不管做什么事情，就应都要想想目的和过程，这样才能高效的完成。电原实验开始的几周上课时间不是很固定，实验报告也累计了很多，第一次感觉有那么多实验报告要写，在交实验报告的前一天很多同学都通宵了的，这说明我们都没有合理的安排好自己的时间，我就应从这件事情中吸取教训，合理安排自己的时间，完成就应完成的学习任务。这学期做的一些实验都需要严谨的态度。在负阻的实验中，我和同组的同学连了两三次才把负阻链接好，又浪费时间，又没有效果，在这个实验中，有很多线，很容易插错，所以要个性仔细。 在最后的综合实验中，我更是受益匪浅。完整的做出了一个红外测量角度的仪器，虽然不是个性准确。我和我组员分工合作，各自完成自己的模块。我负责的是单片机，和数码显示电路。这两块都是比较简单的，但是数码显示个性需要细致，由于我自己是一个粗心的人，所以数码管我检查了很多遍，做了很多无用功。 总结：电路原理实验最后给我留下的是：严谨的学习态度。做什么事情都要认真，争取一次性做好，人生没有太多时间去浪费。 实验报告总结（二）： 在分子生物学实验室为期两个月的实习使我受益匪浅，我不仅仅学习到了专业知识，更重要的是收获了经验与体会，这些使我一生受用不尽，记下来与大家共勉： 1.手脚勤快，热心帮忙他人。初来匝道，不管是不是自己的份内之事，都就应用心去完成，也许自己累点，但你会收获很多，无论是知识与经验还是别人的称赞与认可。 2.多学多问，学会他人技能。学问学问，无问不成学。知识和经验的收获能够说与勤学好问是成正比的，要记住知识总是垂青那些善于提问的人。 3.善于思考，真正消化知识。有知到识，永远不是那么简单的事，当你真正学会去思考时，他人的知识才能变成你自己的东西。 4.前人铺路，后人修路。墨守陈规永远不会有新的建树，前人的道路固然重要，但是学会另辟蹊径更为重要。

薄层色谱的展开剂和显色剂

薄层色谱展开剂与显色剂 展开剂的选择： 一般常用溶剂按照极性从小到大的顺序排列大概为：石油迷<己烷<苯<乙醚<乙酸乙酯<丙酮<乙醇<甲醇使用单一溶剂，往往不能达到很好的分离效果，往往使用混合溶剂通常使用一个高极性和低级性溶剂组成的混合溶剂，高极性的溶剂还有增加区分度的作用，常用的溶剂组合有：< p> Petroleumether/Ethylacetate,petroleumether/Acetone,Petroleumether/Eth er, Petroleumether/CH2Cl2, ethylacetate/MeOH,CHCl3/ethylacetate 展开剂的比例要靠尝试.一般根据文献中报道的该类化合物用什么样的展开剂，就首先尝试使用该类展开剂，然后不断尝试比例，直到找到一个分离效果好的展开剂。展开剂的选择条件：①对的所需成分有良好的溶解性;②可使成分间分开;③待测组分的Rf在0.2~0.8之间，定量测定在0.3～0.5之间;④不与待测组分或吸附剂发生化学反应;⑤沸点适中，黏度较小;⑥展开后组分斑点圆且集中;⑦混合溶剂最好用新鲜配制。 一般来说，弱极性溶剂体系的基本两相由正己烷和水组成，再根据需要加入甲醇、乙醇，乙酸乙酯来调节溶剂系统的极性，以达到好的分离效果，适合于生物碱、黄酮、萜类等的分离;中等极性的溶剂体系由氯仿和水基本两相组成，由甲醇、乙醇，乙酸乙酯等来调节，适合于蒽醌、香豆素，以及一些极性较大的木脂素和萜类的分离;强极性溶剂，由正丁醇和水组成，也靠甲醇、乙醇，乙酸乙酯等来调节，适合于极性很大的生物碱类化合物的分离。很多时候,展开剂的选择要靠自己不断变换展开剂的组成来达到最佳效果。

离子交换柱层析操作(包涵体蛋白)

离子交换柱层析操作 （包涵体蛋白） 1.装柱： 1.1 取出层析柱，用去离子水冲洗干净，连接好管子后固定柱子； 1.2用水冲洗层析柱3-5次，每次10ml去离子水； 1.3取出填料，静止至室温后，根据需要用移液器取出3-5ml的填料进行装柱， 1.4用去离子水冲洗填料5个柱体积； 2.柱的平衡与上样： 2.1用0.02M TB bufferB 缓冲液(PH7.6)平衡Ni柱，直至流出液的pH为7.6； 2.2对处理的样品进行过滤后，缓慢上样让蛋白充分结合； 3洗杂蛋白： 3.1用0.02M TB bufferB 缓冲液(PH7.6)过柱，清洗没有结合到层析柱上的杂蛋白，至流出液与缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测；3.2用含10mM咪唑的TB bufferB 缓冲液（PH7.6）过柱，共洗约30ml，至流出液与含10mM咪唑的TB bufferB 缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测； 3.3用含20mM咪唑的TB bufferB 缓冲液（PH7.6）过柱，共洗约30ml，至流出液与含20mM咪唑的TB bufferB 缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测； 3.4用含40mM咪唑的TB bufferB 缓冲液（PH7.6）过柱，共洗约30ml，至流出液与含40mM咪唑的TB bufferB 缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测； 3.5用含60mM咪唑的TB bufferB 缓冲液（PH7.6）过柱，共洗约30ml，至流出液与含60mM咪唑的TB bufferB 缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测； 3.6用含80mM咪唑的TB bufferB 缓冲液（PH7.6）过柱，共洗约30ml，至流出液与含80mM咪唑的TB bufferB 缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测； 3.2用含100mM咪唑的TB bufferB 缓冲液（PH7.6）过柱，共洗约30ml，至流

柱色谱分离染料实验报告

竭诚为您提供优质文档/双击可除柱色谱分离染料实验报告 篇一：柱色谱实验报告 柱色谱分离实验报告篇二：色谱实验报告色谱实验报告项目一：气相色谱流出曲线的研究一：实验目的 1、2、3、 掌握气相色谱仪的基本结构及工作原理理解色谱流出曲线中各参数的表示方法掌握气 相色谱中定性、定量分析方法 二、实验原理 气相色谱的固定相是涂布在载体表面的固定液，试样气体由载气携带进入色谱柱，与固 定液接触时，气相中各组分便溶解在固定液中。随着载气的不断通入，被溶解的组分又从固 定液中挥发出来，挥发出的组分随载气向前移动时又再次被固定液溶解。由于各组分在固定 液中的溶解能力不同，随着载气的流动，各组分在两相间经过反复的溶解-挥发过程，经过一

段时间，最终实现彼此分离。色谱图是指被测组分从进样开始，经色谱柱分离到组分全部流过检测器后，所产生的响 应信号随时间分布的图像。色谱图上有一组色谱峰，每每个峰代表试样中的一个组分。色谱 流出曲线是以组分流出色谱柱的时间或载气流出的体积为横坐标，以检测器对各组分的电信 号响应值为纵坐标的一条曲线。三、仪器与试剂1、仪器气相色谱仪2、试剂乙醇、正丁 醇 四、实验步骤1、调试气相色谱仪2、分别进行进样 3、进乙醇和正丁醇的混合物样品，分别记录保留时间 五、实验记录 1、色谱条件:50m柱经：320μm固定液：聚乙二醇载气：氮气检测器类型：fid检测器温度：150℃柱温：95℃气化室温度：165℃气体流量：载气30ml／min 2、色谱图参数六：实验结果分析 从实验结果所占百分比可以看出该实验出峰效果较明显，乙醇先出峰，正丁醇后出峰。 在做实验时我们应注意一些问题，比如说乙醇和正丁醇要按一定的比例来混合，柱温要设置 合理，最低要高于正丁醇的沸点，也不能过高，否则会

离子交换层析柱的装填及处理

离子交换层析柱的装填及处理 一、原理： 有些高分子物质含有一些可以分离的基因，例如-SO3H，-COOH等，因此可以和溶液中的离子产生交换反应。如：R-SO3H＋M+ R-S3M＋H+ 或R-NH3OH＋CL－— R-NH3CL＋OH －这类高分子物质通称离子交换剂，其中使用最普遍的是离子交换树脂。由于一定的离子交换剂对不同离子的亲和力不同，因此在洗提过程中，不同的离子在离子交换柱上的迁移速度也不同，最后得到分离。 二、目的与要求： 本实验是采用Zerolit225型阳离子交换树脂所装的柱，选以特定的PH缓冲洗脱液来分离含有两个性质不同的氨基酸溶液。通过实验要求掌握装柱、上样、洗脱、收集等离子交换柱层析技术的要点。 三、仪器与装置： 玻璃层析柱：长19cm，内径1、2cm，3# 砂芯。H L-2型恒流泵。H D-4型电脑核酸蛋白检测仪。B S-100A自动部份收集器。 250ml烧杯。 1ml吸管。 水浴锅。 72型（或721型）分光光度计。

四、试剂与药品： 树脂：Zerolit225型阳离子交换树脂。 洗脱液：0、45N，PH5、3柠檬酸缓冲液，取285g柠檬酸 （C6O7H8?H2O）；186g97℅NaOH；105ml浓硫酸溶于水中稀释至10升。 样品液：0、005M ASP和LYs的0、02N HCL混合溶液。 显色剂：显色剂列出两种可任选一种。 显色剂（Ⅰ）茚三酮-TiCL3溶液。 10g茚三酮溶于500ml乙二醇甲醚，再加入0、85 ml TiCL3（15%）显色剂（Ⅱ）：茚三酮-KCN溶液。 0、1M KCN:0、1628g KCN溶于水中稀释至250ml A、将1、25g茚三酮溶于25ml乙二醇甲醚，配成5%（W/V）浓度的溶液。B 、将2、5ml 0、01M KCN溶液与125ml乙醇甲醚混合。将A和B合并置棕色瓶中过夜即可使用。此溶剂用时， A、B两溶液在前一天合并，配好的溶液仅能在1-2天内使用，过时失效须重配。 五、方法与步骤： 1、树脂的处理： 关于市售新树脂的处理见 7、，本实验采用处理好的树脂。 2、装柱：将层析柱垂直装好，关闭柱底出口，在柱内注入约1cm高的柠檬酸缓冲液。

柱层析和薄层层析试验报告

柱层析和薄层层析实验报告 篇一：柱层析实验报告柱层析分离色素 一、【实验目的】 1．了解柱层析的分类，掌握各种柱层析的原理。 2．熟练掌握吸附层析的原理和操作技术。 二、【实验原理】 叶绿体色素是植物吸收太阳光能进行光合作用的重要物质，主要有叶绿素a、叶绿素b、胡萝卜素和叶黄素组成。从植物叶片中

提取和分离叶绿体色素是对其认识和了解的前提。利 用叶绿体色素能溶于有机溶剂的特性，可用95%乙醇或无水乙醇提取。分离色素的方法有多种，如纸层析、柱层析等。柱层析法是色谱法中的一种，它是根据 混合物中各组分对固定相的吸附能力，以及对洗脱剂（即移动相）的溶解供参考． 度不同将各组分分 离。常用的柱色谱有吸附色柱谱和分配柱色谱两类。吸附柱色谱通常是在玻璃管中填入表面 积很大，经过活化的多孔性物质

或粉状固体作为吸附剂（如氧化铝或硅胶），当混合物的溶液 流经吸附柱时，就被吸附在柱的上端，然后从柱顶加入溶剂（洗脱剂）洗脱。由于不同化合 物在吸附柱上的吸附能力不同，在同一溶剂中的溶解度也不同，因此各组分随溶剂以不同速 度下移，形成色带。继续用溶剂洗脱，吸附能力最弱的组分就随溶剂首先流出，整个层析过 程进行反复的吸附-解析-再吸附-再解吸。用柱层析法可以分别收集各组分，并逐个鉴定。本实验是把三氧化二铝填入玻璃管中

（压成柱状）作为吸附剂，将叶绿体色素的石油醚 提取液倾于吸附柱上，色素即被吸附。由于色素的种类不同，被吸附的强弱不同，就在吸附 柱上排列成为不同的色层，再利用供参考． 吸附剂在不同溶剂中有不同的吸附力，用不同的溶剂进行 洗脱，从而达到叶绿体主要的4种色素（叶绿素a、叶绿素b、叶黄素、胡萝卜素）的分离。 三、【实验材料】 原料： 新鲜的菠菜叶

离子交换层析柱子的选择

离子交换层析技术 离子交换层析技术是以离子交换纤维素或以离子交换葡聚糖凝胶为固定相，以蛋白质等样品为移动相，分离和提纯蛋白质、核酸、酶、激素和多糖等的一项技术。 （一）原理在纤维素与葡聚糖分子上结合有一定的离子基团，当结合阳离子基团时，可换出阴离子，则称为阴离子交换剂。如二乙氨乙基（Dicthylaminoethyl ，DEAE ）纤维素。在纤维素上结合了DEAE ，含有带正电荷的阳离子纤维素—O—C6 H14N +H ，它的反离子为阴离子（如Cl-等），可与带负电荷的蛋白质阴离子进行交换。当结合阴离子基团时，可置换阳离子，称为阳离子交换剂，如羧甲基（Carboxymethy ，CM ）纤维素。纤维素分子上带有负电荷的阴离子（纤维素－O－CH2－COO 一），其反离子为阳离子（如Na+等）,可与带正 电荷蛋白质阳离子进行交换。 溶液的pH 值与蛋白质等电点相同时，静电荷为0，当溶液pH 值大于蛋白质等电点时，则羧基游离，蛋白质带负电荷。反之，溶液的pH 值小于蛋白质等电点时，则氨基电离，蛋白质带正电荷。溶液的pH 值距蛋白质等电点越远，蛋白质的电荷越多。反之则越少。血清蛋白质均带负电荷，但各种蛋白质带负电荷的程度有所差异，以白蛋白为最多，依次为球蛋白，球蛋白和球蛋白。 在适当的盐浓度下，溶液的pH 值高于等电点时，蛋白质被阴离子交换剂所吸附；当溶液的pH 值低于等电点时，蛋白质被阳离子交换剂所吸附。由于各种蛋白质所带的电荷不同。它们与交换剂的结合程度也不同，只要溶液pH 值发生改变，就会直接影响到蛋白质与交换剂的吸附，从而可能把不同的蛋白质逐个分离开来。 交换剂对胶体离子（如蛋白质）和无机盐离子（如NaCl ）都具有交换吸附的能力，当两者同时存在于一个层析过程中，则产生竞争性的交换吸附。当Cl 一的浓度大时，蛋白质不容易被吸附，吸附后也易于被洗脱，当Cl 一浓度小时，蛋白质易被吸附，吸附后也不容易被洗脱。因此，在离子交换层析中，一般采用两种方法达到分离蛋白质的目的。一种是增加洗脱液的离子强度，一种是改变洗脱液的pH 值。pH 值增高时，抑制蛋白质阳离子化，随之对阳离子交换剂的吸附力减弱。pH 值降低时，抑制蛋白质阴离子化，随之降低了蛋白质对阴离子交换剂的吸附。当使用阴离子交换剂时，增加盐离子，则降低pH 值。当使用阳离子交换剂时，增加盐离子浓度，则升高溶液pH 值。 （二）常用离子交换剂的种类与特性 1. 离子交换纤维素离子交换纤维素的种类很多，其种类与特性如表1－1 所示。 表1-1 离子交换剂的类型与特点

生化实验报告模版

生物化学实验报告 姓名：郭玥 学号： 3120100021 专业年级： 2012级护理本科 组别：第8实验室 生物化学与分子生物学实验教学中心

【实验报告第一部分（预习报告内容）：①实验原理、②实验材料（包括实验样品、主要试剂、主要仪器与器材）、③实验步骤（包括实验流程、操作步骤和注意事项）；评分（满分30分）：XX】 实验目的：1、掌握盐析法分离蛋白质的原理和基本方法 2、掌握凝胶层析法分离蛋白质的原理和基本方法 3、掌握离子交换层析法分离蛋白质的原理和基本方法 4、掌握醋酸纤维素薄膜电泳法的原理和基本方法 5、了解柱层析技术 实验原理：1、蛋白质的分离和纯化是研究蛋白质化学及其生物学功能的重要手段。 2、不同蛋白质的分子量、溶解度及等电点等都有所不同。利用这些性质的差别， 可分离纯化各种蛋白质。 3、盐析法：盐析法是在蛋白质溶液中，加入无机盐至一定浓度或达饱和状态，可 使蛋白质在水中溶解度降低，从而分离出来。蛋白质溶液中加入中性盐后，由 于中性盐与水分子的亲和力大于蛋白质，致使蛋白质分子周围的水化膜减弱乃 至消失。中性盐加入蛋白质溶液后由于离子强度发生改变，蛋白质表面的电荷 大量被中和，更加导致蛋白质溶解度降低，蛋白质分子之间聚集而沉淀。

4、离子交换层析:离子交换层析是指流动相中的离子和固定相上的离子进行可逆 的交换，利用化合物的电荷性质及电荷量不同进行分离。 5、醋酸纤维素薄膜电泳原理：血清中各种蛋白质的等电点不同，一般都低于pH7.4。 它们在pH8.6的缓冲液中均解离带负电荷，在电场中向正极移动。由于血清中 各种蛋白质分子大小、形状及所带的电荷量不同，因而在醋酸纤维素薄膜上电 泳的速度也不同。因此可以将它们分离为清蛋白（Albumin)、α1-球蛋白、α 2-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白5条区带。 实验材料：人混合血清葡聚糖凝胶（G-25)层析柱 DEAE纤维离子交换层析柱饱和硫酸铵溶液 醋酸铵缓冲溶液 20%磺基水杨酸 1%BaCl 溶液氨基黑染色液 2 漂洗液 pH8.6巴比妥缓冲溶液 电泳仪、电泳槽 实验流程：盐析（粗分离）→葡聚糖凝胶层析（脱盐）→DEAE纤维素离子交换层析（纯化）→醋酸纤维素薄膜电泳（纯度鉴定） 实验步骤： （一）盐析+凝胶柱层析除盐：

实验一 薄层色谱及纸色谱

硅胶（或硅胶G ）粉、0.5%～0.8%羧甲基纤维素钠水溶液、2%罗丹明B 与2%二甲基黄的乙醇混合溶液、2%罗丹明B 乙醇溶液、2%二甲基黄乙醇溶液、95%乙醇、精氨酸和脯氨酸的混合溶液、精氨酸溶液、脯氨酸溶液、正丁醇－醋酸－水（4∶1∶5上层）、0.2%茚三酮溶液、薄层板（6cm ×12cm ）、中速色谱滤纸、色谱缸、色谱槽。 【实验原理】 薄层色谱和纸色谱是检识天然药物化学成分的常用方法。薄层色谱一般情况下是吸附色谱，适用于微量样品的分离、鉴定，天然药物的定性、定量分析，化合物的纯度检查，寻找柱色谱分离的最佳条件及检识柱色谱分离结果等。 纸色谱是一种以滤纸为支持剂，滤纸上吸着的水分为固定相的分配色谱，在分离鉴定水溶性化合物时应用较多。其原理是利用化合物在固定相和移动相中分配系数的不同而达到分离。 【实验内容】 一、薄层色谱 （一）硅胶板的制备 （二）点样 （三）展开 （四）R f 值的计算方法 二、纸色谱 （一）滤纸的选择 （二）点样 （三）展开 （四）显色 【实验说明及注意事项】 1.铺制薄层板用的羧甲基纤维素钠溶液的浓度为0.5%～0.8%，一般预先配制，静置，取其上清液或用棉花过滤后应用，则所制得的薄层板表面比较光滑细腻。 2.薄层色谱制板前，应将薄层板洗净并干燥，待吸附剂与黏合剂混合均匀后，立即铺板，振荡均匀后水平放置，振荡时间不宜过长。 3.滤纸的裁剪应注意其纹路的方向应与展开方向垂直，滤纸应保持平整、洁净，不能折叠和污染。 4.点样时，应防止污染薄层板面和滤纸，点样应少量多次（一般为2～3次），且样点的直径不可过大，否则斑点过于扩散，影响分离效果。 5.展开时，薄层板和色谱滤纸的两边不能与展开容器接触，起始线不能浸在移动相中，展开用的容器应密闭以及选择灵敏度高的显色剂。 原点至溶剂前沿的距离 原点至斑点中心的距离 f R

凝胶层析实验报告

凝胶层析实验报告 一.实验目的:将血红蛋白与鱼精蛋白混合物进行分离 二.实验原理: 凝胶是一种具有多孔,网状结构的分子筛. 分子量不同通过凝胶柱的速度也不同,利用这种凝胶分子筛对大小不同的分子进行层析分离. 当样品溶液通过凝胶柱时,相对分子质量较大的物质由于直径大于凝胶网孔而只能沿着凝胶颗粒间的孔隙,随着溶剂流动,因此流程较短,向前移动速度快而首先流出层析柱; 反之,相对分子质量较小的物质由于直径小于凝胶网孔,可自由地进出凝胶颗粒的网孔,在向下移动过程中,它们从凝胶内扩散到胶粒孔隙后再进入另一凝胶颗粒,如此不断地进入与逸出,使流量增长,移动速率慢而最后流出层析柱.从而在大分子物质与小分子物质之间被洗脱. 这样,经过层析柱,使混合物中的各物质按其分子大小不同而被分离. 三.主要仪器和试剂: 铁架台层析柱胶管交联葡聚糖凝胶G-50 血红蛋白鱼精蛋白混合物(aq) 四.操作步骤: 1 连接装置:将层析柱固定在铁架台上,保持与水平面垂直,底部与胶管连接.胶管下端置于烧杯中. 2 装柱:将尼龙网放入层析柱底部, 使其水平固定;夹住胶管向柱中注水,松手放水,使水流到剩一厘米,让气泡流出,夹住胶管. 3 灌胶:将凝胶搅拌均匀,用玻璃棒引流将凝胶溶液一次性倒入层析柱约20ml;夹住胶管片刻,然后打开夹子,让凝胶沉淀约20分钟(凝胶与水分层),当水流至离凝胶约5mm处时,夹住胶管.用玻璃棒取滤纸一片伸入层析柱,放置于凝胶表面之上水面之下,打开夹子,当露出滤纸,关闭夹子. 4 加样:用胶头滴管取血红蛋白’鱼精蛋白混合液,滴入层析柱,约两滴. 5 洗脱:当待分离混合液渗入滤纸后,加少量水,开夹放水,(水面始终位于滤纸之上),反复两三次;关闭止水夹到入大量水,再开夹.等待分离 6 回收:将洗净的凝胶回收以便再次利用 五.实验现象: 观察看到红色的液体先被分离,流至烧杯中;黄色液体流速很慢,最终流入烧杯.

薄层层析的原理与操作

薄层层析的原理与操作 薄层色谱，或称薄层层析(thin-layer chromatography)，是以涂布于支持板上的支持物作为固定相，以合适的溶剂为流动相，对混合样品进行分离、鉴定和定量的一种层析分离技术。这是一种快速分离诸如脂肪酸、类固醇、氨基酸、核苷酸、生物碱及其他多种物质的特别有效的层析方法，从50年代发展起来至今，仍被广泛采用。 一、基本原理 薄层层析是把支持物均匀涂布于支持板(常用玻璃板，也可用涤纶布等)上形成薄层，然后用相应的溶剂进行展开。薄层层析可根据作为固定相的支持物不同，分为薄层吸附层析(吸附剂)、薄层分配层析(纤维素)、薄层离子交换层析(离子交换剂)、薄层凝胶层析(分子筛凝胶)等。一般实验中应用较多的是以吸附剂为固定相的薄层吸附层析。 吸附是表面的一个重要性质。任何两个相都可以形成表面，吸附就是其中一个相的物质或溶解于其中的溶质在此表面上的密集现象。在固体与气体之间、固体与液体之间、吸附液体与气体之间的表面上，都可能发生吸附现象。 物质分子之所以能在固体表面停留，这是因为固体表面的分子(离子或原子)和固体内部分子所受的吸引力不相等。在固体内部，分子之间相互作用的力是对称的，其力场互相抵消。而处于固体表面的分子所受的力是不对称的，向内的一面受到固体内部分子的作用力大，而表面层所受的作用力小，因而气体或溶质分子在运动中遇到固体表面时受到这种剩余力的影响，就会被吸引而停留下来。吸附过程是可逆的，被吸附物在一定条件下可以解吸出来。在单位时间内被吸附于吸附剂的某一表面积上的分子和同一单位时间内离开此表面的分子之间可以建立动态平衡，称为吸附平衡。吸附层析过程就是不断地产生平衡与不平衡、吸附与解吸的动态平衡过程。 例如用硅胶和氧化铝作支持剂，其主要原理是吸附力与分配系数的不同，使混合物得以分离。当溶剂沿着吸附剂移动时，带着样品中的各组分一起移动，同时发生连续吸附与解吸作用以及反复分配作用。由于各组分在溶剂中的溶解度不同，以及吸附剂对它们的吸附能力的差异，最终将混合物分离成一系列斑点。如作为标准的化合物在层析薄板上一起展开，则可以根据这些已知化合物的Rf值(后面介绍Rf值)对各斑点的组分进行鉴定，同时也可以进一步采用某些方法加以定量。 薄层层析有许多优点：它保持了操作方便、设备简单、显色容易等特点，同时展开速率快，一般仅需15～20分钟;混合物易分离，分辨力一般比以往的纸层析高10～100倍，它既适用于只有0.01μg的样品分离，又能分离大于500mg的样品作制备用，而且还可以使用如浓硫酸、浓盐酸之类的腐蚀性显色剂。薄层层析的缺点是对生物高分子的分离效果不甚理想。 二、固定相支持剂的选择和处理 在薄层层析时，对支持剂的选择主要考虑两方面：一是支持剂的性质与适用范围;二是支持剂的颗粒大小。一般来说，所选吸附剂应具有最大的比表面积和足够的吸附能力，它对欲分离的不同物质应有不同的吸附能力，即有足够的分辨力;所选吸附剂与溶剂及样品组分不会发生化学反应。吸附力的强弱规律可概括如下：吸附力与两相间界面张力的降低成正比，某物质溶液中被吸附的程度与其在溶剂中的溶解度成反比。极性吸附剂易吸附极性物质，非极性吸附剂易吸附非极性物质。同族化合物的吸附程度有一定的变化方向，例如，同系物极性递减，而被非极性表面吸附的能力将递增。

离子交换层析实验原理及步骤

离子交换层析实验原理及步骤 离子交换层析实验方法 阴离子交换剂与阳离子交换剂的装柱和层析过程基本相同。交联葡聚糖的预处理只需充分溶胀和平衡，不需要除去细粒碎片和酸碱处理。其他步骤也基本同离子交换纤维素。 1. 剂型的选择 根据蛋白质在所用缓冲液pH值下带电荷的种类选择，如pH高于蛋白质等电点，应选阴离子交换剂，反之应选阳离子交换剂。一般情况下，DEAE-纤维素用于分离酸性蛋白，而CM纤维素用于分离碱性蛋白质。 下面以DEAE-纤维素操作为例，介绍试验方法 2. 膨胀活化 此步的目的在于除去杂质，暴露DEAE-纤维素上的极性基团。DEAE-纤维素的用量则根据柱容积的大小和所需过柱样品的量来决定。一般是1.0g DEAE-纤维素相当于6ml～8ml柱床体积。 表1－4 分离的血清与所需DEAE—纤维素量及其他条件的大致关系 血清样品量（ml） DEAE需用量（g） 选层析柱规格（cm） 选脱液量（ml） 1~2 2 1×25 100~150 5 5 2×12 200~300 10 10 2×20 300~400 20 20 2×37

400~800 称取所需的量，撒于0.5Mol/L NaOH溶液中（1g DEAE—纤维素干粉约需15倍NaOH液），浸泡1h左右，不时搅拌。抽滤（以布氏漏斗加两层滤纸或尼龙纱布抽滤），以蒸馏水洗涤，再抽滤，直至滤液近中性为止，再将纤维素浸泡于0.5Mol/L HCl中1h，同样抽滤液至近中性。再将纤维素浸于0.5Mol/L NaOH液中，同样处理，洗至中性。 3. 平衡 将DEAE—纤维素放入0.0lMol/L pH 7. 4 PB液中（即起始缓冲液），静止1h，不时搅拌，待纤维素下沉后，倾去上清液或抽滤除去洗液，如此反复几次至倾出液体的pH值与加入的PB液的pH值相近时为止。 4. 装柱 层析柱的选择要大小、长度适当。一般而言，柱长和柱直径之比为10∶1～20∶1，柱的内径上下要均匀一致。用前将层析柱在清洁液内浸泡处理24h，然后依次用常水、蒸馏水、起始缓冲液充分洗涤。 装柱时，先剪一块圆形的尼龙纱布（直径与层析柱内径一致），放入层析柱底部。将柱下端连接细塑料管，夹上螺旋夹。把层析柱垂直固定在三角铁架上，倒入起始缓冲液至一半的柱高，除去死区及塑料管内的气泡。再将平衡的DEAE－纤维素糊状物沿管壁倒入柱中。注意不要产生气泡，如有气泡应排除或重装。拧开螺旋夹，使流速至1ml/5min，待缓冲液快接近纤维素面时，继续倒入纤维素糊，同时用玻璃棒搅拌表面层，以免使两次加入的纤维素形成分界层，通过进出缓冲液调节流量，也可通过塑料管的升降来控制，至柱床体积不变为止。剪一圆形滤纸（与柱内径大小一致），从柱的上端轻轻放入，使其沉接于纤维素床表面，以免在加样时打乱纤维素层。装好柱的柱面应该是平整的，无倾斜，整个柱床内无气泡、不分层。继续平衡，使流出液的pH值与流入液的pH值完全一致为止。 5. 上样 要层析的样品首先必须用起始缓冲液（4℃）平衡过夜，中间可换液数次。将柱的上端打开，用吸管将纤维素柱上面的缓冲液吸出，不要吸净，留一薄层液面，以免空气进入。沿管壁缓缓加入样品，注意不要打乱纤维素表层。拧开下端的螺旋夹，使样品进入交换剂中，快要进完时，加1ml～2ml缓冲液冲洗柱壁，随即用多量的洗脱液洗脱。 样品的加量与DEAE—纤维素有一个最适比的关系，超过这个比值，吸附就不完全，直接影响到分离的纯度。经过粗提的—球蛋白50mg～100mg，用干重约4g DEAE－纤维素装柱分离，可获得理想结果。