植物体内游离脯氨酸含量的测定
植物体内游离脯氨酸含量的测定
目的意义
植物在正常条件下游离脯氨酸（proline，Pro）含量很低，但在干旱、高温、低温、盐碱、水涝等逆境条件下便会大量积累，并且积累指数与植物的抗逆性呈正相关关系。因此，脯氨酸可作为植物抗逆性的一项生化指标，测定其含量也成为抗性生理研究的重要内容之一。
本实验的目的是掌握游离脯氨酸含量的测定方法、原理及操作技术。
一、酸性茚三酮法
（一）原理
植物体内的氨基酸只有脯氨酸能与酸性茚三酮发生反应，生成稳定的红色产物。该产物在515nm有一最大吸收高峰，其吸收值与脯氨酸的含量呈直线关系。因此，样品中的脯氨酸含量可用酸性茚三酮法测定。除脯氨酸外，酸性和中性氨基酸不能与酸性茚三酮形成红色产物，碱性氨基酸对这一反应只有轻度干扰，在同类样品的测定中可忽略不计，在不同样品的测定中可加入人造沸石排除这种干扰。
（二）实验材料、仪器与试剂
1. 实验材料：正常生长与经逆境处理的植物茎、叶、穗等器官或组织。
2. 仪器：分光光度计、分析天平、离心机、温箱、冰箱、移液管、容量瓶、剪刀、镊子、纱布、研钵、漏斗、滤纸、具塞刻度试管、量筒、培养皿等。
3. 试剂：
（1）酸性茚三酮试剂：称取重结晶茚三酮2.5g放入烧杯，加冰醋酸60mL、6mol·L-1磷酸40mL 于70℃下溶解，冷却后装入棕色瓶内贮于4℃冰箱中，24h内稳定。现用现配。
（2）100μg·mL-1脯氨酸母液：精确称取脯氨酸0.0100g溶于少量80％乙醇中，用蒸馏水定容至100mL。
（3）其他试剂：人造沸石、活性炭粉、冰醋酸、80％乙醇。
（三）操作步骤
1. 标准曲线制作：
（1）取7个50mL容量瓶，分别放入脯氨酸母液0.5、1.25、2.5、5.0、7.5、10.0、12.5mL，用蒸馏水定容至刻度，摇匀，各瓶的脯氨酸浓度分别为1.0、2.5、5.0、10.0、15.0、20.0、25.0μg·mL-1。
（2）另取具塞刻度试管8只（0～7号），0号加入2mL蒸馏水，1～7号分别加入不同浓度的标准系列各2mL，再分别加入冰醋酸2mL和茚三酮试剂2mL，充分摇匀，加盖，沸水浴10～15min。以0号管溶液为空白对照，于515nm处比色，记录消光值，以消光值为纵坐标，脯氨酸浓度为横坐标，绘制标准曲线。
2. 样品提取：称取鲜样0.5～1.0g，放入研钵或匀浆器中，加入80％乙醇3mL和石英砂少许研成匀浆，移入具塞刻度试管中，并用80％乙醇冲洗研钵，匀浆液与洗液合并总量为10mL，加盖后沸水浴煮沸10min，再加活性炭粉末0.25g，振荡过滤（用80％乙醇冲洗滤纸与残渣3次），滤液于80～85℃水浴上蒸去乙醇，残渣用蒸馏水洗涤并定容至100mL供测定之用。
3. 样品测定：取大试管1只，加样品提取液10mL和人造沸石1g，摇动10min并滤去人造沸石。取具塞刻度试管2只，各加入上述过滤样液2mL、冰醋酸2mL、茚三酮试剂2mL，
摇匀后加盖，于沸水浴中煮沸10～15min，冷却后于515nm下比色，记录OD值。
（四）结果计算
W V
C A ?
=
式中：A为样品脯氨酸含量（μg·g-1）；C为从标准曲线上查得脯氨酸浓度（μg·mL-1）；V为样品稀释体积（mL）；W为样品重量（g）。
【附注】
脯氨酸与茚三酮于100℃下的反应时间需严格控制，不宜过久，否则将产生沉淀。
二、磺基水杨酸法
（一）原理
当用磺基水杨酸提取植物样品时，脯氨酸便游离于磺基水杨酸的溶液中，然后用酸性茚三酮加热处理后，溶液即成红色，再用甲苯处理，则色素全部转移至甲苯中。色素颜色的深浅即表示脯氨酸含量的高低。在520nm波长下比色测定吸光度，从标准曲线上查出脯氨酸的含量。
（二）实验材料、仪器与试剂
1. 实验材料：待测植物（水稻小麦、玉米、高粱、大豆等）叶片。
2. 仪器：分光光度计、冰浴锅、研钵、小烧杯、容量瓶、具塞刻度试管、普通试管、移液管、注射器、漏斗、滤纸、剪刀等。
3. 试剂：
（1）酸性茚三酮溶液：将1.25g茚三酮溶于30mL冰醋酸和20mL 6mol·L-1磷酸中，搅拌加热（70℃）溶解，贮于冰箱中。
（2）3％磺基水杨酸：称取3g磺基水杨酸加蒸馏水溶解后定容至100mL。
（3）其他试剂：冰醋酸、甲苯。
（三）操作步骤
1．标准曲线的制作
（1）在分析天平上精确称取25mg脯氨酸，倒入小烧杯内，用少量蒸馏水溶解，然后倒入250mL容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，此标准液浓度为100μg·mL-1。
（2）取6个50mL容量瓶，分别加入脯氨酸原液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL，用蒸馏水定容至刻度，摇匀，各瓶的脯氨酸浓度分别为l、2、3、4、5、6μg·mL-1。
（3）取6支具塞刻度试管，分别吸取2mL系列标准浓度的脯氨酸溶液及2mL冰醋酸和2mL酸性茚三酮溶液，每管在沸水浴中加热30min。
（4）冷却后各试管准确加入4mL甲苯，振荡30s，静置片刻，使色素全部转至甲苯溶液。
（5）用注射器轻轻吸取各管上层脯氨酸甲苯溶液至比色杯中，以甲苯溶液为空白对照，于520 nm波长处进行比色。
（6）以消光值为纵坐标，脯氨酸浓度为横坐标，绘制标准曲线。
2．样品的测定
（1）准确称取不同处理的待测植物叶片各0.5g，分别置于具塞刻度试管中，然后向各管分别加入5mL 3％磺基水杨酸溶液，在沸水浴中提取10min（提取过程中要经常摇动），冷却后过滤于干净的试管中，滤液即为脯氨酸的提取液。
（2）吸取2mL提取液于另一干净的具塞刻度试管中，加入2mL冰醋酸及2mL酸性茚三
酮试剂，在沸水浴中加热30min ，溶液即呈红色。
（3）冷却后加入4mL 甲苯，摇荡30s ，静置片刻，取上层液至10mL 离心管中，以3000rpm 离心5min 。
（4）用注射器轻轻吸取上层脯氨酸红色甲苯溶液于比色杯中，以甲苯为空白对照，在分光光度计上520nm 波长处比色，记录吸光度值。
（四）结果计算
10010
56???=
W C A 式中：A 为样品脯氨酸含量（％）；C 为测定液中脯氨酸浓度（μg ·mL -1）；5为3％磺基水杨酸的量（mL ）；W 为样品鲜重（g ）。
羟脯氨酸(HYP)含量检测试剂盒说明书 可见分光光度法
羟脯氨酸（HYP）含量检测试剂盒说明书可见分光光度法 注意：正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定。 货号：BC0250 规格：50T/48S 产品内容： O（V/V）=1:1，室温保存。 提取液：6mol/L盐酸，自备。浓盐酸：H 2 试剂一：液体15mL×1瓶，4℃避光保存。 试剂二：液体15mL×1瓶，4℃避光保存。 标准品：液体1mL×1支，0.5mg/mL羟脯氨酸标准品，4℃保存。 产品说明： HYP是机体胶原蛋白主要成分之一，胶原蛋白大多分布于皮肤、腱、软骨和血管等，因此HYP含量是反映胶原组织代谢及纤维化程度的一项重要指标。 样品经酸水解产生游离的HYP，进一步被氯胺T氧化，氧化产物与对二甲氨基苯甲醛反应，产生红色化合物，在560nm处有特征吸收峰。通过测定样品水解液560nm吸光值，可计算HYP含量。 自备实验用品及仪器： 天平、烘箱、玻璃管、离心机、水浴锅、可见分光光度计、1mL玻璃比色皿、6mol/L盐酸和蒸馏水。操作步骤： 一、羟脯氨酸提取 1.组织：称取约0.5g样品于玻璃管，将组织尽量剪碎以便消化，盖子稍松不密闭。加入5mL的提取液，煮沸或110℃烘箱2至6小时消化至没有可见大的团块，16000rpm，25℃，离心20min（若离心后仍有杂质，可通过过滤去除），用10mol/LNaOH（约3mL）调节pH值至6～8范围内。蒸馏水定容至8mL，取上清待测。（过程中可能有黑色物质生成，若长时间不能消化，可能为碳化的物质） 2.细胞：取500万个细胞，加入1mL的提取液，煮沸或110℃烘箱2至6小时消化至透明状，16000rpm， 第1页共3页
脯氨酸含量的测定
脯氨酸含量的测定 在逆境条件下，植物体内脯氨酸（proline，Pro）的含量显著增加。植物体内脯氨酸含量在一定程度上反映了植物的抗逆性，抗旱性强的品种往往积累较多的脯氨酸。因此测定脯氨酸含量可以作为抗旱育种的生理指标。另外，由于脯氨酸亲水性极强，能稳定原生质胶体及组织内的代谢过程，因而能降低凝固点，有防止细胞脱水的作用。在低温条件下，植物组织中脯氨酸含量增加，可提高植物的抗寒性，因此，亦可作为抗寒育种的生理指标。 一、原理 当用磺基水杨酸提取植物样品时，脯氨酸便游离于磺基水杨酸的溶液中，然后用酸性茚三酮加热处理后，溶液即为红色，再用甲苯处理，则色素全部转移至甲苯中，色素的深浅即表示脯氨酸含量的高低。在520nm波长下比色，从标准曲线上查出（或用回归方程计算）脯氨酸的含量。 二、材料、仪器设备及试剂 （一）材料 待测植物叶片 （二）仪器设备 1. 722型分光光度计； 2.研钵； 3.100ml小烧杯； 4.容量瓶； 5.大试管； 6.普通试管； 7.移液管； 8.注射器； 9.水浴锅； 10.漏斗； 11.漏斗架； 12.滤纸； 13.剪刀。 （三）试剂 1.酸性茚三酮溶液：将1.25g茚三酮溶于30ml冰醋酸和20ml 6mol/l 磷酸中，搅拌加热（70℃）溶解，贮于冰箱中。 2.3%磺基水杨酸：3g磺基水杨酸加蒸馏水溶解后定容至100ml。 3.冰醋酸。 4.甲苯。 三、实验步骤 1.标准曲线的绘制 （1）在分析天平上精确称取25mg脯氨酸，倒入小烧杯中内，用少量蒸馏水溶解，然后倒入250ml容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，此标准液中每毫升含脯氨酸100ug。 （2）系列脯氨酸浓度的配置：取6个50ml容量瓶，分别加入脯氨酸原液0.5ml、1.0ml、1.5ml、2.0ml、2.5ml及3.0ml，用蒸馏水定容至刻度，摇匀，各瓶的脯氨酸浓度分别为1ug/ml、2ug/ml、3ug/ml、4ug/ml、5ug/ml及6ug/ml。 （3）取6支试管，分别吸取2ml系列标准浓度的脯氨酸溶液及2ml冰醋酸和2ml酸性茚三酮溶液，每管在沸水浴中加热30min。 （4）冷却后各试管准确加入4ml甲苯，振荡30s，静置片刻，使色素全部转至甲苯溶
脯氨酸
实验四十三植物体内游离脯氨酸含量的测定 一、目的 在逆境条件下（旱、热、冷、冻），植物体内脯氨酸的含量显著增加，植物体内脯氨酸含量在一定程度上反映了植物的抗逆性，抗旱性强的品种积累的脯氨酸多。因此测定脯氨酸含量可以作为抗旱育种的生理指标。另外，由于脯氨酸亲水性极强，能稳定原生质胶体及组织内的代谢过程，因而能降低冰点，有防止细胞脱水的作用。在低温条件下，植物组织中脯氨酸增加，可提高植物的抗寒性，因此，亦可作为抗寒育种的生理指标。 二、原理 磺基水杨酸对脯氨酸有特定反应，当用磺基水杨酸提取植物样品时，脯氨酸便游离于磺基水杨酸溶液中。然后用酸性茚三酮加热处理后，茚三酮与脯氨酸反应，生成稳定的红色化合物，再用甲苯处理，则色素全部转移至甲苯中，色素的深浅即表示脯氨酸含量的高低。在520nm波长下测定吸光度，即可从标准曲线上查出脯氨酸的含量。 三、材料、仪器及试剂 1. 材料：植物叶片。 2. 仪器：分光光度计；电子分析天平；离心机；小烧杯；普通试管；移液管；注射器；恒温水浴锅；漏斗；漏斗架；滤纸；剪刀；洗耳球。 3 .试剂及配制： 2.5﹪酸性茚三酮溶液配制：将1.25g茚三酮溶于30ml冰醋酸和20ml 6mol·L－1磷酸中，搅拌加热（70℃）溶解，贮于冰箱中。 3％磺基水杨酸配配制：3g磺基水杨酸加蒸馏水溶解后定容至100ml。 10μg·ml-1脯氨酸标准母液配制：精确称取20mg脯氨酸，倒入小烧杯内，用少量蒸馏水溶解，再倒入200ml容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度（为100μg·ml－1脯氨酸母液），再吸取该溶液10ml, 加蒸馏水稀释定容至100ml, 即为10μg·ml-1脯氨酸标准液。 冰醋酸；甲苯。 四、实验步骤 1.脯氨酸标准曲线的制作 1.1取6支试管，编号，按下表配制每管含量为0～12μg的脯氨酸标准液。 加入表中试剂后，置于沸水浴中加热30min。取出冷却，各试管再加入4ml甲苯，振荡30秒钟，静置片刻，使色素全部转至甲苯溶液。
脯氨酸的检测方法
脯氨酸的检测方法 1. 原理 样品用茚三酮处理，样品中的脯氨酸反应生成橙色物质，在520nm 检测吸光度，并作空白对照实验。 2. 应用范围 本方法适用于蜂蜜、果汁和浓缩汁中的脯氨酸的检测。本方法在其它方面的应用必须经过个别论证。 3. 试剂及仪器 3.1 脯氨酸 3.2 3%茚三酮2-甲氧基乙醇溶液（0.3g 茚三酮溶解于10ml 2-甲氧基乙醇，每天保持新鲜，即现用现配） 3.3 2-甲氧基乙醇 3.4 蚁酸（96%），即甲酸 3.5 异丙醇（2- 丙醇）水溶液：水：丙醇= 1：1 3.6 15ml 旋盖玻璃离心管（确保离心管的边缘没有缺口，将有缺口的离心管丢掉） 3.7 分光光度计，检测吸光度设定在520nm 下 3.8 1cm 玻璃比色皿 4. 样品准备 4.1苹果，梨和大部分浆果的果汁用单一浓度（即原果汁浓度），橙汁用1：20 的水进行 稀释。其它的果汁应进行适当的稀释，以保证稀释后的样品中的脯氨酸的含量低于50mg/L（见稀释表）。浓缩果汁用水稀释到单一浓度，然后再进一步进行适当的稀释。蜂蜜的稀释，采用2.5g蜂蜜加50ml水。 将样品在分析之前离心5min 左右，去除悬浮物，取上清液进行分析。 4.2 原果汁稀释表 稀释比例 颜色空白期望值样品类型 Apple 苹果1:1 yes Apricot 杏21:1 yes Aronia 野樱莓1:1 yes Banana 香蕉1:1 yes Blackberry 黑莓1:1 yes Cherry 樱桃1:1 yes Cranberry 蔓越莓1:1 yes Grape 葡萄16:1 yes Grapefruit 柚子21:1 no Guava 番石榴3:1 yes Kiwi 泥猴桃1:1 yes
乳与乳制品中动物水解蛋白鉴定——L(-)-羟脯氨酸含量测定法
乳与乳制品中 动物水解蛋白鉴定 乳与乳制品中动物水解蛋白鉴定 法 —L(-)-羟脯氨酸含量测定 羟脯氨酸含量测定法 1主题内容与适用范围 本方法规定了乳与乳制品制品中L(-)-羟脯氨酸含量的测定方法。 本方法适用于乳与乳制品中L(-)-羟脯氨酸含量的测定。 本方法通过对L(-)-羟脯氨酸含量的测定，可判定是否为动物水解蛋白。 2 引用标准 ) --羟脯氨酸含量测定 L(--) GB9695.23-90 肉与肉制品L( 3 原理 试样经酸水解,释放出羟脯氨酸。经氯胺T氧化,生成含有吡咯环的氧化物。用高氯酸破坏过量的氯胺T。羟脯氨酸氧化物与对二甲氨基苯甲醛反应生成红色化合物,在波长558nm处进行比色测定。 4 试剂 所用试剂均为分析纯,水为蒸馏水或同等纯度的水。 4.1 氯化亚锡(GB638):0.75％溶液。 将氯化亚锡7.5g溶于500mL水中,再加入500ml浓盐酸(GB 622)。 4.2 盐酸(GB622):6mol/L溶液。 4.3 氢氧化钠(GB629);1mol/L、10mol/L溶液。 4.4 缓冲液:将50g柠檬酸,26.3g氢氧化钠和146.1g结晶乙酸钠(GB694)溶于水,稀至1L,此溶液与200mL水和300mL正丙醇混合。 4.5 氯胺T(HG3-972)溶液:将1.41g氯胺T,溶于10mL水中,依次加入10mL正丙醇和80mL缓冲溶液(用时现配)。 4.6 显色剂:称取10g对二甲氨基苯甲醛,用35mL高氯酸(GB623)溶解,缓慢加入65mL异丙醇。 4.7 L(-)-羟脯氨酸(C5H9NO3)标准溶液。 4.7.1 标准储备液500μg/mL:称取50.0mg/L(-)-羟脯氨酸用少量水溶解,加一滴6mol/L盐酸,定容至100mL容量瓶中。 4.7.2 标准工作液5μg/mL:吸取标准储备液 5.00mL于500mL容量瓶中,定容。 5 仪器和设备
植物组织游离脯氨酸含量的测定实验报告精华版
实验报告 一、实验目的： 了解植物体内水分亏缺与脯氨酸积累的关系 二、实验所用仪器、药品、材料： 1.仪器 分光光度计,水浴锅,漏斗,大试管（20ml）,具塞刻度试管（20ml）,注射器或滴管（5-10ml）。 2.材料 植物小麦叶片 3.试剂 （1）3%磺基水杨酸 （2）甲苯 （3）2.5%酸性茚三酮显色液：冰乙酸和6mol·l-1磷酸以3:2混合，作为溶剂进行配制，此液在4℃下2-3天有效 （4）脯氨酸标准溶液：准确称取25mg脯氨酸，用蒸馏水溶解后定容至250ml，其浓度为100μg·ml-1。再取此液10ml，用蒸馏水稀释至100ml，即成10μg·ml-1的脯氨酸标准溶液。 三、实验步骤： 1、标准曲线的绘制： （1）取7支具塞刻度试管按表9.2-1加入各试剂。混匀后加玻璃球塞，在沸水中加热40min。 （2）取出冷却后向各管加入5ml甲苯充分振荡，以萃取红色物质。静置待分层后吸取甲苯层以0号管匀对照在波长520nm下比色。 （3）以消光值为纵坐标，脯氨酸含量为横坐标，绘制标准曲线，求线性回归方程。
表9．2．1各试管中试剂加入量 2、待测物的提取、显色、比色等测定的数据记录： 3、计算结果： 从标准曲线中查出测定液中脯氨酸浓度 脯氨酸[μg.g-1(干或鲜重)] =(C．V)·(A·W)－1 式中：C一提取液中脯氨酸浓度(PS)，由标准曲线求得： V －提取液总体积（ml） A --- 测定时所吸取得体积（ml）
W----- 样品重（g） 脯氨酸[μg.g-1(干或鲜重)] =(C．V)·(A·W)－1= 四、实验小结：（本次实验成败之处和原因分析以及改进措施） 1.配置的酸性茚三酮溶液仅在24h内稳定，因此最好现用现配。 2.测定样品若进行过渗透胁迫处理，结果会更显著。 3.试剂添加次序不能出错。
实验一植物体内游离脯氨酸含量的测定
实验一植物体内游离脯氨酸含量的测定 一、目的 在逆境条件下（旱、热、冷、冻），植物体内脯氨酸的含量显着增加，植物体内脯氨酸含量在一定程度上反映了植物的抗逆性，抗旱性强的品种积累的脯氨酸多。因此测定脯氨酸含量可以作为抗旱育种的生理指标。另外，由于脯氨酸亲水性极强，能稳定原生质胶体及组织内的代谢过程，因而能降低冰点，有防止细胞脱水的作用。在低温条件下，植物组织中脯氨酸增加，可提高植物的抗寒性，因此，亦可作为抗寒育种的生理指标。 二、原理 磺基水杨酸对脯氨酸有特定反应，当用磺基水杨酸提取植物样品时，脯氨酸便游离于磺基水杨酸溶液中。然后用酸性茚三酮加热处理后，茚三酮与脯氨酸反应，生成稳定的红色化合物，再用甲苯处理，则色素全部转移至甲苯中，色素的深浅即表示脯氨酸含量的高低。在520nm波长下测定吸光度，即可从标准曲线上查出脯氨酸的含量。 三、材料、仪器及试剂 1.材料：植物叶片。 2.仪器：分光光度计；电子分析天平；离心机；小烧杯；普通试管；移液管；注射器；恒温水浴锅；漏斗；漏斗架；滤纸；剪刀；洗耳球。 3.试剂及配制： ﹪酸性茚三酮溶液配制：将茚三酮溶于30ml冰醋酸和20ml6mol·L－1磷酸中，搅拌加热（70℃）溶解，贮于冰箱中。 3％磺基水杨酸配配制：3g磺基水杨酸加蒸馏水溶解后定容至100ml。 10μg·ml-1脯氨酸标准母液配制：精确称取20mg脯氨酸，倒入小烧杯内，用少量蒸馏水溶解，再倒入200ml容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度（为100μg·ml－1脯氨酸母液），再吸取该溶液10ml,加蒸馏水稀释定容至100ml,即为10μg·ml-1脯氨酸标准液。 冰醋酸；甲苯。 四、实验步骤 1.?????脯氨酸标准曲线的制作 取6支试管，编号，按下表配制每管含量为0～12μg的脯氨酸标准液。 加入表中试剂后，置于沸水浴中加热30min。取出冷却，各试管再加入
脯氨酸(Pro)含量测定试剂盒使用说明
脯氨酸（Pro）含量测定试剂盒使用说明 分光光度法50T/48S 货号：BC0290 测定意义： 脯氨酸(Pro)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，逆境条件下，植物体内Pro 含量显著增加。Pro增加量在一定程度上反映了抗逆性，抗旱性强的品种往往积累较多的脯氨酸。因此，脯氨酸增加量可以作为抗逆育种的生理指标之一。 测定原理： 用磺基水杨酸（SA）提取Pro，加热处理后，Pro与酸性茚三酮溶液反应生成红色；加甲苯萃取后，在520nm测定吸光度。 需自备的仪器和用品： 可见分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、冰乙酸、甲苯、研钵、冰和蒸馏水。 试剂的组成和配制： 提取液：液体50mL×1瓶，4℃保存。 试剂一：冰乙酸4℃保存。（自备） 试剂二：液体45mL×1瓶，4℃保存。 试剂三：甲苯4℃保存。（自备） 标准品：脯氨酸10mg，4℃保存。
样品测定的准备： 1、细胞、细菌或组织样品的制备： 细菌或细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，弃上清；按照每100万细菌或细胞加入1mL提取液，超声波破碎细菌或细胞（功率20％，超声3秒，间隔10秒，重复30次），之后置沸水浴振荡提取10min；10000g，常温离心10min，取上清，冷却后待测。 组织：称取约0.1g组织，加入1mL提取液进行冰浴匀浆；之后置沸水浴振荡提取10min，10000g，常温离心10min，取上清，冷却后待测。 2、血清（浆）样品：取100μL血清（浆）加入1mL提取液，充分混匀，之后置沸水浴振荡提取10分钟，10000g，常温离心10分钟，取上清，冷却后待测。 3、标准品的处理:称取1mg，将标准品稀释为15、10、8、6、 4、2、1、0g/ml。 测定步骤： 1、分光光度计预热30min以上，调节波长至520nm，蒸馏水调零。 2、取0.5mL上清液（或稀释后的标准品）+0.5mL试剂一+0.5mL试剂二于有盖试管中，置沸水浴中保温30min（盖紧，防止水分散失），每10min振荡一次。 3、待冷却后，在试管中加入1mL试剂三，振荡30s，静置片刻，使色素转至试剂三中；吸取0.8mL-1mL上层溶液于1mL玻璃比色皿中，用试剂三调零，于520nm波长处比色，记录吸光值。 4、根据标准品吸光值和浓度，建立标准曲线。 Pro含量计算： 1、通过标准曲线计算样品脯氨酸含量(y为脯氨酸含量，μg/mL；x为OD值)
脯氨酸检测方法
试验目的：在逆境条件下（旱、盐碱、热、冷、冻），植物体内脯氨酸（proline，Pro）的含量显著增加。植物体内脯氨酸含量在一定程度上反映了植物的抗逆性， 抗旱性强的品种往往积累较多的脯氨酸。因此测定脯氨酸含量可以作为抗旱育种的生理指标。另外，由于脯氨酸亲水性极强，能稳定原生质胶体及组织内的代谢过程，因而能降低冰点，有防止细胞脱水的作用。在低温条件下，植物组织中脯氨酸增加，可提高植物的抗寒性，因此，亦可作为抗寒育种的生理指标。 一、原理 用磺基水杨酸提取植物样品时，脯氨酸便游离于磺基水杨酸的溶液中，然后用酸性茚三酮加热处理后，溶液即成红色，再用甲苯处理，则色素全部转移至甲苯中， 色素的深浅即表示脯氨酸含量的高低。在520nm波长下比色，从标准曲线上查 出（或用回归方程计算）脯氨酸的含量。 二、材料、仪器设备及试剂 （一）材料：待测植物（水稻、小麦、玉米、高粱、大豆等）叶片。 （二）仪器设备：1. 722型分光光度计；2. 研钵；3. 100ml小烧杯；4. 容量瓶； 5. 大试管； 6. 普通试管； 7. 移液管； 8. 注射器； 9. 水浴锅；10. 漏斗；11. 漏斗架；12. 滤纸；13 剪刀。 （三）试剂1. 酸性茚三酮溶液：将1.25g茚三酮溶于30ml冰醋酸和20ml6mol/L 磷酸中，搅拌加热（70℃）溶解，贮于冰箱中；2. 3％磺基水杨酸：3g磺基水杨酸加蒸馏水溶解后定容至100ml；3. 冰醋酸；4. 甲苯。 三、实验步骤 1. 标准曲线的绘制
（1）在分析天平上精确称取25mg脯氨酸，倒入小烧杯内，用少量蒸馏水溶解，然后倒入250ml容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，此标准液中每ml含脯氨酸100μg。 （2）系列脯氨酸浓度的配制取6个50ml容量瓶，分别盛入脯氨酸原液0.5，1.0，1.5，2.0，2.5及3.0ml，用蒸馏水定容至刻度，摇匀，各瓶的脯氨酸浓度分别为1，2，3，4，5及6μg/ml。 （3）取6支试管，分别吸取2ml系列标准浓度的脯氨酸溶液及2ml冰醋酸和2ml 酸性茚三酮溶液，每管在沸水浴中加热30min。 （4）冷却后各试管准确加入4ml甲苯，振荡30S，静置片刻，使色素全部转至甲苯溶液。 （5）用注射器轻轻吸取各管上层脯氨酸甲苯溶液至比色杯中，以甲苯溶液为空白对照，于520nm波长处进行比色。 （6）标准曲线的绘制：先求出吸光度值（Y）依脯氨酸浓度（X）而变的回归方程式，再按回归方程式绘制标准曲线，计算2ml测定液中脯氨酸的含量（μg/2ml）。 2. 样品的测定 （1）脯氨酸的提取：准确称取不同处理的待测植物叶片各0.5g，分别置大管中，然后向各管分别加入5ml3％的磺基水杨酸溶液，在沸水浴中提取10min，（提取过程中要经常摇动），冷却后过滤于干净的试管中，滤液即为脯氨酸的提取液。（2）吸取2ml提取液于另一干净的带玻塞试管中，加入2ml冰醋酸及2ml酸性
原料中羟脯氨酸含量的测定
原料中羟脯氨酸含量的测定 1.材料和试剂 1.1材料 秦宝雪花牛牛蹄筋：陕西秦宝牧业有限责任公司。 秦宝普通育肥牛、雪花牛肺：陕西秦宝牧业有限责任公司。 秦宝雪花牛棒骨：陕西秦宝牧业有限责任公司。 1.2试剂 所用试剂均为分析纯，水为蒸馏水或去离子水，或相同浓度的水。 1.2.1硫酸溶液[c(H2SO4)≈3mol/L] 量取750mL水于2L的容量瓶中，在搅拌下缓慢加入320mL浓硫酸（ρ20=1.84g/mL）。冷却至室温后用水定容。 1.2.3缓冲溶液（PH=6.8） 包括下列组分： a）26.0g一水柠檬酸（C6H8O7·H2O）； b）14.0g氢氧化钠； c）78.0g无水乙酸钠[Na(CH3CO2)]。 用500mL水溶解上述试剂并转入1L的容量瓶中，加入250mL 正丙醇，用水定容。该溶液于4℃暗处可稳定保存几周。 1.2.4氯胺T溶液 称取1.41g三水·N-氯-对甲苯磺酰胺钠盐（氯胺T），用100mL 缓冲溶液溶解。临用前配制。 1.2.5显色剂 称取10.0g对甲氨基苯甲醛，用30mL高氯酸溶液[70%（质量分数）]溶解，缓慢加入65mL异丙醇。临用前配制。 1.3羟脯氨酸标准溶液 1.3.1标准储备液 称取50mg4-羟基-α-吡咯甲酸（羟脯氨酸）于100mL容量瓶中，用水溶解，加一滴硫酸溶液（1.2.1），用水定容。该溶液于4℃下可稳定存放1个月。 1.3.2标准工作液 移取5.00mL上述标准储备液至500mL容量瓶中，用水定容。分
别吸取该溶液10.00mL、20.00mL、30.00mL、40.00mL于100mL容量瓶中，用水定容，所得标准工作液浓度一次为0.5μg/mL、1.0μg/mL、 1.5μg/mL、 2.0μg/mL。临用前配制。 2.仪器和设备 3.试样制备 用刀将原料在冷冻时（0℃以下）切成小块（约0.5cm3，边长约为8mm）。将切好的试样装入密封样品盒中，或用耐热塑料袋真空包装，70℃以上保温30min后，冷却。用绞肉机将试样均质。将试样装入密封的容器里，防止变质和成分变化。试样应在均质化后24h内尽快分析。 4.分析步骤 4.1试样 称取4g试样（精确至0.001g）于烧杯中，避免试样粘在烧杯壁上。 4.2水解 4.2.1量取30mL±1mL硫酸溶液，加入烧杯中，用培养皿盖住，于105℃干燥箱内恒温16h。 4.2.2趁热将水解产物转移至250mL容量瓶中。用10mL硫酸溶液分三次洗涤烧杯，合并至上述容量瓶中。用水定容，摇匀。然后将其过滤至三角瓶中。 4.3测定 4.3.1用移液管移取5mL的上述滤液至250mL容量瓶中。 4.3.2移取4.00mL上述溶液于比色管中，加入2.00mL氯胺T试剂，混合后于室温下放置20min±1min。 4.3.3加入2.00mL显色剂于比色管中，充分混合，用塞子将比色管封
羟脯氨酸的测定方法
1羟脯氨酸含量测定 2羟脯氨酸标准曲线绘制 3试剂的配制【6-7】 [6] 李秋营,姚汝琳.细胞中羟脯氨酸的测定.山西医科大学学报.2001,32(6):558-559 [7] David J Etherington, Trevor J Sims. Detection and Estimation of Collagen[J]. J Sci Food Agric, 1981,32:539-546 柠檬酸缓冲液：柠檬酸钠120g、冰醋酸12mL、柠檬酸46g、氢氧化钠34g 溶解于蒸馏水中，调整pH 值至6.0，然后定容至1000mL。 0.05mol/L 氯胺T 溶液：称取氯胺T 7.05g，溶解于100mL 蒸馏水中，然后加入乙二醇独甲醚150mL，再加入250mL 柠檬酸缓冲液混合均匀。 对二甲基氨基苯甲醛: 试剂 A：取无水乙醇20mL，慢慢加入浓硫酸2.74mL；试剂B：取对二甲基氨基苯甲醛12.0g，慢慢加入无水乙醇40mL，水浴加热使其完全溶解并冷却至室温，然后将A 液慢慢加入B，混合均匀。 3.5mol/L 高氯酸溶液：取27mL 高氯酸，以蒸馏水定容到100mL。 羟脯氨酸标准曲线的绘制羟脯氨酸标准储存液：准确称取L-羟基脯氨酸标准品50mg，加入0.01mol/L 盐酸中溶解，稀释并定容到100mL，在冰箱中保存。 羟脯氨酸标准工作液：吸取羟脯氨酸标准储存液10mL到50mL 容量瓶中，用蒸馏水定容到50mL(临用前配)，浓度为100μg/mL。 4标准曲线绘制 分别吸取羟脯氨酸标准工作液1.0、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5mL，用蒸馏水定容到50mL容量瓶中。以蒸馏水为空白，分别吸取上述标准液1mL，加入1mL 柠檬酸缓冲液和1mL 0.05mol/L 氯胺T 溶液，室温(25 ℃) 氧化10min 后，加入高氯酸1mL(3.5mol/L)，放置10min，加入对二甲基氨基苯甲醛试剂1mL，在65℃水浴显色10min，冷却后在560nm处测吸光度。以羟脯氨酸浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线，求出回归方程。 浓度μg/mL0.50 1.00 1.25 1,50 1,75 2.00 2.25 0.612 吸光度A560 0.134 0.284 0.347 0.409 0.477 0.55 6样品水解将样品反复绞碎，充分混合。称取5.000g样品放入250ml三角瓶中，加
脯氨酸含量测定
植物抗逆性的测定（脯氨酸快速测定法） 在逆境条件下（旱、热、冷、冻），植物体内脯氨酸的含量显著增加，Barheff 和Naylor（1966年）指出：在水分亏缺的情况下，引起蛋白质分解，而脯氨酸首先大量地被游离出来。植物内脯氨酸含量在一定程度上反映了植物的抗逆性，抗旱性强的品种积累的脯氨酸多。因此测定脯氨酸含量可以作为抗旱性的生理指标。另外，由于脯氨酸亲水性极强，能稳定原生质体及组织内的代谢过程，因而能降低冰点，有防止细胞脱水的作用。在低温条件下，植物组织中脯氨酸增加，可提高植物的抗寒性，因此，亦可作为抗寒性的生理指标。 （一）原理 磺基水杨酸对脯氨酸有特定反应，当有磺基水杨酸提取植物样品时，脯氨酸便游离于磺基水杨酸的溶液中，然后用酸性茚三酮加热处理后，溶液即成红色，再用甲苯处理，则色素全部转移至甲苯中，色素的深浅即表示脯氨酸含量的高低。在520nm波长下比色，从标准曲线上查出（或用回归方程计算）脯氨酸的含量。 （二）材料及设备 1. 材料仪器械：（1）待测植物（水稻、小麦、玉米、高梁、大豆均可）。（2）722分光光度计，（3）研钵，（4）100ml小烧杯，（5）容量瓶，（6）大试管2支，（7）普通式管8支，（8）移液管；（9）注射器；（10）水浴锅，（11）漏斗，（12）漏斗架，（13）滤纸，（14）剪刀。 2. 试剂 （1）酸性茚三酮溶液：将1. 25茚三酮溶于30ml冰醋酸和20ml 6M 磷酸中，搅拌加热（70℃）溶解，贮于冰箱中。 （2）3%磺基水杨酸：3g磺基水杨酸蒸馏水溶解后定容至100ml。 （3）冰醋酸，（4）甲苯 （三）实验步骤 1. 标准曲线的绘制 （1）在分析天平上精确称取25mg脯氨酸，倒入小烧杯内，用少量蒸馏水溶解，然后倒入250ml容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，此标准液中每毫升含脯氨酸100μg。 （2）系列脯氨酸浓度的配制 取6个50ml容量瓶，分别盛入脯氨酸原液0.5，1.0，1.5，2.0，2.5及3.0ml，用蒸馏水定容至刻度，摇匀，其每瓶的脯氨酸浓度分别为1，2，3，4，5，及6μg/ml/ （3）取6支试管，分别吸取2ml系列标准浓度的脯氨酸溶液及2ml冰醋酸和2ml酸性茚三酮溶液，每管在沸水浴中加热30分钟。 （4）冷却后向各试管准确加入4ml甲苯，振荡30秒钟，静置片刻，使色素全部转至甲苯溶液。 （5）用注射器轻轻吸取各管上层脯氨酸甲苯溶液至比色杯中，以甲苯溶液为空白对照，于520nm波长进行比色。 （6）标准曲线的绘制：先求出密度（y）依脯氨酸浓度（x）而变的回归方程式，再按回归方程式绘制标准曲线计算2ml测定液中脯氨酸的含量 （μg/ml）。 2. 样品的测定 （1）脯氨酸的提取：准确称了以不同处理的待测植物叶片各0.5g，分
脯氨酸含量的测定
植物组织游离脯氨酸含量的测定 （一）实验原理 植物在逆境条件下，游离脯氨酸便会大量积累，且积累指数与植物的抗逆性有关。因此，脯氨酸可作为植物抗逆性的一项生化指标。 采用磺基水杨酸提取植物体内的游离脯氨酸，不仅大大减少了其他氨基酸的干扰，快速简便，而且不受样品状态(干或鲜样)限制。在酸性条件下，脯氨酸与茚三酮反应生成稳定的红色缩合物，用甲苯萃取后，此缩合物在波长520 nm处有一最大吸收峰。脯氨酸浓度的高低在一定范围内与其消光度成正比。 （二）实验材料、仪器设备及试剂 1 材料 植物叶片 2 仪器设备 分光光度计，恒温水浴锅，漏斗，具塞刻度试管(20 ml) ，移液枪（1 ml和5 ml），5 ml 和1 ml刻度试管，烧杯，吸水纸，玻璃棒，试管架，比色皿等。 3 试剂 (1) 3％磺基水杨酸溶液：万分之一电子天平称取3 g磺基水杨酸，然后将称好药品溶于100 ml蒸馏水中。 (2) 甲苯 (3) 2.5％酸性茚三酮显色液：冰乙酸和6 mol L-l磷酸以3:2混合，作为溶剂进行配制，此液在4℃下2～3天有效（此步骤重要）。称取1.25 g茚三酮放入烧杯中用混合液50 ml 放入70℃水浴锅中溶解，冷却。 (4) 脯氨酸标准溶液：准确称取25 mg脯氨酸，用蒸馏水溶解后定容至250 ml，其浓度为100 ug/ml。再取此液10 ml，用蒸馏水稀释至100 ml，即成10 ug/ml的脯氨酸标准液。 三．实验方法 1 标准曲线制作 （1）取7支具塞刻度试管按表2加入各试剂。混匀后加玻璃球塞，在沸水中加热40 min。 试管号 0 1 2 3 4 5 6 脯氨酸标准溶液 0 0.2 0.4 0.8 1.2 1.6 2 /ml 水/ml 2 1.6 1.2 0.8 0.4 0.2 0 冰乙酸/ml 2 2 2 2 2 2 2 茚三酮显色液 3 3 3 3 3 3 3 /ml 脯氨酸含量/μg 0 2 4 8 12 16 20 （2）取出冷却后向各管加入5 ml甲苯充分振荡，以萃取红色物质。静置待分层后吸取甲苯层以0号管作为对照在波长520 nm下比色。
羟脯氨酸(HYP)含量检测试剂盒说明书 微量法
羟脯氨酸（HYP）含量检测试剂盒说明书微量法 注意：正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定 货号：BC0255 规格：100T/96S 产品内容： O（V/V）=1:1，室温保存。 提取液：6mol/L盐酸，自备。浓盐酸：H 2 试剂一：液体8mL×1瓶，4℃避光保存。 试剂二：液体8mL×1瓶，4℃避光保存。 标准品：0.5mL×1支，0.5mg/mL羟脯氨酸标准品，4℃保存。 产品说明： HYP是机体胶原蛋白主要成分之一，胶原蛋白大多分布于皮肤、腱、软骨和血管等，因此HYP含量是反映胶原组织代谢及纤维化程度的一项重要指标。 样品经水解产生游离的HYP，进一步被氯胺T氧化，氧化产物与对二甲氨基苯甲醛反应，产生红色化合物，在560nm处有特征吸收峰。通过测定样品水解液560nm吸光值，可计算HYP含量。 自备实验用品及仪器： 天平、烘箱、玻璃管、离心机、水浴锅、可见分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96孔板、6mol/L 盐酸和蒸馏水。 操作步骤： 一、羟脯氨酸提取： 1、组织：称取约0.2g样品于玻璃管，将组织尽量剪碎以便消化，盖子稍松不密闭。加入2mL的提取液，煮沸或110℃烘箱2至6小时消化至没有可见大的团块，16000rpm，25℃，离心20min（若离心后仍有杂质，可通过过滤去除），用10mol/L NaOH（约1mL）调节pH值至6～8范围内。蒸馏水定容至4mL，取上清待测。（过程中可能有黑色物质生成，若长时间不能消化，可能为碳化的物质） 2.细胞：取500万个细胞，加入1mL的提取液，煮沸或110℃烘箱2至6小时消化至透明状，16000rpm，
植物体内游离脯氨酸含量的测定
目的意义 植物在正常条件下游离脯氨酸（proline，Pro）含量很低，但在干旱、高温、低温、盐碱、水涝等逆境条件下便会大量积累，并且积累指数与植物的抗逆性呈正相关关系。因此，脯氨酸可作为植物抗逆性的一项生化指标，测定其含量也成为抗性生理研究的重要内容之一。 本实验的目的是掌握游离脯氨酸含量的测定方法、原理及操作技术。 一、酸性茚三酮法 （一）原理 植物体内的氨基酸只有脯氨酸能与酸性茚三酮发生反应，生成稳定的红色产物。该产物在515nm有一最大吸收高峰，其吸收值与脯氨酸的含量呈直线关系。因此，样品中的脯氨酸含量可用酸性茚三酮法测定。除脯氨酸外，酸性和中性氨基酸不能与酸性茚三酮形成红色产物，碱性氨基酸对这一反应只有轻度干扰，在同类样品的测定中可忽略不计，在不同样品的测定中可加入人造沸石排除这种干扰。 （二）实验材料、仪器与试剂 1. 实验材料：正常生长与经逆境处理的植物茎、叶、穗等器官或组织。 2. 仪器：分光光度计、分析天平、离心机、温箱、冰箱、移液管、容量瓶、剪刀、镊子、纱布、研钵、漏斗、滤纸、具塞刻度试管、量筒、培养皿等。 3. 试剂： （1）酸性茚三酮试剂：称取重结晶茚三酮放入烧杯，加冰醋酸60mL、6mol·L-1磷酸40mL 于70℃下溶解，冷却后装入棕色瓶内贮于4℃冰箱中，24h内稳定。现用现配。 （2）100μg·mL-1脯氨酸母液：精确称取脯氨酸溶于少量80％乙醇中，用蒸馏水定容至100mL。 （3）其他试剂：人造沸石、活性炭粉、冰醋酸、80％乙醇。 （三）操作步骤 1. 标准曲线制作： （1）取7个50mL容量瓶，分别放入脯氨酸母液、、、、、、，用蒸馏水定容至刻度，摇匀，各瓶的脯氨酸浓度分别为、、、、、、μg·mL-1。 （2）另取具塞刻度试管8只（0～7号），0号加入2mL蒸馏水，1～7号分别加入不同浓度的标准系列各2mL，再分别加入冰醋酸2mL和茚三酮试剂2mL，充分摇匀，加盖，沸水浴10～15min。以0号管溶液为空白对照，于515nm处比色，记录消光值，以消光值为纵坐标，脯氨酸浓度为横坐标，绘制标准曲线。 2. 样品提取：称取鲜样～，放入研钵或匀浆器中，加入80％乙醇3mL和石英砂少许研成匀浆，移入具塞刻度试管中，并用80％乙醇冲洗研钵，匀浆液与洗液合并总量为10mL，加盖后沸水浴煮沸10min，再加活性炭粉末，振荡过滤（用80％乙醇冲洗滤纸与残渣3次），滤液于80～85℃水浴上蒸去乙醇，残渣用蒸馏水洗涤并定容至100mL供测定之用。 3. 样品测定：取大试管1只，加样品提取液10mL和人造沸石1g，摇动10min并滤去人造沸石。取具塞刻度试管2只，各加入上述过滤样液2mL、冰醋酸2mL、茚三酮试剂2mL，摇匀后加盖，于沸水浴中煮沸10～15min，冷却后于515nm下比色，记录OD值。 （四）结果计算 W V C A ? = 式中：A为样品脯氨酸含量（μg·g-1）；C为从标准曲线上查得脯氨酸浓度（μg·mL-1）；
植物体内脯氨酸含量测定
植物体内脯氨酸的含量测定 植物细胞膜起调节控制细胞内外物质交换的作用，它的选择透性是其最重要的功能之一。当植物遭受逆境伤害时，细胞膜受到不同程度的破坏，膜的透性增加，选择透性丧失，细胞内部分电解质外渗。膜结构破坏的程度与逆境的强度、持续的时间、作物品种的抗性等因素有关。因此，质膜透性的测定常可作为逆境伤害的一个生理指标，广泛应用在植物抗性生理研究中。 当质膜的选择透性被破坏时细胞内电解质外渗，其中包括盐类、有机酸等，这些物质进入环境介质中，如果环境介质是蒸馏水，那么这些物质的外渗会使蒸馏水的导电性增加，表现在电导率的增加上。植物受伤害愈严重，外渗的物质越多，介质导电性也就越强，测得的电导率就越高（不同抗性品种就会显示出抗性上的差异。） 蛋白质水分子 疏水端脯氨酸亲水端 脯氨酸是水溶性最大的氨基酸，具有很强的水合能力，其水溶液具有很高的水势。脯氨酸的疏水端可和蛋白质结合，亲水端可与水分子结合，蛋白质可借助脯氨酸束缚更多的水，从而防止渗透胁迫条件下蛋白质的脱水变性。因此脯氨酸在植物的渗透调节中起重要作用，而且即使在含水量很低的细胞内，脯氨酸溶液仍能提供足够的自由水，以维持正常的生命活动。正常情况下，植物体内脯氨酸含量并不高，但遭受水分、盐分等胁迫时体内的脯氨酸含量往往增加，它在一定程度上反映植物受环境水分和盐度胁迫的情况，以及植物对水分和盐分胁迫的忍耐及抵抗能力。 植物体内脯氨酸的含量可用酸性茚三酮法测定。在酸性条件下，脯氨酸和茚三酮反应生成稳定的有色产物，该产物在520nm有一最大吸收峰，其色度与含量正相关，可用分光光度法测定。该反应具有较强的专一性，酸性和中性氨基酸不能与酸性茚三酮试剂形成有色产物，碱性氨基酸对这一反应有干扰，但加入人造沸石（permutit ），在PH 1~7 范围内振荡溶液可除去这些干扰的氨基酸（如甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、苯丙氨酸，精氨酸等 2 —氨基的氨基酸）。[ 实验材料] 绿豆幼苗 [ 仪器设备] 分光光度计、水浴锅、天平、带塞试管、研钵、石英砂、漏斗、滤纸、玻棒、电导率仪、微波炉、移液管、试管、50mL 小烧杯等 【试剂药品】 1 ．无离子水 2 ．80% 乙醇。 3 ．酸性茚三酮试剂：称取2.5g 茚三酮，加入60mL 冰醋酸和40mL 6mol/L 磷酸，于70 ℃加热溶解，冷却后储于棕色试剂瓶中， 4 ℃保存，两天内稳定。 4 ．脯氨酸标准母液：称取10mg 脯氨酸溶于少量80% 乙醇中，再用蒸馏水定容至100mL, 成100μg/L 母液。 5 ．人造沸石、活性碳等。 【实验步骤】取绿豆种子，用水吸胀，萌动后加洗净的河沙覆盖，放在光照培养箱中培养（25 ℃，每天光照12h ），当苗高3~5cm 时，即可进行干旱胁迫处理。 ?一盆浇充足水分作为对照，另一盆干旱处理24h 。 ?肉眼观察伤害症状。 ?取样和测定 测相对电导率：
脯氨酸含量测定
脯氨酸含量测定 在逆境条件下（旱、盐碱、热、冷、冻），植物体内脯氨酸（proline，Pro）的含量显著增加。植物体内脯氨酸含量在一定程度上反映了植物的抗逆性，抗旱性强的品种往往积累较多的脯氨酸。因此测定脯氨酸含量可以作为抗旱育种的生理指标。另外，由于脯氨酸亲水性极强，能稳定原生质胶体及组织内的代谢过程，因而能降低冰点，有防止细胞脱水的作用。在低温条件下，植物组织中脯氨酸增加，可提高植物的抗寒性，因此，亦可作为抗寒育种的生理指标。 一、原理 用磺基水杨酸提取植物样品时，脯氨酸便游离于磺基水杨酸的溶液中，然后用酸性茚三酮加热处理后，溶液即成红色，再用甲苯处理，则色素全部转移至甲苯中，色素的深浅即表示脯氨酸含量的高低。在520nm波长下比色，从标准曲线上查出（或用回归方程计算）脯氨酸的含量。 二、材料、仪器设备及试剂 （一）材料：待测植物（水稻、小麦、玉米、高粱、大豆等）叶片。（二）仪器设备：1. 722型分光光度计；2. 研钵；3. 100ml小烧杯； 4. 容量瓶； 5. 大试管； 6. 普通试管； 7. 移液管； 8. 注射器； 9. 水浴锅；10. 漏斗；11. 漏斗架；12. 滤纸；13 剪刀。 （三）试剂 1. 酸性茚三酮溶液：将1.25g茚三酮溶于30ml冰醋酸和20ml6mol/L 磷酸（8ml85%磷酸定容至20ml）中，搅拌加热（70℃水浴）溶解，
贮于（4度）冰箱中（2-3天有效）； 2. 3％磺基水杨酸：3g磺基水杨酸加蒸馏水溶解后定容至100ml；（密封避光） 3. 冰醋酸； 4. 甲苯。 三、实验步骤 1. 标准曲线的绘制 （1）在分析天平上精确称取25mg（10mg）脯氨酸（-20度，现稀释现用），倒入小烧杯内，用少量蒸馏水溶解，然后倒入250ml(100ml)容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，此标准液中每ml含脯氨酸100μg。取此液10ml稀释至100ml,即成10ug/ml脯氨酸标准液。 （2）各试管中试剂加入量： 0 1 2 3 4 5 6 标准脯氨酸量0 0.2 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0 蒸馏水 2 1.8 1.6 1.2 0.8 0.4 0 冰乙酸 2 2 2 2 2 2 2 酸性茚三酮 2 2 2 2 2 2 2 （3）取7支试管按上表加入各试剂，每管在沸水浴中加热40min。（4）冷却后各试管准确加入5ml甲苯，振荡30S，静置10min，使色素全部转至甲苯溶液。（5）用注射器轻轻吸取各管上层脯氨酸甲苯溶液至比色杯中，以甲苯溶液为空白对照，于520nm波长处进行比
脯氨酸(PRO)含量测定试剂盒说明书
货号：QS1605 规格：50管/48样脯氨酸（PRO）含量测定试剂盒说明书 可见分光光度法 正式测定前务必取2-3 个预期差异较大的样本做预测定 测定意义： Pro广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，逆境条件下，植物体内Pro含量显著增加。Pro增加量在一定程度上反映了抗逆性，抗旱性强的品种往往积累较多的脯氨酸。因此，脯氨酸增加量可以作为抗逆育种的生理指标之一。 测定原理： 用磺基水杨酸（SA）提取Pro，加热处理后，Pro与酸性茚三酮溶液反应生成红色；加甲苯萃取后，在520nm测定吸光度。 自备实验用品及仪器： 可见分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1 mL玻璃比色皿、冰乙酸50mL、甲苯50mL、研钵、冰和蒸馏水。 试剂的组成和配制： 提取液：液体50mL×1瓶，4℃保存。 试剂一：冰乙酸25 mL×1瓶，4℃保存。（自备） 试剂二：液体25 mL×1瓶，4℃保存。 试剂三：甲苯50mL×1瓶，4℃保存。（自备） 样品测定的准备： 1、细菌、细胞或组织样品的制备： 细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；之后置95℃水浴振荡提取10min；10000g，25℃离心10min，取上清，冷却后待测。 组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆；之后置95℃水浴振荡提取10min；10000g，25℃离心10min，取上清，冷却后待测。 2、血清（浆）样品：按照血清（浆）体积（mL）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议取0.1mL血清（浆）加入1mL提取液），充分混匀，之后置95℃水浴振荡提取10分钟，10000g，25℃离心10分钟，取上清，冷却后待测。 测定步骤： 1、分光光度计预热30min以上，调节波长至520nm，蒸馏水调零。 2、样本测定： (1)取0.5mL样本+0.5mL试剂一+0.5mL试剂二于有盖试管中，置95℃水浴中保温30min（盖紧，防止水分散失），每10min振荡一次。 (2)待冷却后，在试管中加入1mL试剂三，振荡30s，静置片刻，使色素转至试剂三中；吸取0.8mL-1mL上层溶液于1mL玻璃比色皿中，于520nm波长处比色，记录吸光值A。 第1页，共2页
羟脯氨酸检测试剂盒使用说明
羟脯氨酸检测试剂盒使用说明 微量法货号:BC0255 规格:100T/96S 产品简介： HYP是机体胶原蛋白主要成分之一，胶原蛋白大多分布于皮肤、腱、软骨和血管等，因此HYP 含量是反映胶原组织代谢及纤维化程度的一项重要指标。 样品经水解产生游离的HYP，进一补被氯胺T氧化，氧化产物与对二甲氨基苯甲醛反应，产生红色化合物，在560nm处有特征吸收峰。通过测定样品水解液560nm吸光值，可计算HYP 含量。 产品内容： 组织提取液：6mol/L盐酸，自备。浓盐酸：H2O（V/V）=1:1，室温保存； 细胞提取液：液体100mL×1瓶，4℃保存； 试剂一：液体10mL×1瓶，4℃避光保存； 试剂二：液体10mL×1瓶，4℃避光保存。 操作步骤： 一、羟脯氨酸提取： 1.组织：取约0.2g样品于玻璃管，加入2mL的组提取液，置于110℃烘箱，水解6至12小时，16000rpm，25℃，离心20min，用提取液定容至2mL，取上清待测。 2.细胞：取约500万个细胞，加入1mL的细胞提取液，于高压消毒器中15磅保持30min，自然降压后待测。 二、测定操作：
对照管 测定管样本（uL）60试剂一（uL） 60 60 混匀，室温静置20min 试剂二（uL）6060H 2O（uL） 180 120 混匀，60℃，20min，取出后室温静置15min，测定A 560。(A 560=A 测定-A 对照) 羟脯氨酸含量计算： 用微量比色皿测定的计算公式: 标准曲线：y=64.875x+0.0251，R 2 =0.9991（1）按组织计算 HYP 含量（mg/g）=（A 560-0.0251）÷64.875×V 反总÷(V 样÷V 样总×W) =0.154×（A 560-0.0251）÷W （3）按细胞计算： HYP 含量（mg/104 cell)=（A 560-0.0251）÷64.875×V 反总÷V 样×V 样总÷细胞数量（万个） =0.077×（A 560-0.0251）÷细胞数量（万个） V 反总：反应体系总体积，0.3mL；V 样：反应中样本体积，0.06mL；V 样总：加入提取液体积，mL；W：样本质量，g。用96孔板测定的计算公式如下: 标准曲线：y=32.4375x+0.0251，R 2 =0.9991