十年来MRSA对万古霉素耐药研究和临床治疗观察

十年来万古霉素对MRSA耐药研究和临床治疗观察

史煜波翁幸鐾孙定河

[摘要]：目的：评价十年来万古霉素对MRSA的体外MIC值变化趋势；观察对各MIC值临床治疗效果并了解当地的hVISA的百分比与临床治疗失败相关性研究。方法：MIC测定采用CLSI推荐的琼脂平板稀释法；查阅病史，评价治疗效果；用菌群分析法筛选hVISA,计算分析临床治疗失败与hVISA相关性。结果：00-01年度MIC为2 mg/L、1 mg/L 和≤0.5 mg/L时百分比为0.3%、18.5%和81.2%；02-03年度为0.7%、36.4%和62.8%；04-05年度为1.0%、53.8%，45.2%；06-07年度为1.6%、70.4%和27.7%；08-09年度为4.5%、70.5%和24.0%。其中06-07和08-09年度MIC为4 mg/L也出现了1%和4%。MIC为≥2 、1和≤0.5 mg/L时治疗成功率分别为31.4%、65%和75%。当MIC≥2时，hVISA的百分比高达57.4%，MIC为1mg/L时，hVISA的百分比为14.18%。结论：MRSA的MIC随时间显示升高趋势，当MIC浓度到达2mg/L时，hVISA检出概率明显提高，临床治疗失败概率也增多，呈高度的相关性。

关键词：万古霉素MRSA治疗成功率MIC hVISA

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）,已成为院内感染的重要菌种，治疗MRSA

大都用糖肽类的万古霉素或替考拉宁，而万古霉素是从1956年获得FDA批准上市，在临床上应用数十年之久，近年来，又有多位学者提出[1]万古霉素对金黄色葡萄球菌的MIC

值有漂移趋势，且临床治疗失败与高MIC值、是否存在hVISA的研究国内这方面还较少。故本作者对2000~2009年十年来MRSA作一个科学的研究，现报告如下：

1.资料与方法：

1.1菌株来源：收集2000年1月至2009年12月到我院住院临床分离的MRSA菌株，

标本共收集1620株：其中痰液1022株（63.1%），伤口151株（9.3%），脓液143（8.8%），血液103株（6.4%），其它201株（12.4%）。

1.2.万古霉素（稳可信，V ancomycin批号：090311））美国礼来公司，M.H血平皿

为美国的OXOID公司生产：细菌鉴定仪为VITEK2COMPACT，VITEK32微生物分析仪

1.3质控菌株为金黄色葡萄球菌A TCC25923、A TCC29213。

1.4 MRSA检测方法按美国临床实验室标准化委员会（CLSI）抗生素药物敏感执

行标准，用头孢西丁纸片进行确认。头孢西丁（每片30 ）纸片对1620株金黄色葡萄球菌做药敏实验，头孢西丁纸片抑菌圈直径小于19mm为耐药，则可确定为MRSA。万古霉素对金黄色葡萄球菌的MIC测定采用CLSI推荐的琼脂平板稀释法，质控菌株

A TCC29213及试验菌株在M-H琼脂上培养16-18小时后，取菌落用无菌生理盐水配成

0.5麦氏浊度菌悬液，用多点种仪接种于含一系列药物浓度的M-H琼脂平板上，37℃培

养24小时，无菌生长的最低药物浓度为MIC，（2008年CLSI标准）[2]；疗效判断标准: 根据卫生部颁布的《抗菌药物临床研究指导原则》，疗效分为：痊愈、显效、进步、无效4级评定，痊愈和显效合计为有效。痊愈：症状.体征.实验室检查及病原学检查4项指标均恢复正常;显效：并且明显好转，用药后病情有所好转，但不够明显；无效：用药72h后病情无明显进步，或有所加重。痊愈与显效合计有效，计算有效率；异质性万古霉素中介金黄色葡萄球菌（heterogeneous intermediate-vancomycin-resistantStaphylococcus aureus,hVISA）的检测：万古霉素耐药或中介的菌株，本研究用MI C≥1mg/L的MRSA895株，.筛选方法：将试验菌株用无菌生理盐水配制成0.5麦氏管（细菌浓度相当于

108CFU/ml），稀释至106CFU/ml，取10μl接种于4μg/ml的万古霉素选择性培养基，35℃孵育48h，观察细菌生长情况，同时按美国CDC要求用A TCC25923作为敏感菌株，

A TCC51299作为耐药菌株质控[3]。对筛选阳性菌株重新用VITEK32微生物分析仪进行

细菌鉴定，以保证筛选菌株为葡萄球菌。hVISA判断标准：根据Hiramatsu报道的方法，菌谱分析法符合以下条件者判断为hVISA，（1）细菌在≥4μg/ml的万古霉素选择性培养基上生长，出现频率≥10-6（10万分之一）；（2）细菌亚群对万古霉素的耐药性相对稳定，在不含万古霉素的培养基中传代9代，耐药性不丢失[4、5]。

2. 统计学方法:统计软件使用SPSS16.0。计量资料用t检验，记数资料用u 检验，

相关性用Spearma等级相关进行统计。

2．结果：

00-01年度MIC为2 mg/L、1 mg/L和≤0.5 mg/L时百分比为0.3%、18.5%和81.2%；

02-03年度为0.7%、36.4%和62.8%；04-05年度为1.0%、53.8%，45.2%；06-07年度为

1.6%、70.4%和27.7%；08-09年度为4.5%、70.5%和24.0%。其中06-07和08-09年度

MIC为4 mg/L也出现了1%和4%，详见表一：各年度分离菌株在不同MIC值百分比表一：各年度分离菌株在不同MIC值百分比

年度菌株4mg/l(%) 2 mg/l(%) 1 mg/l(%) ≤0.5 mg/l(%)

00-01 260 02-03 280 04-05 305 06-07 375 08-09 400 0（0%）

0（0%）

0（0%）

1（0.3%）

4（1.0%）

1（0.3%）

2（0.7%）

3（1.0%）

6（1.6%）

18（4.5%）

48（18.5%）

102（36.4%）

164（53.8%）

264（70.4%）

282（70.5%）

211（81.2%）

176（62.8%）

138（45.2%）

104（27.7%）

96（24.0%）

治疗成功率：MI C≥2 mg/L治疗成功率为31.4%；1 mg/L时治疗成功率为65%；当MIC≤0.5 mg/L治疗成功率为75%.详见表二：各MIC值的治疗成功率

表二：各MIC值的治疗成功率

MIC（mg/L）总数痊愈（例）显效（例）进步（例）无效（例）有效率（%）≥2 35 8 3 20 4 31.4

1

≤0.5 860

725

507

472

52

72

287

173

14

8

65

75

hVISA分布在MI C≥1 mg/L的情况与临床治疗研究数据详见表三：各MIC值中hVISA分布表

表三：各MIC值中hVISA分布表（hVISA例数/MRSA例数）

MIC（mg/L）总数痊愈（例）显效（例）进步（例）无效（例）hVISA（%）≥2 20/35 2/8 2/3 12/20 4/4 57.14

1 122/860 40/507 13/5

2 57/287 12/14 14.18

经Spearma等级相关统计：MIC值与治疗有效率P＜0.01，呈负相关。MIC值与hVISA检出率P＜0.01，呈正相关。hVISA与治疗失败经统计计算P＜0.01，也呈现相关。

3讨论：

本研究结果显示：万古霉素对MRSA的MIC=1mg/L菌株，由00-01年度的18.5%，上升到08-09年的70.5%；MIC=2mg/菌株从0.3%上升到4.5%，与此同时MI C≤0.5mg/菌株从81.2%下降至24.0%，意味着在此范围内，万古霉素的MIC范围有所漂移。这与国内报道基本一致[6]。

近年来MRSA检出率逐年增多，对临床治疗提出了更严峻的挑战[3]，万古霉素治疗MRSA 感染存在高失败率是各国普遍存在的现象[7，8]，我国的赵子文报道使用国产去钾万古霉素和进口万古霉素治疗MRSA感染患者14天，临床有效率分别为：80.9％和78.7％；患者体内细菌不能清除率分别有19.1％和17.1％[9]。而本研究中，当MRSA的MI C≥2mg/L时，临床

治疗有效率为31.4%，MI C为1mg/L时，有效率为65%，≤0.5时才达75%，经Spearma等级相关统计：MIC值与治疗有效率P＜0.01，呈负相关。万古霉素体外药敏试验结果虽为敏感，但当MI C≥2mg/L时，临床常规治疗失败概率明显增加，应引起高度重视。治疗失败是否与hVISA/hVRS存在有关，多数文献报道是肯定的[7，8]，异形万古霉素中敏金葡菌(hVISA)1997年首次由日本提出，该菌种的出现考虑是耐甲氧西林金葡菌(MRSA) 的变异，潜在性地说明了和万古霉素的临床疗效降低有一定的关系，表明MRSA对糖肽类的敏感性开始呈下降趋势[10]。而本研究中同样统计得：MIC值与hVISA检出率P＜0.01，呈正相关。hVISA与治疗失败率P＜0.01，也呈现相关，这hVISA的检出与万古霉素治疗失败有关。但有4例是hVISA且MI C≥2mg/L，而临床用万古霉素治疗是有效的（4/11）。而临床治疗无效有16例是hVISA（16/24），这说明hVISA与是否治疗有效具有相关性，但不是唯一因素。hVISA对万古霉素的耐药机制主要有耐药基因的获得、细胞壁增厚、青霉素结合蛋白（PbPs）的改变、调节基因的改变等等。hVISA感染若处理不当，可诱导成发展为中介耐药（VISA），最终发展成同源性耐药（VRS）[11].而h－VRS的耐药机制比较肯定是细胞壁成分合成增加，导致细胞壁增厚。增厚的细胞壁，交联减少，使游离的D－丙氨酰－D－丙氨酸侧链含量增加，这些游离的侧链可以与万古霉素结合，将万古霉素“扣留”在细胞壁中，阻碍了万古霉素到达作用靶位[12]，细胞壁增厚是VRS的共同特性，其厚度与葡萄球菌对糖肽类抗生素的敏感性（MIC）具有很好的相关性[12]。虽然所有报道的h－VRS菌株均未检出万古霉素耐药的van基因[13]，但是，2002年从美国分离的2株VRSA中检测出vanA基因，目前认为细胞壁增厚和获得耐药基因可能是葡萄球菌耐药的两种不同机制，前者比较常见，但多表现对万古霉素低度耐药，一般MIC不超过32μg/ml；后者比较少见，至今仅有2例报道，但表现为万古霉素高度耐药，MIC可达128μg/ml。目前，当万古霉素的浓度超过2mg/L 时，就会抑制金葡菌菌落里大多数细胞的生长，但如果有一定比例的金葡菌细胞能形成新的菌落，例如：浓度高的时候发生的频率低至10-6，这样分离出的金葡菌即被定义为hVISA，hVISA的方法多种多样，世界各国均已有hVISA发病率的报道，从本研究来看宁波地区当MIC≥2时，hVISA的百分比高达57.4%，MIC为1mg/L时，hVISA的百分比为14.18%。与中国大陆hVISA的发病率为9.5％基本一致[14]。

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)是引起医院感染的多重耐药菌,其有效的治疗药物为万古霉素等糖肽类抗菌素。糖肽类药物的使用也随之越来越普遍，那么我们可以预计hVISA 向万古霉素中敏金葡菌(VISA)以及耐万古霉素金葡菌（VRSA）发展是必然的。建议临床实验室开展hVISA和h－VRS的筛选检测是非常必要的，一旦hetero-VRSA和hVISA发展为耐万古霉素金黄色葡萄球菌(VRSA),临床将面临无药可选择的被动局面. 同时临床上应用万古霉素治疗MRSA失败,临床医生应该考虑是否有hetero-VRSA或VISA的存在.因此,对VRSA的耐药机制以及hetero-VRSA和hVISA的检测方法研究已迫在眉睫。

参考文献：

[1]Maor Y,Lago L,Zlotkin A, et al.Molecular features of hetergeneous vancomycin-intermediate Stapylococcus aureus strains isolated from bacteremic patients [J].BMC Microbiol,2009,9;189

[2]Clinical and Laboratory Standards Instituts.Performance standards for antimicrobial susceptibility testing (CLSI document M 100-S18)[M].Wayne:Clinical and Laboratory Standards Institute,2008:46-53.

[3] 吴本权，唐英春，张扣兴等. 万古霉素异质性耐药葡萄球菌的分离及其药物敏感性分析. [J]中国抗生素杂志，2002，27（2）：116－120.

[5 ]Fridkin SK. Vancomycin－intermediate and–resistant Staphylococcus aureus：What the

infectious disease specialist needs to know. Clin Inf Dis，2001，32（1）：108－115.

[6 ]T allent SM，Bischoff T，Climo M，et al. Vancomycin susceptibility of Oxacillin－resistant Staphylococcus aureus isolates causing nosocomial bloodstream infections. J Clin Microbiol，2002，40（6）：2249–2250

[7] Wil C，Van DC，Y vette J，et al. Nosocomial spread of a Staphylococcus capitis strain with heteroresistance to ancomycin in a neonatal intensive care unit. J Clin Microbiol，2002，40（7）：2520–2525.

[8] Moore MR，Perdreau－Remington F，Chambers HF. Vancomycin T reatment Failure Associated with Heterogeneous Vancomycin－Intermediate Staphylococcus aureus in a Patient with Endocarditis and in the Rabbit Model of Endocarditis. Antimicrob Agents Chemother，2003，47（4）：1262－1266.

[9]赵子文，熊剑辉，钟维农等．进口万古霉素与国产去甲万古霉素治疗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌下呼吸道感染的对比研究．[J]中国抗生素杂志，2003，28（4）：242－244．[10] Hiramatsu K，Aritaka N，Hanaki H，et al. Dissemination in Japanese hospitals of strains of staphylococcus aureus heterogeneously resistant to vancomycin. Lancet，1997，350（12）：1670～1673

[11] Moore MR，Perdreau－Remington F，Chambers HF. Vancomycin T reatment Failure Associated with Heterogeneous Vancomycin－Intermediate Staphylococcus aureus in a Patient with Endocarditis and in the Rabbit Model of Endocarditis. Antimicrob Agents Chemother，2003，47（4）：1262－1266

[12] Cui LZ，Ma XX，Sato K，et al. Cell wall thickening is a common feature of vancomycin resistance in S taphylococcus aureus. J Clin Microbiol，2003，41（1）：5－14.

[13] T enover，FC，Lancaster MV，Hill BC，et al.Characterization of staphylococci with reduced susceptibilities to vancomycin and other glycopeptides. J Clin Microbiol，1998，36（4）：1020－1027.

[14]陈宏斌，王辉，孙闻嘉等。2007年中国14个城市异质性万古霉素中介耐药的金黄色葡萄球菌分子特征，[J]中华检验医学杂志，2009，32（11）1223-1227

作者简介:

史煜波是宁波市第一医院微生物实验室副主任技师.毕业浙江大学医学检验系,在各种专业期刊发表论著/论文十余篇,主要研究细菌耐药机理.

电话:0574********,134********. 信箱地址:nbdyyysyb@https://www.wendangku.net/doc/f36813982.html,