P120 连环蛋白在鼻咽癌中的表达及其与细胞凋亡的关系

润和转移的基本环节。MMP-2是降解癌组织基底膜的关键酶，在肿瘤的浸润转移过程中起重要作用。Levy等［3］采用Northern印迹发现72％的大肠腺癌MMP-2mRNA异常升高，且阳性率与癌组织浸润的深度和转移相关，提示检测癌组织MMP-2对预测浸润和转移有帮助。新近报道MMP-2高表达与肝癌移植术后复发相关［4］，本研究显示肝癌组织中有MMP-2蛋白的过表达（62．5％），表达的增强与肝癌TNM分期、血管内有无癌栓和转移关系密切，可作为了解肝癌侵袭性的一个标志，与上述结果一致。但肝癌组织MMP-2mRNA和蛋白间无统计学差异，说明RT-PCR 和免疫组化检测MMP-2表达的方法无明差异，而后者更简便，因此免疫组化检测MMP-2蛋白可作为判断肝癌侵袭性较为理想的方法。

褚忠华等［5］报道CD44等多种粘附分子表达与肝癌临床病理特点的关系。CD147也是一种重要的粘附分子，Zhang等［6］报道CD147肝癌的侵袭和转移中有非常重要有作用，它具有刺激肿瘤细胞产生MMP，还可以通过调节肿瘤周边的成纤维细胞分泌MMP；在缺乏成纤维细胞的条件下，CD147分子也可以通过促使肿瘤细胞分泌MMP来促进肿瘤细胞的浸润和转移。本实验证实癌旁肝组织中CD147表达微弱，其阳性率仅为10．7％，明显低于其在肝癌中的阳性率60．7％，有统计学差异；CD147蛋白表达的增强与肝癌的TNM分期和转移关系密切，与Caudroy等［7］报道的结果类似；CD147蛋白在瘤体直径＜3cm的早期肝癌中低表达，它是否可单独作为判断肝癌临床病理分型的参考指标尚有待验证。本研究还发现MMP-2和CD147蛋白表达吻合系数κ＝0．689，P＝0．000，说明这两种蛋白在肝癌中表达的吻合度有统计学意义，且较强，同时检测这两种蛋白对肝癌TNM分期和转移关系的评价重复性较强。因此，临床上检测MMP-2和CD147蛋白对评估患者临床病理特征有一定的指导意义。

4参考文献

Sun J X，Hemler M E．Regulation of MMP-1and MMP-2production through CD147／extracellular matrix metalloproteinase inducer interactions［J］．Cancer Res，2001，61（5）：2276－2281．

Ou D P，Tao Y M，Tang F Q，et al．The hepatitis B virus X protein promotes hepatocellular carcinoma metastasis by upregulation of matrix metalloproteinase［J］．Int J Cancer，2007，120（6）：1208－1214．

Levy A T，Cioce V，Sobel M E，et al．Increased expression of the 72kDa type IV collagenase in human colonic adenocarcinoma［J］．Cancer Res，2001，51（1）：439－444．

Wu L M，Zhang F，Xie H Y，et al．MMP2promoter polymorphism （C-1306T）and risk of recurrence in patients with hepatocellular carcinoma after transplantation［J］．Clin Genet，2008，73（3）：273－278．

褚忠华，闵军，凌云彪，等．多种粘附分子基因在原发性肝癌的表达及其临床意义［J］．中国病理生理杂志，2004，20（9）：1672－1676．

Zhang Q，Zhou J，Ku X M，et al．Expression of CD147as a significantly unfavorable prognostic factor in hepatocellular carcinoma［J］．Eur J Cancer Prev，2007，16（3）：196－202．

Caudroy S，Polette M，Nawrocki-Raby B，et al．EMMPRIN-mediated MMP regulation in tumor and endothelial cells［J］．Clin Exp Metastasis，2002，19（8）：697－702．

（收稿：2009－05－25编辑：杜冠辉）

近年来研究表明，人类肿瘤的生长、浸润、转移与细胞黏附分子有密切关系。上皮－钙黏蛋白（E-cadherin）是一类介导上皮细胞－细胞间黏附作用的钙依赖性跨膜糖蛋白。它与细胞内链蛋白（catenin）的家［1］

［2］

［3］

［4］

［5］

［6］

［7］

P120连环蛋白在鼻咽癌中的表达及其与细胞凋亡的关系

欧海玲覃宇周张锡流何仕远

摘要目的：研究鼻咽癌组织中上皮钙黏蛋白（E-cadherin）／P120连环蛋白（P120ctn）的表达情况，探讨它们与临床病理特征、细胞凋亡之间的关系。方法：应用免疫组化二步法、TUNEL技术检测56例鼻咽癌标本和15例正常

鼻咽黏膜上皮标本中E-cadherin、P120ctn的表达情况以及鼻咽癌细胞凋亡情况。结果：鼻咽癌组织中E-cadherin和

P120ctn的异常表达率分别为64．29％（36／56）和67．86％（38／56）。E-cadherin和P120ctn的异常表达均与鼻咽癌的病

理分型（分别为P＝0．0118和P＝0．0010）、TNM分期（分别为P＝0．0208和P＝0．0124）、颈部淋巴结转移（分别为P

＝0．0438和P＝0．0406）之间存在显著相关。P120ctn与E-cadherin在鼻咽癌组织中的表达呈正相关（r＝0．5217，P＝

0．0000）。12例E-cadherin与P120ctn共同正常表达组癌细胞凋亡指数（AI）为0．3％～2．0％（均数为0．83％），28例E-

cadherin与P120ctn共同异常表达组癌细胞AI为0．1％～1．3％（均数为0．56％），无统计学差异（P＝0．3271）。结论：鼻

咽癌的发生发展过程中常发生E-cadherin与P120ctn的表达异常，与肿瘤的浸润、转移有关，可作为判断鼻咽癌生物

学特征和预后的重要指标。鼻咽癌组织中E-cadherin与P120ctn的表达与癌细胞凋亡无直接相关关系。

关键词鼻咽肿瘤；细胞凋亡；E-cadherin；P120ctn；临床病理特征

基金项目：广西青年科学基金资助项目（编号：桂科青0542060）

作者单位：530001南宁市，广西中医学院病理教研室（欧海玲，张

锡流，何仕远）；530021南宁市，广西壮族自治区肿瘤医院（覃宇周）

通信作者：张锡流E-mail：xiliuzhang＠sina．com

表1鼻咽癌组织中E-cadherin／P120ctn的表达与临床病理特征间的关系例（％）

项目

病理分型

角化性鳞状细胞癌

分化型非角化性癌

未分化型非角化性癌TNM分期

Ⅰ～Ⅱ期

Ⅲ～Ⅳ期

颈部淋巴结转移

无

有例数

8

20

28

30

26

36

20

正常表达

7（87．50）

9（45．00）

8（29．57）

16（53．33）

6（23．08）

17（47．22）

4（20．00）

异常表达

1（12．50）

11（55．00）

20（71．43）

14（46．67）

20（76．92）

19（52．78）

16（80．00）

P值

0．0118

0．0208

0．0438

正常表达

6（75．00）

11（55．00）

4（14．29）

14（46．67）

4（15．38）

15（41．67）

3（15．00）

异常表达

2（25．00）

9（45．00）

24（85．71）

16（53．33）

22（84．62）

21（58．33）

17（85．00）

P值

0．0010

0．0124

0．0406 E-cadherin P120ctn

族成员α-catenin、β-catenin、γ-catenin以及P120连环蛋白（P120ctn）结合构成黏蛋白－链蛋白复合体（cadherin catenin complex，CCC），维持着上皮细胞间黏附力和正常上皮组织结构完整性和极性，在肿瘤演进过程中扮演着重要的角色。目前，有关E-cadherin与P120ctn在鼻咽癌组织中表达研究尚未见报道。我们应用免疫组化方法、脱氧核糖核酸末端转移酶介导的缺口末端标记（TUNEL）技术了解E-cadherin、P120ctn 在鼻咽癌中的表达以及与临床病理特征、细胞凋亡的关系，以进一步探讨鼻咽癌的发生、发展、浸润、转移机制，希望能更好地为患者诊断、治疗、判定预后提供依据。

1资料与方法

1．1一般资料收集广西中医学院第一附属医院病理科2004－2007年存档的鼻咽癌活检标本56例和15例正常鼻咽黏膜上皮标本。鼻咽癌患者中，男33例，女23例；年龄23～76岁，中位年龄43岁；按WHO国际组织分类标准分类：角化性鳞状细胞癌8例，分化型非角化性癌20例，未分化型非角化性癌28例；按国际抗癌联盟（UICC）临床TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期30例，Ⅲ～Ⅳ期26例；伴有颈部淋巴结转移者20例。所有鼻咽癌患者活检前均未接受过放化疗及其他针对肿瘤的治疗。

1．2试剂与方法鼠抗人E-cadherin单克隆抗体，即用型（北京中杉金桥生物技术公司）；鼠抗人P120ctn 单克隆抗体，浓缩型（Santa Cruz公司）；二步法Max Vision检测试剂盒（福建迈新生物技术公司）；细胞凋亡原位检测试剂盒（POD）（福建迈新生物技术公司）。

免疫组化二步法染色步骤：切片常规脱蜡、水化；柠檬酸盐缓冲液高压抗原修复；3％过氧化氢溶液室温下孵育15min阻断内源性过氧化物酶活性。滴加一抗E-cadherin、P120ctn，4℃孵育过夜。滴加Max Vision检测试剂盒中的试剂A（增强剂）和试剂B（酶标羊抗鼠聚合物），室温下孵育20min。滴加DAB溶液显棕黄色。苏木素复染；脱水、透明、封片。PBS代替一抗作阴性对照，已知阳性片作阳性对照。

TUNEL染色步骤：石蜡切片脱蜡至水；5μg／mL 蛋白酶K37℃消化30min；0．3％H

2

O2甲醇室温30 min；滴加TUNEL反应混合液，湿盒内37℃60min；滴加50μL转化剂－POD液酶标记抗荧光素抗体，湿盒内30min；DAB显色；水洗中止反应，苏木素复染核；中性树胶封片。用PBS液代替TUNEL液作阴性对照；滴加TUNEL液前用DNA酶Ⅰ消化组织（20min，室温）行阳性对照。

1．3结果判定参照Gamallo等［1］免疫组化评分方法，采用染色强度评分与染色范围评分之和进行结果判断：0分为（－）；1～2分为（＋）；3～4分为（＋＋）；5～6分为（＋＋＋）。E-cadherin、P120ctn正常阳性表达定位于细胞膜，膜（＋＋＋）为正常表达，膜（＋）～（＋＋）为表达减弱，膜（－）为表达缺失。无论膜表达情况如何，只要≥10％瘤细胞胞浆或核出现棕褐色颗粒则为异位表达。膜表达减弱、缺失和异位表达统一定义为异常表达［2］。

TUNEL结果判定：阳性物质呈棕黄色，位于细胞核内，呈散在分布。物镜100倍油镜下随机计数1000个细胞中阳性细胞数并以百分数表示作为凋亡指数（apoptotic index，AI）。

1．4统计学处理所得数据使用SPSS13．0统计学软件包进行卡方检验，P＜0．05为差异有显著性。

2结果

2．1免疫组化染色正常鼻咽黏膜上皮中，E-cadherin和P120ctn均有14例（93．33％）在细胞膜上强烈表达。但在鼻咽癌组织中膜表达下调（图1～4），异常表达率分别为64．29％（36／56）、67．86％（38／56），主要表现为膜表达减弱、缺失以及胞浆表达，其中P120ctn还有4例伴有胞核的异位表达。

2．2鼻咽癌组织中E-cadherin／P120ctn的表达与临床病理特征间的关系如表1所示，E-cadherin和P120ctn的表达与鼻咽癌的病理分型显著相关（分别为P＝0．0118和P＝0．0010），分化差的肿瘤细胞中异常表达率高；与TNM分期亦显著相关（分别为P＝0．0208和P＝0．0124），临床分期越晚，E-cadherin和P120ctn 异常表达就越明显；鼻咽癌E-cadherin和P120ctn异

表2

鼻咽癌组织中P120ctn 与E-cadherin 表达间的关系

组别

P120ctn （x ）E-cadherin （y ）

x ±s 1．6250±0．48851．5714±0．4994

r 值0．5217

t 值4．4943

P 值0．0000

表3

鼻咽癌组织E-cadherin 、P120ctn 的表达与AI 的关系

组别共同正常表达组共同异常表达组

AI （x ±s ，％）0．8286±0．58510．5625±0．4241

t 值1．0184

P 值0．3271

图1

鼻咽癌组织E-cadherin 膜表达正常（40×）

图2

鼻咽癌组织P120ctn 膜表达正常（40×）

图3

鼻咽癌组织E-

cadherin 膜表达减弱伴胞浆表达（40×）

图4鼻咽癌组织P120ctn 膜表达减弱伴胞浆表达（40×）图5E-cadherin ／

P120ctn 共同正常表达组的癌细胞凋亡（100×）

图6E-cadherin ／P120ctn 共同异常表达组的癌细胞凋亡（100×）●

●

●●

●

●

常表达者有较容易出现颈部淋巴结转移的倾向。

2．3鼻咽癌组织中P120ctn 与E-cadherin 表达间的关系P120ctn 与E-cadherin 共同正常表达和共同异常表达分别为12例和28例，存在显著一致性，呈正相关（r ＝0．5217，P ＝0．0000）。见表2。

2．4鼻咽癌组织E-cadherin 、P120ctn 的表达情况与

AI 的关系56例鼻咽癌细胞AI 为0．1％～2．0％，均数为0．69％。12例E-cadherin 与P120ctn 共同正常表达组AI 为0．3％～2．0％，均数为0．83％（图5）；28例E-cadherin 与P120ctn 共同异常表达组AI 为0．1％～1．3％，均数为0．56％（图6）。统计学分析，无统计学差异（P ＝0．3271）。见表3。

3

讨论

与其他肿瘤的研究报道［3－6］相似，本研究结果显示：鼻咽癌中E-cadherin 、P120ctn 的异常表达明显高于正常鼻咽黏膜上皮，差异有显著性（P ＜0．05）。说明正常上皮细胞间具有很强的E-cadherin 和P120ctn 表达，它们在维持形态和结构方面起着重要作用，E-cadherin ／P120ctn 表达下调促进了鼻咽癌的发生。

大多数文献报道E-cadherin 是在胞膜上表达的，存在着膜表达减弱或缺失。但本研究发现一种现象，部分鼻咽癌组织中E-cadherin 有胞浆表达，可以说是异位表达现象，考虑可能是癌变过程中细胞信号转导失调导致蛋白“漏入”胞浆。P120ctn 在鼻咽癌组织中的异常表达主要表现为膜表达减弱和（或）出现胞浆表达，这与已有报道［7－8］的一些其他恶性肿瘤组织如在胃癌、结直肠癌等中的表达情况相符。P120ctn 是否也能在细胞核内表达，目前国内外文献报道很少，但本研究却发现了4例膜、浆、核同时表达的现象。

Daniel 等［9］最先发现P120ctn 在细胞核内与转录因子Kaiso 连接。Sarrio 等［10］在262例乳腺癌组织中仅检测到几例P120ctn 的核表达，P120ctn 是否通过与Kaiso

相连启动肿瘤的浸润、转移，从这少数几例核表达样本尚难以确定，作用机制还待进一步研究。

本研究探讨了E-cadherin 和P120ctn 的蛋白表达与临床病理特征间的关系。我们发现E-cadherin 和P120ctn 表达与鼻咽癌分化程度、TNM 分期、颈部淋巴结转移呈显著相关，鼻咽癌分化越差、恶性程度越高、临床分期越晚，E-cadherin 和P120ctn 异常表达就越明显；鼻咽癌E-cadherin 和P120ctn 异常表达者有较容易出现颈部淋巴结转移的倾向。这可能是由于E-cadherin 和P120ctn 的异常表达损害E-cadherin 和P120ctn 结合形成的CCC 的功能，从而导致细胞的黏附功能下降，使肿瘤细胞从原发部位脱离，浸润周围组织并转移到淋巴结和远方器官。因此，E-cadherin 和P120ctn 不仅在鼻咽癌的发生过程中有着重要的作

用，而且也与肿瘤的进展相关，可视为浸润、转移的标志。

从本研究结果来看，鼻咽癌中P120ctn与E-cadherin表达之间存在显著一致性，二者呈正相关。P120ctn与E-cadherin共同正常表达和共同异常表达分别为12例和28例，表明P120ctn同其他catenin一样，对E-cadherin功能的发挥起着重要的修饰和调节作用。

鼻咽癌中P120ctn与E-cadherin共同表达异常一致性的现象，对于鉴别鼻咽黏膜活检标本中一些不能明确的可疑癌细胞可能有一定帮助。可以通过免疫组化检查P120ctn、E-cadherin的表达来进行鉴别诊断，如果二者表达下调，提示可能为恶性细胞，应引起高度重视，建议患者进一步检查或随访。对于P120ctn、E-cadherin在鼻咽部结核、真菌等特殊感染或者淀粉样变等疾病中的表达情况，我们未作相关研究，亦未查到相关文献报道，如果两者在这些疾病中的表达情况与正常鼻咽黏膜的表达一致，则更能体现出两者在鼻咽癌中表达下调的特异性，这将有待我们进一步的研究探讨。

我们还发现，鼻咽癌中P120ctn的异常表达率为67．86％，而E-cadherin的异常表达率为64．29％，P120ctn表达减弱或缺失的7例患者E-cadherin表达正常，这提示：P120ctn的表达异常可能较E-cadherin 频繁，P120ctn在某些特定状态下可能不依赖于E-cadherin的正常与否而有着自身的作用特征。

近年来研究发现细胞凋亡与肿瘤有着密切的关系，细胞凋亡信号的转导在细胞凋亡的调控中起了很大的作用。大量的研究资料证明，P120ctn作为一个超级Src底物，易被酪氨酸蛋白激酶受体（如EGFR、PDGFR、CSFlR、VEGFR和NGFR等）影响而发生磷酸化，这可能是有关受体通过酪氨酸蛋白激酶（比如Src）造成的P120ctn磷酸化［11］。发生磷酸化的主要位点在黏附连接处，因此P120ctn的酪氨酸磷酸化需要P120ctn与E-cadherin在细胞膜上发生作用后才能发生，当P120ctn滞留在细胞浆中时，并未发生磷酸化，而且也可能没有能力接受膜的有关信号［12］。这表明酪氨酸蛋白激酶是调节P120ctn活性的重要因子，P120ctn的作用机制与Src有关，P120ctn参与了酪氨酸蛋白激酶信号转导通路。

酪氨酸蛋白激酶信号转导系统作为细胞凋亡的信号转导系统，它会影响到肿瘤细胞的凋亡，P120ctn 的改变是否会通过酪氨酸蛋白激酶信号转导通路影响到鼻咽癌细胞凋亡呢？这方面的研究目前未见报道。因此，我们设想，想通过观察鼻咽癌中P120ctn表达的改变和鼻咽癌细胞凋亡的情况来了解P120ctn 的改变是否会促进肿瘤的演进。

我们考虑到P120ctn的酪氨酸磷酸化需要P120ctn与E-cadherin在细胞膜上发生作用后才能发生，因此，我们将研究分为两组，一组是鼻咽癌组织中P120ctn与E-cadherin共同表达正常的12例，一组是P120ctn与E-cadherin共同表达异常的28例，研究两组细胞凋亡的关系。但研究结果显示，差异无统计学意义（P＝0．3271），也就是说鼻咽癌中P120ctn与E-cadherin都表达正常的组别的细胞凋亡指数与P120ctn与E-cadherin都表达异常的组别无差异，我们目前没有证据证明P120ctn、E-cadherin的异常表达会通过酪氨酸蛋白激酶所介导的信号转导途径对细胞凋亡产生影响。这也许与我们研讨的例数尚少有关，或者是它们之间本来就没有必然联系，还有待进一步实验研究。

4参考文献

Gamallo C，Palacios J，Suarez A，et al．Correlation of E-cadherin expression with differentiation grade and histological type in breast carcinoma［J］．Am J Pathol，1993，142（4）：987－993．

谢成耀，王亮，刘洋，等．P120ctn在非小细胞肺癌组织中的表达及其临床意义［J］．中华病理学杂志，2005，34（4）：206－210．

Joo Y E，Rew J S，Choi S K，et al．Expression of E-cadherin and catenins in rarly gastric cancer［J］．J Clin Gastroenterol，2002，35（1）：35－42．

Shibata T，Kokubu A，Sekine S，et al．Cytoplasmic P120ctn regulates the invasive phenotypes of E-cadherin-deficient breast cancer［J］．Am J Pathol，2004，164（6）：2269－2678．

张锡流，何仕远，张力，等．E－钙黏附蛋白及其相关蛋白在前列腺癌组织中的表达及其临床意义［J］．检验医学，2006，21（1）：5－7．

Ramburan A，Govender D．Cadherins and catenins in pathology［J］．Curr Diagn Pathol，2002，8（5）：305－317．

Karayiannakis A J，Syrigos K N，Alexiou D，et al．Expression pattems of the novel catenin p120cas in gastrointestinal cancers［J］．Anticancer Res，1999，19（5）：4401－4405．

Gold J S，Reynolds A B，Rimm D L．Loss of P120ctn in human colorectal cancer predicts metastasis and poor survival［J］．Cancer Lett，1998，132（1－2）：193－201．

Daniel J M，Reynolds A B．The catenin p120（ctn）interacts with Kaiso，a novel BTB／POZ domain zinc finger transcription factor［J］．Mol Cell Biol，1999，19（5）：3614－3623．

Sarrio D，PerezMies B，Hardisson D，et al．Cytoplasmic localization of P120ctn and E-cadherin loss characterize lobular breast carcinoma from preinvasive to metastatic lesions［J］．Oncogene，2004，23（19）：3272－3283．

Shibamoto S，Hayakawa M，Takeuchi K，et al．Association of p120，

a tyrosine kinase substrate，with E-cadherin／catenin complexes［J］．

J Cell Biol，1995，128（5）：949－957．

Thoreson M A，Anastasiadis P Z，Daniel J M，et al．Selective uncoupling of P120ctn from E-cadherindisrupts strong adhesion［J］．J Cell Biol，2000，148（1）：189－201．

（收稿：2009－05－02编辑：张倩）［1］

［2］

［3］

［4］

［5］

［6］

［7］

［8］

［9］

［10］

［11］

［12］