植物DNA和RNA提取方法剖析

实验一植物基因组DNA的提取

一、实验目的

掌握植物总DNA的抽提方法和基本原理。学习根据不同的植物和实验要求设计和改良植物总DNA抽提方法。

二、实验原理

通常采用机械研磨的方法破碎植物的组织和细胞，由于植物细胞匀浆含有多种酶类(尤其是氧化酶类)对DNA的抽提产生不利的影响，在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂(如巯基乙醇)以降低这些酶类的活性。在液氮中研磨，材料易于破碎，并减少研磨过程中各种酶类的作用。

十二烷基肌酸钠(sarkosyl)、十六烷基三甲基溴化铵(hexadyltrimethyl ammomum bromide，简称为CTAB)、十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate，简称SDS)等离子型表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以游离出来。再加入苯酚和氯仿等有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸(DNA、RNA)水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。上清液中加入无水乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于TE溶液中，即得植物总DNA溶液。

三、实验材料

水稻幼叶

四、主要试剂配方

2% CTAB抽提缓冲溶液: CTAB 4g NaCl 16.364 g 1M Tris-HCl 20ml( PH8.0) 0.5M EDTA 8ml，先用70ml ddH2O溶解, 再定容至200ml灭菌, 冷却后0.2-1% 2-巯基乙醇（400ul）

氯仿-异戊醇（24：1）：先加96ml氯仿，再加4ml异戊醇，摇匀即可。

五、实验步骤

1. DNA的提取

（1）2%CTAB抽提缓冲液在65℃水浴中预热。

（2）取少量叶片（约1g）置于研钵中，用液氮磨至粉状；

（3）加入700ul的2%CTAB抽提缓冲液，轻轻搅动；

（4）将磨碎液分倒入1.5 ml的灭菌离心管中，磨碎液的高度约占管的三分之二；

（5）置于65℃的水浴槽或恒温箱中，每隔10 min轻轻摇动，40 min后取出；

（6）冷却2 min后，加入氯仿-异戊醇（24：1）至满管，剧烈振荡2~3 min，使两者混合均匀；

（7）放入离心机中10 000 rpm离心10 min，与此同时，将600 μl的异丙醇加入另一新的灭菌离心管中；

（8）10 000 rpm离心1 min后，移液器轻轻地吸取上清夜，转入含有异丙醇的离心管内，将离心管慢慢上下摇动30 sec，使异丙醇与水层充分混合至能见到DNA絮状物；

（9）10000 rpm离心1 min后，立即倒掉液体，注意勿将白色DNA沉淀倒出，将离心管倒立于铺开的纸巾上；

（10）60 sec后，直立离心管，加入720 μl的75%乙醇及80 μl 5 M的醋酸钠，轻轻转动，用手指弹管尖，使沉淀与管底的DNA块状物浮游于液体中；

（11）放置30 min，使DNA块状物的不纯物溶解；

（12）10000 rpm离心1 min后，倒掉液体，再加入800 μl 75%的乙醇，将DNA再洗30 min；

（13）10000 rpm离心30 sec后，立即倒掉液体，将离心管倒立于铺开的纸巾上；数分钟后，直立离心管，干燥DNA（自然风干或用风筒吹干）；

（14）加入50 μl 0.5 × TE(含RNase)缓冲液，使DNA溶解，置于37℃恒温箱约15 h，使RNA消解；

（15）置于-20℃保存、备用。

2. DNA质量检测

琼脂糖电泳检测，原理和方法见实验二。

六、注意事项

（1）叶片磨得越细越好。

（2）移液器的使用。

（3）由于植物细胞中含有大量的DNA酶，因此，除在抽提液中加入EDTA抑制酶的活性外，第一步的操作应迅速，以免组织解冻，导致细胞裂解，释放出DNA酶，使DNA降解。

思考题：

1. 本实验中所用到的各试剂的作用是什么? CTAB, 氯仿, 异丙醇, 75%乙醇, EDTA 2．提取基因组DNA的方法有哪些？各有何优缺点？

实验二多聚酶链式反应( polymerase chain reaction, PCR) 基因扩

增及琼脂糖凝胶电泳检测

一、实验目的

通过本实验学习PCR反应的基本原理，掌握PCR的基本操作技术以及琼脂糖凝胶电泳技术。

二、实验原理

PCR用于扩增位于两端已知序列之间的DNA区段，即通过引物延伸而进行的重复双向DNA合成。基本原理及过程如下：

PCR循环过程中有三种不同的事件发生：（1）模板变性；（2）引物退火；（3）热稳定DNA聚合酶进行DNA合成。

1．变性：加热使模板DNA在高温下（94-95℃）变性，双链间的氢键断裂而形成两条单链，即变性阶段。

2．退火：在体系温度降至37-65℃，模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合，使引物与模板链3’端结合，形成部分双链DNA，即退火阶段。

3．延伸：体系反应温度升至中温72℃，耐热DNA聚合酶以单链DNA为模板，在引物的引导下，利用反应混合物中的4种脱氧核苷三磷酸（dNTP），按5’到3’方向复制出互补DNA，即引物的延伸阶段。

上述3步为一个循环，即高温变性、低温退火、中温延伸3个阶段。从理论上讲，每经过一个循环，样本中的DNA量应该增加一倍，新形成的链又可成为新一轮循环的模板，经过25～30个循环后DNA可扩增106～109倍。

典型的PCR反应体系由如下组分组成：DNA模板、反应缓冲液、dNTP、MgCl2、两条合成的DNA引物、耐热DNA Taq聚合酶。

琼脂糖凝胶电泳的原理：琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，沸水中溶解，45℃开始形成多孔性刚性滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。DNA分子在碱性环境中带负

电荷，在外加电场作用下向正极泳动。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同DNA，其分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。琼脂糖凝胶电泳法分离DNA，主要是利用分子筛效应，迁移速度与分子量的对数值成反比关系。溴化乙锭（EB）为扁平状分子，在紫外照射下发射荧光。EB可与DNA分子形成EB-DNA复合物，其发射的荧光强度较游离状态EB发射的荧光强度大10倍以上，且荧光强度与DNA的含量成正比。用肉眼观察，可检测到5 ng以上的DNA。

三、实验材料及相关试剂

基因组DNA，基因特异性引物，PCR扩增相关试剂，等

四、实验步骤

1．模板DNA的抽提：实验一所得的水稻基因组DNA。

2．PCR操作(在冰上操作)：

（1）PCR反应混合液的配制：反应体系25 μL, 在无菌的0.2 mL离心管中按下列操作程序加样：

反应物加样顺序体积/μL 终浓度

ddH2O 1 17.3×n

10 x Buffer 2 2.5×n 1 x

25 mmol/L MgCl2 3 1.5×n 1.5 mmol/L

10 mmol/L dNTP 4 0.5×n200 μmol/L

10 μM上游引物 5 1×n0.4 μmol/L

10 μM下游引物 6 1×n0.4 μmol/L

DNA Taq聚合酶7 0.2×n 1 U （2）将反应混合液混匀, 然后每个PCR管中分装24 μL反应混合液，再加1 μL模板DNA，最后加1滴石蜡油，防止水分蒸发, 然后稍离心。

（3）将PCR管放到PCR热循环仪中，按下列程序开始循环：

94℃ 4 min (预变性) 94℃ 30 sec, 60℃ 30 sec, 72℃ 2 min 72℃ 7 min

35个循环

（4）注意事项

由于PCR灵敏度非常高，所以应当采取措施以防反应混合物受痕量DNA的污染。

a.所有与PCR有关的试剂，只作PCR实验用，而不挪作它用。

b. 操作中所用的PCR管、离心管、吸管头等都只能一次性使用。

c. 每加一种反应物，应换新的枪头。

3．PCR产物的检测：

琼脂糖浓度（1.2%）；EB浓度（5 μl / 100 ml TBE）

（1）制胶（以150 mL为例）

a. 称取1.8 g 琼脂糖，加入150 ml 的TBE缓冲液（pH 8.0），摇匀，用电子天平称

三角瓶的总重量。

b. 电炉上加热，至琼脂糖完全溶解；然后在天平上加蒸馏水至原重量;

c. 用凝胶将制胶板两端封好，插入适当的梳子，将溶解的琼脂糖（约50℃），倒入

其中，直至厚度为4～6 mm（如有气泡要把气泡赶出），在室温下冷却凝固(约30~

45 min)；

d.将制胶板置于电泳槽中，小心垂直向上拔出梳子，以保证点样孔完好。

（2）点样

a. 将2.0 μl 溴酚蓝加入到PCR产物中，然后稍微离心；

b. 每孔点样10.0 μl，蓝色样品混合物将沉入点样孔下部。

（3）电泳

打开电源开关，调节电压至3~5 V/cm(约100 V)，可见到溴酚蓝条带由负极向正极移动，约1小时后即可观察。

（4）染色

将电泳好的凝胶放入含EB的水溶液中, 染色15-20分钟。

（5）观察

将电泳好的胶置于紫外透射检测仪上，戴上防护观察罩，打开紫外灯，可见到橙红色核酸条带，根据条带粗细，可粗略估计该样品DNA的浓度。如同时有已知分子量的标准DNA 进行电泳，则可通过线性DNA条带的相对位置初步估计样品的分子量。

（6）注意事项

a. 煮胶时，胶液的量不应超过三角瓶容量的1/3，否则易溢出。

b. 煮好的胶应冷却至50℃左右时再倒，以免制胶板变形，并减少漏胶的机会。

c. 倒胶注意厚度（4-6 mm），充分凝固后再拔出梳子，以保持齿孔形状完好。也可待胶稍凝固后，放入4℃冰箱10多分钟，以加速胶的凝固。

d. 加样前赶走点样孔中的气泡，点样时吸管头垂直，切勿碰坏凝胶孔壁，以免使带型不整齐。

e. 一般情况下不必每点一个样品都换枪头，吸电泳缓冲液洗几次即可再点下一个样品。凝胶中含有EB，切勿直接用手接触胶，废弃胶应集中处理，勿乱丢。

思考题：

1．PCR反应液中主要成分是哪些？在PCR反应过程中各起什么作用？

2．为什么在PCR反应过程中，使用三个不同的温度变化？

3．用PCR扩增目的基因，要想得到特异性产物需注意哪些事项？

实验三植物总RNA的提取

一、实验目的

通过本实验学习从植物组织中提取RNA的方法

二、实验原理

RNA是一类极易降解的分子，要得到完整的RNA，必须最大限度地抑制提取过程中内源性及外源性核糖核酸酶对RNA的降解。高浓度强变性剂异硫氰酸胍，可溶解蛋白质，破坏细胞结构，使核蛋白与核酸分离，失活RNA酶，所以RNA从细胞中释放出来时不被降解。细胞裂解后，除了RNA，还有DNA、蛋白质和细胞碎片，通过酚、氯仿等有机溶剂处理得到纯化、均一的总RNA。

三、仪器、药品与试剂配方

(一)仪器

1．低温离心机

2．分光光度计

3．琼脂糖胶电泳系统，用前先用1% Na OH溶液浸泡过夜,之后再用DEPC水浸泡冲洗。

4．高压灭菌锅

5．研钵、剪刀、一次性手套等

(二)药品

1. 焦碳酸二乙酯(DEPC)

2. 吗啉代丙烷磺酸(MOPS)

3. 异硫氰酸胍

4. 醋酸钠(NaAc)

5. 氯仿

6. 苯酚

7. 甲醛

8. 乙醇

9. 乙二胺四乙酸(EDTA)

10. 琼脂糖

11. 异丙醇

(三) 试剂配方

1．0.1% DEPC水

0.1ml DEPC 加入100 ml三蒸水中，振摇过夜，再湿热灭菌。

2. 2 mol/L NaAc、0.5 mol/L EDTA、4 mol/L异硫氰酸胍、4 mol/L LiCl等均用DEPC水

配制。

3. 5ΧMOPS 电泳缓冲液(pH 7.0)

MOPS 0.1 mol/L

NaAc 40 mmol/L

EDTA 5 mmol/L

四、实验步骤

（一）总RNA的提取（方案一）

1. 实验前10天左右播种水稻种子，在3-4叶期，剪取1.2 g幼叶。放入研钵，在液氮中

研磨成粉末状，移入10 mL离心管。加入

4 mol/L异硫氰酸胍 4 mL

苯酚 3 mL

2 mol/L NaAc (pH 4.8) 0.

3 mL

氯仿0.6 mL

混匀，冰浴放置30 min。

2. 4℃，8000 r/min，离心13 min。

3. 弃沉淀，取上清至另一干净无菌离心管中。

4. 加入2倍体积无水乙醇，-70℃，0.5 h。

5. 4℃，8000 r/min，离心13 min。

6. 弃上清，在沉淀中加入1 mL 4 mol/L LiCl，使其溶解。

7. 移入1.5 mL离心管中，冰浴2 h。

8. 4℃，13000 r/min，离心15 min。

9. 弃上清，在沉淀中加入400 uL DEPC水，再加入400 uL氯仿，混匀。

10. 4℃，13000 r/min，离心6 min。

11. 取上清,并加入1/10体积3 mol/L NaAc（pH 5.0），2倍体积无水乙醇，-20℃放置30 min。

12. 4℃，13000 r/min，离心20 min。

13. 将沉淀RNA用70%乙醇洗涤2次。

14. 将沉淀RNA室温下稍干燥。

15. 加30 uL DEPC水溶解，-70℃保存。

（二）总RNA的提取（方案二）

利用TRIzol提取液抽提RNA，具体步骤如下：

1. 取幼叶约250 mg在液氮中研磨至细粉，转入预冷的1.5 ml离心管；

2. 加入1 ml TRIZOL提取液震荡摇匀；

3. 室温放置5 min后，加入0.5 ml的氯仿，剧烈摇动离心管5 min；

4. 在8℃条件下，12000 rpm离心15 min；

5. 溶液分为两层，下层为酚－氯仿浅红色液层，将上层液体移入干净离心管，加入

0.5 ml异丙醇在15~30℃条件下，沉淀10 min；

6. 然后在, 2~8℃条件下，12000 rpm离心10 min，RNA沉淀管壁和底部；

7. 去掉液体部分，加入1 ml 75%酒精洗2次；

8. 风干后，加入25 μl DEPC处理过的水溶解RNA，储藏于-80℃冰箱备用。

（三）甲醛变性琼脂糖凝胶电泳分析总RNA

1．配制1.2%变性琼脂糖凝胶(40 mL)

称取0.48 g,加入DEPC水25.2 mL,5X电泳缓冲液4 mL, 加热使溶解，稍冷却加入甲醛

3.4 mL, 混匀，室温凝固0.5-1 h.

2. RNA电泳检测样品制备

RNA 2 μl

甲醛 2.5 μl

甲酰胺7.5 μl

10×MOPS 2 μl

RNA Loading Buffer 2 μl

灭菌的DEPC 水 4 μl

混合液轻轻混匀并离心，放于65℃下温育5 min后，置于冰上。

3. 电泳检测

将1.2%变性琼脂糖凝胶放入水平电泳槽中，加1×MOPS电泳缓冲液，覆盖凝胶约1 mm。将RNA样品加到凝胶点样孔中，在5 V/cm条件下电泳30 min，然后在EB中染色15-20 min，在紫外灯下观察提取的RNA的质量。

五、注意事项

1．在研磨过程中，利用液氮时刻使组织保持冰冻状态。

2．RNA酶是一类生物活性非常稳定的酶类，除了细胞内源RNA酶外，外界环境中均存在RNA酶，所以操作时应戴手套，并注意时刻换新手套。

思考题：

1. 实验中所用到的各试剂的作用是什么?

焦碳酸二乙酯(DEPC), 吗啉代丙烷磺酸(MOPS), 异硫氰酸胍, 醋酸钠(NaAc), 氯仿,

苯酚, 甲醛, 乙醇, 乙二胺四乙酸(EDTA), 异丙醇

动植物组织mRNA提取实验方法

一、材料

水稻叶片或小鼠肝组织。

二、设备

研钵，冷冻台式高速离心机，低温冰箱，冷冻真空干燥器，紫外检测仪，电泳仪，电泳槽。

三、试剂

1、无RNA酶灭菌水：用将高温烘烤的玻璃瓶（180℃2小时）装蒸馏水，然后加入0.01%的DEPC（体积/体积），处理过夜后高压灭菌。

2、75%乙醇：用DEPC处理水配制75%乙醇，（用高温灭菌器皿配制），然后装入高温烘烤的玻璃瓶中，存放于低温冰箱。

3、1×层析柱加样缓冲液；20mmol/L Tris·Cl(pH7.6)，0.5mol/L NaCl，1mmol/L EDTA(pH8.0)，0.1% SDS。

4、洗脱缓冲液：10mmol/L Tris·Cl (pH7.6)，1mmol/L EDTA (pH8.0)，0.05% SDS。

四、操作步骤

（一）动植物总RNA提取-Trizol法

Trizol法适用于人类、动物、植物、微生物的组织或培养细菌，样品量从几十毫克至几克。用Trizol法提取的总RNA绝无蛋白和DNA污染。RNA可直接用于Northern斑点分析，斑点杂交，Poly(A)+分离，体外翻译，RNase封阻分析和分子克隆。

1、将组织在液N中磨成粉末后，再以50-100mg组织加入1ml Trizol液研磨，注意样品总体积不能超过所用Trizol体积的10%。

2、研磨液室温放置5分钟，然后以每1mlTrizol液加入0.2ml的比例加入氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管15秒。

3、取上层水相于一新的离心管，按每mlTrizol液加0.5ml异丙醇的比例加入异丙醇，室温放置10分钟，12000g离心10分钟。

4、弃去上清液，按每ml Trizol液加入至少1ml的比例加入75%乙醇，涡旋混匀，4℃下7500g离心5分钟。

5、小心弃去上清液，然后室温或真空干燥5-10分钟，注意不要干燥过分，否则会降低RNA的溶解度。然后将RNA溶于水中，必要时可55℃-60℃水溶10分钟。RNA可进行mRNA分离，或贮存于70%乙醇并保存于-70℃。

[注意] 1、整个操作要带口罩及一次性手套，并尽可能在低温下操作。

2、加氯仿前的匀浆液可在-70℃保存一个月以上，RNA沉淀在70%乙醇中可在4℃保存一周，-20℃保存一年。

（二）mRNA提取

由于mRNA末端含有多poly(A)+，当总RNA流径oligo(dT)纤维素时，在高盐缓冲液作用下，mRNA被特异的吸附在oligo(dT)纤维素柱上，在低盐浓度或蒸馏水中，mRNA可被洗下，经过两次oligo(dT) 纤维素柱，可得到较纯的mRNA。

1、用0.1mol/L NaOH悬浮0.5-1.0g oligo(dT)纤维素。

2、将悬浮液装入灭菌的一次性层析柱中或装入填有经DEPC处理并经高压灭菌的玻璃棉的巴斯德吸管中，柱床体积为0.5-1.0ml，用3倍柱床体积的灭菌水冲洗柱床。

3、用1x柱层析加样缓冲液冲洗柱床，直到流出液的pH值小于8.0。

4、将（一）中提取的RNA液于65℃温育5分钟后迅速冷却至室温，加入等体积2x柱

层析缓冲液，上样，立即用灭菌试管收集洗出液，当所有RNA溶液进入柱床后，加入1倍柱床体积的1x层析柱加样溶液。

5、测定每一管的OD260，当洗出液中OD为0时，加入2-3倍柱床体积的灭菌洗脱缓冲液，以1/3至1/2柱床体积分管收集洗脱液。

6、测定OD260，合并含有RNA的洗脱组分。

7、加入1/10体积的3M NaAc(pH5.2)，2.5倍体积的冰冷乙醇，混匀，-20℃30分钟。

8、4℃下12000g离心15分钟，小心弃去上清液，用70%乙醇洗涤沉淀，4℃下12000g 离心5分钟。

9、小心弃去上清液，沉淀空气干燥10分钟，或真空干燥10分钟。

10、用少量水溶解RNA液，即可用于cDNA合成（或保存在70%乙醇中并贮存于-70℃）。

[注意] 1、mRNA在70%乙醇中-70℃可保存一年以上。

2、oligo(dT)纤维素柱用后可用0.3mol/l NaOH洗净，然后用层析柱加样缓冲液平衡，并加入0.02%叠氮钠（NaN3)冰箱保存，重复使用。每次用前需用NaOH水层析柱加样缓冲液依次淋洗柱床。

RNA提取流程

RNA（total RNA）和信使RNA(mRNA)的抽提

RNA的提取

RNA和无RNA酶的环境

原核生物能产生功能上截然不同的三种RNA, 信使RNA(mRNA),核糖体RNA (rRNA),转运RNA(tRNA).而真核生物则能产生四种,还有一种为真核生物所持有的小RNA.mRNA是由基因转录而来的,它运送编码蛋白所需的信息. 由于mRNA代表了基因表达的水平,因此mRNA的分离,定量和检测极为重要.

应用RNA对细胞和分子生物学的各个方面进行研究非常普遍.RNA存在于从简单的逆转录病毒到哺乳动物细胞的所有的生命形式之中.由于当前没有一种方法能够直接扩增RNA,因此,RNA的分离通常是决定实验结果质量的第一步,也是关键的一步.

提取RNA 过程中防止RNA酶的污染所采取的步骤

RNA分离的实用方法既有简单直接的方法(如分离rRNA和tRNA),也有困难和涉及复杂步骤的方法(如分离mRNA).在无细胞体系中克隆基因的体外转录非常有用,它可以产生足量的同源RNA分子用作探针或模板以识别和测定表达基因的量,或用于RNA的生化研究,处理RNA样品时必需仔细小心,其程度取决于样品的用途和来源.由于RNA酶存在于所有的生物中并且能够抵抗诸如煮沸这样的物理破坏,固此建立一个无RNA酶的环境对于制备优质RNA很重要.对于制备mRNA来说这些预防措施尤其重要.

方案:

工作区域应与进行普通微生物实验的区域分离好,特别是那些用于细菌接种,培养基和试剂配制的区域,那些培养基和试剂用于从细菌和动物细胞中进行DNA的制备和操作.通常认为这些区域富含RNA酶.

如有可能,使用标有"无RNA酶"的商品试管,吸头,溶液和水.通常新的无菌处理过的塑料试管和吸管无RNA酶,

3)双蒸水(ddH2O)和溶液应该用RNA酶的抑制剂DEPC(焦碳酸二乙酯)进行处理:

每100mL溶液或水中加入0.1mL DEPC原液,放在摇床上充分混匀并在37℃下作用数小时.然后将溶液高压灭菌15min使DEPC失活.

4)用分子级的试剂和DEPC处理过的水配制的溶液通常没有RNA酶.

5)分离RNA以前,将一些实验室玻璃制品置于烤箱在300 ℃ 烘烤4h以灭活核酶.如有可能,将其他设备也灭菌处理.

从组织中提取RNA则要注意:

动物器官的解剖器械

存放组织块的玻璃器皿

冻存组织块所用的器皿

组织器官的冲洗液

人汗含有RNA酶,故在所有步骤中均应戴手套并经常更换.

记住我们的周围环境含有大量的微生物和气雾,它们来自吸液操作或来自我们自己的呼吸.这些可能造成RNA酶的污染

一些组织像脾脏可能比其它组织含有更多的RNA酶.细菌比哺乳动物细胞中有更多的RNA酶.因此从这些细胞中制备RNA应采取更严格的预防措施.

分离后的RNA通过琼脂糖凝胶电泳再经溴化乙锭染色后便可检查其是否完

整.rRNA(18s和28s) 条带模糊可能表明由RNA酶引起的RNA的降解.

一步法分离RNA

应用

从组织或细胞中分离细胞的总RNA

从液体样品中分离RNA

TRI REAGENT (Tripure) 是一种用于RNA 分离的商品溶液.该法源于chomc- zynski 的RNA分离一步法.它更便于使用并且结果更加可靠.对于来源有限的样品,我们推荐使用这种试剂.这种试剂能从同一样品中同时分离RNA, DNA,蛋白质.

方案 .

用l mL Tripure/50-100mg (组织)匀浆组织样品.对于细胞,每10cm2面积(贴壁的单层细胞)或每106个细胞(细胞沉淀)使用1mL.将样品转至1.5mLEP管

中.(-70 ℃可保存1月)

室温下放置样品5min.每1mL Tripure中加入0.2mL氯仿并摇动15s,置于室温下2—15min.

4 ℃下12000g离心15min.

将水相(上部)转至一个新EP管.每1mL Tripure加入0.5mL异丙醇沉淀RNA.将样品置于室温下5—10min.

4 ℃,12000g离心10min.凝胶样沉淀物为RNA.

吸出上清并用1mL 75%乙醇在涡旋振荡器上洗涤RNA沉淀一次, 4 ℃, 7500g 离心5min.

晾干RNA沉淀.然后用无RNA酶的水,甲酰胺或0.5X 的 SDS溶液溶解沉淀. RNA的检测:

将样品稀释液于三处波长处读取OD值.

记录OD值,通过计算确定RNA浓度或纯度.

公式如下

对于ssDNA:[ssDNA]=33×(OD260一OD310) ×稀释倍数

对于dsDNA:[dsDNA]=50×(OD260—OD 310) ×稀释倍数

对于ssRNA:[ssRNA]=40×(OD260一OD310)×稀释倍数

以上浓度单位为ug/mL.

注意事项

1)OD310值是背景,若盐浓度较高,OD310"值也高.

2)OD260/OD280 对DNA而言其值大约为1.8,高于1.8有RNA污染.低于1.8则有蛋白质污染.

3)OD260/OD280.对RNA而言其值大约为2.0.

小结

所有可能与RNA接触的器材均得用DEPC处理.

操作过程中应带口罩,手套.

DEPC有致癌之可能,尽量避免接触皮肤

提取的RNA应尽早逆转录成 cDNA.

逆转录聚合酶链式反应

(RT—PCR)

RT—PCR间接用来扩增从RNA分子今得到的一段特异序列.RNA首先被逆转录为cDNA.用位于一段特异序列或者一个基因两侧的引物生成以cDNA为摸板的PCR 产物成为一个标准的PCR反应.得到阳性产物说明存在着特异的RNA序列.

对于—个成功的PCR反应来说,寡聚核苷酸引物是最重要的组分.引物的长度范围通常在18至25个核苷酸之间.用常规条件扩增的PCR产物的长度范围为100一1000bp.为了扩增从mRNA逆转录得到的cDNA,引物中应含有一段目的基因的内含子区,以便从带有基因组DNA的PCR产物中区分出cDNA的PCR产物.

许多计算机程序,诸如Primer Primer5.0,使得最适引物的选择十分便利.评判标准包括GC含量,解链温度,引物—引物二聚体和特异性.

应用

1. 利用有限的总RNA量测定一段持异的RNA信息;

2. 进行PCR克隆.

逆转录

1) 用分光光度计测定A260以确定RNA浓度.

2)RT反应混合物包括以下组分(20ul):

0.5至 l ug RNA .

1.25mmol/L dNTPs(dATP,dTTP, dCTP, dGTP).

1.6 ug的随机六聚物(pd[N] 6).

2uL 10xRT buffer

200 u 逆转录酶

加DEPC处理过的双蒸水至总体积为20ul,

于37℃反应lh.然后于94度加热5min以终止反应.

PCR扩增

将以下组分混合(50ul)以进行PCR扩增:

a.从上面反应中逆转录得到的10ul cDNA.

b.1U的Taq聚合酶.

c. 引物(0.2umol/L).

d.5ul 10×PCR缓冲液(o.5mmol/L MgCl2, 50mmol/L KCl, 10mmol/L Tris·HCl,0.001%明胶)

e.加双蒸水使总体积为50ul.

f. 编程,开始PCR

一步法RT—PCR

优点:一步法RT-PCR排除了在将cDNA转至PCR反应混合体系过程中可能出现的污染和吸量的变化.避免了在逆转录反应结束阶段的变性过程中可能发生的cDNA蒸发.

缺点:对于新手来说,一次不成功须从第一步重新开始.

方案

0.1-1ug 总RNA

200一500 umol/L的dNTP(每种)

2 umol/L随机六聚物pd(N)

200 U AMV逆转录酶

1×Taq聚合酶缓冲液

0.5-15mmol/L MgCI2

1 mmo1/L DTT

1.5U Taq聚台酶

0.5umol/L的引物(每种)

终体积为50ul.

小结:

半定量时必需设计内参照.

内参的长度与目的片段相差100bp以上,否则电泳时不能很好分开

内参的退火温度应与目的片段相当,最好控制在1-2 ℃左右,且退火温度不要太高.

有时内参与目的基因引物之间可以形成二聚体,导致条带暗,可以分开PCR, 然后加在一起电泳.

进行基因克隆时应在引物上加酶切位点,尽量选用常用酶,如BamH I,EcoR I, Hind III 等便于连接到表达载体上.

产量低时可通过增加模版量,增加循环数量来解决.