注射用甲磺酸左氧氟沙星的无菌检查方法验证
注射用甲磺酸左氧氟沙星的无菌检查方法验证
【摘要】目的：验证注射用甲磺酸左氧氟沙星的无菌检查方法。方法:按《中国药典》2005版二部(附录XIH)所载“无菌检查法”项下进行试验。通过对阳性对照菌条件的选择和每筒500ml0.1%蛋白胨（含1%0.1mol/LMnSO4)缓冲液的冲洗，建立了无菌检查方法。结果：阴性、样品管无菌生长，六株阳性菌生长良好。结论：经方法学验证该检验结果准确可靠。可做为注射用甲磺酸左氧氟沙星的无菌检查方法验证的无菌检查。
【关键词】注射用甲磺酸左氧氟沙星无菌检查法（薄膜过滤法）方法验证
注射用甲磺酸左氧氟沙星为喹诺酮类药物。主要作用于革兰氏阴性菌，对革兰氏阳性菌作用弱，有的药物对金葡菌作用强，对其他病原微生物也有不同的作用。它的主要作用机制为抑制细菌DNA旋转酶活性，抑制细菌DNA复制。本品剂型属注射剂类，为了确保临床用药安全。中国药典2005年版要求其做无菌检查。本试验旨在按中国药典2005年版所载“无菌检查法”探索并建立注射用甲磺酸左氧氟沙星的无菌检查方法。
1.材料和试药
1.1供试品
注射用甲磺酸左氧氟沙星（规格：g/支，批号：，生产厂家：福建省闽东力捷迅药业有限公司）
1. 2培养基、稀释液及冲洗液
硫乙醇酸盐流体培养基（批号：）；
改良马丁培养基（批号：）；
营养肉汤培养基（批号：）；
营养琼脂培养基（批号：）；
蛋白胨 (批号：）；
玫瑰红钠琼脂培养基（批号：）,
上述试剂试药均由北京三药科技开发公司提供。
改良马丁琼脂培养基（批号：）上海中科昆虫生物开发有限公司提供。
0.9%NaCl注射液（批号：09011403）上海长征富民药业铜陵有限公司。
分析纯MnSO4（批号： )
1. 3仪器和滤器
HTY2000B型集菌仪及KSF型全封闭式无菌集菌培养器（厂家：）
YXQ-LS-50立式压力蒸汽灭菌器（厂家：上海博迅实业有限公司医疗设备厂）
SPX-250B-2生化培养箱（厂家：上海博迅实业有限公司医疗设备厂）
MJP-150霉菌培养箱（厂家：上海精宏实验设备有限公司）
20ml注射器（厂家：）
1. 4菌种（第代）
①金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC（B）26003]
②大肠埃希菌（Escherichia coli)[CMCC(F)44102]
③枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）[CMCC(B)63501]
④生孢梭菌（Clostridium sporogenes）[CMCC(B)64941]
⑤白色念珠菌（Candida albicans）[CMCC(F)98001]
⑥黑曲霉（Aspergillus niger）[CMCC(F)98003]
2.试验前准备
2.1培养基、冲洗液及稀释液的制备和灭菌
本实验均采用市售干的培养基、冲洗液，按照说明书要求配制，并于灭菌器内121℃灭菌15min。
2.2菌液的制备[3]
2.2.1取金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中于35℃培养18-24h，采用培养物直接稀释法用0.9%的无菌NaCl稀释至小于100cfu/ml（用营养琼脂平板计数）备用。
2.2.2取生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中于35℃培养18-24h，采用培养物直接稀释法用0.9%无菌NaCl稀释至小于100cfu/ml（在缺氧的条件下用营养琼脂平板计数）备用。
2.2.3取白色念珠菌的新鲜培养物接种至改良马丁培养基中于25℃培养18-24h，用0.9%无菌NaCl稀释至小于100cfu/ml，一般稀释至1:106的菌悬液(用玫瑰红钠琼脂培养基平板计数)备用。
2.2.4将黑曲霉的新鲜培养物接种至改良马丁琼脂斜面培养基上，于25℃培养5d。加5ml0.9%的无菌NaCl溶液用玻棒将孢子洗下，然后用管口带有纱布的无菌吸管吸至无菌的试管中，最后用0.9%的无菌NaCl稀释至小于100cfu/ml，一般稀释至1:104的菌悬液（用改良马丁琼脂培养基双碟法计数）备用。
2.3菌液计数
将6菌株的菌液用0.9%无菌NaCl溶液稀释至适宜的倍数，并各吸1ml注入平皿中，每菌株各注两皿，然后倒入相应的培养基。待凝固后放入相应的培养箱中培养适宜的时间。（需气、厌气菌30-35℃培养24h，真菌23-28℃培养48h）必要时可延长时间。结果如下：表1菌液平板计数结果
试验菌名称接种量稀释级菌落形成数(cfu/ml) 平均菌落数（cfu/ml）
平皿1 平皿2
①金黄色葡萄球菌1ml 10-6
②大肠埃希菌1ml 10-6
③枯草芽孢杆菌1ml 10-6
④生孢梭菌1ml 10-6
⑤白色念珠菌1ml 10-6
⑥黑曲霉1ml 10-4
菌液计数结果均符合规定
2.4培养基的无菌检查及灵敏度检查
2.4.1培养基的无菌检查
每批培养基随机取6瓶，培养14天，结果全部无菌生长。
2.4.2培养基的灵敏度检查
取装量为12ml的硫乙醇酸盐流体培养基试管9支。分别接种上述制备的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌各两支，剩余一管做空白对照，35℃培养3天。取每管装量为9ml的改良马丁培养基5支，分别接种上述制备的白色念珠菌、黑曲霉各两支，剩余一支做空白对照，25℃培养5天，逐日观察结果。结果空白对照管无菌生长，且其它管菌都生长良好。结果如下表2：
表2培养基的灵敏度检查结果
试验菌培养1d 培养2d 培养3d 培养4d 培养5d
①金黄色葡萄球菌
②大肠埃希菌
③枯草芽孢杆菌
④生孢梭菌
⑤白色念珠菌
⑥黑曲霉
细菌阴性对照
真菌阴性对照
注：－为澄清，+表示菌生长良好
2.5方法验证实验
2.5.1试验组(菌+样品+培养基)
取本品30瓶，用20ml注射器吸适宜的稀释液（冲洗液:0.1%蛋白胨缓冲液）注入每瓶中，待溶解后吸干移至具塞的瓶子中为供试品溶液。取一次性全封闭集菌培养器（三联）一套，放在集菌仪的不锈钢插座上，将培养器的软管放入集菌仪的泵头上。开动电控集菌仪，先用冲洗液润湿滤膜，再将溶解好的本品泵入培养器中过滤，滤完后用冲洗液冲洗，每一个培养器每次冲洗100ml，冲洗5次。夹住其中一软管,在另两管中分别泵入改良马丁培养基(100ml),随后取下夹子将已泵入改良马丁培养基两管的软管夹紧,再泵入硫乙醇酸盐流体培养基(100ml)。关闭集菌仪，用剪刀将软管剪断，将软管的开口端套在空气过滤器的开口端上。另取一次性全封闭集菌培养器（三联）一套和本品30瓶按以上方法过滤冲洗并每管分别泵入硫乙醇酸盐流体培养基(100ml)，夹紧管口。将上述两套一次性全封闭集菌培养器移入接种室用注射器将上述稀释的菌液吸1ml注入相应的培养基中，得到试验组。
2.5.2对照组（菌+培养基）
取一次性全封闭集菌培养器（三联）一套，操作同前，向两管分别泵入改良马丁培养基(100ml)，向四管分别泵入硫乙醇酸盐流体培养基（100ml）。移入接种室用注射器将上述稀释的菌液吸1ml注入相应的培养基中，即得对照组。
2.5.3阴性对照组(培养基)
取一次性全封闭集菌培养器（二联）一套，用0.1%蛋白胨缓冲液冲洗培养器，冲洗量与试验组一致。分别泵入改良马丁培养基(100ml)和硫乙醇酸盐流体培养基(100ml)，得阴性对照组。
将上述装培养基的容器按规定温度（需气、厌气菌35℃，真菌25℃）培养5天。结果如下：
表2 a试验组与对照组检验结果
试验用菌株每管冲洗量接种量培养时间/天试验组对照组
①金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26003] 500ml cfu
1
2
3
4
5
②大肠埃希菌[CMCC(F)44102]500ml
cfu 1
2
3
4
5
③枯草芽孢杆菌[CMCC(B)63501] 500ml
cfu 1
2
3
4
5
④生孢梭菌[CMCC(B)64941] 500ml cfu
1
2
3
4
5
⑤白色念珠菌[CMCC(F)98001] 500ml cfu
1
2
3
4
5
⑥黑曲霉
[CMCC(F)98003]500ml cfu 1
2
3
4
5
表2 b阴性对照组检验结果
阴性对照冲洗量培养时间/天 1 2 3 4 5 硫乙醇0ml
改良马丁0ml
（注：－为澄清，+表示菌生长良好,对照组无需冲洗）
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