细胞培养污染的途径、危害及预防措施

细胞培养污染的途径、危害及预防措施

污染是细胞培养技术中面临的主要问题。由于每一种细胞有其独特的培养体系，因此污染造成的后果也不尽相同。某些污染的发生往往难以察觉和检测，而且污染源能长期共存于培养体系中，这类污染事实上大部分被人们忽视了。培养的细胞作为一个生物体，会对培养环境以及环境中的污染物作出相应的反应，造成培养细胞生物学特性的改变，而对实验结果造成潜在的威胁，而且随着污染时间的延长而增加。

培养环境中的物理、化学及生物因素都可能侵入培养环境造成污染。由于入侵的微生物在培养体系中不断增殖、代谢，因此生物性的污染对细胞的危害最大。随着污染微生物的不断增殖，交叉污染的可能性也不断增加。此外，微生物代谢消耗大量必需的养分，同时产生多种有毒的代谢产物，如酶、抗原及毒素等，进一步对细胞产生毒害作用。因此，认识细胞培养污染的途径及其危害性，建立细胞培养规范的操作方法及规章制度，可以有效地防止污染，保证实验体系的稳定性和可靠性。

1 细胞培养基本技术

为了减少污染对细胞培养的影响，必须建立细胞冻存库。细胞冻存库应该分主细胞库（Master cell bank，MCB）和工作细胞库（Working cell bank，WCB），当需要做实验时从主细胞库中复苏细胞建立工作细胞库。每一个冻存标本都应明确记录细胞的性质、代数及有无污染。同时还应建立规范的检测程序进行菌检及细胞鉴定［1］。

为了保证培养细胞系的完整性，必须进行详细的实验记录，应包括以下内容：细胞系的种类及来源、有无污染（如细菌，病毒，支原体）、细胞代数和倍增时间、以及选择性突变。详细的记录有利于对细胞的遗传及生理特性在常规传代培养中因突变、污染及各种原因导致的改变进行分析。经过连续传代培养的细胞与它较早代数的冻存细胞相比，随着培养时间的延长，细胞在适应环境的过程中，其生物特性已发生了改变。培养的细胞由若干生长速度及活力各异的亚群组成。随着培养时间的延长，生长速度快及活力高的细胞亚群逐渐占优势，这种选择性趋势会影响整个细胞群的生物特性。应用不同代数的细胞连续进行实验则结果会发生偏差。建立细胞冻存库就能避免这种影响，通过复苏相同代数的细胞，人们就能在较为均一的条件下重复实验。

细胞培养工作需要清洁，保持良好的环境及规范的操作程序［2，3］。超净工作台是细胞培养中普遍使用的无菌操作装置，它需要合理的布置及经常性的维护。超净工作台的工作原理是驱动经高效滤菌净化后的空气，通过工作台面形成气流屏障，从而阻止外界污染物的侵入并使操作过程中产生的飞沫限制在超净工作台中。因为操作过程中可能产生有毒的物质，所以采用垂直气流比水平气流安全。

当进行移液，倾倒液体的操作过程会产生飞沫，并沉积在超净工作台内物体的表面。超净工作台的气流并不能阻止飞沫的产生，飞沫会随着气流的方向飘浮。超净工作台不合理的放置、不恰当的维护以及不规范的使用会破坏超净工作台气流的方向，导致飞沫更广泛的沉积。酒精灯的火焰、操作者的活动、谈话、咳嗽及打喷嚏都有可能影响气流。飞沫的沉积是导致超净工作台内物品污染的主要因素，造成潜在污染的进一步传播。因此为减少交叉污染

的发生，应尽可能减少超净工作台内的物品。不同细胞系以及同一个实验室不同操作者所使用的培养试剂一定要分开使用，如胰酶、培养液等。否则，一个操作者的失误可能引起所有细胞发生污染。

2 细胞培养的污染

细胞培养污染是指培养环境中侵入了对细胞生存有害的成分和造成细胞变异的异物。细胞培养污染可分为以下三类：物理性、化学性及生物性［2，3］。为了使细胞培养的结果更可靠，应该固定所有培养条件，并保证其重复性。

2.1 物理性污染的来源、危害及预防物理性污染常常被人们所忽视或被笼统地归为化学性污染。物理性污染通过影响细胞培养体系中的生化成分，从而影响细胞的代谢。培养环境中的物理因素，如温度、放射线、振动、辐射(紫外线或荧光)会对细胞产生影响［2］。细胞、培养液或其它培养试剂暴露于放射线、辐射或过冷过热的温度中，可以引起细胞代谢发生改变，如细胞同步化、细胞生长受抑制甚至细胞死亡。通过实验室的合理设计及建立规范的操作规程，可以减少环境中物理因素对细胞的影响。孵箱应放在温度较恒定的环境中，周围不能放置能引起机械振动的设备，如离心机。培养液及培养试剂应放在固定的位置，为避免光照试剂不能放在玻璃门的冰箱中，试剂周围不能放同位素。培养液从冰箱中取出后应在室温中放置一段时间后再进行实验，以避免过冷的温度对细胞的影响。

2.2 化学性污染的来源、危害及预防培养环境中许多化学物质都可以引起细胞的污染［2］。化学物质并不总是抑制细胞的生长，某些化学物质如激素就可促进细胞的生长。不同细胞对化学物质污染的反应是不一样的。未纯化的物质、试剂、水、血清、生长辅助因子及储存试剂的容器都可能成为化学性污染的来源。细胞培养的必需养分，如氨基酸，若浓度超过了合适的范围，也会对细胞产生毒性。同样，不同细胞系其最佳培养条件下对血清和缓冲液的要求是不一样的，在培养中应严格控制。玻璃制品清洗过程中残留的变性剂或肥皂(通常残留在瓶盖的内表面)是最常见的化学性污染。

2.2.1 水水是唯一一种在凝固时膨胀的化合物。因此在选择冻存细胞的容器时应考虑到这个因素。容器因水的膨胀而发生破裂是引起试剂污染的重要原因。为了避免金属离子、有机分子、细胞内毒素等物质对水的污染，在配制液体，清洗容器时必须使用不含杂质的超纯水［4］。需要注意的是，超纯水放置过久其纯度会下降。

在高压蒸气灭菌及蒸馏水时水经常被污染，因为高压蒸气锅及纯水机的常规维护后可能有少量的化学物质残留。为了保证水的纯度，我们应采取措施尽量避免化学物质的残留。

2.2.2 血清动物血清是细胞培养中常用的天然培养基，但血清又是潜在的生物及化学污染的来源。由于血清采集于多个动物，而且不同厂商的生产工艺及质量各不相同，因此血清中许多成分的浓度存在很大的变异。血清对不同细胞的促生长能力及毒副作用取决于这些细胞的分化功能、组织来源及培养基的成分等因素。在进行一系列实验时，为了保证实验的可重复性，最好选用同一批次的血清。

2.2.3 培养液、培养附加成分、试剂培养液、培养附加成分、试剂都可能成为化学性污染的来源。细胞培养使用的所有物质都应是高纯度的，并经过权威机构的鉴定，实验者

本人也应对上述成分进行纯度鉴定。同时，正确配置和储存培养液及试剂也是非常重要的，应该采取标准的操作步骤，避免液体体积计算错误，混用类似化合物等错误。

2.2.4 培养器皿及容器细胞培养过程中会使用到各种不同的培养器皿及容器。培养器皿的大小，构形设计可能会影响到培养中气体交换、湿度、培养液的pH值和细胞生长密度。培养器皿的工艺及灭菌过程中的差异可能对培养体系产生影响。塑料制品在生产过程中可能残留一些有毒成形剂，生产工艺的不同可能引起器皿表面附着能力的不同。储存不同物质时应选用合适的塑料或玻璃容器，因为酒精、强酸、强碱能够溶解塑料或玻璃的某些成分。

2.3 生物性污染的来源、危害及预防外界的微生物如昆虫、节肢动物、原虫、霉菌、病毒、细菌、无细胞壁的微生物（通常指支原体）和其它类型的细胞都可能侵入培养环境引起污染［2，3］。只要在一个开放的环境中进行培养，都难以避免发生污染。发生污染的可能性取决于操作方法、培养室的无菌环境以及实验室的规章制度。生物性污染对细胞代谢的影响，可因污染源和细胞的种类不同而表现各异。

细菌、真菌或其它微生物污染的检测可以用不同培养基进行检查［5］。支原体污染的检测需要特殊的方法。病毒污染的检测可以使用许多体内或体外实验，包括大鼠或小鼠的接种、逆转录酶分析、凝血试验、红细胞吸附试验等。

细菌和真菌的污染较易发现并及时清除，而大多数实验室对支原体的污染缺乏足够的认识。为了防止支原体及其它微生物污染的发生和传播，必须建立规范的无菌操作程序及各种规章制度。支原体归属于柔膜体纲（Mollicutes）的支原体目，它们都具有以下共性：无细胞壁、无细胞壁主要成分——粘肽的表达。支原体与其它细菌不同之处还在于其胞膜中含有胆固醇或其它甾醇，这种特性使支原体膜更具柔顺性，对于物理因素，如压力、渗透压、脱水的抵抗力很大［3］。支原体直径仅有0.3～0.8 μm，并且变形能力大，故能通过滤菌器。需要指出的是，只要有一个具有增殖能力的支原体就能引起培养体系的污染。一旦细胞被污染，支原体的滴度随着时间的延长而逐渐升高，最高可至每毫升109克隆。最为致命的是，即使存在很严重的支原体污染，细胞外观可无明显变化。如果继续使用这种已被支原体污染，而貌似正常的细胞做实验，将会严重影响实验结果。

2.3.1 来源培养体系中支原体污染的最可能途径是经已被支原体污染的细胞扩散和传播。细胞被支原体污染后，支原体可以与宿主细胞形成一个共生体系，使污染不断扩大。一旦发生支原体污染，支原体和其它微生物会随着飞沫而不断传播。操作过程中移液，倾倒液体时都会产生具有潜在感染能力的飞沫，并沉积在接触到的表面。这种污染性飞沫能存活数天甚至数星期。此外，操作失误引起的交叉污染也是支原体污染的一个常见途径。

人体的组织及体液成分是细胞培养中支原体污染的主要来源。污染的细胞中通常能分离到人类口腔支原体、发酵支原体、唾液支原体以及其它一些与人有关的支原体，如

M.buccale，M.faucium，M.homonis，M.pirum和生殖支原体等。无菌操作过程中，操作者能产生有污染性的随空气传播的飞沫和微粒，造成培养体系的污染。人体外周血、骨髓、淋巴组织原代培养中有可能发生发酵支原体的原发污染（primary contamination），这也证明支原体在分化细胞中较未分化细胞更易生长。随着培养技术的不断发展，人们已能培养来自不同物种如动物、植物、昆虫的各种细胞，同时也扩大了支原体及其它微生物的宿主范围。此外，某些支原体，如菜氏无胆甾原体科（Acholeplasma laidlawii）、M.arginini、

M.hyorhinis、口腔支原体、唾液支原体能寄生不同的宿主，并能在培养体系中稳定增殖数

年。牛血清中能分离到https://www.wendangku.net/doc/f64145536.html,idlawii、M.arginini和M.hyorhinis支原体，因此血清可能成为支原体污染的来源。由于无血清培养基中许多附加成分及试剂是从血清或其它生物制品中制备的，因此无血清培养体系并不能排除支原体污染的危险。尽管随着培养技术的进步，血清发生污染的可能性进一步降低，但只要有一个活的支原体能通过滤菌器，整个培养体系就会被污染。

2.3.2 危害支原体通过产生代谢产物及消耗各种养分，如核酸前体及必需氨基酸，从而改变细胞的代谢状态。支原体可以酵解糖，分解精氨酸，氧化丙酮酸，解脲支原体可以利用尿素作为能源，这会使细胞代谢发生一系列改变，从而影响蛋白质、DAN、RNA合成以及嘌呤从头合成及补偿合成途径。污染时间的长短及核酸代谢改变决定了支原体污染造成的危害程度，导致细胞染色体断裂、重排、非整倍体的出现。随后，细胞的生长特性发生改变，使某些酶和细胞因子的产生增加，并表现出一些特殊的细胞功能，而其它一些细胞正常的功能则被抑制。某些支原体附着在细胞表面后，会与宿主细胞交换膜抗原成分。随着细胞膜成分的改变，细胞的形态及抗原性发生改变。细胞污染对研究工作带来的最大危害是由于错误的实验结果导致研究误入歧途。此外，支原体污染还会干扰细胞的筛选，如杂交瘤细胞生长受到抑制并丧失产生单抗的能力（附表）。

附表支原体污染对细胞的影响

分类可能的危害

1 杂交瘤技术1 融合细胞无分泌单抗的能力

2 杂交瘤细胞产生的单抗不是针对靶抗原，而是针对支原体

3 支原体消耗胸腺嘧啶，干扰HAT*筛选

4 在HAT筛选过程中丧失了杂交瘤细胞

2 细胞遗传学1 造成羊水污染

2 姊妹染色单体交换增多

3 染色体随机断裂和畸变增多

4 产生额外的染色体

5 干扰羊水培养的结果

6 精子污染后受精能力下降

7 染色体数目减少

3 病毒学1 转录酶活性下降

2 干扰某些逆转录病毒的分离

3 降低禽痘病毒的感染力及空斑的形态

4 诱导人单核细胞产生干扰素

5 抑制腺病毒的增殖

6 诱导小鼠脾细胞产生干扰素

7 污染病毒疫苗

8 引起巨细胞病毒及带状病毒形成假空斑

9 降低腺病毒及SV40胸腺嘧啶的掺入

10 抑制腺病毒和单纯疱疹病毒的增殖

11 抑制脊髓灰质炎病毒和牛痘病毒的增殖

12 支原体与病毒在蔗糖梯度离心中共沉淀

13 抑制新城病病毒（NDV）产生干扰素

14 丧失HIV敏感细胞

4 代谢1 降低鸟氨酸脱羧酶的产生

2 降低蛋白质和RNA的产生

3 消耗培养液中的精氨酸

4 改变尿苷／尿氨酸的比例

5 降低DNA和RNA的合成

6 增加胸腺嘧啶的降解

7 诱导3T3细胞产生胶原酶

8 增加致癌物诱导芳香烃羟化酶的产生

9 促进淋巴瘤细胞的增殖

10 降低嘌呤替代途径

11 降低ATP水平

12 降低脱氢酶的水平

13 降低氧的消耗

14 抑制胸腺嘧啶的掺入

5 生物反应性1 引起鼠的淋巴细胞发生转化

2 促进肿瘤坏死细胞因子的释放

3 抑制同种抗原引起的细胞毒性反应

4 诱导NK细胞产生细胞毒性因子

5 促进支原体与宿主细胞交换抗原

6 产生类淋巴因子的活性

7 改变成淋巴样细胞产生的免疫球蛋白

8 诱导细胞产生抗支原体的多克隆抗体

9 抑制某些淋巴细胞的分裂

10 对胸腺细胞产生毒性

11 活化鼠的巨噬细胞

*HAT：次黄嘌呤-氨基喋呤-胸腺嘧啶核苷系统

2.3.3 预防及控制污染发生后首先应确定污染物的种类及污染的程度。为了能正确检测细菌或支原体的污染，应先撤去培养液中的抗生素。常规细胞传代培养中应用抗生素会导致：①掩盖了不很严重的污染；②导致了耐药菌的产生。每一种抗生素的抗菌谱都是有限的，而且许多抗生素仅是抑制细菌生长，而非杀菌剂。因为支原体无细胞壁，所以青霉素，头孢菌素等干扰细胞壁合成的抗生素对于支原体无效。

菌检及支原体检测只有在撤去抗生素后才能进行。实验中若发生污染或其它问题应有详细的记录，并由经验丰富的专家分析，找出哪个环节出了问题，包括培养液的配置、实验室环境的保持和无菌操作过程等，从而不断完善操作规程，避免类似问题的出现。此外，管理者还应制定细胞培养的各项规章制度，教育每一个实验人员遵守。实验室负责人应根据情况，制定修改各项规范的操作程序及人员培训计划。一般来说，随着实验室规模的扩大，细胞发生变异和污染的可能性增加了［5］。因此，大型实验室应严格制定各项操作程序及规章制度。细胞培养中无菌操作需要清洁的工作环境、实验的合理安排、实验者熟练的操作技巧及强烈的责任感。只有通过不断地学习、训练，才能熟练掌握无菌操作技术。

为了尽可能减少污染的发生，以常规检查的方式来监督是必要的。细胞培养中发生污染是不可避免的，我们的目的是尽可能减少污染的发生及危害。根据美国实验室的调查报告显示，至少10％的细胞系存在支原体的污染［2］。一旦发生污染，如果细胞有详细的记录，则污染引起的危害较小。我们可以根据细胞定期菌检记录，拼弃最后一次细胞菌检阴性后的实验结果。利用菌检阴性的细胞重新开始实验。如果仅偶尔进行菌检或采用非特异检测方法，尤其是支原体污染，那么确定污染的范围比较困难。因为所有的细胞系都有可能被交叉污染。一旦发生污染，所有未进行菌检的冻存细胞都必须进行菌检，以去除污染的细胞并明确污染发生的时间。

2.3.4 检测由于支原体污染并不引起细胞外观的明显变化，故常规的支原体检测非常必要的。人们可利用一系列直接或间接的方法检测支原体。但由于支原体种类的多样性，目前还没有一种方便、广谱、特异性高、准确的检测方法。因此，有必要对不同检测方法的灵敏度及局限性有所了解。

不同检测方法对送检标本的要求不同，如果标本不合格，将不可能获得正确的结果。血清、培养液或培养基附加成分在加工和储存过程中污染会在一定程度上被稀释，影响检出率［6］。间接检测法由于其敏感性较差，若不采用浓缩标本，则不适用于检测血清和培养液的污染。由于污染物的随机分布，因此仅进行一次检测通常会出现假阴性［1］。如果标本中污染物浓度低于10个污染物／ml，随机抽取1ml标本进行检测可能有36.6％的假阴性率。增加标本体积，浓缩标本有助于降低假阴性率。另一种假阴性的产生是由于污染物在试剂瓶，冻存瓶等容器中的分布不均所致。若20个样品中有一个被污染（5％的污染率），检测所有20个样品，假阴率为36.6％。需要指出的是，仅仅单次检测一个标本来判断有无生物性污染的作法是不可靠的。因此，在分装液体前，就应当从原液中尽可能多取一点液体进行检测。如果不能做到这一点，则应该用标准方法选择多个标本进行检测。例如，在无菌过滤操作中，随着滤过体积的增大，滤膜破损的可能性增加，故应选择最后过滤的液体进行检测。

标本的处理与标本的选择同样重要。各种酶如胰酶、脂酶，强酸，强碱或其它化学物质会破坏支原体膜的脂质，使支原体丧失活力及膜的完整性。膜的完整性被破坏后，支原体内的蛋白酶及核酶释放，从而会干扰间接检测方法的结果。如果标本收集后不能当天检测，则应该尽快冻存标本以防止降解。选择、处理检测标本的目的是尽可能发现潜在的污染。在细胞培养过程中就应考虑到支原体污染的检测。我们最好选用无抗生素培养，检测应尽可能离传代时间长一点，以便让任何潜在的污染物生长、繁殖。为防止支原体活力丧失，如果检测的是贴壁细胞，应采用刮除细胞的方法，因为胰酶或其它生化分离方法会降低支原体的活性。

在选用合适的检测方法时，应考虑到支原体的滴度和活力这两个因素。直接培养法是最敏感的，但也是最耗时的检测方法，大约需28天。从理论上讲，只需一个有活力的支原体就能在培养基上生长。但某些难以培养的支原体限制了直接培养法的应用。理想的直接培养法应采用多功能的培养基，以降低假阴性率［7］。为增加对低滴度和低活力支原体检出率，应采用有氧和无氧两种培养条件及几种传代方式。直接培养法还需要活性支原体作为阳性对照，而且耗时，操作繁琐，因而不适于大多数实验室。

检测支原体污染的间接法包括：PCR、ELISA、电子显微镜检查、DNA探针、DNA荧光染色及生化分析法等。间接法能检测到107／L的滴度。通常情况下，支原体污染后其滴度一般超过109／L，故尽管间接法不敏感，但相对较精确。由于支原体的多样性，表达不同特异

性的抗原及酶，为生化及免疫检测法带来技术上的困难［8］。在选择PCR、DNA探针等方法前，应考虑好选择合适的靶序列及引物序列。

DNA荧光染色法和直接培养法相结合是支原体检测的金标准［5］。美国、加拿大、日本和欧共体国家生物制药及诊断的监督机构推荐使用这种方法。其基本原理在于利用不同的技术，多次检测，以弥补各种检测技术的缺陷，增加检测结果的可信度。

2.3.5 控制及排除控制支原体污染或其它生物性污染的唯一可靠的方法是所有可能污染的物品用高压蒸气灭菌法消毒。所有细胞培养设备都应消毒，应严格遵守上述的各项规章制度及监督制度，直至所有潜在的污染源都被消除。

细胞一旦被支原体污染，要将它清除是非常困难的。由于一些不可复得的细胞被污染，人们不得不设法清除污染，挽救一些珍贵的细胞。事实上，经支原体污染的细胞，在污染经处理被清除后，细胞原有的许多生物学特性，如基因的表达，抗原性和代谢特点也随之发生了相应的改变。排除支原体污染的方法，包括使用抗生素、抗血清、裸鼠体内接种、巨噬细胞吞噬、胰酶消化等方法，但没有一种方法是普遍有效的。所以在采用每一种方法时必须对其效果，以及对细胞可能产生的毒性影响进行监测。Del Guidice和Gardella［6］提出了一个有效的方法，其基本步骤包括首先分离、鉴定污染物及测定对抗生素的敏感性，然后使用至少两种敏感的抗生素进行处理。为增加排除污染的有效性，可以通过稀释以降低血清及其它促生长因子的浓度，从而降低细胞的密度。治疗后细胞应在无抗生素条件下培养若干代，以确定污染已被彻底清除。细胞培养过程中支原体污染不易察觉，细胞被支原体污染后清除非常困难，支原体污染的细胞在支原体被清除后，其细胞特性会发生很大改变，对研究结果造成严重影响。因此，为了保证细胞培养体系免受污染的影响，关键是加强预防措施。

作者简介：李颖健(南京大学医学院博士研究生)

参考文献

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Mycoplasma.Eds.S.Razin，JG.Tully.San Diego：Academic Press，1996.411-418

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8 Rosengarten R，Wise KS.Phenotypic switching in mycoplasma：Phase variation of diverse surface lipoproteins.Science，1990，247：315

细胞培养中支原体污染

细胞培养中的支原体污染的预防及处理 Mycoplasma国内主要有三种译名，医学文献译为“支原体”（分枝原体，枝原体，类菌质体），动物医学文献译为“霉形体”或“支原体”，台湾、香港则译为微浆菌。 支原体是目前已知一类能在无生命培养基上生长繁殖的最小的原核细胞型微生物。自然界分布广泛，种类多，有80余种，分为两个属：一为支原体属（Mycoplasma），有几十个种；另一为脲原体属（Ureaplasma），仅有一种。与人类感染有关的主要是肺炎支原体和解脲脲原体。 支原体无细胞壁，多呈不规则球状、长丝状，可分枝，营寄生共生或腐生。一般侵害对象为动植物，可造成多种疾病。 细胞培养（特别是传代细胞）被支原体污染是个世界性问题。国内外研究表明，95%以上是以下四种支原体：口腔支原体（M.orale）、精氨酸支原体（M.arginini）、猪鼻支原体（M.hyorhinis）和菜氏无胆甾原体（https://www.wendangku.net/doc/f64145536.html,idlawii），为牛源性。国外调查证明，大约有二十多种支原体能污染细胞，有的细胞株可以同时污染两种以上的支原体。 支原体污染的来源包括工作环境的污染、操作者本身的污染（某些支原体在人体是正常菌群）、培养基的污染、被污染细胞造成的交叉污染、实验器材的污染、制备细胞的原始组织或器官的污染，等等。 体外生长的细胞对微生物及一些有害有毒物质没有抵抗能力，因此培养基应达到无化学物质污染、无微生物污染（如细菌、真菌、支原体、病毒等）、无其他对细胞产生损伤作用的生物活性物质污染（如抗体、补体）。对于天然培养基，污染主要来源于取材过程及生物材料本身，应当严格选材，严格操作。对于合成培养基，污染主要来源于配制过程，配制所用的水，器皿应十分洁净，配制后应严格过滤除菌。 由于体外培养细胞自身没有抵抗污染的能力，而且培养基中的抗生素抗污染能力有限，因而培养细胞一旦发生污染多数将无法挽回。支原体污染后，因为它们不会使细胞死亡可以与细胞长期共存，培养基一般不发生浑浊，细胞无明显变化，外观上给人以正常感觉，实则细胞手到多方面潜在影响，如引起细胞变形，影响DNA合成，抑制细胞生长等。 组织细胞培养工作中，可以从以下几方面来预防支原体的污染：控制环境污染；严格实验操作；细胞培养

如何预防细胞培养中的黑胶虫污染

如何预防细胞培养中的黑胶虫污染 污染是细胞培养的大敌。预防和避免污染是细胞培养成功的关键之一。一开始就要十分重视，防止污染，否则会前功尽弃，不仅浪费时间，而且浪费人力、物力，甚至造成无法弥补的损失。细胞培养中常见的生物污染类型有7种，分别是细菌污染、支原体污染、原虫污染、黑胶虫污染、真菌污染、病毒污染以及非细胞污染。他们在细胞培养中污染的特点如下： 1、细菌：细菌在普通倒置显微镜下为黑色细沙状，根据感染细菌的不同，可有不同的外形，培养液一般会浑浊变黄，对细胞生长影响明显。 2、支原体：黑色的，好象多为多形，培养液一般培养液一般会浑浊，原体感染，国内血清很多都没有做支原体阴性检测，而支原体是牛血清中最常见的微生物之一。而且它不能用过滤的办法除去。支原体感染细胞以后，细胞病变不很明显，只是慢慢死去。 3、黑胶虫：可以穿透滤膜，也可以通过空气传播，低倍下为黑色点状，高倍下可看见黑色的小虫游来游去，培养液也是不浑的，一般不会太影响，细胞还是可以用的。常常是细胞生长状态良好，且观测到的运动物无明显增多，且培养液颜色、透明度无明显变化，可在同一批号的血清养的细胞中发现类似现象。对细胞生长状态不会有明显影响，在细胞增殖旺盛之后会自然消失，除更换血清外无须特殊处理。 4、真菌：一般培养液清亮，不变色，镜下有丝状物，有些真菌开始很像死细胞碎片，只是它很多很多的小块很清楚，象珊瑚状，不象细胞碎片分不清，慢慢的会长出很细的黑色丝状物。真菌生长的比较慢，不象细菌那么容易被发现，但是一旦发现有它的存在细胞就被污染了，也很难救活了。 5、原虫：培养液可轻微浑浊，显微镜下那些细小的点状物数量非常多，轻微活动，细胞虽然可以生长但繁殖速度却明显减慢，而且细胞状态不好，边缘不清楚，细胞不透亮。他们与细胞可共生但会与细胞争夺营养。这种共生是非常普遍的，但他们的数量小，细胞站优势所以不会影响到细胞的正常生长，只有当他们到达一定的数量时就会影响到细胞的生长，最终形成恶性循环。 6、病毒：组织细胞培养过程中，如果没有除去潜在的病毒，就会产生病毒污染。目前，从原代猴肾细胞的培养中已发现不少于20种血清性病毒。尽管病毒污染的细胞不影响原代培养，但生产疫苗是不安全的。因此，潜在病毒是细胞大量生产和疫苗、干扰素等生物制品制作中的难题 7、非同种细胞污染：即是细胞交叉污染，由于细胞培养操作时各细胞株所需的器材和溶液没有严格分开，往往会使一种细胞被另一种细胞污染。目前，世

细胞培养中的几种污染

胞培养中的污染分为两类，化学污染和生物污染。 化学污染 化学污染是一些对细胞有毒性的或对细胞产生刺激的化学物质。这些污染一般来自于没有洗净的器皿、不纯的化学试剂和质量较差的蒸馏水等。 化学污染中比较引人注意的是细菌内毒素。它是革兰氏阴性细菌细胞死亡后解体释放出的疏水性的细胞壁组成物质，对塑料等疏水性强的物质有很强的吸附能力。细菌内毒素可刺激部分细胞产生一些激素或细胞因子，对细胞生长和实验结果产生影响。细菌内毒素是临床上的最主要的热原（即注射到动物体内会导致动物发热），所以通过细胞培养生产的疫苗、细胞因子等用在临床上的药品的生产过程中更是要避免细菌内毒素的污染。 生物污染 生物污染包括比较容易发现的细菌、霉菌和酵母的污染，和较难发现的病毒、支原体和其他细胞的污染。 细菌、霉菌和酵母到处存在，它们能在合适的环境中非常快速的生长。这些污染比较容易观察到，它们往往会使其污染的培养液产生可见的变化，或者通过显微镜观察就可以看见。 由于病毒有种属特异性，所以病毒污染的概率比较小。但是病毒污染难于发现，因为病毒颗粒特别微小，一般的实验室都没能力检查细胞培养中污染的病毒。由于病毒一般潜伏在细胞内，对整个细胞培养不是致死的，所以它可能会使研究人员长期得到受病毒影响的细胞的实验结果。 1956 年 Robinson 及其同事首次发现细胞培养中的支原体污染。90年代初美国的一个调查发现，在该国的细胞培养中，至少有15%被支原体污染。由于支原体没有细胞壁，在细胞培养液中几乎是透明的，同时对常用于细胞培养中的抗生素不敏感，不引起 pH 变化，不使培养液浑浊，所以支原体污染不容易被发现，但是其存在会影响实验的结果。 细胞的交叉污染在细胞培养中发生的严重程度大大超过人们的想象：1981 年对ATCC 细胞株的调查显示：超过 60 标记为其他细胞株的细胞居然是 HeLa 细胞。

细胞培养常见问题及其解决

细胞培养常见问题及其解决 1. 如何选用特殊细胞系培养基？ 培养某一类型细胞没有固定的培养条件。在MEM中培养的细胞，很可能在DMEM或M199中同样很容易生长。总之，首选MEM做粘附细胞培养、RPMI-1640做悬浮细胞培养是一个好的开始。 2. 何时须更换培养基？ 视细胞生长密度而定，或遵照细胞株基本数据上之更换时间，按时更换培养基即可。 3. 可否使用与原先培养条件不同之培养基？ 不能。每一细胞株均有其特定使用且已适应之细胞培养基，若骤然使用和原先提供之培养条件不同之培养基，细胞大都无法立即适应，造成细胞无法存活。 4 可否使用与原先培养条件不同之血清种类？ 不能。血清是细胞培养上一个极为重要的营养来源，所以血清的种类和品质对于细胞的生长会产生极大的影响。来自不同物种的血清，在一些物质或分子的量或内容物上都有所不同，血清使用错误常会造成细胞无法存活。 5 何谓FBS, FCS, CS, HS ? FBS (fetal bovine serum) 和FCS (fetal calf serum) 是相同的意思，两者都是指胎牛血清，FCS 乃错误的使用字眼，请不要再使用。CS (calf serum) 则是指小牛血清。HS (horseserum) 则是指马血清。 6 培养细胞时应使用5 % 或10% CO2？或根本没有影响？ 一般培养基中大都使用HCO3-/CO32-/H+ 作为pH 的缓冲系统，而培养基中NaHCO3 的含量将决定细胞培养时应使用的CO2 浓度。当培养基中NaHCO3 含量为每公升3.7 g 时，细胞培养时应使用10 % CO2；当培养基中NaHCO3 为每公升1.5 g 时，则应使用5 % CO2 培养细胞。 7.Hank's 平衡盐溶液(HBS)要在空气中使用，不需要CO2培养箱。原因是什么？Hank's 平衡盐溶液(HBS)和Earle's平衡盐溶液(EBS)有什么本质的功能差别？ HBS和EBS 的主要差别在于碳酸氢钠的水平,在Eagles (2.2g/L)中比在Hanks (0.35g/L) 中高。碳酸氢钠需用高水平的CO2平衡，以维持溶液的PH值。Eagles液在空气水平的CO2 中，溶液会变碱，Hanks液在CO2培养箱中会变酸。如果希望在CO2培养箱中保存组织，需要用Eagles 液，。如果仅仅是清洗将要在细胞培养基中储存的组织，用Hanks液就可以了。 8. 细胞之接种密度为何？

细胞常见污染情况与分析

细胞培养常见污染的判别及应对措施 2011-01-02 10:19:04| 分类：实验| 标签：污染无菌细胞培养基灭菌|字号大中小订阅 一、避免细胞培养污染的措施： 污染是细胞培养中一个大敌，一旦污染，前功尽弃！决定要进行细胞培养，首先一定要有强烈的无菌意识！操作中要遵守严格的操作规程，不要怕麻烦，越细心越好！注意以下几点，大部份的污染是可以避免的： 1. 每次开始实验前，先用紫外照无菌台和实验室20分，用酒精擦手，台面和不消毒的器械（如移液枪等）；实验中，如允许，尽量多过火，开起或盖盖都靠近火焰或在无菌台深处；使用无菌台后，再用酒精擦台面，紫外照20分！ 2. 滴管不要接触瓶口，吸取废液及加入新鲜培养基时都要注意不要滴在瓶口上等等。 3. 凡是接触瓶口后都要用酒精灯烧烧。 4. 提取组织时，往往头会距离组织很近，所以带口罩很重要！还要换无菌衣（紫外照过的白大褂）。 5. 注意配制完全培养基时不要发生污染，在使用前一定要做无菌培养，因为一般应用污染后的培养基培养细胞后，很快就会发生特别严重的污染。 6. 操作时一定按照实验室的要求，切忌粗心大意。 7. 使用完的东西尽快移出无菌台！另外无菌台上的器械，试剂摆放，也尽量遵循一定的顺序！依污染可能程度依次向外摆。 二、常见的细胞培养污染： 下面是几种细胞培养过程中常见的污染： 1. 支原体污染： 传说中的黑焦虫，长得暴快。24小时就满视野都是了。污染源大多数情况下是培养用血清。

图1 支原体污染的光镜检测（圆圈所示，×10倍） 图2 支原体污染的光镜检测（×20倍）

图3 支原体污染的荧光检测

图4 支原体污染的电镜检测（×30k，煎蛋状和其他形状）

关于细胞培养中的污染

细胞培养中常见的污染情况总结如下:常见的污染如下： 1、细菌：细菌在普通倒置显微镜下为黑色细沙状，根据感染细菌的不同，可有不同的外形， 培养液一般会浑浊变黄，对细胞生长影响明显。仔细检查一下器皿的灭菌情况，是否在高压灭菌时放气时间足够，压力足够！尤其是和储存培养液接触的移液管等物品，连续两次污染的话有可能造成储存液污染，一定要注意！下次使用前检查一下培养液是否存在浑浊的现象！可在培养液中加相应的抗生素处理 2、霉菌：培养液是清亮的，倒置显微镜下无杂质，37度孵箱培养2-3天，仍清亮，但出现 絮状杂质，镜下可见呈细丝状的团状漂浮物，可看到明显的菌丝，细胞仍可生长，但时间长之后，细胞的活力状态变差，用硫酸铜溶液擦拭CO2孵箱内，再把水盘里也加上饱和量的硫酸铜。或者在培养箱的托盘加入饱和的消毒磷酸氢二钠高盐液体,可以防止霉菌污染。CO2孵箱被霉菌污染后，可把所有细胞暂时转移，采用过氧乙酸擦洗孵箱（包括隔板，箱壁）。并把过氧乙酸放置在孵箱内一个小时，使其蒸汽弥漫。待过氧乙酸的气味消散后，再移入细胞。孵箱应定期清洁（2月左右），尤其在多雨的季节。其它培养箱清洗方法是：用84液擦洗－清水擦洗－75%酒精擦洗－紫外灯照。预防霉菌污染，可在培养基里加3u/ml的两性霉素或制霉菌素或放线菌素D或双抗；但细胞一旦污染，很难挽救，制霉菌素或放线菌素D 或双抗都于事无补，建议舍弃该污染细胞。，将环境彻底消毒，如果所有细胞都污染，可能是系统污染，检查一下培养基和器材，如果只是个别污染，可能是操作问题，就要注意操作 3、支原体：黑色的，好象多为多形，培养液一般培养液一般会浑浊，原体感染，国内血清 很多都没有做支原体阴性检测，而支原体是牛血清中最常见的微生物之一。而且它不能用过滤的办法除去。支原体感染细胞以后，细胞病变不很明显，只是慢慢死去。用泰乐菌素，兽用支原体病的药，但可用于细胞培养，无任何不良反应。Sigma公司的使用时用50ug/ml Tylosin培养液培养6天或连续传两代即可清除支原体污染。如果作为常用的抗生素的话, 建议用8ug/ml的浓度。 4、黑蛟虫：可以穿透滤膜，也可以通过空气传播，低倍下为黑色点状，高倍下可看见黑色 的小虫游来游去，培养液也是不浑的，一般不会太影响，细胞还是可以用的。常常是细胞生长状态良好，且观测到的运动物无明显增多，且培养液颜色、透明度无明显变化，可在同一批号的血清养的细胞中发现类似现象。对细胞生长状态不会有明显影响，在细胞增殖旺盛之后会自然消失，除更换血清外无须特殊处理。建议如果细胞有可能是此种污染的话，可以增加细胞的种板密度，以提高细胞的生存率。 5、真菌：一般培养液清亮，不变色，镜下有丝状物，有些真菌开始很像死细胞碎片，只是 它很多很多的小块很清楚，象珊瑚状，不象细胞碎片分不清，慢慢的会长出很细的黑色丝状物。真菌生长的比较慢，不象细菌那么容易被发现，但是一旦发现有它的存在细胞就被污染了，也很难救活了。 6、原虫：培养液可轻微浑浊，显微镜下那些细小的点状物数量非常多，轻微活动，细胞虽 然可以生长但繁殖速度却明显减慢，而且细胞状态不好，边缘不清楚，细胞不透亮。他们与细胞可共生但会与细胞争夺营养。这种共生是非常普遍的，但他们的数量小，细胞站优势所以不会影响到细胞的正常生长，只有当他们到达一定的数量时就会影响到细胞的生长，最终

细胞培养常见问题的原因及其解决的办法

细胞培养常见问题的原因及其解决的办法： 问题1培养液pH值变化太快 可能原因 (1)CO2张力不对 (2)培养瓶盖拧得太紧 (3)NaHCO3缓冲系统缓冲力不足 (4)培养液中盐浓度不正确 (5)细菌、酵母或真菌污染 建议解决方法 (1)按培养液中NaHCO3浓度增加或减少培养箱内CO2浓度，2.0g/L到3.7g/L浓度NaHCO3对应CO2浓度为5%到10%。 (2)松开瓶盖1/4圈。 (3)改用不依赖CO2培养液。加HEPES缓冲液至10到25mM终浓度。 (4)在CO2培养环境中改用基于Earle′s盐配制的培养液，在大气培养环境中培养改用Hanks盐配制的培养液。 (5)丢弃培养物，或用抗生素除菌。 问题2：培养液出现沉淀，但pH值不变 可能原因 (1)洗涤剂清洗后残留有磷酸盐，将培养基成分沉淀下来 (2)冰冻保存培养液 建议解决方法 (1)用去离子水反复冲洗玻璃器皿，然后灭菌。 (2)将培养液加热到37℃，摇动使其溶解如沉淀仍然存在，丢弃培养液。 问题3：培养液出现沉淀，同时pH发生变化 可能原因 细菌或真菌污染 建议解决方法

丢弃培养物，或用抗生素除菌。 问题4：培养细胞不贴壁 可能原因 (1)胰蛋白酶消化过度 (2)支原体污染 (3)培养瓶瓶底不干净 (4)培养液pH值过碱(NaHCO3分解) (5)消化液或培养液配制错误、过期储存、储存不 细胞老化(如传代前细胞已汇合导致失去贴附性) (7)接种细胞起始浓度太低或太高 建议解决方法 (1)缩短胰蛋白酶消化时间或降低胰蛋白酶浓度。 (2)分离培养物，检测支原体。清洁支架和培养箱。如发现支原体污染，丢弃培养物。 (3)注意刷洗，或换用一次性塑料培养瓶 (4)使用无菌醋酸溶液调整pH值或充入无菌CO2(将培养液敞口放入培养箱也可) (5)重新配置消化液或培养液 启用新的保种细胞 (7)调节最佳接种细胞浓度 问题5：悬浮细胞成簇 可能原因 (1)培养液中含钙、镁离子 (2)支原体污染 (3)蛋白酶过度消化使得细胞裂解释 (4)DNA污染 建议解决方法 (1)用无钙镁平衡盐溶液洗涤细胞，轻轻吹吸细胞获得单细胞悬液。 (2)分离培养物，检测支原体。如发现支原体污染，丢弃培养物。

细胞培养中常见的污染的处理

细胞培养中常见的污染情况总结如下: 常见的污染如下： 1、细菌：细菌在普通倒置显微镜下为黑色细沙状，根据感染细菌的不同，可有不同的外形，培养液 一般会浑浊变黄，对细胞生长影响明显。 仔细检查一下器皿的灭菌情况，是否在高压灭菌时放气时间足够，压力足够！尤其是和储存培养液接触的移液管等物品，连续两次污染的话有可能造成储存液污染，一定要注意！下次使用前检查一下培养 液是否存在浑浊的现象！ 可在培养液中加相应的抗生素处理 2、霉菌：培养液是清亮的，倒置显微镜下无杂质，37度孵箱培养2-3天，仍清亮，但出现絮状杂质，镜下可见呈细丝状的团状漂浮物，可看到明显的菌丝，细胞仍可生长，但时间长之后，细胞的活力状态变差，用硫酸铜溶液擦拭CO2孵箱内，再把水盘里也加上饱和量的硫酸铜。或者在培养箱的托盘加入饱和的 消毒磷酸氢二钠高盐液体,可以防止霉菌污染。 CO2孵箱被霉菌污染后，可把所有细胞暂时转移，采用过氧乙酸擦洗孵箱（包括隔板，箱壁）。并把过氧乙酸放置在孵箱内一个小时，使其蒸汽弥漫。待过氧乙酸的气味消散后，再移入细胞。孵箱应定期 清洁（2月左右），尤其在多雨的季节。 其它培养箱清洗方法是：用84液擦洗－清水擦洗－75%酒精擦洗－紫外灯照。 预防霉菌污染，可在培养基里加3u/ml的两性霉素或制霉菌素或放线菌素D或双抗；但细胞一旦污染，很难挽救，制霉菌素或放线菌素D或双抗都于事无补，建议舍弃该污染细胞。，将环境彻底消毒，如果所有细胞都污染，可能是系统污染，检查一下培养基和器材，如果只是个别污染，可能是操作问题，就 要注意操作 3、支原体：黑色的，好象多为多形，培养液一般培养液一般会浑浊，原体感染，国内血清很多都没有做支原体阴性检测，而支原体是牛血清中最常见的微生物之一。而且它不能用过滤的办法除去。支原体 感染细胞以后，细胞病变不很明显，只是慢慢死去。 用泰乐菌素，兽用支原体病的药，但可用于细胞培养，无任何不良反应。Sigma公司的使用时用50ug/ml Tylosin培养液培养6天或连续传两代即可清除支原体污染。如果作为常用的抗生素的话, 建议用 8ug/ml的浓度。 4、黑蛟虫：可以穿透滤膜，也可以通过空气传播，低倍下为黑色点状，高倍下可看见黑色的小虫游来游去，培养液也是不浑的，一般不会太影响，细胞还是可以用的。常常是细胞生长状态良好，且观测到的运动物无明显增多，且培养液颜色、透明度无明显变化，可在同一批号的血清养的细胞中发现类似现象。对细胞生长状态不会有明显影响，在细胞增殖旺盛之后会自然消失，除更换血清外无须特殊处理。建议如果细胞有可能是此种污染的话，可以增加细胞的种板密度，以提高细胞的生存率。 5、真菌：一般培养液清亮，不变色，镜下有丝状物，有些真菌开始很像死细胞碎片，只是它很多很多的小块很清楚，象珊瑚状，不象细胞碎片分不清，慢慢的会长出很细的黑色丝状物。真菌生长的比较慢，不象细菌那么容易被发现，但是一旦发现有它的存在细胞就被污染了，也很难救活了。 6、原虫：培养液可轻微浑浊，显微镜下那些细小的点状物数量非常多，轻微活动，细胞虽然可以生长但繁殖速度却明显减慢，而且细胞状态不好，边缘不清楚，细胞不透亮。他们与细胞可共生但会与细胞争夺营养。这种共生是非常普遍的，但他们的数量小，细胞站优势所以不会影响到细胞的正常生长，只有当他们到达一定的数量时就会影响到细胞的生长，最终形成恶性循环。

细胞培养中常见的污染

细胞培养中常见的污染情况总结如下: 1、细菌：细菌在普通倒置显微镜下为黑色细沙状，根据感染细菌的不同，可有不同的外形，培养液一般会浑浊变黄，对细胞生长影响明显。 仔细检查一下器皿的灭菌情况，是否在高压灭菌时放气时间足够，压力足够！尤其是和储存培养液接触的移液管等物品，连续两次污染的话有可能造成储存液污染，一定要注意！下次使用前检查一下培养液是否存在浑浊的现象！可在培养液中加相应的抗生素处理 2、霉菌：培养液是清亮的，倒置显微镜下无杂质，37度孵箱培养2-3天，仍清亮，但出现絮状杂质，镜下可见呈细丝状的团状漂浮物，可看到明显的菌丝，细胞仍可生长，但时间长之后，细胞的活力状态变差， 用硫酸铜溶液擦拭CO2孵箱内，再把水盘里也加上饱和量的硫酸铜。或者在培养箱的托盘加入饱和的消毒磷酸氢二钠高盐液体,可以防止霉菌污染。 CO2孵箱被霉菌污染后，可把所有细胞暂时转移，采用过氧乙酸擦洗孵箱（包括隔板，箱壁）。并把过氧乙酸放置在孵箱内一个小时，使其蒸汽弥漫。待过氧乙酸的气味消散后，再移入细胞。孵箱应定期清洁（2月左右），尤其在多雨的季节。 其它培养箱清洗方法是：用84液擦洗－清水擦洗－75%酒精擦洗－紫外灯照。 预防霉菌污染，可在培养基里加3u/ml的两性霉素或制霉菌素或放线菌素D或双抗；但细胞一旦污染，很难挽救，制霉菌素或放线菌素D或双抗都于事无补，建议舍弃该污染细胞。，将环境彻底消毒，如果所有细胞都污染，可能是系统污染，检查一下培养基和器材，如果只是个别污染，可能是操作问题，就要注意操作 3、支原体：黑色的，好象多为多形，培养液一般培养液一般会浑浊，原体感染，国内血清很多都没有做支原体阴性检测，而支原体是牛血清中最常见的微生物之一。而且它不能用过滤的办法除去。支原体感染细胞以后，细胞病变不很明显，只是慢慢死去。 用泰乐菌素，兽用支原体病的药，但可用于细胞培养，无任何不良反应。Sigma公司的使用时用50ug/ml Tylosin培养液培养6天或连续传两代即可清除支原体污染。如果作为常用的抗生素的话, 建议用8ug/ml的浓度。 4、黑蛟虫：可以穿透滤膜，也可以通过空气传播，低倍下为黑色点状，高倍下可看见黑色的小虫游来游去，培养液也是不浑的，一般不会太影响，细胞还是可以用的。常常是细胞生长状态良好，且观测到的运动物无明显增多，且培养液颜色、透明度无明显变化，可在同一批号的血清养的细胞中发现类似现象。对细胞生长状态不会有明显影响，在细胞增殖旺盛之后会自然消失，除更换血清外无须特殊处理。建议如果细胞有可能是此种污染的话，可以增加细胞的种板密度，以提高细胞的生存率。 5、真菌：一般培养液清亮，不变色，镜下有丝状物，有些真菌开始很像死细胞碎片，只是它很多很多的小块很清楚，象珊瑚状，不象细胞碎片分不清，慢慢的会长出很细的黑色丝状物。真菌生长的比较慢，不象细菌那么容易被发现，但是一旦发现有它的存在细胞就被污染了，也很难救活了。 6、原虫：培养液可轻微浑浊，显微镜下那些细小的点状物数量非常多，轻微活动，细胞虽然可以生长但繁殖速度却明显减慢，而且细胞状态不好，边缘不清楚，细胞不透亮。他们与细胞可共生但会与细胞争夺营养。这种共生是非常普遍的，但他们的数量小，细胞站优势所

细胞培养的污染和排除

第十一章细胞培养的污染和排除 组织培养细胞被有害物污染是组织培养工作的大敌。应用组织培养进行研究工作，除需要好的实验设计和技术方法外，成败的关键还在于能否避免污染。一项好的研究,或建成的满意细胞系，往往由于遭受污染而前功尽弃。因此，一个组织培养工作者,要始终注意防止污染。 培养细胞被污染，人们最注意的是真菌、细菌和病毒等微生物。现在看来已经不够，当前“污染”一词的概念应该是，凡混入培养环境中对细胞生存有害的成分和造成细胞不纯的异物，都应视为污染。从这一概念考虑，组织培养污染应包括以下几个方面： 微生物：真菌、细菌、支原体和病毒 化学物质：影响细胞生存的非细胞所需的化学成分 细胞：非同种的其它细胞 当然在培养中以微生物污染最为多见，化学污染较少；但近年随细胞种类增多,不同种细胞交叉污染却屡有发生，以致在ATCC接受入库细胞中特设同工酶检测一项，目的在于证明是否有HeLa等细胞的交叉污染。但细胞交叉污染只要工作细心，是容易防止的，而微生物污染在实际工作中却是最难防止和易发生的。 第一节污染途径 各种污染主要通过以下途径和媒介发生： 一.空气 空气是扩散微生物的主要途径。由于空气流动性大，在操作场地与外界隔离不严和消毒不充分的情况下，外界不洁空气很容易侵入造成污染。因此，培养设施不宜置于通风场所。现各实验室普遍应用净化工作台，能产生无菌的屏障气流，可防止不洁空气污染。净化工作台使用过久，过滤层受尘埃堵塞情况下，工作时不带口罩或外界

气流过强、污染空气均可进入操作野，导致污染。又不同季节和不同地区空气内含菌数不同；炎热夏季尤其南方多雨地区空气湿度大、含菌数量多，工作应特别注意。空气是不断流动的；虽用消毒措施也难以排出空气中所有微生物，但每立方米内含菌数不应超过1～5个。 二.清洗消毒 培养器皿和容器洗刷不净残留污物、培养用液灭菌不彻底等，都可引入有害物。 三.操作 实验操作马虎、动作不准确、消毒观念不强，使用的吸管、刀、剪沾染微生物等；或封瓶口时不严，都可发生污染。同时培养两种以上细胞，操作不慎，使用同一吸管或培养用液，可能导致细胞交叉污染。 四.血清 血清也是污染细胞的来源，有的市售血清制备水平低、检测不严，常已被支原体和病毒污染。 五.组织 初代培养组织常有污染；有的是在手术中污染，有的本身可能是被污染的组织(如已经发生溃烂的肿瘤组织)；手术用碘酒消毒后，擦拭不净可能混入碘污染。 第二节污染对细胞的影响 在细胞受有害物污染时间短、污染程度轻、并能及时排除污染物的情况下，细胞有可能恢复。当污染物持续存在于培养环境中时，轻者细胞增殖生长缓慢、分裂相减少、细胞变得粗糙、细胞轮廓增强，重者细胞停止增殖，分裂相消失，细胞质中出现大量堆积物，细胞变圆或崩溃从瓶壁脱落。但根据污染物的不同，对细胞的影响有别。 有的微生物如支原体，无致死毒性，可与细胞长期共存，对细胞形态和功能的影

教你判断你的细胞是何种污染

教你判断你的细胞是何种污染 细胞培养中常见的生物污染类型有7种，分别是细菌污染、支原体污染、原虫污染、黑胶虫污染、真菌污染、病毒污染以及非细胞污染。他们在细胞培养中污染的特点如下： 1、细菌：细菌在普通倒置显微镜下为黑色细沙状，根据感染细菌的不同，可有不同的外形，培养液一般会浑浊变黄，对细胞生长影响明显。 2、支原体：黑色的，好象多为多形，培养液一般培养液一般会浑浊，原体感染，国内血清很多都没有做支原体阴性检测，而支原体是牛血清中最常见的微生物之一。而且它不能用过滤的办法除去。支原体感染细胞以后，细胞病变不很明显，只是慢慢死去。 3、黑胶虫：可以穿透滤膜，也可以通过空气传播，低倍下为黑色点状，高倍下可看见黑色的小虫游来游去，培养液也是不浑的，一般不会太影响，细胞还是可以用的。常常是细胞生长状态良好，且观测到的运动物无明显增多，且培养液颜色、透明度无明显变化，可在同一批号的血清养的细胞中发现类似现象。对细胞生长状态不会有明显影响，在细胞增殖旺盛之后会自然消失，除更换血清外无须特殊处理。 4、真菌：一般培养液清亮，不变色，镜下有丝状物，有些真菌开始很像死细胞碎片，只是它很多很多的小块很清楚，象珊瑚状，不象细胞碎片分不清，慢慢的会长出很细的黑色丝状物。真菌生长的比较慢，不象细菌那么容易被发现，但是一旦发现有它的存在细胞就被污染了，也很难救活了。 5、原虫：培养液可轻微浑浊，显微镜下那些细小的点状物数量非常多，轻微活动，细胞虽然可以生长但繁殖速度却明显减慢，而且细胞状态不好，边缘不清楚，细胞不透亮。他们与细胞可共生但会与细胞争夺营养。这种共生是非常普遍的，但他们的数量小，细胞站优势所以不会影响到细胞的正常生长，只有当他们到达一定的数量时就会影响到细胞的生长，最终形成恶性循环。 6. 病毒：组织细胞培养过程中，如果没有除去潜在的病毒，就会产生病毒污染。目前，从原代猴肾细胞的培养中已发现不少于20种血清性病毒。尽管病毒污染的细胞不影响原代培养，但生产疫苗是不安全的。因此，潜在病毒是细胞大量生产和疫苗、干扰素等生物制品制作中的难题 7、非同种细胞污染：即是细胞交叉污染，由于细胞培养操作时各细胞株所需的器材和溶液没有严格分开，往往会使一种细胞被另一种细胞污染。目前，世界上已有几十种细胞都被HeLa细胞所污染，致使许多实验宣告无效。非细胞培养物所造成的化学成分的污染也偶有发生，大多是由于细胞培养所需物品清洗消毒不彻底而带入一些有毒化学物质所致。

细胞培养中霉菌污染问题讲解学习

细胞培养中霉菌污染问题 Julius：我的细胞被污染了，表现为培养液内有浑浊，可见很多白色粉末的东西悬浮，之前发现一瓶有，就丢了，剩下的及时换液，清洗，可在传代后的第二天就又见浑浊，仍有部分细胞是贴壁的，可以看到很多”细胞“首尾相连成一条条的线状，可细胞怎会是线状生长呢？（抱歉没有拍下照片）请问是霉菌还是细菌污染呢？如何区分细菌，霉菌及真菌的污染。现在如何处理呢？污染控制区大家所说的用甲醛熏蒸，碘伏擦拭，或75％酒精擦拭，是用那种呢？时间要多长呢？ 因培养箱内还有别人的细胞，现在消毒处理时剩余的细胞该怎么办呀？还应注意什么呢？ liyq_1：应该是霉菌污染.其特点正是肉眼可见白色悬浮,形态呈线状. qxlbljys：1.细菌污染液体混浊,霉菌污染可看见霉苔但液体不混,所以你的细菌和霉菌同时污染 处理:扔掉,以免污染其他细胞 2.你说的线状生长实际上细胞已经接近死亡 3.可以将培养箱用75%的酒精擦拭,并停止细胞培养,然后用紫外消毒房间 sunandsuny：由于细菌的生长分裂呈指数级的生长方式,所以细菌污染后,培养瓶很快就是浑浊的了,但一般不像霉菌污染,霉菌有菌丝,往往呈絮状漂浮,甚至有丝状突起.因此霉菌污染和细菌污染在肉眼上有时可以大体上区分,这只是一些常规的经验,如果要具体确定,还 要通过涂片染色,看看是球菌或杆菌或是弧菌． 叶知秋：原代培养的软骨细胞，贴壁良好，长势旺盛，可霉菌悄然而至，大有疯长之势。不想放弃，该如何处理，敬请指点。 ratman：配制以下5X抗生素培养液：AMP:100ug/ml, gentamycin 100ug/ml, 两性霉素B 2ug/ml, 制霉菌素1.5ug/ml, 脱氧胆酸钠10ug/ml，进行冲击，培养时间为8小时后换液，改用1X抗生素培养液进行培养，以上配方为1x配方。每天换液。 icesugar75：别救了。霉菌是抗拒不了地，别让这瓶细胞把其它的污染了最重要。

细胞中常见的污染

一、常见的污染如下： 1. 细菌：细菌在普通倒置显微镜下为黑色细沙状，根据感染细菌的不同，可有不同的外形，培养液一般会浑浊变黄，对细胞生长影响明显。 仔细检查一下器皿的灭菌情况，是否在高压灭菌时放气时间足够，压力足够！尤其是和储存培养液接触的移液管等物品，连续两次污染的话有可能造成储存液污染，一定要注意！下次使用前检查一下培养液是否存在浑浊的现象！可在培养液中加相应的抗生素处理。 2. 霉菌：培养液是清亮的，倒置显微镜下无杂质，37度孵箱培养2-3天，仍清亮，但出现絮状杂质，镜下可见呈细丝状的团状漂浮物，可看到明显的菌丝，细胞仍可生长，但时间长之后，细胞的活力状态变差，用硫酸铜溶液擦拭CO2孵箱内，再把水盘里也加上饱和量的硫酸铜。或者在培养箱的托盘加入饱和的消毒磷酸氢二钠高盐液体,可以防止霉菌污染。 CO2孵箱被霉菌污染后，可把所有细胞暂时转移，采用过氧乙酸擦洗孵箱（包括隔板，箱壁）。并把过氧乙酸放置在孵箱内一个小时，使其蒸汽弥漫。待过氧乙酸的气味消散后，再移入细胞。孵箱应定期清洁（2月左右），尤其在多雨的季节。其它培养箱清洗方法是：用84液擦洗－清水擦洗－75%酒精擦洗－紫外灯照。预防霉菌污染，可在培养基里加3u/ml的两性霉素或制霉菌素或放线菌素D或双抗；但细胞一旦污染，很难挽救，制霉菌素或放线菌素D或双抗都于事无补，建议舍弃该污染细胞。，将环境彻底消毒，如果所有细胞都污染，可能是系统污染，检查一下培养基和器材，如果只是个别污染，可能是操作问题，就要注意操作。 3. 支原体：黑色的，好象多为多形，培养液一般会浑浊，原体感染，国内血清很多都没有做支原体阴性检测，而支原体是牛血清中最常见的微生物之一。而且它不能用过滤的办法除去。支原体感染细胞以后，细胞病变不很明显，只是慢慢死去。 用泰乐菌素，兽用支原体病的药，但可用于细胞培养，无任何不良反应。Sigma 公司的使用时用50ug/ml Tylosin培养液培养6天或连续传两代即可清除支原体污染。如果作为常用的抗生素的话, 建议用8ug/ml的浓度。 4. 黑蛟虫：可以穿透滤膜，也可以通过空气传播，低倍下为黑色点状，高倍下可看见黑色的小虫游来游去，培养液也是不浑的，一般不会太影响，细胞还是可以用的。常常是细胞生长状态良好，且观测到的运动物无明显增多，且培养液颜色、透明度无明显变化，可在同一批号的血清养的细胞中发现类似现象。对细胞生长状态不会有明显影响，在细胞增殖旺盛之后会自然消失，除更换血清外无须特殊处理。建议如果细胞有可能是此种污染的话，可以增加细胞的种板密度，以提高细胞的生存率。 5. 真菌：一般培养液清亮，不变色，镜下有丝状物，有些真菌开始很像死细胞碎片，只是它很多很多的小块很清楚，象珊瑚状，不象细胞碎片分不清，慢慢的会长出很细的黑色丝状物。真菌生长的比较慢，不象细菌那么容易被发现，但是一旦发现有它的存在细胞就被污染了，也很难救活了。 6. 原虫：培养液可轻微浑浊，显微镜下那些细小的点状物数量非常多，轻微活动，细胞虽然可以生长但繁殖速度却明显减慢，而且细胞状态不好，边缘不清楚，细胞不透亮。他们与细胞可共生但会与细胞争夺营养。这种共生是非常普遍的，但他们的数量小，细胞站优势所以不会影响到细胞的正常生长，只有当他们到达一定的数量时就会影响到细胞的生长，最终形成恶性循环。 污染的可能原因：可能原因很多。比如配液消毒问题、操作问题、环境问题等等。

细胞培养污染问题及解决方案

一、细菌污染 状态：细菌在普通倒置显微镜下为黑色细沙状，根据感染细菌的不同，可有不同的外形，培养液一般会浑浊变黄，对细胞生长影响明显。 预防和补救： 1.仔细检查一下器皿的灭菌情况，是否在高压灭菌时放气时间和压力足够！尤其是和储存培养液接触的移液管等物品，连续两次污染的话有可能造成储存液污染，一定要检查培养液是否存在浑浊现象！ 2.可在培养液或血清中加支原体预防剂。 3.若细胞一旦污染，建议加支原体清除剂，能清楚常见的革兰氏阴性和阳性菌。 二、霉菌及真菌污染 状态：肉眼观察培养基发现培养基颜色基本无变化，不浑浊，但是培养基中由絮状漂浮物，显微镜下观察，若感染真菌可看到分叉细丝状的结构（不同种类结构不同），若感染霉菌显微镜下可看到片状的结构，不透明，真菌及霉菌对影响细胞的生长影响不大。 预防和补救： 1.保证细胞房的干净整洁，干燥的环境(潮湿的环境利于霉菌及真菌的生长)。 2.控制外来人员进出实验室。 3.对实验室及培养箱进行彻底消毒。 4.若细胞非常珍贵，且不易获得，可以对污染的细胞采取如下操作。 悬浮细胞：收集细胞并离心，用PBS漂洗，重复此操作数次。贴壁细胞：用PBS轻轻冲洗细胞，丢弃，重复此操作数次。 三、支原体感染 状态：镜下黑色，多为多形，培养液一般会浑浊，国内血清很多没做支原体阴性检测，而支原体是牛血清中最常见的微生物之一。而且它不能用过滤的办法除去。支原体感染细胞以后，细胞病变不很明显，只是慢慢死去。 预防和补救： 预防：实验室新购买的血清及培养基需检测是否含有支原体，引进的新品种细胞需做支原体检测，向培养基中添加预防支原体的抗生素。 补救：向培养基中添加抗生素，（如氧氟沙星10 μg/ml、环丙沙星10 μg/ml、卡那霉素20~50 μg/ml、四环素10~50 μg/ml、庆大霉素200μg/ml等抗生素），或者向培养基中添加支原体清除剂清除支原体数天。 四、黑蛟虫 状态：可以穿透滤膜，也可以通过空气传播，低倍下为黑色点状，高倍镜下可看见黑色的小虫游来游去，培养液不浑浊，一般不会太影响，细胞还可以用。常常可在同一批号的血清养的细胞中发现类似现象。 预防和补救：一般黑胶虫不会影响细胞的生长状态，可以尝试改变培养基的品牌。血清冻融采取逐级冻融的方法。 五、原虫感染 状态：培养液可轻微浑浊，显微镜下那些细小的点状物数量非常多，轻微活动，细胞虽然可用生长但繁殖速度却明显减慢，而且细胞状态不好，边缘不清楚，细胞不透亮。他们与细胞可共生，但会与细胞争夺营养。这种共生是非常普遍的，

细胞培养中常见污染

最近看到不少问有关细胞培养污染的事，正好我看到了一个有关这方面的总结，很全很好很强大，跟大家分享下细胞培养中常见的污染情况总结如下:常见的污染如下：1、细菌：细菌在普通倒置显微镜下为黑色细沙状，根据感染细菌的不同，可有不同的外形，培养液一般会浑浊变黄，对细胞生长影响明显。仔细检查一下器皿的灭菌情况，是否在高压灭菌时放气时间足够，压力足够！尤其是和储存培养液接触的移液管等物品，连续两次污染的话有可能造成储存液污染，一定要注意！下次使用前检查一下培养液是否存在浑浊的现象！可在培养液中加相应的抗生素处理2、霉菌：培养液是清亮的，倒置显微镜下无杂质，37度孵箱培养2-3天，仍清亮，但出现絮状杂质，镜下可见呈细丝状的团状漂浮物，可看到明显的菌丝，细胞仍可生长，但时间长之后，细胞的活力状态变差，用硫酸铜溶液擦拭CO2孵箱内，再把水盘里也加上饱和量的硫酸铜。或者在培养箱的托盘加入饱和的消毒磷酸氢二钠高盐液体,可以防止霉菌污染。CO2孵箱被霉菌污染后，可把所有细胞暂时转移，采用过氧乙酸擦洗孵箱（包括隔板，箱壁）。并把过氧乙酸放置在孵箱内一个小时，使其蒸汽弥漫。待过氧乙酸的气味消散后，再移入细胞。孵箱应定期清洁（2月左右），尤其在多雨的季节。其它培养箱清洗方法是：用84液擦洗－清水擦洗－75%酒精擦洗－紫外灯照。预防霉菌污染，可在培养基里加3u/ml的两性霉素或制霉菌素或放线菌素D或双抗；但细胞一旦污染，很难挽救，制霉菌素或放线菌素D或双抗都于事无补，建议舍弃该污染细胞。，将环境彻底消毒，如果所有细胞都污染，可能是系统污染，检查一下培养基和器材，如果只是个别污染，可能是操作问题，就要注意操作3、支原体：黑色的，好象多为多形，培养液一般会浑浊，原体感染，国内血清很多都没有做支原体阴性检测，而支原体是牛血清中最常见的微生物之一。而且它不能用过滤的办法除去。支原体感染细胞以后，细胞病变不很明显，只是慢慢死去。用泰乐菌素，兽用支原体病的药，但可用于细胞培养，无任何不良反应。Sigma公司的使用时用50ug/ml Tylosin培养液培养6天或连续传两代即可清除支原体污染。如果作为常用的抗生素的话, 建议用8ug/ml的浓度。4、黑蛟虫：可以穿透滤膜，也可以通过空气传播，低倍下为黑色点状，高倍下可看见黑色的小虫游来游去，培养液也是不浑的，一般不会太影响，细胞还是可以用的。常常是细胞生长状态良好，且观测到的运动物无明显增多，且培养液颜色、透明度无明显变化，可在同一批号的血清养的细胞中发现类似现象。对细胞生长状态不会有明显影响，在细胞增殖旺盛之后会自然消失，除更换血清外无须特殊处理。建议如果细胞有可能是此种污染的话，可以增加细胞的种板密度，以提高细胞的生存率。5、真菌：一般培养液清亮，不变色，镜下有丝状物，有些真菌开始很像死细胞碎片，只是它很多很多的小块很清楚，象珊瑚状，不象细胞碎片分不清，慢慢的会长出很细的黑色丝状物。真菌生长的比较慢，不象细菌那么容易被发现，但是一旦发现有它的存在细胞就被污染了，也很难救活了。6、原虫：培养液可轻微浑浊，显微镜下那些细小的点状物数量非常多，轻微活动，细胞虽然可以生长但繁殖速度却明显减慢，而且细胞状态不好，边缘不清楚，细胞不透亮。他们与

细胞培养中常见的问题讲解

细胞培养中常见的问题 2006-11-23 15:53 细胞中的颗粒到底是怎么回事？ 我的细胞总有颗粒，开始是细胞中有，后来细胞之间也好像有许多颗粒。好像是细胞碎片一样。是什么东西啊？是支原体污染吗？这可是我刚买回来的细胞啊! 我们实验室也有这种情况，是不是黑的小碎片，有人说是细胞代谢产物，后来拿到高倍镜下看还会动，就怀疑是污染了，也想问问大家到底是什么 是黑色的小碎片。我没注意到它会动，只是觉得不像是活的微生物。我觉得是由于某种污染或外界因素导致的细胞状态变差，裂解出的东西。但是，是什么东西不清楚。 的确很常见 在以前帖子见到说是“黑焦虫”。长时间培养的很容易出现，我根据自己的经验估计是一种污染，因为随着黑点增多，本来生长旺盛的细胞逐渐停滞甚至死亡。而且我后来原代培养的几批细胞并没有发现，我怀疑有好多细胞系本身就是污染的。不过增加换液次数的情况下，好象一般不太娇气的细胞生长不是很受影响。 以前听很有经验的老师说黑焦虫是国产血清的问题，可以有条件换进口血清试试，或者离心一下也可能能解决问题。那么所谓的“黑焦虫”到底是什么东西啊？有谁知道？ 我培养的细胞也出现过此中问题，放到高倍镜下看时有东西在动，但培养液不混浊，估计不是细菌污染，可能是血清问题，是支原体污染。 我培养的细胞也出现过这样的问题，我个人认为是一种支原体污染。国产血清是罪魁祸首，因为只要将细胞饥饿一下，不超过24小时，这种东西就会疯长 我培养的细胞也有出现这中情况。但是并不影响细胞生长。应该不是支原体污染 最近，我复苏细胞细胞的时候也发现过这样的东西，尽管我用的是GIBCO的FBS，后来，每天换液之前洗几遍后，就慢慢变少，现在没了 细胞培养的细菌污染 我们新建的细胞室。每周都会做清洁，用0。2%新洁尔灭消毒，照紫外。实验前也会照至少30分钟。培养基中加青霉素，链霉素。可是培养细胞时还是常有细菌污染，有时甚至分析不出原因。用培养瓶还好一点，用多孔板或平皿就更凄惨。我养的是哺乳动物细胞，不知各位有什么好的方法避免污染！谢谢！ 很可能是超净台无效了，，或者培养基？其实严格操作箱污染都难 我们是新的超净台，不可能失效。而且用同一瓶培养基，一瓶传两瓶，原始的一

细胞培养中常见的污染情况、可能原因、解决方法

细胞培养中常见的污染情况、可能原因、解决方法 细胞培养中常见的污染情况总结如下: 常见的污染如下： 1、细菌：细菌在普通倒置显微镜下为黑色细沙状，根据感染细菌的不同，可有不同的外形，培养液一般会浑浊变黄，对细胞生长影响明显。 仔细检查一下器皿的灭菌情况，是否在高压灭菌时放气时间足够，压力足够！尤其是和储存培养液接触的移液管等物品，连续两次污染的话有可能造成储存液污染，一定要注意！下次使用前检查一下培养液是否存在浑浊的现象！ 可在培养液中加相应的抗生素处理 2、霉菌：培养液是清亮的，倒置显微镜下无杂质，37度孵箱培养2-3天，仍清亮，但出现絮状杂质，镜下可见呈细丝状的团状漂浮物，可看到明显的菌丝，细胞仍可生长，但时间长之后，细胞的活力状态变差， 用硫酸铜溶液擦拭CO2孵箱内，再把水盘里也加上饱和量的硫酸铜。或者在培养箱的托盘加入饱和的消毒磷酸氢二钠高盐液体,可以防止霉菌污染。 CO2孵箱被霉菌污染后，可把所有细胞暂时转移，采用过氧乙酸擦洗孵箱（包括隔板，箱壁）。并把过氧乙酸放置在孵箱内一个小时，使其蒸汽弥漫。待过氧乙酸的气味消散后，再移入细胞。孵箱应定期清洁（2月左右），尤其在多雨的季节。 其它培养箱清洗方法是：用84液擦洗－清水擦洗－75%酒精擦洗－紫外灯照。 预防霉菌污染，可在培养基里加3u/ml的两性霉素或制霉菌素或放线菌素D或双抗；但细胞一旦污染，很难挽救，制霉菌素或放线菌素D或双抗都于事无补，建议舍弃该污染细胞。，将环境彻底消毒，如果所有细胞都污染，可能是系统污染，检查一下培养基和器材，如果只是个别污染，可能是操作问题，就要注意操作 3、支原体：黑色的，好象多为多形，培养液一般培养液一般会浑浊，原体感染，国内血清很多都没有做支原体阴性检测，而支原体是牛血清中最常见的微生物之一。而且它不能用过滤的办法除去。支原体感染细胞以后，细胞病变不很明显，只是慢慢死去。 用泰乐菌素，兽用支原体病的药，但可用于细胞培养，无任何不良反应。Sigma公司的使用时用50ug/ml Tylosin培养液培养6天或连续传两代即可清除支原体污染。如果作为常用的抗生素的话, 建议用8ug/ml的浓度。 4、黑蛟虫：可以穿透滤膜，也可以通过空气传播，低倍下为黑色点状，高倍下可看见黑色的小虫游来游去，培养液也是不浑的，一般不会太影响，细胞还是可以用的。常常是细胞生长状态良好，且观测到的运动物无明显增多，且培养液颜色、透明度无明显变化，可在同一批号的血清养的细胞中发现类似现象。对细胞生长状态不会有明显影响，在细胞增殖旺盛之后会自然消失，除更换血清外无须特殊处理。建议如果细胞有可能是此种污染的话，可以增加细胞的种板密度，以提高细胞的生存率。 5、真菌：一般培养液清亮，不变色，镜下有丝状物，有些真菌开始很像死细胞碎片，只是它很多很多的小块很清楚，象珊瑚状，不象细胞碎片分不清，慢慢的会长出很细的黑色丝状物。真菌生长的比较慢，不象细菌那么容易被发现，但是一旦发现有它的存在细胞就被污染了，也很难救活了。