质粒构建中DNA片段与载体连接

摩尔比是指载体和插入片段，在连接时的摩尔比。

1 比例应该在1:2-10之间（载体：片段；片段要多）。

2 连接体系如果是20 ul（T4连接酶），载体和片段的总质量（微克）要在0.02 ug~0.2 ug 之间。如果是10 ul（Solution I），则在0.01~0.1 ug之间。

如何计算摩尔数和微克数（用10微升的链接体系，solution I连接酶）

公式：pmol数*kb数（双链）*0.65=微克数

实例：片段大小：555bp=0.555kb，浓度=190 ng/ul

载体大小：4.969kb，浓度=115 ng/ul

选取：载体0.04pmol；片段0.12pmol（载体：片段=1:3）

代入公式：pmol数*kb数（双链）*0.65=微克数；

载体用129 ng；片段用43 ng，得出质量比为3：1，所以按10 ul体系连接时载体和片段各加3.75 ul和1.25 ul。

连接体系：体积按需调整，10ul体系

Solution I 5 ul，

片段 1.25 ul，

载体 3.75 ul，

混匀，16 ℃连接3 h以上

另外一种推算结果

设x1为DNA片段pmol数，x2为其ug数；设y1为载体pmol数，y2为载体ug数，a为DNA片段的kb数，b为载体的kb数，并且假定摩尔比为DNA片段：载体=3:1，则有

x1·a·0.65=x2

y1·b·0.65=y2

x1：y1=3

x2+y2=0.2（总质量）

载体构建经验

做酶切要注意的问题 重组质粒构建是常用的分子生物学手段，其实只是最基本的方法，一般一个星期同时构建三二个组质粒是没有问题的。但是其中还是有些基本的技巧需要掌握。在这里将我的心得分享于大家，这也是我本人几年来一线工作时的经验积累，以期能让大家在实验中少走弯路。所涉及内容如下： 1) 克隆基因的酶切位点问题 2) 载体酶切的问题 3) 连接片段浓度比的问题 在阐明上述问题同时，本人尽可能举些实验中的问题案例予以说明。 一、克隆基因的酶切位点问题 1、克隆位点选择的问题。首先要对目标基因进行酶切位点扫描分析，列出其所含酶切位点清单。然后对照质粒多克隆位点，所选择的克隆位点必须是目标基因所不含的酶切位点。这是常识，不赘述。 2、保护碱基数目的问题。在设计PCR引物时，引入酶切位点后，常常要加入保护碱基，这是大家所熟知的。但是保护碱基数量多少，可能被新手所忽视。这种忽视碰可能会大大影响后续的实验进展。 一般情况下，普通的内切酶只加入两个保护碱基，其内切反应就可以正常进行；而有一类，仅仅只加入两个保护碱基，其内切反应就不能正常进行，这是因为内切酶不能正常结合DN 段上。如NdeI就属这类，需要加入至少6个保护碱基，常用的HindIII也要三个。 下面是我提供这类酶的列表及其所需最少的保护碱基数，相信下列将有助于大这家的实验设计。 NcoI 4 NdeI 6 NheI 3 NotI 8 PmeI 6 SacI 3 SalI 3

SmaI 3 HindIII 3 BstI 8 SphI 4 XhoI 3 XbaI 3 SmaI 4 案例分析一：本人最初曾选用NdeI克隆位点，未注意到保护碱基数目的问题，设计PCR引物时，引入NdeI酶切位点后，只加上两个保护碱基，一个月内没有进展，始终不能成功构建重组载体。后查文献得知症结所在，在NdeI序列后加上六个保护碱基后，迎刃而解。大家引以为戒啊。 现在普通酶我都引入三个保护碱基。现在碱基合成价格也不贵了，为保证酶切充分，连接顺利，不用节约那点钱，再说若一次不成功，重复实验花费时间与金钱更多，孰利孰弊，不言自明。呵呵。 二、载体酶切的问题 1、质粒的单酶切鉴定。这个问题似乎很简单，但我认为很有着重强调之必要。现在大家手头的质粒都是转来转去的，其中的各酶切位点状况如何，是否能被有效地切开，这些问题都是要核实的。因此，在实验开始之前必须对质粒载体进行单酶切鉴定。现在我每次构建之前，对所选择的克隆位点都要作一一鉴定，例如选择NdeI和HindIII作为克隆位点，就先分别对质粒上这两个酶的酶切位点进行单酶切鉴定。单酶切鉴定能有效地切开后，再发出引物合成定单，进行引物合成；若不能，就按“一”中原则进行调换。 2、连接反应的对照。在实验中，这步骤属于质粒载体与外源DN段的连接反应。成功与否，很大程度上取决于与质粒和DN段的酶切效果。一般情况下，都在通用缓冲液中进行双酶切，但这两种酶在通用缓冲液中酶切效率不一样，这可能导致部分的单缺口的质粒片段存在，这样，在连接反应中，即使在外源DN段存在下，这种单缺口的质粒片段能够进行更快速有效自我连接。最终结果是大量假阳性的菌斑生长。对照连接反应中，在不加入外源片段情况下，实验结果如果有菌斑生长，说明双酶切不充分，质粒DNA必须重新进行双酶切。 实验案例分析2：本人曾用XhoI和HindIII酶切位点构建重组质粒，对质粒进行双酶切后，直接就做连接，未上述两步鉴定，每次结果满板的菌斑。但就是没有阳性。后来对质粒进行单酶要鉴定后，发现XhoI酶切位点损坏。又是一个月没有进展，浪费精力和药品。血的教训啊。因为当时没有注意到：单切质粒是一条带，双切质粒也是一条带，电泳行为上是一样

载体片段连接技巧

我首先酶切得到带有粘段的载体和目的片段,然后分别补平,再做载体去磷酸化,最后将载体和目的片段连接,转化,可是只可怜昔昔的长出3个单菌落, 我还得鉴定正反向,怎么办?平端连接效率真这么低吗?请大家传授自己的经验. 欢迎大家以此帖为引展开“平端连接”讨论！ 我曾经作过跟你类似的实验。 1）目的片段和载体的质量最好高一些。 2）按照常规连接体系进行，一般20ul体系。 3））连接温度20-25度。由于平端连接不涉及粘性末端的互补，所以温度可以高一些。 4）酶的用量不要过量，按照说明就可以。 5）连接时间至少4h，能过夜就过夜。 6）转化的时候：休克后加入培养基，孵育50min，最多不超过1h，转速不要高，大约150-170rpm。然后稍加离心弃去上清，留下大约200ul 涂板子就可以了。 在我的平端连接试验中，我曾经尝试过将目的片断抽真空变成干粉后，以较小体积重新溶解后再与目的载体连接，我觉得这样效果也不错。 另外，平端连接反应最好在16度环境中过夜。 1) 提高目的片段浓度无论对于粘性末端或者平端连接都是很有促进作用的； 2）就连接的温度而言，一般粘性末端选择16C，而平端连接选择20-25C，我特地查了一下，NEB公司的平端推荐温度也是20－25C。 连接的过程中涉及大量个事件：粘性末端突出部分的退火互补；两端序列5'-3'之间在连接酶的作用下进行连接。两个事件互相促进。 在粘性末端连接中，2种因素都起作用。但是，连接酶的最佳活性温度是37C，退火互补需要温度降低，连接酶发挥作用需要温度提高，所以就权衡 一下，实践摸索16C是粘性末端的最佳连接温度。 平端连接中，不存在粘性末端那样突出序列要互补的问题，所以要尽可能的照顾连接酶的活性。那为什么不用37C？因为这个时候虽然酶的活性较好， 但是不利于片段和载体之间的相互碰撞。所以，还是选择了20－25C。 screen.width-333)this.width=screen.width-333" width=139 height=139 title="Click to view full my.JPG (139 X 139)" border=0 align=absmiddle> 有启发！多谢 ！ 我的经验是: 1，平端连接需要过夜反应。 2，插入的DNA片段的摩尔数是载体摩尔数的5-10倍，这个很关键。载体通常50ng就够了，若你的载体在10k左右，可用50~100ng. 3，若你的载体很大，建议你用电转化。而且电转化前要纯化连接产物。 先谢谢楼上各位的指点，对我大有启发，我再重新做一次，希望能有好的结果。还有一个问题请教各位，补平之后，是否需要先回收再去磷？还是补 平后直接加BUFFER和CIAP？ 如果补平后回收，然后CIAP，然后再回收，载体处理的更干净，可是会有损失。通常我是补平后用纯化试剂盒纯化,之后做CIAP, 然后跑胶回收。

基因工程原理讲义：基因克隆的质粒载体

第六讲基因克隆的质粒载体 中国科学院遗传与发育生物学研究所 2017年8月

基因克隆的质粒载体 一、导言 1．质粒是一类引人注目的亚细胞有机体 其结构比病毒还要简单，既无蛋白质外壳，也无细胞外生命周期，只能在寄主细胞内增殖，并随着寄主细胞的分裂而被遗传下去。2．质粒的类型多种多样 F质粒：F因子或性质粒(Sex plasmid)，它能够使寄主染色体上的基因与F因子(F factor)一道转移到原先不存在该质粒的 寄主受体细胞中去。 R质粒：通称抗药性因子(Resistant factor, R factor)，编码一种或数种抗菌素抗性基因，并能将此抗性转移到缺乏该质粒 的适宜的受体细胞中去。 Col质粒：所谓Col质粒，即是一种产生大肠杆菌素的因子，编码控制大肠杆菌素合成的基因。大肠杆菌素可使不带Col 质粒的亲缘关系密切的细菌菌株致死。 3．质粒载体 70年代在实验室构建的一类最普遍使用的基因克隆载体。

二、质粒的一般特性 1．质粒DNA(细菌质粒定义) *1.大肠杆菌的质粒是独立于寄主染色体以外的自主复制的共价、闭合、环形的双链DNA分子(covalently closed circular DNA, cccDNA)。除了酵母的杀伤质粒(Killer plasmid)是RNA质粒外，所有的质粒都是质粒DNA。但是质粒DNA的复制又必须依赖 于寄主提供核酸酶及蛋白质。 *2.质粒DNA分子大小 文献中有3种说法：小的仅有103KD，仅能编码2-3种蛋白质； 大的可达105KD，两者相差上百倍。 1Kb～200Kb (Sambrok et al.) 5Kb～400Kb (Lehninger) MD(megadaltons)=106D (兆道尔顿) 1.5Kb≈1MD *3.质粒DNA与寄主染色体DNA间的关系 一般情况下，质粒DNA可持续地处于寄主染色体外的游离状

DNA片段与载体的连接

外源基因（DNA片段）很难直接透过受体细胞的细胞膜进入受体细胞，即使进入，也会受到细胞内限制性酶的作用而分解。要将外源DNA片段导入受体细胞，必须选择适当的载体（V ector），这是关键步骤之一。 载体是携带外源基因进入受体细胞的工具。作为载体的DNA分子，需具备两项基本条件:①容易进入寄主细胞；②进入寄主细胞后能够独立进行自主的复制和表达；③容易从宿主细胞中分离纯化。 通常在基因工程中选作载体的有： ①质粒——环状双链小型DNA分子，种类甚多，有的可在细菌细胞内独立复制，有的亦可用于动、植物细胞。例如：根瘤土壤杆菌所携带的Ti 质粒常用作植物细胞基因工程的载体。人工改造的质粒常用的有pBR322天然质粒，派生质粒pmB1，psC101等 ②噬菌体——常用的是λ噬菌体。经构建后，常用于细菌细胞。常见的有Mu噬菌体载体。 ③病毒——例如猿猴空泡病毒SV40 常用作动物细胞基因工程的载体。 ④粘粒（cosmid,装配性质粒），由质粒和Mu噬菌体的cos位点u或膜等构建而成的一种大容量克隆载体。 含有目的基因的DNA片段和载体DNA连接技术即DNA重组技术，其核心步骤是DNA片段之间的体外连接，其本质是涉及限制酶，连接酶等酶促反应过程。载体为细菌中的质粒，温和噬菌体。重组DNA即载体DNA+引入的DNA。把目的基因连接到载体上去，要经过一系列酶促反应，需要几种工具酶，这中间最为重要的是两大类酶： ①DNA限制性内切酶：把载体DNA片段切开。 ②DNA连接酶：用于连接载体和外源DNA片段。 此外，在构建DNA重组分子中使用的工具酶还有：DNA聚合酶、逆转录酶、DNA修饰酶、RNA修饰酶、核酸外切酶、碱性磷酸酶等。 1、粘性末端的连接：用同一种限制性内切酶或者用能够产生相同粘性末端的两种限制性内切酶分别消化外源DNA分子和载体，所形成的DNA末端彼此互补，用DNA连接酶共价连接起来，形成重组体DNA分子。 图10-3-3 粘性末端的连接 2、平末端的连接：可先生成粘性末端，在带平头末端的DNA片段的3’-末端加上多聚核苷酸的尾巴，在载体上加上互补的尾巴，然后用DNA连接酶连接。 图10-3-4 用质粒构建重组DNA分子 用噬菌体DNA构建重组DNA分子 原文地址:https://www.wendangku.net/doc/f97983419.html,/biotech/exp/TechArticle/2007/8043.html

表达载体的构建方法及步骤

表达载体的构建方法及步骤 一、载体的选择及如何阅读质粒图谱 目前，载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒DNA 是一种新的非病毒转基因载体。一个合格质粒的组成要素： （1）复制起始位点Ori 即控制复制起始的位点。原核生物DNA 分子中只有一个复制起始点。而 真核生物DNA 分子有多个复制起始位点。 （2）抗生素抗性基因可以便于加以检测，如Amp+ ,Kan+ （3）多克隆位点MCS 克隆携带外源基因片段 （4）P/E 启动子/增强子 （5）Terms 终止信号 （6）加poly（A）信号可以起到稳定mRNA 作用 选择载体主要依据构建的目的，同时要考虑载体中应有合适的限制酶切位点。如果构建的目 的是要表达一个特定的基因，则要选择合适的表达载体。 载体选择主要考虑下述3点： 【1】构建DNA 重组体的目的，克隆扩增/基因表达，选择合适的克隆载体/表达载体。【2】.载体的类型： （1）克隆载体的克隆能力－据克隆片段大小（大选大，小选小）。如<10kb 选质粒。（2）表达载体据受体细胞类型－原核/真核/穿梭，E.coli/哺乳类细胞表达载体。

（3）对原核表达载体应该注意：选择合适的启动子及相应的受体菌，用于表达真核蛋白质时注意克服4个困难和阅读框错位；表达天然蛋白质或融合蛋白作为相应载体的参考。【3】载体MCS 中的酶切位点数与组成方向因载体不同而异，适应目的基因与载体易于链接，不能产生阅读框架错位。 综上所述，选用质粒（最常用）做载体的5点要求： （1）选分子量小的质粒，即小载体（1－1.5kb）→不易损坏，在细菌里面拷贝数也多（也有大载 体）； （2）一般使用松弛型质粒在细菌里扩增不受约束，一般10个以上的拷贝，而严谨型质粒<10个。 （3）必需具备一个以上的酶切位点，有选择的余地； （4）必需有易检测的标记，多是抗生素的抗性基因，不特指多位Ampr（试一试）。（5）满足自己的实验需求，是否需要包装病毒，是否需要加入荧光标记，是否需要加入标签蛋白，是否需要真核抗性（如Puro、G418）等等。 无论选用哪种载体，首先都要获得载体分子，然后采用适当的限制酶将载体DNA 进行切割，获得线性载体分子，以便于与目的基因片段进行连接。 如何阅读质粒图谱 第一步：首先看Ori 的位置，了解质粒的类型（原核/真核/穿梭质粒） 第二步：再看筛选标记，如抗性，决定使用什么筛选标记。 （1）Ampr 水解β－内酰胺环，解除氨苄的毒性。 （2）tetr 可以阻止四环素进入细胞。 （3）camr 生成氯霉素羟乙酰基衍生物，使之失去毒性。 （4）neor（kanr）氨基糖苷磷酸转移酶使G418（长那霉素衍生物）失活

基因克隆的质粒载体

基因克隆的质粒载体 在大肠杆菌的各种菌体中找到了许多种不同类型的质粒，其中已经作了比较详尽研究的主要有F质粒、R质粒和Col质粒。 ①F质粒又叫F因子或性质粒（sex plasmid）。它们能够使寄主染色体上的基因和F质粒一道转移到原先不存在该质粒的受体细胞中去。 ②R质粒通称抗药性因子。它们编码有一种或数种抗菌素抗性基因，并且通常能够将此种抗性转移到缺管该质粒的适宜的受体细胞，使后者也获得同样的抗菌素抗性能力。 ③Col质粒即所谓产生大肠杆菌素因子。它们编码有控制大肠杆菌素合成的基因。大肠杆菌是一类可以使不带有Col质粒的亲缘关系密切的细菌菌株致死的蛋白质。 第一节质粒的一般生物学特性一．质粒DNA 细菌质粒是存在于细胞质中的一类独立于染色体的自主复制的遗传成份。绝大多数的质粒都是由环形双DNA组成的复制子（图4-1）。 质粒DNA分子可以持续稳定地处于染色体外的游离状，但在一定的条件下又可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。 环形双链的质粒DNA分子具有三种不同的构型： 1．当其两条多核苷酸链均保持着完整的环形结构时，称之为共价闭合环形DNA（cccDNA），这样的DNA通常呈现超螺旋的SC构型； 2．如果两条多核苷酸链中只有一条保持着完整的环形结构，另一条链出现有一至数个缺口时，称之为开环DNA（ocDNA），此即OC构型； 3．若质粒DNA经过适当的核酸内切限制酶切割之后，发生双链断裂形成线性分子（IDNA），通称L构型（见图4-2）。 在琼脂糖凝胶电泳中，不同构型的同一种质粒DNA，尽管分子量相同，仍具有不同的电泳迁移就绪。其中走在最前沿的是SC DNA，其后依次是L DNA和OC DNA（图4-3）。 凡经改建而适于作为基因克隆载体的所有质粒DNA分子，都必定包括如下三种共同的组成部分，即复制基因（replicator）、选择性记和克隆位点。 二．质粒DNA编码的表型 质粒DNA仅占细胞染色体组的1%～3%左右，但却编码着一些重要的非染色体控制的遗传性状。其中对抗菌素的抗性最质粒的最重要的编码特性之一。

在质粒载体中进行平末端片段的克隆

在质粒载体中进行平末端片段的克隆 佚名 在质粒载体中进行平末端片段的克隆 1．分别设立两个反应，用适当的限制性内切核酸酶消化1~10μg质粒DNA和外源DNA片段，使它们能产生平末端。 2．苯酚：氯仿抽提与乙醇沉淀法纯化出已被消化的载体和外源DNA片段。 3．分别用TE（pH 8.0）重新溶解纯化出的两种DNA沉淀，使终浓度为100 ng/ml。假设1 bp相当于660 Da，计算DNA的终浓度（pmol/ml）。 4．将载体DNA去磷酸化。 5．按下表将适量的DNA转移至无菌的0.5 ml离心管： 管号DNA A和E 载体1 [60fmol (~100ng)] B 外源插入片段2[60fmol (~10ng)] C和F 载体1（60fmol）和外源插入片段3（60fmol） D 线状载体（5’-磷酸化）（60fmol） G 环状载体[60fmol (~10ng)] 1载体DNA已进行去磷酸化 2外源目的DNA可以连接接头。 3 连接反应中，质粒载体和插入的DNA片段摩尔比一般为1：1。DNA的总浓度应约为10ng/μl。 a.A、B和C管中加入： 10×连接缓冲液 1.0μl T4噬菌体连接酶 0.5 Weiss单位 5 mmol/L ATP 1.0μl

H2O 补至8.5μl 30%PEG 8000 1~1.5μl b.D、E和F管中加入： 10×连接缓冲液 1.0μl 5 mmol/L ATP 1.0μl H2O 补至8.5μl 30%PEG 8000 1~1.5μl 不加DNA酶 6．连接反应体系置于16℃水浴温育过夜或20℃水浴温育4 h。 7．用每份稀释的连接产物转化感受态大肠杆菌。转化时，应包括用标准方法制备的已知量的超螺旋质粒DNA作为对照，以检查转化效率。 管号DNA 连接酶（有/无）预期转化克隆数 A 载体1+ ~03 B 插入片段+ 0 C 载体1和插入片段+ 比F管高5倍 D 载体1- ~0 E 载体2- 比D管高50倍 F 载体和插入片段- 比D管高50倍 G 环状质粒- 2×105 1去磷酸化 2未去磷酸化 3如果出现来自去磷酸化的载体DNA自身连接产物的转化子，是由于用碱性磷酸酶处理时未能除尽5’端的磷酸基。

慢病毒(Lentivirus)载体构步骤和方法

一、简介 慢病毒（Lentivirus）载体是以HIV-1（人类免疫缺陷I型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。慢病毒载体的研究发展得很快，研究的也非常深入。该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。 二、实验流程（大致的简单过程） 慢病毒表达载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装RNA 到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。为产生高滴度的病毒颗粒，需要利用表达载体(自己构建)和包装质粒（购入）同时共转染细胞，在293T细胞(购入)中进行病毒的包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离心取得上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染，目的基因进入到宿主细胞之后，经过反转录，整合到基因组，从而高水平的表达效应分子。 大致的实验流程： 1. 根据目的基因相关信息（序列，序列号等），构建含有外源基因或siRNA的重组载体；（即质粒构建，已构建好，质粒可以永久保存） 2. 对于测序正确的重组质粒，提取和纯化高质量的不含内毒素的重组质粒； 3. 使用高效重组载体和病毒包装质粒（购入）共转染293T 细胞[1]，进行病毒包装和生产，收集病毒液； 4. 浓缩、纯化病毒液； 5. 用高质量的病毒液感染细胞(293T细胞)； 6. 通过定量PCR精确测定病毒滴度（高精确滴定方法）和Western 分析实验结果； 7. 用高质量的病毒液感染宿主细胞；检测基因功能或者siRNA的沉默效率以及使用药物进行稳定转染细胞株的筛选，通常状况下，筛选的细胞克隆株具有长期的表达稳定性。病毒液足够用于一般的动物活体实验。 三、重组质粒构建流程 1.基因的获得: shRNA寡核苷酸序列的设计和合成(将正确序列克隆入载体中，退火形成双链，PCR扩增) 2.回收 A．酶切产物的胶回收：一般做50-100ul 体系，然后跑电泳回收，回收量一般为30ul。B．PCR扩增产物的胶回收 原理：首先利用低熔点琼脂糖凝胶电泳DNA片段，分离目的条带DNA，然后紫外光下切割含目的DNA条带的胶块，利用胶回收试剂盒回收纯化DNA片段。试剂盒的胶回收

克隆载体与表达载体

克隆载体：大多是高拷贝的载体，一般是原核细菌，将需要克隆的基因与克隆载体的质粒相连接，再导入原核细菌内，质粒会在原核细菌内大量复制，形成大量的基因克隆，被克隆的基因不一定会表达，但一定被大量复制。克隆载体只是为了保存基因片段，这样细胞内不会有很多表达的蛋白质而影响别的工作。 克隆载体(Cloning vector )：携带插入外源片段的质粒或噬菌体，从而产生更多物质或蛋白质产物。(这是为“携带”感兴趣的外源DNA、实现外源DNA的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。) 其中，为使插入的外源DNA序列可转录、进而翻译成多肽链而设计的克隆载体又称表达载体。 是否含有表达系统元件，即启动子--核糖体结合位点--克隆位点--转录终止信号，这是用来区别克隆载体和表达载体的标志。 表达载体：有的是高拷贝的，有的是低拷贝的，各有各的用处，是一些用于工程生产的细菌，被导入的目标基因会在此类细菌中得到表达，生产出我们需要的产物，导入的基因是由克隆载体产出的。表达载体具有较高的蛋白质表达效率，一般因为具有强的启动子。 表达载体（Expression vectors）就是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件（如启动子、RBS、终止子等），是目的基因能够表达的载体。如表达载体pKK223-3是一个具有典型表达结构的大肠杆菌表 达载体。其基本骨架为来自pBR322和pUC的质粒复制起点和氨苄青霉素抗性基因。在表达元件中，有一 个杂合tac强启动子和终止子，在启动子下游有RBS位点（如果利用这个位点，要求与ATG之间间隔5-13bp），其后的多克隆位点可装载要表达的目标基因。 （RBS位点：1974年Shine和Dalgarno首先发现，原核生物，在mRNA上有核糖体的结合位点，它们 是起始密码子AUG和一段位于AUG上游3～10 bp处的由 3—9bp组成的序列。这段序列富含嘌呤核苷酸，刚好与16S rRNA 3，末端的富含嘧啶的序列互补，是核糖体RNA的识别与结合位点。根据发现者的名字，命名为Shine-Dalgarno序列，简称S-D序列。 由于它正好与30S小亚基中的16s rRNA3’端一部分序列互补，因此S-D序列也叫做核糖体结合序列。 真核生物存在于真核生物mRNA的一段序列，其在翻译的起始中有重要作用。加Kozark sequence(GCCACC), Kozak sequence是用来增强真核基因的翻译效率的。是最优化的ATG环境，避免ribosome出现leaky scan） 克隆载体目的在于复制足够多的目标质粒，所以常带有较强的自我复制元件，如复制起始位点等，往往 在菌体内存在多拷贝，所以抽质粒会抽出一大堆。但不具备表达元件。而表达质粒有复杂的构成，为的是控制目标蛋白的表达，如各种启动子（T7），调节子（LacZ）等，而且以pET为代表的表达载体在菌体内都是低拷贝的，防止渗漏表达。 克隆载体只是把你要的基因片段拿到就可以了，不管读码框什么的，但是表达载体是不但要你的目的基因连在上面，而且要表达蛋白，所以就要求你的读码框不能乱了，否则就不能得到你想到的表达产物。 1.载体即要把一个有用的基因（目的基因——研究或应用基因）通过基因工程手段送到生物细胞（受体细胞），需要运载工具（交通工具）携带外源基因进入受体细胞，这种运载工具就叫做载体（vector）。 2. 载体的分类 按功能分成：（1）克隆载体: 都有一个松弛的复制子，能带动外源基因，在宿主细胞中复制扩增。它是 用来克隆和扩增DNA片段（基因）的载体。（2）表达载体 :具有克隆载体的基本元件（ori,Ampr,Mcs等）还具有转录/翻译所必需的DNA顺序的载体。 按进入受体细胞类型分：（1）原核载体（2）真核载体（3）穿梭载体（sbuttle vector）指在两种宿主生物体内复制的载体分子，因而可以运载目的基因（穿梭往返两种生物之间）. 克隆载体顾名思义就是质粒拷贝数比较高,在做上游克隆时比较方便, 其重点在于质粒的复制.

如何对表达载体进行选择及读谱方法

如何对表达载体进行选择及读谱方法 目前，载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒DNA是一种新的非病毒转基因载体。一个合格质粒的组成要素： （1）复制起始位点Ori即控制复制起始的位点。原核生物DNA分子中只有一个复制起始点。而真核生物DNA分子有多个复制起始位点。 （2）抗生素抗性基因可以便于加以检测，如Amp+,Kan+ （3）多克隆位点MCS克隆携带外源基因片段 （4）P/E启动子/增强子 （5）Terms终止信号 （6）加poly（A）信号可以起到稳定mRNA作用 选择载体主要依据构建的目的，同时要考虑载体中应有合适的限制酶切位点。如果构建的目的是要表达一个特定的基因，则要选择合适的表达载体。 载体选择主要考虑下述3点： 【1】构建DNA重组体的目的，克隆扩增/表达表达，选择合适的克隆载体/表达载体。 【2】.载体的类型： （1）克隆载体的克隆能力－据克隆片段大小（大选大，小选小）。如<10kb选质粒。 （2）表达载体据受体细胞类型－原核/真核/穿梭，E.coli/哺乳类细胞表达载体。 （3）对原核表达载体应该注意：选择合适的启动子及相应的受体菌，用于表达真核蛋白质时注意克服4个困难和阅读框错位；表达天然蛋白质或融合蛋白作为相应载体的参考。 【3】载体MCS中的酶切位点数与组成方向因载体不同而异，适应目的基因与载体易于链接，不产生阅读框架错位。 综上所述，选用质粒（最常用）做载体的4点要求： （1）选分子量小的质粒，即小载体（1－1.5kb）→不易损坏，在细菌里面拷贝数也多（也有大载体）； （2）一般使用松弛型质粒在细菌里扩增不受约束，一般10个以上的拷贝，而严谨型质粒<10个。（3）必需具备一个以上的酶切位点，有选择的余地； （4）必需有易检测的标记，多是抗生素的抗性基因，不特指多位Ampr（试一试）。 无论选用哪种载体，首先都要获得载体分子，然后采用适当的限制酶将载体DNA进行切割，获得分子，以便于与目的基因片段进行连接。 如何阅读质粒图谱 第一步：首先看Ori的位置，了解质粒的类型（原核/真核/穿梭质粒） 第二步：再看筛选标记，如抗性，决定使用什么筛选标记。 （1）Ampr水解β－内酰胺环，解除氨苄的毒性。 （2）tetr可以阻止四环素进入细胞。 （3）camr生成氯霉素羟乙酰基衍生物，使之失去毒性。 （4）neor（kanr）氨基糖苷磷酸转移酶使G418（长那霉素衍生物）失活 （5）hygr使潮霉素β失活。 第三步：看多克隆位点（MCS）。它具有多个限制酶的单一切点。便于外源基因的插入。如果在这些位点外有外源基因的插入，会导致某种标志基因的失活，而便于筛选。决定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。 第四步：再看外源DNA插入片段大小。质粒一般只能容纳小于10Kb的外源DNA片段。一般来说，外源DNA片段越长，越难插入，越不稳定，转化效率越低。 第五步：是否含有表达系统元件，即启动子－核糖体结合位点－克隆位点－转录终止信号。这是用来区别克隆载体与表达载体。克隆载体中加入一些与表达调控有关的元件即成为表达载体。选用那种载体，还是要以实验目的为准绳。 第六步：启动子－核糖体结合位点－克隆位点－转录终止信号 （1）启动子－促进DNA转录的DNA顺序，这个DNA区域常在基因或操纵子编码顺序的上游，是DNA分子上可以与RNApol特异性结合并使之开始转录的部位，但启动子本身不被转录。（2）增强子/沉默子－为真核基因组（包括真核病毒基因组）中的一种具有增强邻近基因转录过程的调控顺序。其作用与增强子所在的位置或方向无关。即在所调控基因上游或下游均可发挥作用。/沉默子－负增强子，负调控序列。

目的基因片段与克隆载体质粒的连接操作步骤

连接反应总体积为10μL，体系组成如下： 回收纯化的PCR扩增目的基因片段 7.0μL 10×Ligation buffer 1.0μL T载体（10ng/μL） 1.0μL T4 DNA ligase 1.0μL 共10.0ul 混均后，4℃连接18-24小时，连接所得克隆载体命名为TA-VP4-STI。 转化操作方法 1）取一管-80℃保存的感受态细胞，置冰上融化； 一次转化感受态细胞的建议用量为50-100ul,应注意所用DNA体积不要超过感受态细胞悬液体积的十分之一。以100ul为例： 2）加入连接物（50ul的感受态细胞能够被1ng超螺旋质粒DNA所饱和），轻轻旋转离心管以混匀内容物，冰浴30min；

3）将离心管置于42℃热击60-90秒，然后迅速置冰浴2-3分钟，该过程不要摇动离心管； 4）向每个离心管中加入500ul液体LB培养基（不含抗生素），混匀后置于37℃摇床振荡培养45分钟（150转/分钟）；目的是使质粒上相关的抗性标记基因表达，使菌体复苏。 5）将离心管内容物混匀，吸取100ul已转化的感受态细胞加到含相应抗生素的LB固体琼脂培养基上（含50 ug/ml氨苄青霉素），用无菌的弯头玻棒轻轻将细胞均匀涂开。将平板置于室温直至液体被吸收，倒置平板，37℃培养12-16小时。至红、白斑区分明显为止。 涂布用量可根据具体试验来调整：如转化的DNA总量较多，可取更少量转化产物涂布平板；反之，如转化的DNA总量较少，可取200-300ul 转化产物涂布平板。如果预计的克隆较少，可通过离心 （4000rpm,2min）后析除部分培养液，悬浮菌体后将其涂布于一个平板中。（涂布剩余的菌液可置于4℃保存，如果次日的转化菌落数过少可以将剩下的菌液再涂布新的培养板）

质粒构建中 DNA片段与载体连接的经验

在排除了其他问题后，我做了摩尔比的调整，需要做OD260的测量。不要怕浪费回收的载体和片段因为实际用量非常少，看了下面我们的实验实例就知道了。 摩尔比是指载体和插入片段，在连接时的摩尔比。 1 比例应该在1:2-6之间（载体：片段；片段要多）。 2 连接体系如果是20微升，载体和片段的总质量（微克）要在0.02微克~0.2微克之间。如果是10微升，则在0.01~0.1微克之间。我一般都用到接近上限。 3 EDTA不能太多。否则可能影响连接酶。 附加： 如何计算摩尔数和微克数（用20微升的链接体系，NEB的T4 DNA ligase） 公式：pmol数*kb数（双链）*0.65=微克数 实例：片段大小=555bp=0.555kb，浓度=0.19微克/微升 载体大小=4.969kb，浓度=0.115微克/微升 选取：载体0.04pmol；片段0.12pmol（载体：片段=1:3） 代入公式：pmol数*kb数（双链）*0.65=微克数； 载体用0.129微克（1.12微升）；片段用0.043微克（0.23微升）：：：注意20微升体系 得出：载体和片段的总质量=0.043+0.129=0.172微克（在20微升体系所要求的0.02~0.2微克之间） 连接体系：体积按需调整，我们喜欢用20ul的体系。你如果要用10ul的，把上述用量减半。 20ul体系： 3d水15.65 ul， 片段0.23 ul， 载体 1.12 ul， 将上面三个液体混匀，45摄氏度水浴5min，迅速插入冰中，2min 保持在冰浴中，加入 10×buffer 2 ul T4 DNA ligase 1 ul 混匀，4℃连接过夜 另外一种推算结果 设x1为DNA片段pmol数，x2为其ug数；设y1为载体pmol数，y2为载体ug数，a为DNA片段的kb数，b为载体的kb数，并且假定摩尔比为DNA片段：载体=3:1，则有 x1·a·0.65=x2 y1·b·0.65=y2 x1：y1=3 x2+y2=0.2（总质量）

一种高效实现多片段插入的重组质粒的构建方法

高效构建一种多片段插入的疟原虫基因敲除重组质粒 刘权兴谭章平徐文岳戴纪刚 【摘要】目的构建一种基因敲除重组质粒，在PL0007质粒中实现多个片段的无缝插入。方法首先，设计融合PCR引物，在各片段之间的引物设计15bp重叠序列，并且在第一个插入片段的5’端和最后一个插入片段的3’端也要与载体上重叠15bp。其次，运用常规PCR 方法扩增出待融合片段，并进行胶回收纯化。应用融合PCR技术将要插入的各个片段拼接到一起成为一个大片段。最后，应用无缝克隆试剂盒将该大片段插入PL0007质粒的特定位点。结果经酶切鉴定和DNA测序证明所构建的重组质粒完全正确，插入序列碱基无一突变。结论联合应用融合PCR技术和无缝拼接技术可以高效的在质粒载体中连续无缝插入多个片段，阳性率比传统技术更高，操作更方便。 [关键词]：重组质粒、融合PCR、无缝拼接 [中图分类号] R382.3+1 A highly efficient method for the construction of recombinant plasmid with several DNA fragments insertion for knockout Plasmodium genome [Abstarct]Objective In this study, we describe a general method for plasmid assembly that uses infusion method to insert three DNA fragments into plasmid PL0007. Methods At first, we designed the fusion PCR primers, which request 15bp overlap sequence between the primers, and the first insertion fragment of the 5' terminal and the last insertion fragment of the 3' terminal also overlap 15bp with the vector. Secondly, infusion fragments, amplified by PCR and purified with the Gel Extraction Kit, were infused into a integrated fragment with the method of fusion PCR technology and then inserted into the target site in the plasmid PL0007 with the Infusion Kit. At last, the recombinant plasmid was proved entirely correct with no mutation in the sequence of bases by restriction enzyme digestion and DNA sequencing. Results Restriction endonuclease reactions was used to identify the recombinant plasmid and followed by sequence analysis. All recombinant plasmid are right and without a mutation point in the inserted fragment. Conclusion Combined with fusion PCR technology and fusion PCR technology may insert mμl tiple fragments into plasmid vectors with high efficacy and more convenient, and the positive rate is higher than the traditional technology.

质粒载体

载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒DNA是一种新的非病毒转基因载体。 一、一个合格质粒的组成要素 a复制起始位点Ori 即控制复制起始的位点。原核生物DNA分子中只有一个复制起始点。而真核生物DNA分子有多个复制起始位点。 b 抗生素抗性基因可以便于加以检测，如Amp+ ,Kan+ c 多克隆位点MCS 克隆携带外源基因片段 d P/E 启动子/增强子 e Terms 终止信号 f 加poly（A）信号可以起到稳定mRNA作用 二、如何阅读质粒图谱 第一步：首先看Ori的位置，了解质粒的类型（原核/真核/穿梭质粒） 第二步：再看筛选标记，如抗性，决定使用什么筛选标记。 （1）Ampr 水解β－内酰胺环，解除氨苄的毒性。 （2）tetr 可以阻止四环素进入细胞。 （3）camr 生成氯霉素羟乙酰基衍生物，使之失去毒性。 （4）neor（kanr）氨基糖苷磷酸转移酶使G418（长那霉素衍生物）失活 （5）hygr 使潮霉素β失活。 第三步：看多克隆位点（MCS）。它具有多个限制酶的单一切点。便于外源基因的插入。如果在这些位点外有外源基因的插入，会导致某种标志基因的失活，而便于筛选。决定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。 第四步：再看外源DNA插入片段大小。质粒一般只能容纳小于10Kb的外源DNA片段。一般来说，外源DNA片段越长，越难插入，越不稳定，转化效率越低。 第五步：是否含有表达系统元件，即启动子－核糖体结合位点－克隆位点－转录终止信号。这是用来区别克隆载体与表达载体。克隆载体中加入一些与表达调控有关的元件即成为表达载体。选用那种载体，还是要以实验目的为准绳。 启动子－核糖体结合位点－克隆位点－转录终止信号 a 启动子－促进DNA转录的DNA顺序，这个DNA区域常在基因或操纵子编码顺序的上游，是DNA分子上可以与RNApol特异性结合并使之开始转录的部位，但启动子本身不被转录。b增强子/沉默子－为真核基因组（包括真核病毒基因组）中的一种具有增强邻近基因转录过程的调控顺序。其作用与增强子所在的位置或方向无关。即在所调控基因上游或下游均可发