人源性抗日本血吸虫噬菌体抗体库的构建及初步鉴定

文章编号:1002-2694(2007)04-0386-04

人源性抗日本血吸虫噬菌体抗体库的构建及初步鉴定3

雷　黎1,2,赵志荣1,朱绍春1,刘　淼1,卞茂红1,张林杰1,沈际佳1

摘　要:目的　利用噬菌体抗体展示技术构建人源性抗日本血吸虫Fab段噬菌体抗体库并进行初步鉴定。方法　R T2 PCR从对血吸虫感染有一定抗性成年人外周血淋巴细胞中扩增出人Ig G轻链和重链Fd段基因片段,将其克隆入PComb3中,构建人源性Fab段噬菌体抗体库,并用限制性内切酶酶切、序列分析、DO T2BLO T以及SDS2PA GE等方法对噬菌体抗体库进行初步鉴定。结果　噬菌体抗体库的滴度为6.2ⅹ1011/L,库容量为1.2ⅹ107,酶切鉴定结果显示噬菌体抗体库轻重链重组率达到66.6%,测序结果表明克隆入PComb3的是人免疫球蛋白轻链和重链基因,DO T2BLO T实验证明该抗体库表达了人源性的抗体,而SDS2PA GE证实了免疫球蛋白Fab段的可溶性表达。结论　成功地构建了人源性抗日本血吸虫Fab段噬菌体抗体库,为筛选人源性抗日本血吸虫的抗体、研究这些抗体的特性和功能奠定了基础。

关键词:日本血吸虫;人源性;噬菌体抗体库;Fab段抗体

中图分类号:R383　文献标识码:A

Construction and preliminary identif ication of humanized F ab fragment phage antibody library against Schistosoma j a ponica

L EI Li,ZHAO Zhi2rong,ZHU Shao2chun,L IU Miao,

Bian Mao2hong1,ZHAN G Lin2jie,SH EN Ji2Jia

(De partment of Microbiolog y and Parasitology,A nhui Medical Universit y,Hef ei230032,China)

ABSTRACT:To construct and identify the humanized Fab f ragment phage antibody library against Schistosoma j aponica, genes encoding for light chains and the Fd f ragments of heavy chain were amplified by R T2PCR f rom peripheral blood lympho2 cytes of adults showing to S chistosoma j aponica,and they were cloned into vector pComb23to construct humanized Fab f rag2 ment phage antibody library.The library was identified with restriction enzyme digestion,SDS2PA GE,dot blot and sequence analysis.It was found that the titer of the phage antibody library was6.2×1011/L and the volume of library was1.2×107re2 spectively.The recomnination ratio of light and heavy chanins of the phage antibody library was66.6%as demonstrated f rom the results of restriction enzyme digestion.It was proved by the results of sequencing that the genes cloned into vector pComb2 3were those encoding for human light and heavy chains This phage antibody library could express the humanized antibodies was comfirmed by dot blotting and the soluble expression of Fab fragment of immunoglobulin was demonstrated by SDS2PA G.E. From these experimenyations,it is evident that the humanized Fab f rgment phage antibody library against Schistosoma j a pani2 ca was successively constructed,thus providing the basis for the f urther study on the chracteristics and f unction of these anti2 bodies.

KE Y WOR DS:Schistosoma j a ponica;humanized;phage antibody library;Fab f ragment antibody

血吸虫病仍然是一个不容忽视的公共卫生问题,每年至少有25万人死于血吸虫病〔1〕。单克隆抗体技术、分子生物学和基因工程技术在血吸虫病的防治研究中起到了很大的促进作用。而噬菌体抗体库技术的诞生和迅速发展,则为血吸虫病的研究提供了新的思路和方法。噬菌体抗体库技术绕过了细胞杂交这一步,避免了杂交瘤细胞系不稳定的缺点,为人源性抗体的制备和应用开辟了广阔的前景〔224〕。本实验运用噬菌体抗体展示技术,采用流行区对血吸虫感染具有一定抗性的人〔5〕(Endemic normal, EN指较长时间生活在流行区,有经常疫水接触史,从未接受过血吸虫病药物治疗,多次粪检未能发现血吸虫卵,血清中血吸虫抗体强阳性)外周血淋巴细胞,成功地构建人源性Fab段噬菌体抗体展示库,

基金项目:安徽省自然科学基金项目(050430805);安徽省人才开发基金项目(2005Z030)

通讯作者:shenjijia@hot https://www.wendangku.net/doc/f98003757.html,

作者单位:1.安徽医科大学病原生物学教研室,合肥　230032

2.安徽中医学院第一附属医院检验科,合肥　230031

为进一步筛选获得人源性抗日本血吸虫的抗体以及研究这些抗体的特性和功能奠定了基础。

1　材料和方法

质粒PComb3、大肠杆菌XL12blue由本室保存。辅助噬菌体M13K07由上海第二军医大学潘卫教授惠赠。PCR胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒购自杭州V2gene生物工程有限公司。T4DNA连接酶购自立陶宛MBI公司。Taq DNA 聚合酶、反转录试剂盒购自美国Promega公司。T载体和各种限制性内切酶购自大连宝生物生物工程有限公司。淋巴细胞分离液购自天津灏洋生物制品科技有限公司。提取RNA所用TRIzol试剂购自美国Invitrogen公司,其它试剂是进口或国产分析纯。

2　淋巴细胞总RNA的提取和R T2PCR

2.1　标本来源　标本采集于4名年龄在40～50岁之间(2名男性、2名女性),长期生活在血吸虫病流行区,有经常疫水接触史,从未接受过血吸虫病药物治疗,标本采集前三个月经三次改良加藤法六检粪便中虫卵阴性,血清中血吸虫特异性抗体呈强阳性(间接凝集实验1∶40阳性和EL ISA法大于1∶400阳性)的血吸虫病流行区对血吸虫感染具有一定抗性人。

2.2　方法　抽取肝素抗凝血各5ml,加入等量的生理盐水,然后将混匀的抗凝血小心的加入已装有3ml淋巴细胞分离液的试管中,2000g,10min,用吸管小心的吸出淋巴细胞层,将四份淋巴细胞混合后,用生理盐水洗两遍,TRIzol法提取总RNA。反转录实验参照试剂盒说明书进行。

2.3　轻链和重链的PCR扩增　引物设计参照文献〔6〕,由上海生工生物工程公司合成。轻链PCR的反应条件为94℃4min热启动,94℃变性45s,65℃退火45s,72℃延伸30s,共30个循环,最后72℃延伸10min,在其上游和下游引物中分别引入了限制性内切酶S acⅠ和X baⅠ的识别序列。重链PCR的反应条件为:94℃4min热启动,94℃变性45s,61℃退火45s,72℃延伸60s,共30个循环,最后72℃延伸10min,其上游和下游引物中分别引入了限制性内切酶X hoⅠ和S pe Ⅰ的识别序列。1%的琼脂糖电泳分析。PCR产物胶回收按照试剂盒说明书进行。

2.4　噬菌体抗体库的构建　将PCR扩增的轻链基因与T 载体相连,然后转化XL12blue,提取质粒后,经S acⅠ和X ba Ⅰ双酶切,1%琼脂糖凝胶电泳回收目的条带。将表达载体PComb3用同样的两个酶进行酶切,并用碱性磷酸酶去磷酸化,1%琼脂糖凝胶电泳回收目的条带,再与已经回收的轻链片断进行连接,转化XL12blue,加入含有氨苄青霉素的液体LB培养基培养,提取质粒得到轻链基因文库。重链PCR产物与T载体相连,转化XL12blue,提取质粒,用X hoⅠ和S pe Ⅰ进行双酶切,1%琼脂糖凝胶电泳回收后与经相同酶切并做去磷酸化处理后的轻链基因文库连接,转化XL12blue,加入2ml LB液体培养基,37℃振摇1h,加入10ml LB液体培养基(20μg/ml氨苄青霉素,10μg/ml四环素)37℃振摇1h,补足氨苄青霉素至50μg/ml,继续振摇1h,加入100ml LB 培养基(100μg/ml氨苄青霉素,10μg/ml四环素)和1012PFU辅助噬菌体M13K07,37℃振摇2h,加卡那霉素至终浓度70μg/ml,37℃振摇过夜。4℃4000g离心收集上清,加PEG8000至4%,NaCl至3%,冰浴30min后4℃12000g 离心弃上清,沉淀悬浮于2ml PBS(p H7.2),再以4℃12000g离心5min,弃去不溶物,收集上清即为噬菌体抗体库。

2.5　噬菌体抗体库的鉴定

2.5.1　酶切鉴定　取所构建噬菌体抗体库20μl加入2ml 新鲜的XL12blue,室温孵育15～20min后,吸取10μl涂含氨苄青霉素的LB琼脂平板,37℃培养过夜,其余的转入10 ml LB液体培养基(20μg/ml氨苄青霉素)中,37℃振摇过夜。次日提取质粒,分别进行酶切鉴定轻链与重链。另外从LB琼脂平板上随机挑取9个菌落摇菌,提取质粒分别酶切鉴定轻链和重链的重组情况,以判断噬菌体抗体库的重组效率。

2.5.2　抗体库滴度和库容量测定　以1∶1000倍稀释后的抗体库20μl侵染1ml XL12Blue菌液,取20μl涂到含氨苄青霉素的LB琼脂平板上,24h后计数培养皿上的菌落数,并挑取单个菌落培养扩增,从中提取质粒进行酶切鉴定。

2.5.3　重组质粒的序列测定　将鉴定正确的质粒送上海生工生物工程公司进行测序,并与G enBank上的序列进行比对。

2.5.4　点印迹法鉴定　分别将5μl阳性对照(血吸虫抗体诊断试剂盒中人Ig G抗体阳性标准品)、构建成功的噬菌体抗体库、辅助噬菌体M13K07点在硝酸纤维素膜上,室温晾干后,用于点印迹(DO T2BLO T)检测,具体方法参照文献〔7〕。

2.5.5　免疫球蛋白的可溶性表达　方法参见文献〔8〕,分别在加入异丙基硫代2β2D2半乳糖苷(IPT G)前,加入IPT G5h 后,12h后留取1mL菌液,4000g,离心5min,去上清,加入100μl PBS重悬菌液,加入等量的2X上样缓冲液,100℃煮沸5min,采用12%凝胶,不连续缓冲系统,通过十二烷基磺酸钠2聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS2PA GE),考马氏亮蓝染色1h,摇振脱色过夜。

3　结　果

3.1　PCR扩增产物　PCR扩增轻链和重链后,1%琼脂糖电泳后可以见到约700bp大小的条带,与理论值一致(图1)。

3.2　酶切鉴定及库容量测定结果　对噬菌体抗体库分别采用S peⅠ/X hoⅠ和S acⅠ/X baⅠ酶切后, 1%琼脂糖电泳可见大小两条带,大带为4700bp左右,小带约700bp。随机挑取的9个菌落的质粒酶切鉴定可见轻链有8个重组成功、成功率88.8%,重链有7个重组成功,成功率77.7%,同时具有轻链和重链的有6个菌落,成功率66.6%(图2)。涂板法测得噬菌体抗体库的滴度为6.2×1011/L,抗体库的库容为1.2×107。

3.3　序列分析结果　将测序结果分别与GenBank

图1　PCR 扩增产物电泳图

1:轻链PCR 产物,2:重链PCR 产物,M :DNA 分子量标准。

Fig.1　R esults of PCR

1:PCR production of light chain ,2:PCR produc 2tion of

heavy chain ,M :DNA Marker.

进行比对,结果显示克隆入PComb3中的免疫球蛋

白轻链序列与GenBank 中人的免疫球蛋白轻链(к

)恒定区序列(gi/63101937/gb/Bc095489.1)有95%的同源性;克隆入PComb3中的免疫球蛋白重链序列有351个碱基与GenBank 中人的免疫球蛋白重链的恒定区(gi/62201665/gb/BC092518.1)有100%的同源性。另外264个碱基与GenBank 中人的免疫球蛋白重链的可变区(gi2370210/emb/96961.1/HSZ96961)有88%的同源性。序列分析结果证实克隆入PComb3的外源基因是人免疫球蛋白的轻链和重链基因。3.4　点印迹法鉴定　结果显示阳性对照与噬菌体抗体库呈现阳性,而辅助噬菌体为阴性(图3),证明噬菌体抗体库表达了人的免疫球蛋白Ig G 片段。3.5　免疫球蛋白Fab 段的可溶性表达　SDS 2PA GE

图2　噬菌体抗体库的酶切鉴定

A :酶切鉴定噬菌体抗体库的轻链与重链重组情况,

B :酶切(S ac Ⅰ/X ba Ⅰ)

鉴定轻链的重组效率,C :酶切(S pe Ⅰ/X ho

Ⅰ

)鉴定重链的重组效率。Fig.2　Identif ication of phage display antibody library with restriction enzyme digestion

A :The library was digested by S pe Ⅰ/X ho Ⅰand S ac Ⅰ/X ba Ⅰrespectively ,

B :S ac I and X ba I restriction analysis of light chain recombinants ,

C :

S pe Ⅰand X ho Ⅰrestriction analysis of heavy chain recombinants.

结果显示,在没有加入IP T G 诱导时,未见明显特异性条带出现,在加入IP T G 后的5h 和12h 后,免疫球蛋白Fab 段可溶性表达,在Mr25000处可见有明显条带出现,与理论值大小相符(图4)

图3　点印迹法鉴定噬菌体抗体库的F ab 呈现

A :阳性对照,

B :噬菌体抗体库,

C :辅助噬菌体M13K07

Fig.3　Id entif ication of ph age antibody lib rary w ith DOT 2B LOT

A :Positive control ,

B :Phage display antibody li 2brary ,

C :Helper phage M13K07

图4　免疫球蛋白F ab 段的可溶性表达的SDS 2PAGE 图

1:未加IP T G ,2:加入IPT G 后5h ,3:加入IP T G 后12h ,M :蛋白质标准物。Fig.4　SDS 2PAGE analysis of F ab fragment of immunoglobu 2

lin soluble expression

1:Before add IPT G ,2:5hours after add IPT G ,3:12hours after add IPT G ,M :Protein marker.

4　讨　论

近年来,噬菌体抗体展示技术发展迅速,尤其在肿瘤〔9〕、自身免疫性疾病〔10〕以及血栓性疾病〔11〕等领域取得了突破性进展,通过噬菌体技术获得的新药有的已进入临床Ⅱ/Ⅲ期研究,如分别用于治疗风湿性关节炎和青光眼的D2E7和CA T152〔12213〕,有的已获美国FDA认证。我们构建人源性抗日本血吸虫噬菌体抗体库,以克服鼠源性单抗引起的人抗鼠免疫反应,避免传统单抗制备的繁琐程序,力求能够筛选获得可与血吸虫发生特定作用的人源化抗体。 本实验采用流行区对血吸虫感染具有一定抗性人的外周血淋巴细胞,用PCR方法扩增出人的Ig G 轻链和重链Fd段基因,以T载体为辅助,运用定向克隆的方法,采用了酶切后的载体去磷酸化处理技巧,提高了PCR产物与表达载体的连接效率,成功地构建了滴度为6.2×1011/L,库容量为1.2×107的人源性Fab段噬菌体抗体库。随机挑取9个菌落,用菌落PCR和酶切两种方法同时对轻重链重组率进行鉴定,酶切鉴定结果是轻链为88.8%,重链为77.7%,轻重链的重组成功率为66.6%,本次实验结果与文献报道的重组率相符〔14216〕,而菌落PCR 的阳性率不论是轻链还是重链均为100%,说明菌落PCR方法鉴定抗体库的重组率确实存在一定的假阳性〔17〕。对鉴定正确的单个菌种进行了序列测定,结果证实克隆入PComb3的外源基因是人免疫球蛋白的轻链和重链基因。免疫球蛋白的可溶性表达的实验说明了如果筛选获得阳性克隆,可以得到可溶性表达的Fab段抗体,便于获得这些抗体分子和进一步分析抗体生物学活性。

我们建库采用的是4名对血吸虫感染具有一定抗性的人,他们长期生活在血吸虫病流行区,有经常疫水接触史,从未接受过血吸虫病药物治疗,三次改良加藤法检测粪便中虫卵阴性,血清中血吸虫特异性抗体呈强阳性,以他们的外周血淋巴细胞构建噬菌体抗体库,为进一步筛选获得可能具有一定保护性作用的人源性抗日本血吸虫抗体以及研究这些抗体的免疫学特性、生物学活性和功能奠定了基础。参考文献:

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收稿日期:2006212227;修回日期:2007202214

传染病学日本血吸虫培训资料

传染病学日本血吸虫培训资料 指日本血吸虫寄生在门静脉系统所引起的疾病； 1)由皮肤接触含尾蚴的疫水而感染； 2)基本病理变化：虫卵所引起的虫卵肉芽肿； 3)病变主要部位：肝脏、结肠； 4)急性期：发热、腹痛、腹泻或脓血便、肝肿大与压痛， 血中嗜酸性粒细胞显著增多； 5)慢性期：以肝脾肿大或慢性腹泻为主； 6)晚期：以门静脉周围纤维化病变为主，可发展为肝硬 化、巨脾、腹水。 【病原学】 日本血吸虫雌雄异体，成虫主要寄生在宿主的门静脉系统血管内，雌雄合抱，移至肠壁 小静脉末端产卵，部分虫卵穿破肠壁，随大便排出体外，其余虫卵或留在肠壁组织或随门静

脉血流入肝内。虫卵在水中于适宜的温度下经数小时至24小时孵化出毛蚴，侵入钉螺体内 则继续发育为尾蚴，尾蚴从螺体逸入水中，最长可存活3日；当人或牲畜与疫水接触，尾蚴由 皮肤侵入发育成童虫，童虫在门静脉系统血管内发育成成虫。 【流行病学】 寄生于人体的血吸虫病有5种，即日本血吸虫、曼氏血吸虫、埃及血吸虫、间插血吸虫和湄公血吸虫。 1)传染源主要是排出血吸虫虫卵的患者和患病的哺乳类 动物如牛，钉螺是唯一的 中间宿主。 2)传播途径通过皮肤与疫水接触而感染。若饮用含有尾蚴 的生水也可经口腔粘膜 3)人群易感性普遍易感。夏秋季因接触疫水机会多而多 发。 【发病机制和病理】

（一）.发病机制：尾蚴、幼虫、成虫、虫卵对宿主均可引起一系列免疫反应，虫卵是引起宿主免疫反应和病理变化的主要因素。 1)卵内毛蚴释放SEA→T细胞致敏释放各种淋巴因子→吸 引大量巨噬细胞、单核细胞、 嗜酸性粒细胞等聚集于虫卵周围→虫卵肉芽肿（虫卵结节）→嗜酸性脓肿 2)卵内毛蚴释放SEA→浆细胞产生抗体→抗原抗体复合物 →环绕虫卵周围，形成 放射状嗜酸性棒状体→何博礼现象（Hoeppli） 3)可溶性虫卵因子、巨噬细胞、T淋巴细胞→成纤维细胞刺 激因子→成纤维细胞增殖与胶原合成→干线型纤维化（pipestem fibrosis） 何博礼现象（Hoeppli）虫卵周围又是酸性辐射样棒状物，系抗原与抗体结合的免疫复合物，称之。 血吸虫病免疫学特点：V ①急性：血清循环免疫复合物与嗜异抗体阳性率高，

血吸虫病的简介及治疗

日本血吸虫病 简称血吸虫病，是由日本血吸虫寄生于人体导致的疾病。曾在我国广泛流行。建国后被一度扑灭。现又有抬头趋势。 目录 疾病名称 疾病分类 疾病概述 疾病描述 病原学 症状体征 （一）急性血吸虫病 （二）慢性血吸虫病 （三）晚期血吸虫病 （四）异位血吸虫病 流行病学 （一）地理分布 （二）流行环节 发病机制与病理生理 1、第一阶段 2、第二阶段 3、第三阶段 1 结肠 2 肝 3 脾 4 异位损害 并发症 诊断 治疗方案 疾病预防 用药安全 展开 疾病名称 疾病分类 疾病概述 疾病描述 病原学 症状体征 （一）急性血吸虫病 （二）慢性血吸虫病 （三）晚期血吸虫病 （四）异位血吸虫病 流行病学 （一）地理分布

（二）流行环节 发病机制与病理生理 1、第一阶段 2、第二阶段 3、第三阶段 1 结肠 2 肝 3 脾 4 异位损害 并发症 诊断 治疗方案 疾病预防 用药安全 展开 疾病名称 日本血吸虫病 【拉丁学名】 Schistosoma japonicum Katsurada 疾病分类 感染科 疾病概述 日本血吸虫病是日本血吸虫寄生于门静脉系统所引起，籍皮肤接触含尾蚴的疫水而感染。主要病变为虫卵沉积于肠道和肝脏等组织而引起的虫卵肉芽肿。急性期有发热、肝肿大与压痛，腹痛、腹泻、便血等，血嗜酸粒细胞显著增多；慢性期以肝脾肿大或慢性腹泻为主要表现；晚期表现主要与肝脏门静脉周围纤维化有关，临床上有巨脾、腹水等。有时可发生血吸虫病异位损伤。本病的传染源为病人和保虫宿主。粪便入水、钉螺的存在和接触疫水是本病传播的三个重要环节。 治疗：病原治疗：吡喹酮；对症治疗。 预后：急性和慢性早期患者接受病原治疗后，绝大多数症状消失，体重、体力明显增进和恢复，并可长期保持健康状态。侏儒症患者治疗后常能恢复生长发育，获得生育能力。晚期患者有高度顽固性腹水、并发上消化道出血、黄疸、肝性脑病以及并发结肠癌者预后较差。 预防：控制传染源，切断传播途径，保护易感人群。 编辑本段疾病描述 日本血吸虫病是日本血吸虫寄生在门静脉系统所引起的疾病。由皮肤接触含尾蚴疫水而感染，主要病变为肝与结肠由虫卵引起的肉牙肿。急性期病人有发热肝肿大与压痛，腹泻或脓血便，血中嗜酸性粒细胞显著增多。免刑期以肝脾肿大为主。晚期则以门静脉周围纤维化病变为主可发展为门静脉高压症，巨脾与腹水。 编辑本段病原学 成虫：雌雄异体，雄虫大小为（10-22）mm×（0.5-0.55）mm，雌虫细长，大小为（12-28）mm×（0.1-0.3）mm。成虫在血管内交配产卵，一条雌虫每日课产卵的1000个左右。 虫卵：成熟虫卵呈椭圆形或类圆形，淡黄色，大小平均为82μm×62μm，内含一毛蚴。卵壳无卵盖，侧位有一逗点状棘突。 日本血吸虫生活始中，人是终末宿主，钉螺是必需的唯一中间宿主。除人外，尚有牛、

噬菌体展示肽库的筛选方法及其应用

噬菌体展示肽库的筛选方法及其应用 1985年,SmithGP利用基因工程手段将一段外源肽序列展示在丝状噬菌体的表面[1]。1988年[2]他们又将合成的随机序列的寡核苷酸片段克隆到丝状噬菌体,表达后每个噬菌体粒子的表面展示一种肽段,所有这些展示不同肽段的噬菌体构成了噬菌体展示肽库。1990年,他们通过亲合筛选,得到了与特定蛋白结合的结合肽,并由于噬菌体表达的肽与编码基因直接相关,扩增和分离目的克隆后,很容易得到其DNA序列[3]。这样就建立了噬菌体表面展示的随机肽库技术,这项技术一经产生就显示其无与伦比的生命力,被广泛用于生命科学的各个领域,并带来广泛而深远的影响。传统的药物筛选大多数是从自然界的动、植物及微生物中分离天然的具有特定药理作用的化学物质,然后直接应用或再以此作为药物化学的先导化合物,再进一步设计、加工、合成,筛选有效的功能药物。此方法具有一定的盲目性,筛选周期长。而采用分子进化工程技术则会大大加速这一过程。根据所需要的药物特性,选用适当的方法构建含有大量异质性分子的组合库,用靶分子进行筛选,先筛选药物先导化合物,然后进一步优化设计,最终确定候选的药物结构。近年来,引入组合策略和模拟进化思想,建立了一种从噬菌体随机肽库中筛选药物先导化合物的新方法[4],即用库容量极大的随机肽库去快速筛选具有较高特异性和亲和力的理想目的肽。通过此种方法可以快速筛选生物活性肽、蛋白质、受体及其他化合物等新型药物或先导化合物。这一方法具有传统的药物筛选无法比拟的优越性,将药物开发带入了一个崭新的时代。1噬菌体展示系统的建立早在1986年Geysen就认为含有关键残基的短肽能够模拟蛋白质上的决定族。在多数情况下,几个关键残基与它的结合分子所形成的非共价键构成了全部结合的主要部分,即蛋白质之间的相互作用或识别是通过局部残基肽段间的相互作用来实现的。1982年,Dulbecco提出将病原体的免疫原与λ噬菌体和其他病毒的衣壳蛋白融合,便可产生能够用作疫苗的表面展示外来多肽的病毒颗粒。1985年,Smith描述了外源肽段在丝状噬菌体fd表面的展示结果。1988年,他们建立了新的表达载体——可选择抗体的丝状噬菌体fd载体,能将外源短肽表达并伸展到噬菌体表面,用亲和筛选可选到表达特异肽的噬菌体,通过测定噬菌体序列,就可以知道所表达肽段的氨基酸序列。这为噬菌体展示肽库的建立提供了技术保障。2噬菌体展示系统的类别噬菌体展示系统因载体和宿主细胞不同分别有:丝状噬菌体展示系统(包括p 、p 和噬菌体粒展示系统)、λ噬菌体展示系统及T4噬菌体展示系统。2.1丝状噬菌体展示系统:丝状噬菌体展示系统是外源基因与g3p或g8p基因融合,并将它以外壳蛋白表面多肽的形式展示出来。它是最早被用来展示外源肽或蛋白质的系统,也是目前应用最广、发展最完善的噬菌体展示系统。丝状噬菌体是单链DNA病毒,其通过与细菌纤毛的相互作用感染宿主细胞,然后将病毒DNA注入细菌的胞质,利用细菌胞质内的酶转变成复制的双链DNA,并通过滚动复制产生子一代DNA分子。噬菌体展示技术正是利用丝状噬菌体DNA的结构和复制特点,把丝状噬菌体M13或fd 作为良好的基因工程的载体。因它的DNA复制与装配不受DNA分子的限制,因此可以将外源DNA插入到其一些非必须区,仅导致噬菌体颗粒的加长,而不影响其感染宿主及装配,这样即可得到一些插入外源DNA的基因重组体。噬菌体还可把插入的DNA片段以融合蛋白的形式表达在衣壳蛋白上。2.2λ噬菌体展示系统:是将外源肽或蛋白质与λ噬菌体的主要尾部蛋白PV或λ噬菌体头部组装的必需蛋白——D蛋白融合而被展示。2.3T4噬菌体展示系统:T4噬菌体展示系统是将外源肽和蛋白质与T4噬菌体的小衣壳蛋白SOC的C端融合而被展示,也有将外源蛋白与T4噬菌体的次要纤维蛋白(Fibritin)的C末端融合而被展示。由于T4噬菌体是在寄主细胞内组装而不必通过分泌途径,因此它可展示的肽/蛋白质范围较广,尤其适合于展示那些不能被E.coli分泌的复杂蛋白质[6]。3噬菌体展示肽库的筛选方法3.1生物淘金法:是目前常用的、最早由Smith等设计的一种筛选方法。将靶分子包被在固相介质上,加入噬菌体肽库与之吸附,洗去非亲和性或低亲和性的噬菌体,回收等亲和性的噬菌体,经过几轮“淘选”,可富集到特异性的噬菌体多肽。用于噬菌体肽库筛选的目标蛋白可以直

噬菌体抗体库技术(1)

噬菌体抗体库技术 张爱华　余模松 【摘要】　噬菌体抗体库技术是20世纪90年代继噬菌体展示技术发展而来。这一技术彻底改变了抗体制备的传统途径,使抗体工程技术进入了一个新的发展阶段。噬菌体抗体库技术是迄今发展最成熟、应用最广泛的抗体库技术。本文对与基因工程抗体相关的噬菌体展示技术以及噬菌体抗体库技术作一综述。 【关键词】　噬菌体展示技术;噬菌体抗体库技术;免疫抗体库 【中图分类号】R 392.11　【文献标识码】A 【文章编号】1673-4211(2006)01-0013-04 作者单位:430060武汉生物制品研究所免疫学研究室 20世纪80年代,随着DNA 重组技术的进展和抗体基因结构的阐明,产生了基因工程抗体技术。早期用于构建基因工程抗体的抗体基因主要来源于小鼠杂交瘤细胞。由于要获得杂交瘤细胞必须经过动物免疫、细胞融合及克隆筛选这样一个长期、复杂的过程;而且利用杂交瘤技术很难制备人源抗体和抗自身抗原或弱免疫原性抗原的抗体,所以限制了基因工程抗体技术的推广和应用。20世纪90年代,人们又将噬菌体展示技术应用到抗体的表达和克隆,将组建亿万种不同特异性抗体可变区基因文库和抗体在大肠杆菌功能性表达与高效快速的筛选手段结合起来,产生了噬菌体抗体库技术,这一技术彻底改变了抗体制备的传统途径,由此抗体工程技术进入了一个新的发展阶段。噬菌体抗体库技术是迄今发展最成熟、应用最广泛的抗体库技术[1]。 1　噬菌体展示技术 1985年Smith [2]首次阐述了噬菌体展示技术,该技术通过将外源蛋白或肽段的基因克隆到丝状噬菌体的基因组DNA 中,与噬菌体的外壳蛋白形成融合蛋白,从而使该外源分子呈现于噬菌体表面。该技术的主要特点是将特定分子的基因型和表型统一在同一噬菌体颗粒内,即在噬菌体表面表达特定蛋白,而在噬菌体核心DNA 中含有该蛋白的结构基因,通过表型筛选就可以获得其编码基因,因此噬菌体展示技术是一种强有力的基因表达筛选技术。 蛋白质可以展示在更小的丝状噬菌体颗粒的表面,这就是噬粒展示系统[3] 。噬粒的基因组中包含丝状噬菌体的基因间隔区,包括病毒颗粒和互补链合成的复制起始点以及发夹包装信号,同时也含 有质粒的复制起始点和抗性基因。噬粒也可以像质粒一样操作,假如需要,可以直接在细菌中表达目的蛋白。采用丝状辅助噬菌体感染细菌可以激活噬菌体的复制起始点,从而导致单链噬粒DNA 被包装进由辅助噬菌体蛋白形成的丝状噬菌体样的颗粒中,由于辅助噬菌体缺乏包装信号,所以产生的大多数噬菌体为含有噬粒单链DNA 的颗粒[4],将这种噬粒和噬菌体混合物感染细菌,筛选具有抗性的克隆,这种带抗性的克隆只含有噬粒DNA,可再次通过辅助噬菌体的感染进行扩增。由于噬粒颗粒可以传播抗性基因,所以有时又把这种颗粒称为“转导颗粒”。 p Ⅲ蛋白是一种最常用于展示外源片段的噬菌体外壳蛋白。其缺点是每个噬菌体颗粒表面仅有5个p Ⅲ分子,但是它的优点是带大的插入片段的p Ⅲ分子可以被很好地包装进噬菌体颗粒中。在绝大多数情况下,外源蛋白插入在信号序列和p Ⅲ蛋白第一结构域(N 1)的起始位点之间,一方面外源蛋白不影响噬菌体的包装,另一方面,外源蛋白位于包装颗粒的最末端,所以当通过p Ⅳ蛋白孔时,其空间位阻较小。但问题是大片段的插入降低了噬菌体的感染能力,甚至使噬菌体无感染性,因此限制了某些特殊蛋白的选择。这一问题可以通过杂交噬菌体得到解决,即仅有一个p Ⅲ分子用于展示蛋白,具体方案是将外源蛋白构建到噬粒载体中,转化细菌后,再用辅助噬菌体超感染,这样细菌中的大多数p Ⅲ蛋白为来源于辅助噬菌体的野生型分子[5] 。噬菌体展示活性蛋白的能力主要依赖于以下几个方面的因素,比如融合蛋白能否被正确地转移到细菌内膜,能否正确地折叠,能否在外周质中逃避降解以及能否被包装进噬菌体颗粒中。外源蛋白也可以插入到p Ⅲ蛋白的N1和N2以及N 2和CT 结 ? 13?国际生物制品学杂志2006年2月第29卷第1期　Int J Biolog icals,February 2006,Vol 29,No.1

预防血吸虫病知识

预防血吸虫病知识 一、什么是血吸虫病 血吸虫病是一种寄生虫病，可造成急性或慢性肠炎、肝硬化，并导致腹泻、消瘦、贫血与营养障碍等疾患， 二、急性血吸虫病的症状与体征 血吸虫病可分为急性、慢性和晚期3种。急性多发生于初次感染者，但少数慢性甚至晚期血吸虫病病人，在感染后也可发生。接触疫水后1-2天内，有的人在接触部位的皮肤出现点状红色丘疹，奇痒。 病人绝大多数有肝脏肿大，并伴有压痛。感染较重，或反复感染者可出现脾肿大，若不及时治疗，可迅速出现消瘦、贫血、营养性水肿和腹水，而导致死亡。。 三、什么季节最容易得血吸虫病 一年四季都可能感染血吸虫，但在气温较高的4-10月份最容易感染。不同地区、不同职业、不同习惯的人感染血吸虫的高峰季节也不相同。 春季雨水多，气候温暖，最适宜钉螺活动。加上人们春耕生产繁忙，下水的次数多，因此感染的机会较多。 夏季气温高，下湖、下河游泳、洗澡的人数多，接触疫水的时间长，身体暴露的面积也大。另外，在洞庭湖、鄱阳湖湖滨和长江沿岸等一些地区，洪水季节到来时，由于抗洪抢险突击下水人数增多，因此，受感染的人数也有可能增加。一般来说，急性血吸虫感染以夏季最为常见。 秋季温度也适宜钉螺活动，且又是捕鱼的好季节，鄱阳湖、洞庭湖等沿湖地区居民纷纷下湖捕鱼、捉虾，常常发生急性感染。因此，秋季同样是感染血吸虫的一个重要季节。 四、预防血吸虫病的措施 1、普查普治病人和病牛以控制传染源； 2、灭螺以切断传播途径； 3、粪便管理，防止人畜粪便污染水源，保护水源，改善用水卫生(提倡用井水。可疑用水消毒：饮水先用明矾沉淀，再以漂白粉消毒。每担水加漂白粉1克漂白粉精一片，15分钟后即可安全取用)； 4、尽量避免接触疫水，必须接触时应采取个人防护措施。防蚴笔(以脂肪酸为基质，加碱皂化后加2％氮硝柳胺和10％松节油制成)具有强大杀灭尾蚴的作用，涂擦皮肤可耐久不脱。此外有1％氯硝柳胺碱性溶液浸渍衣裤，对尾蚴亦有杀灭作用。 大桥中心卫生院宣

应用噬菌体抗体库技术制备抗体

湖南农业大学课程论文 学院：生物科学技术学院班级：08C生工 姓名：李栋学号：200842145118 课程论文题目：应用噬菌体抗体库技术制备抗体 课程名称： 评阅成绩： 评阅意见： 成绩评定教师签名： 日期：年月日

应用噬菌体抗体库技术制备抗体 李栋 生物科学技术学院08C生工200842145118 摘要：噬茵体抗体库技术是利用PCR扩增出抗体的全套可变区基因，将抗体分子DNA片断如Fab或单链抗体(scFv)与噬茼体外壳蛋白基因PⅢ或PVI]I连接，使融合蛋白表达于噬茵体颗粒的表面，经过“吸附一洗脱一扩增”过程富集筛选特异性抗体.。这一技术将抗体基因型和表型联系在一起，使识剐抗原的能力和噬茵体的可扩增性统一起来，较好的模拟了体内的抗体产生的过程，成为一种高效的筛选体系。噬菌体抗体库是近年发展起来的一项分子生物学新技术。构建容量大、特异性高和敏感性强的人源性抗体是此项技术的核心，也是其远大前景的基础.本文就噬茵体抗体库技术的原理、构建、筛选做一综述。 关键词：噬茵体抗体库技术；抗体库；噬茵体 噬菌体抗体库技术(phage display antibody li—brary techniques)是指用聚合酶链反应(polymerasechain reaction，PCR)扩增抗体的全套可变区基因，通过噬菌体表面展示技术，把Fab段或单链抗体(ScFv)表达在噬菌体的表面，经过“吸附一洗脱一扩增”过程筛选并富集特异性抗体。20世纪80年代中期，Smith 在前人对丝状噬菌体分子生物学研究的基础上首先提出了噬菌体展示技术。由于该技术具有生产人抗体的潜力，因此，吸引了许多学者投入这一研究中，使得噬菌体抗体库技术得以迅速发展，并由此开创了一条简便、快速的基因工程抗体生产路线. 1 噬菌体抗体库技术的基本原理 噬菌体抗体库技术的原理是将抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因与噬菌体的外壳蛋白Ill(PIl1)或外壳蛋白Ⅷ(PⅧ)基因随机重组，继而感染大肠杆菌，经增殖并在噬菌体表面以抗体片段Fab或ScFv一外壳蛋白融合蛋白的形式表达。这种噬菌体颗粒可以特异识别抗原，又能感染宿主菌进行再扩增，经过“吸附一洗脱一扩增”过程就能筛选并富集特异性抗体。所构建的抗体库称为全套抗体库，从中筛选到的抗体称为噬菌体抗体。它的最大特点是实现了直接将基因型

日本血吸虫 教案

长沙卫生职业学院目标教学教案（首页） 专业：护理学科：传染病护理学班级:2011级护理5-6班授课时间：5月27、29日 时春红

第五节日本血吸虫病 教学重点：日本血吸虫病的临床表现、护理诊断、护理措施及日本血吸虫的生活史 教学难点：日本血吸虫的发病机制及病理 教学内容： 一、引言 二、概述 血吸虫寄生在人体的血管内而得名；它引起的疾病为血吸虫病，俗称“大肚子病。是WHO规定的“六大热带病”之一，我国“五大寄生虫病”之一。 （一）危害 1.分布广： ★WHO 1990年统计，全球76国流行血吸虫病，2亿患者，5-6亿人口受威协； ★我国长江中下游及江南12个省市流行，现有150多万患者，30多万病人 2.后果严重： ★解放前，由于得了血吸虫病没有药物治疗，人们曾唱着这样的民谣：“得病如进鬼门关，十个就要死九个”。 ★解放后，83-86年间，洞庭湖边一个83户人家的农场，由于血吸虫病流行，最后只剩下了27个寡妇，4个光棍和88个孤儿。这样就造成了“千里粮田无人种：的惨象！ （二）分类 血吸虫属扁形动物门，吸虫纲；寄生于人体的有以下6种： 埃及血吸虫（Schistosoma haematobium） 1851 曼氏血吸虫（Schistosoma mansoni） 1902 日本血吸虫（Schistosoma japonicum） 1903 间插血吸虫（Schistosoma intercalatum）1934 湄公血吸虫（Schistosoma mekongi） 195x,1978 其中日本血吸虫对人类危害最大，我国仅有日本血吸虫流行 第 1 页

日本血吸虫病是日本血吸虫寄生于门静脉系统所引起的寄生虫病，主要病变为虫卵沉积于结肠、肝脏等组织而引起的肉芽肿。急性期以发热、肝大与压痛、腹泻或脓血便为特征；慢性期以肝脾肿大为主；晚期以门静脉周围纤维化病变为主，可发展为门脉高压症，巨脾与腹水。 三、病原学 （一）形态（两个例外） 1.成虫：雌雄异体 ♂：长12-20mm，乳白色，有抱雌沟，外形圆筒状；椭圆形睾丸7个，单行排列 ♀：长20-25mm，黑褐色，形似线虫；长椭圆形卵巢位于虫提体中部，子宫开口于腹吸盘下方，内含虫卵50-300个 ◇雌雄合抱后发育良好（性信息素，营养联系） ◇消化系统有口、食道和肠支，成虫摄食血液，肠管内充满消化的Hb * 2.虫卵： ◇大小 67×89um,（中偏大） ◇颜色淡黄色 ◇形状椭圆形 ◇结构卵壳厚薄均匀，无卵盖，有侧刺内含毛蚴（毛蚴分泌的SEA集中于毛蚴与卵黄膜之间，油滴状，可通过卵壳微孔释出） 3.毛蚴： ◇ 99×35um大小，梨形，灰白色，半透明，全身布满纤毛 ◇具有向光性和向上性，在水中作直线运动（毛蚴孵化） ◇借助顶突和腺细胞的分秘作用，主动钻入钉螺体内 4.尾蚴： ◇尾部分尾干和尾叉；体表布满体棘； ◇有口、腹吸盘，腹吸盘位于体后1/3处，有较强的吸力； ◇后部有5对单细胞钻腺，开口于顶端 第 2页

【工作方案】血吸虫病传染源控制工作方案

血吸虫病传染源控制工作方案 为了认真贯彻实施《血吸虫病防治条例》，根据全国预防控制血吸虫病中长期规划纲要（XX-2015）和上级血防会议精神，认真抓好以控制传染源为主的血吸虫病综合治理工作，保护血防区群众身体健康，构建和谐社会，促进社会主义新农村建设，促进区域经济社会的协调发展，结合我区血吸虫病流行特点，确保我区血吸虫病防治工作目标顺利实现――20xx年达血吸虫病传播控制标准，特制定本方案。 一、指导思想 以科学发展观和党的十七大精神为指导，认真贯彻落实《血吸虫病防治条例》以及党中央、国务院和省委、省政府关于血防工作的一系列方针、政策，坚持“预防为主，标本兼治，综合治理，群防群控，联防联控”的工作方针，坚持防治血吸虫病与建设社会主义新农村、构建和谐社会相结合，以控制传染源为重点，落实综合治理、科学防治的策略，进一步加强组织领导，强化部门责任，加强健康教育，切实提高广大人民群众自我防护意识和能力；加强与农业、水利、林业工程结合，改善自然环境，切实压缩钉螺面积；加强人畜查病治病和粪便管理，切实控制传染源；加强群众性血防工作，切实建立群防群控工作机制；加强区域性防治工作，切实建立联防联控工作机制；加大防治投入力度，切实减轻血吸虫病危害，有效控制血吸虫病流行。 二、防治目标 1、降低人畜血吸虫病感染率。到20xx年底，全区所有疫区村的人畜血吸虫病阳性率降至1%以下，无急性病例发生。力争达到传播控制标准。 2、普及农村自来水和无害化厕所。到20xx年底，全区所有疫区村自来水普及率达到90%，农村沼气式或三格式无害化厕所普及率达到90%。

3、提高防治知识普及率，增强防病意识。到20xx年底，全区中小学生和家庭主妇血防知识知晓率和正确行为形成率分别达到95%和90%以上。 4、加大人畜传染源管理力度。对人畜感染率1%以上的疫区村人畜进行查治病和扩大化疗、建安全牧场，实施以机代牛、封洲禁牧、家畜圈养、扩禽压畜等血防项目工程。到20xx年底，全区所有疫区村的家畜圈养普及率力争达到100%。 三、实施范围 实施范围为河市镇、黄金乡、凤凰乡、琴棋乡、营田镇和天问街道办事处6个疫区乡镇，共涉及70个行政村（社区）。 四、工作任务及分工 1、人畜血吸虫病查治。 工作任务：计划人群血检查病37828人次、粪检查病3307人次、治疗及化疗43490人次；牛畜查病26424头次，治疗及化疗28668头次。 责任单位：疫区乡镇政府、区血防办、畜牧局。 工作要求：根据国家血吸虫病查治病技术规范，市血防、畜牧部门要同步实施人畜查治病及化疗工作，对查出的病人、病畜建档建卡，健全数据库，实行动态管理。要及时调整疫区村类型，加大对人畜查治病及化疗力度，使人畜感染率明显下降。 工作指标：每年以村为单位人畜查病覆盖率达100%；目标人畜查病覆盖率达90%以上，目标人畜化疗覆盖率达95%以上。 2010－20xx年人、畜查治病规划进度表

血吸虫病题库及答案

血吸虫病题库及答案 试题 一、判断题（判断为正确的请将答题卡上相应题号的“A”涂黑，判断为错误的请将相应题号的“B”涂黑） 1. 吡喹酮是当前治疗血吸虫病的首选药物，对移行期童虫也有明显的杀灭效果。（） 2. 急性血吸虫病的现场处置中不需要对病人、病畜的粪便进行灭卵处理。（） 3. 日本血吸虫病是一种人畜共患的疾病，除人外，尚有40余种哺乳动物可感染血吸虫。（） 4. 有疫水接触史，出现发热、肝脏肿大及周围血液嗜酸性粒细胞增多为主要特征的病人即可定义为急性血吸虫病病例。（） 5. 日本血吸虫尾蚴多分布于水体表面。（） 6. 为了加快加藤片透明速度，在冬季温度较低时，可将加藤片放置于下照射以提高温度。（） 7. 粪便管理的目的是通过无害化处理人畜粪便，杀灭血吸虫虫卵，控制血吸虫病传播。（） 8. 灭螺前活螺平均密度和灭螺后活螺平均密度指标可用来考核灭螺效果。（） 9. 间接红细胞凝集试验（IHA）中使用过的微量板可以浸泡于酸性溶液中，然后用毛刷洗涤，晾干后继续使用。（） 10. 血吸虫病四类流行村要求每3年对有钉螺分布的村民组和有疫水接触史的常住居民（6-65岁）用血清学方法查病1次，受检率达90%以上。血清学阳性者即给予1次化疗。（） 11. 防止钉螺扩散不是目前血吸虫病防治中的重点和难点。（） 12. 人接触疫水的次数愈多，接触时间愈久，暴露的面积愈大，则感染血吸虫的机会愈多，感染的程度愈重。（） 13. 血吸虫病和钉螺的地理分布均有严格的地方性，两者分布基本一致。（） 14. 血吸虫病传播途径的3个重要环节分别为：含虫卵的粪便污染水体、水中存在钉螺和人畜接触疫水。（） 15. 我国血吸虫病流行区类型包括：湖沼型、平原水网型和山区丘陵型。（） 16. 日本血吸虫生活史中对人体危害最大的致病阶段为成虫阶段。（） 17. 日本血吸虫的发育阶段分别是：成虫、虫卵、毛蚴、母胞蚴、子胞蚴、尾蚴、童虫。（） 18. 我国2006年颁布的《血吸虫病防治条例》中规定的血吸虫病防治工作原则是：坚持防治结合、分类管理、综合治理、联防联控，人与家畜同步防治。（） 19. 流行病学三间分布包括：时间、地点和人群。（） 20. 日本血吸虫属于雌雄同体吸虫。（） 21. 日本血吸虫的生殖方式为有性生殖。（） 22. 日本血吸虫的保虫宿主主要是钉螺。（） 23. 日本血吸虫尾蚴逸出的最适宜温度围为20℃～35℃。（） 24. 日本血吸虫进入人体以后的移行途径为：皮肤、小静脉或淋巴管、右心、肺、左心、主动脉、门静脉、肠系膜静脉。（） 25. 历史上，我国血吸虫病疫情最为严重的流行区为平原水网型。（） 26. 含有日本血吸虫尾蚴的水被称为疫水。（） 27. 日本血吸虫在人体常见的异位损害部位为肝和肠壁。（） 28. 50%以上晚期血吸虫病患者的死亡原因是上消化道出血。（） 29. 急性期血吸虫病患者，排便多为果酱样便。（） 30. 日本血吸虫成虫在人体的寄生部位为门脉－肠系膜动脉系统。（）

血吸虫病防治知识(二)

血吸虫病防治知识(二)

鸭畈教学点血吸虫病防治知识教育 人得了血吸虫病，会严重损害身体健康，造成劳动力下降，影响生产；急性或慢性病人若不及时治疗或治疗不彻底，血吸虫在人体内不断产卵，放出毒素，使肝脏、脾脏受到损害，发展到晚期可危急生命；妇女得了此病，严重的会影响生育，造成家庭不幸；儿童患了这种病，影响生长发育，严重的成为矮小人“侏儒症”。 耕牛患了血吸虫病，表现为消瘦，役力下降，严重的粪便带血、带粘液，粪稀如水，最后衰弱虚脱而死亡。 一、血吸虫病是怎样传播的？ 血吸虫寄生在人或哺乳动物体内的肠系膜静脉和肝脏附近的门静脉血管内。成虫产出的虫卵一部分随血流进肝脏、造成肝损害，另一部分虫卵随粪便排出体外，在水中孵出毛蚴，毛蚴钻入钉螺体内发育成尾蚴；尾蚴从钉螺体内逸至水中，遇到人畜仅需10秒钟即可经皮肤钻入人体内发育成虫。如此循环，即造成血吸虫病的传播与流行。 二、人体感染血吸虫病有哪些主要方式和途径？ 不论男、女、老、幼，也不论何种民族与性别，只要接触含有尾蚴的疫水，就有感染血吸虫病的可能。 感染血吸虫病的方式主要有两类：一是生产性接触疫水感染。如水田作业、打湖草、放牧、防汛、抗洪抢险、测量、勘测、施工，以

及捕鱼捞虾等在疫水中作业；二是生活性接触疫水感染，如游泳戏水、淘米洗菜、洗衣物及饮用疫水等。 尾蚴侵入人体的主要途径是皮肤。接触疫水机会越多，暴露在疫水中的时间越长，感染的机会越大。 三、什么季节最容易感染血吸虫病？ 感染血吸虫病主要是3~11月，而以7~9月发生感染的机会最多，尾蚴感染的最适温度为15~30℃。一条尾蚴夏季存活3天，冬季可存活一周。这一时期气温高，雨水多，钉螺（血吸虫的唯一中间宿主）最活跃，逸放出来的尾蚴多、活动力强，此阶段人畜因生产、生活接触疫水的机会也多，容易感染。 四、怎样预防血吸虫病感染？ 只要做好集体和个人防护工作和注意饮用水安全，就能有效地预防血吸虫病的感染。主要措施有： 1、集体防护措施 ①、改造自然环境 疫区生产场所易积水和要涉水的低洼滩地，应事先开沟沥水，平整坑洼，修整道路，搭桥设渡，避免不必要的涉水。在江河湖草滩上搭建工棚住宿时，应选择地势高的地方，铲光住地周围的杂草，灭光钉螺。 ②、改革生产工具和改进操作方法

噬菌体抗体库筛选操作流程tomlinsonij

the Libraries General Introduction to Over the past 10 years Greg Winter’s lab at the MRC Laboratory of Molecular Biology and the MRC Centre for Protein Engineering (Cambridge, UK) has created a number of artificial libraries of antibodies that can be used to derive binders to almost any target molecule using phage display and selection. These binders can be used for all the same applications as conventional monoclonal antibodies (ELISA, Western blotting, FACS, immunohistochemistry etc) but can be isolated in a fraction of the time and without the need for animal immunisation. To date these so called “na?ve” or “single pot” phage-antibody libraries have been used successfully in hundreds of molecular biology labs world-wide to derive highly specific antibody reagents to a wide range of different proteins, peptides or small molecule compounds. The latest libraries (Tomlinson I and J) that are being distributed by the MRC HGMP Resource Centre each comprise over 100 million different scFv fragments cloned in an ampicillin resistant phagemid vector and transformed into TG1 E. Coli cells (scFv fragments comprise a single polypeptide with the VH and VL domains attached to one another by a flexible Glycine-Serine linker). By carefully following the protocol provided, large numbers of phagemids can be produced and used to select specific binders to target molecules that are attached to the surface of a tube or biotinylated and captured by streptavidin coated beads (so called “panning”). After each round of panning, the non-binders are washed away and the phagemids bound to the target molecule/s are eluted and amplified by infection into fresh TG1 cells. After producing new phagemids from the previous round of panning, the process can be repeated. Typically two or three rounds of panning are required to ensure that more than half the different scFvs in the selected population bind to the target molecule. The monoclonal scFvs can then be screened for binding (using a simple ELISA based protocol) and then used for further analysis of the target molecule. Since all the functional scFvs in the Tomlinson I and J libraries bind Proteins A and L, either of these secondary reagents can be used for detection, purification or immobilisation. Alternatively, secondary reagents that bind the attached myc or HIS6 tags can be used, although in our experience it is better to use the Protein A or L reagents. Finally, we would like to emphasise that these libraries represent a valuable resource. Whether you are familiar with phage display or not we recommend that you perform test selections and subsequent ELISA screening using the anti-bovine serum albumin and anti-bovine ubiquitin controls provided. Only when these experiments have been successfully carried out should you defrost the libraries and start preparing library phage.

血吸虫病防治知识宣传

血吸虫病防治知识宣传 血吸虫病是世界上对人类危害严重的寄生虫病之一，全世界流行区人口约有6亿，其中约有2亿人受到感染，1.2亿感染者有症状，2000万患者有严重后果，每年大约有2万人死于血吸虫病，病例的80%和大多数严重感染病人集中在非洲撒哈拉以南地区。在我国流行的是日本血吸虫病，主要分布在长江流域及其以南地区，江、浙、皖、赣、闽、沪、两湖、两广、云、川等12个省、区、市，其中上海、广东、福建、广西、浙江已消灭了血吸虫病，血吸虫病流行时间长，约有2100年左右。 1.什么是血吸虫病 血吸虫病俗称“大肚子病”，是由于人或牛、羊、猪等哺乳动物感染了血吸虫所引起的一种传染病和寄生虫病。 2.哪些活动会感染血吸虫病 一般在3—11月份，只要接触含有尾蚴的水体———疫水，就可能感染血吸虫病，如插秧割谷、防汛抢险、捕鱼捞虾、游泳嬉水、洗衣洗菜等。接触疫水的次数越多，感染的机会也就越大。 3.血吸虫病是怎样传播的 血吸虫寄生在人和哺乳动物体内。成虫产出的虫卵随粪便排出体外，在水中孵出毛蚴；毛蚴钻入钉螺体内发育成尾蚴；尾蚴离开钉螺游入水中，遇到人畜即经皮肤（粘膜）钻入体内发育为成虫。如此循环反复，即造成血吸虫病的传播和流行。 4.预防措施 （一）控制传染源普查与普治病人及病牛。 （二）切断传播途径 1．查螺、灭螺是切断传播途径的关键。灭螺应结合农田基本建设、兴修水利，彻底改变钉螺孳生和分布的环境。因地制宜采用物理方法和化学药物灭螺。 2．粪便管理防止人畜粪便污染水源，严格做到无害化处理，严格实行粪管制度及有螺地带禁牧。 3．水源管理保护水源，改善用水，做到饮用水无害化处理。 （三）保护易感人群不接触疫水，雨后与早晨不要在河边草地赤足行走。必须与疫水接触时，应确实做好个人防护措施。 5.怎样知道自己得了血吸虫病？ 凡是生活在血吸虫病流行区或到过疫区的人，如果接触过疫水，都有感染血吸虫的可能。当出现皮疹、发热、腹痛、腹泻、乏力、肝脏不适等症状时，就应该提高警惕。但也有较多的血吸虫感染者不出现或不立即出现上述症状。当你怀疑自己感染了血吸虫时，就应该立即到血吸虫病防治所检查。 检查血吸虫病的方法很多，常用的有粪便检查、血液化验和直肠活组织检查等方法。目前，B超技术常与粪便检查和免疫诊断结合使用，用以检查肝脾有无肿大，是否有血吸虫病肝硬化的声像特征以及肝硬化的程度，以判定病情。 6.患血吸虫病后要及时治疗 患了血吸虫病不能麻痹大意，要及时到当地血吸虫病防治站进行治疗，治疗药品为吡喹酮。由于吡喹酮对人体有一定的毒副作用，所以在使用吡喹酮治疗前，需对心、肝、肾功能等进行检查，对肝脏等实施保护治疗，若有其它杂症的，还要对症治疗控制病情，以确保使用吡喹酮治疗血吸虫病的安全。

应用噬菌体抗体库技术制备抗体

应用噬菌体抗体库技术制备抗体 摘要：噬茵体抗体库技术是利用PCR扩增出抗体的全套可变区基因，将抗体分子DNA片断如Fab或单链抗体(scFv)与噬茼体外壳蛋白基因PⅢ或PVI]I连接，使融合蛋白表达于噬茵体颗粒的表面，经过“吸附一洗脱一扩增”过程富集筛选特异性抗体.。这一技术将抗体基因型和表型联系在一起，使识剐抗原的能力和噬茵体的可扩增性统一起来，较好的模拟了体内的抗体产生的过程，成为一种高效的筛选体系。噬菌体抗体库是近年发展起来的一项分子生物学新技术。构建容量大、特异性高和敏感性强的人源性抗体是此项技术的核心，也是其远大前景的基础.本文就噬茵体抗体库技术的原理、构建、筛选做一综述。 关键词：噬茵体抗体库技术；抗体库；噬茵体 噬菌体抗体库技术(phage display antibody li—brary techniques)是指用聚合酶链反应(polymerasechain reaction，PCR)扩增抗体的全套可变区基因，通过噬菌体表面展示技术，把Fab段或单链抗体(ScFv)表达在噬菌体的表面，经过“吸附一洗脱一扩增”过程筛选并富集特异性抗体。20世纪80年代中期，Smith 在前人对丝状噬菌体分子生物学研究的基础上首先提出了噬菌体展示技术。由于该技术具有生产人抗体的潜力，因此，吸引了许多学者投入这一研究中，使得噬菌体抗体库技术得以迅速发展，并由此开创了一条简便、快速的基因工程抗体生产路线. 1 噬菌体抗体库技术的基本原理 噬菌体抗体库技术的原理是将抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因与噬菌体的外壳蛋白Ill(PIl1)或外壳蛋白Ⅷ(PⅧ)基因随机重组，继而感染大肠杆菌，经增殖并在噬菌体表面以抗体片段Fab或ScFv一外壳蛋白融合蛋白的形式表达。这种噬菌体颗粒可以特异识别抗原，又能感染宿主菌进行再扩增，经过“吸附一洗脱一扩增”过程就能筛选并富集特异性抗体。所构建的抗体库称为全套抗体库，从中筛选到的抗体称为噬菌体抗体。它的最大特点是实现了直接将基因型

抗体库筛选技术介绍

抗体库筛选技术介绍 导读 自从噬菌体展示技术于1985年创立以来，细胞生物学、免疫学、蛋白质工程以及医药行业等领域深受影响。它从根本上了改变了传统的单抗制备流程（杂交瘤技间接术），宣告在体外改良抗体的特异性以及进行亲和力成熟。随着该技术的不断发展，继而出现了核糖体展示、mRNA展示、细菌展示和酵母展示等多种展示技术。这篇文章主要以噬菌体展示抗体库为例，来介绍抗体库的筛选技术。 抗体库的筛选是指从抗体库中筛选出针对某一抗原的特异性抗体，是获得高亲和力抗体过程中的关键环节。 那什么是抗体库呢？通过PCR和DNA重组技术克隆人类或者动物体内全套抗体可变区基因（关于抗体的具体结构详见抗体的基本结构），并通过展示技术进行表达，得到的全套抗体基因表达文库即为抗体库。 图1、抗体库克隆的抗体基因片段（SCFV）

图2、噬菌体展示抗体库构建流程 由于单抗性质的千差万别，抗体库的筛选需要根据不同的单抗制定严格的筛选条件，优化筛选方法，因此抗体库的筛选技术一直处于发展和改进的状态，根据出现时间的先后，主要分为经典筛选法和新型筛选法。 1、经典筛选法 经典筛选法主要包括固相筛选法和液相筛选法，适合针对性质明确并且可纯化的抗原进行抗体筛选。 固相筛选法是通过包被在酶标板或者免疫试管等固相介质上的抗原富集高亲和性的噬菌体；液相筛选法是将生物素化的抗原包被在与亲和素偶联的磁珠或琼脂糖上，通过磁珠富集能与抗原特异性结合的噬菌体抗体，再通过洗涤、洗脱、回收等步骤。如此反复筛选数次，可得到高亲和性的噬菌体。这两种方法可通过添加脱脂牛奶或者BSA来减少非特异性结合。

2、新型筛选法 对于抗原无法提纯或者性质不明确的情况（如癌细胞表面受体），或者经典筛选过程可能造成抗原失活的情况，需要开发新的筛选方法。目前的新型筛选法主要有细胞筛选法、组织切片或体内筛选法、选择感染筛选法和蛋白质芯片筛选法等。 细胞筛选法： 细胞筛选能维持抗原和抗体的天然构象，因此在对肿瘤细胞筛选方面应用较多，该技术还适合于细胞表面受体筛选和抗原鉴定等。但是细胞筛选存在一定的难度，由于细胞膜表面成分复杂，增加了非特异性的结合，筛选的轮次过多又容易丢失特异性结合的抗体。为了减少非特异性结合，细胞筛选法发展出了扣除筛选、竞争筛选和内化筛选等方法。 扣除筛选是通过将抗原阴性细胞在筛选前或筛选后与抗体库结合，从而起到减少非特异性结合。 内化筛选的原理是一些与细胞表面抗原结合的抗体会进入细胞内，因此可以通过细胞的内化来进行抗体筛选。具体操作是先用抗原阴性细胞对待筛抗体库进行扣除筛选，再将抗体库与抗原阳性细胞一起孵育，洗去细胞膜表面结合的抗体，裂解细胞获得细胞内的特异性结合抗体，随后进行扩增与下一轮筛选。 竞争筛选是将过量阴性和阳性抗原同抗体库一起孵育，而针对阳性细胞的回收方法的不同，竞争筛选又分为荧光激活细胞分离法（fluorescently-actiscvated cell sorting, FACS）和免疫磁性细胞分离法（immolunomagnetic cell separation methods）。FACS法是将能待筛抗体标记上荧光素，洗涤，再通过流式细胞仪进行分选。