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油菜种子高质量总RNA提取的一种有效方法_丁勇

油菜种子高质量总RNA提取的一种有效方法_丁勇
油菜种子高质量总RNA提取的一种有效方法_丁勇

收稿日期:2005O 12O 28

*国家自然科学基金项目(30170600)和湖北省自然科学基金项目(2001ABD113)资助**通讯作者E O mail:ganli@https://www.wendangku.net/doc/fe8045660.html,

丁勇,男,1979年生,华中农业大学植物科技学院硕士研究生,武汉430070

文章编号1000O 2421(2006)05O 0465O 04

油菜种子高质量总RNA 提取的一种有效方法

*

勇1)刘英2)杨鸯鸯1)甘莉1)**

(1)华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室,武汉430070;2)

东北林业大学森林植物生态学教育部重点实验室,哈尔滨150040)

摘要 设计了1种从油菜种子中分离高质量总RN A 的方法,有效的排除了种子中富含的多酚、多糖和蛋白质等杂质的污染。分离的总RN A 经甲醛变性凝胶电泳和紫外光检测,可见28S 和18S rRN A 的2条清晰的带型,完整无降解,其A 260/A280在1.8~2.0之间。研究结果证明,利用本方法提取的油菜种子总R NA 具有很高的质量和纯度,且得率高,完全能满足后续的RT O PCR 、全长基因的克隆和No rthern blo tting 分析等分子生物学研究。

关键词

油菜种子;R NA 提取;多酚;多糖;方法

中图法分类号 S 565.403.53 文献标识码 A

分子生物学研究是科学研究中很普遍的一种手段。在分子生物学研究中,RNA 一直是其研究的主要内容之一。植物组织RN A 的提取是进行植物分

子生物学方面研究的必要前提。要进行RT O PCR 、cDNA 合成、RNA 序列分析、Northern 印迹杂交、狭线杂交、引物延伸、纯化mRNA 以用于蛋白质体外翻译或构建cDNA 文库,以及新近热门的用m R -NA 差异显示技术筛选感兴趣的相关基因等分子生物学研究,均需要有高质量、高纯度、完整性好的RNA 。可以说,分子生物学研究后续工作的进展及成效在很大程度上取决于RNA 的质量。所以,如何提高RNA 纯度和经济而快捷地获得足够量的RNA 是当前研究人员十分关注的问题。

油菜种子属脂肪质种子,含有大量的脂质、蛋白质、多糖、矿物质、维生素、色素、植物固醇、酶类及多酚和植酸等。由于酚类化合物的存在,RNA 提取过程中极易产生褐化效应(brow ning effect)

[1]

,氧化

的酚类化合物(如醌类)可以与RNA 不可逆地结合,导致RNA 的降解及RNA 活性的丧失[2],或形成不溶性复合物

[3]

。多糖能与RNA 共沉淀形成难

溶的胶状物[4],还可以抑制许多酶的活性[5]。目前广泛应用的T RIzol Reag ent Kit 、异硫氰酸胍一步

法,以及已报道的植物组织总RNA 提取的方法[6~10]都不适用于油菜种子。所以,如何从油菜种子中有效地提取出高质量的RNA,一直困扰着从事

油菜种子分子生物学研究的人们。笔者通过试验探索,提出了一种从油菜种子中有效地提取高质量RNA 的方法。

1 材料与方法

1.1 试验材料

油菜(甘蓝型和白菜型)播种于华中农业大学实验基地。待油菜开花后(DAF)40d,用液氮取其角果,剥出籽粒,-70e 保存。1.2 试验用品

离心管、枪头等聚乙烯塑胶制品用DEPC 水浸泡处理;研钵、研杵和玻璃制品均在180e 烘烤8h 以上,进行无RNA 酶处理。1.3 试验试剂

①0.5j DEPC H 2O;②RNA 提取缓冲液0.1mol/L Tris O H Cl (pH 8.0),0.05mo l/L

EDTA

(pH 8.0),2%CTAB (W /V ),2%PVP (W /V ),2mol/L NaCl,3%B O M E(V /V )(B O M E 在使用前加入,65e 温育30min 后使用);③4mol/L LiCl ;

第25卷第5期2006年 10月华 中 农 业 大 学 学 报Journal o f Huazho ng A gr icultural U niver sity Vo l.25 No.5Oct.2006,465~468

④3mo l/L NaAc(pH 5.2);⑤70%乙醇;⑥无水乙醇;⑦氯仿B 异戊醇(24B 1)

①②③④⑤均用DEPC 水配制,且①②③④均需高压灭菌。1.4 总R NA 提取方法

①取0.8g 油菜籽粒于研钵中,加液氮研磨,粉末装入10mL 离心管中,按1B 5(W /V )的比例加入65e 预热的提取液4m L,盖紧管口,涡旋2min 使充分混匀,然后65e 温育30m in 。

②同一离心管中加入等提取液体积(4m L)的氯仿B 异戊醇(24B 1),涡旋混匀,于4e 12000r/min 离心10min 。可见分3层,小心吸取中间层清液于另一新的10mL 离心管中。

③加入等提取液体积(4mL)的氯仿B 异戊醇(24B 1),涡旋混匀,于4e 12000r/min 离心10min 。小心吸取上清液于另一新的10mL 离心管中。

④加入1/4倍提取液体积(125L L)的4mol/L LiCl,混匀,放置-20e 4~5h 。

⑤取出离心管,于4e 12000r/min 离心10min,弃上清,沉淀溶于1.35mL DEPC 处理的无菌水中,加入150L L 3m ol/L pH 5.2N aAc,(终浓度为0.3mol/L ),混匀。再加入2.5倍体积(3.75mL)预冷的无水乙醇,混匀,于-70e 放置30min 。

⑥4e 12000r/min 离心20min,弃上清,沉淀即为RNA,用等提取液体积(4mL)预冷的70%乙醇清洗。

⑦4e 10000r/min 离心15min,弃上清,含有沉淀RNA 的离心管于超净工作台中干燥,变透明即可。

⑧RNA 溶于一定量(100L L)DEPC 处理的无RNase 水中,放置-70e 备用。1.5 总R NA 纯度及完整性检测

1)分光光度法测定。取5L L 总RNA,用DEPC 处理的无菌水稀释100倍,加入到狭缝比色皿中,采用Pharmacia Bio tech GeneQuant ⅡO 紫外分光光度计测定总RNA 的含量及纯度。

2)1.2%琼脂糖甲醛变性凝胶电泳检测。紫外成像系统下观察总RNA 的谱带,检验总RNA 的完整性。

1.6 cDN A 合成检测R N A 的R T 活性

cDNA 第一链和第二链的合成参照SM ART

TM

PCR cDNA Synthesis Kit U ser M anual 方法进

行。

2 结果与分析

2.1 总R NA 质量分析

RNA 的纯度和完整性是分子生物实验成功的关键性因素。利用本方法分离得到的总RNA 经紫外分光光度计测定A260/A280nm 比值,甘蓝型为1.878,白菜型为1.858,处于1.8~2.0之间;1.2%变性琼脂糖凝胶电泳结果(如图1)显示出28S rRNA 和18S rRNA 2条完整的带型,且前者的亮度约为后者的2倍。试验结果表明得到的总RNA 既未发生降解,又没有DNA 、蛋白质、酚和多糖等杂质污染,质量和纯度较高。

图1 总R N A 甲醛变性凝胶电泳Fig.1 Quality checking of total RN A i n 1.2%denatur alizati on form aldehyde agarose gel

1:甘蓝型RNA from Br assica nap us s eeds;2:白菜型RNA from Br assica ca mp e stris s eed s

2.2 总R NA 得率分析

本试验从0.8g 样品中分离的总RNA 溶解在100L L DEPC 处理的无RNase 水中,采用GeneQuant ⅡO 紫外分光光度计测定总RNA 的浓度,甘蓝型为7.497L g /L L,白菜型为7.700L g/L L;得率分别为0.937mg /g (RNA/样品)和0.963m g/g (RNA/样品),明显高于采用其它RNA 提取方法所得到的RN A 得率(数据略)。说明此方

466 华中农业大学学报第25卷

图2双链cDN A合成产物电泳

F i g.2Quality checking of doubl e

strands cD NA in1.2%agarose gel

M:1kb plu s DNA ladder;

1:甘蓝型RNA from Br assica nap us s eeds;

2:白菜型RNA from Br assica ca mp e stris s eed s

法能够得到很高的RNA得率,接近于1mg/g (RNA/样品)。

2.3双链cDNA合成分析

将合成双链的总RNA控制在2L g左右,经反转录合成出的cDNA是大小在300bp~5kb左右的弥散带(如图2)。双链cDNA的合成保证了基因结构的真实性,不会因为cDNA的截短而丧失酶切位点;同时也反映提取的总RNA保持了完整性,无降解,完全适合后续的分子生物学实验。

3讨论

不同于其它植物材料,油菜种子有其特殊的结构和组成,含有大量的脂质、蛋白质、多糖和酚类化合物等成分,干扰RNA的抽提。作者利用TRIzol Reag ent Kit、异硫氰酸胍一步法等RNA提取方法抽提油菜种子总RNA时,极易产生褐化现象,且无法将被氧化的酚类化合物、多糖和蛋白质等杂质与RNA分开;获得的沉淀呈现胶状或黏稠状,无法干燥,更不易溶解。笔者就此摸索了一种有效地从油菜种子中提取高质量RNA的方法。

抑制内源和外源RNA酶的活性,防止RNA的降解是RNA抽提过程中最重要的策略之一。外源RNA酶可以通过DEPC水处理和高温灭菌等实验室常规方法来排除,关键是内源RNA酶的抑制。RNA酶活性的发挥常常需要二价金属离子的参与,而EDTA可以螯合二价金属离子,所以利用0.05 mol/L EDT A来抑制内源RNA酶的活性。提取缓冲液为偏碱性(pH8.0),也可以部分抑制RNase的活性[11]。

十六烷基三甲基溴化铵(CT AB)是一种阳离子去污剂,在高离子强度的溶液中,CT AB与多糖和蛋白质形成复合物而沉淀下来,而核酸仍然留在溶液中[12]。高浓度的NaCl也有助于去除多糖[5,13,14]。所以RNA提取缓冲液采用在2mo l/L NaCl存在条件下,加入2%CTA B来结合并沉淀多糖和蛋白质,既排除了多糖对RNA的干扰,又抑制了内源RNase的活性。

RNA提取缓冲液中加入2%PVP和3%B O ME可有效地抑制褐化效应。螯合剂聚乙烯吡咯烷酮(PVP)中的O CO O N=基团与多酚化合物结合[15],巯基还原剂B O巯基乙醇(B O M E)可防止酚类物质被氧化[16]。与CT AB结合的多糖和蛋白质、与PVP 结合的多酚通过离心以及氯仿B异戊醇抽提后离心去除。抽提过程中用沉淀型变性剂氯仿而不用苯酚,既可以除去蛋白质又避免了苯酚对RNA的破坏。

LiCl可以选择性地沉淀RNA[12]。小分子RNA(如tRNA及5S rRNA)和DNA在高离子强度下是可容的,而大分子RNA(如rRNA和m R-NA)则不溶。该方法利用了这个差异在高浓度LiCl(0.8mol/L)中沉淀大分子RNA。所以在RNA电泳图(图1)中只显示出28S rRNA和18S rRNA2条带型。应用LiCl来沉淀RNA还可以将未被氧化的酚类化合物、残留的多糖留在溶液中。LiCl在乙醇溶液中的溶解度很高,而且不随核酸共沉淀,可以在后面步骤中除去残留的LiCl。另外, RNA在0.3mol/L的N aAc(pH 5.2)溶液中难溶[12],而DNA则易溶,从而通过离心有效地将DNA去除。

该RNA提取法所用的都是常规试剂,尽管时间比较长,但操作非常简单。提取的RNA A260nm/A280n m比值在1.8~2.0之间,电泳条带为完整的28S rRNA和18S rRNA,前者比后者亮,得率约高为1mg/g。我们利用提取的总RNA,设计

467

第5期丁勇等:油菜种子高质量总RN A提取的一种有效方法

简并引物,进行RT O PCR操作,得到1条分子量为486bp的基因cDNA片断(图略),克隆测序确定是油菜油脂沉积相关的蛋白基因Caleosin的一部分,并且利用RACE(Rapid Amplification of cDNA Eends)技术成功克隆该基因1058bp的全长cDNA 序列。利用获得的总RNA进行Northern Blotting 实验,获得了理想的杂交效果。表明经该方法所提取的RNA完全能满足后续的RT O PCR、全长基因的克隆和No rthern Blotting等分子操作的要求。

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An Efficient Method for Extraction of High Quality RNA from Rapeseeds

DIN G Yong1)LIU Ying2)YANG Yang O yang1)GAN Li1)

(1)National K ey Laboratory of Crop Genetic I mp rovement,

H uaz hong Agricultural University,Wuhan430070,China;

2)The K ey Laboratory of Forest Plant Ecology Ministry of Education,

Northeast Forestry University,H arbin150040,China)

A bstract A highly efficient method of ex tracting total RNA from rapeseed w as developed.Polyphenols, polysaccharides and protein,rich in rapeseed cells,could be removed effectively.Two clear bands of28S rRNA and18S rRNA isolated from rapeseeds could be detected by formaldehyde denaturalization agarose gel electro-phoresis.It was proved that RNA w as intact w ithout degradation.The ratio of A260/A280is1.8~2.0.The re-sults show ed that the RNA obtained from rapeseed w ith this method had high purity and quality and could be used in molecular biological research,like RT O PCR,full O length cDNA cloning and Northern blotting analysis d-i rectly.

Key w ords rapeseed;RNA isolation;polyphenols;polysaccharides;method

(责任编辑:杨锦莲) 468华中农业大学学报第25卷

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