基于PCRarray技术探讨脾虚_省略_谢通路相关基因mRNA表达的影响_程岩岩

激骨形成和骨吸收的双向作用在骨重建偶联过程中起了重要的作用［7］。

本实验研究结果显示，与模型组比较，固本活血壮骨颗粒各治疗组均可增强成骨细胞增殖因子TGF－β1表达，降低破骨细胞因子IL－1表达，促进骨形成，抑制骨吸收；促进肠道吸收，调节体内钙、磷代谢及微量元素的平衡，增强骨形成，从而提高大鼠骨密度含量，使骨质量有显著的提升，并表现出一定的量效关系，提示固本活血壮骨颗粒可以通过调节细胞因子TGF－β1、IL－1的表达，改善骨代谢，对糖尿病性骨质疏松症的预防和治疗发挥作用。

收稿日期：2016－03－21

作者简介：程岩岩（1980－），女，辽宁丹东人，主治医师，博士研究生，研究方向：中西医结合心脑血管病。

通讯作者：杨关林（1962－），男，主任医师，博士研究生导师，研究方向：中西医结合心脑血管病，E－mail：yangguanlin945@163．com。参考文献

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DOI?10．13192/j．issn．1000-1719．2016．05．058

基于PCＲarray技术探讨脾虚痰浊AS对心肌线粒体能量代谢通路相关基因mＲNA表达的影响

程岩岩1，2，贾连群1，宋囡1，马艺馨1，张妮1，吴瑾1，关乐2，杨关林1

（1.辽宁中医药大学，辽宁沈阳110847；2.辽宁中医药大学附属医院，辽宁沈阳110847）

摘要：目的：利用PCＲarray的技术检测脾虚痰浊动脉粥样硬化（AS）巴马小型猪心肌线粒体能量代谢信号通路相关基因mＲNA的表达。方法：普通级雄性巴马小型猪10只，随机分为正常组，脾虚痰浊AS组。脾虚痰浊AS组予饮食不节、劳倦过度结合高脂饲料饮食。使用全自动生化分析仪测定TC、TG、LDL－C水平，提取各组巴马小型猪心肌总ＲNA，应用线粒体能量代谢信号通路PCＲ芯片测定脾虚痰浊AS巴马小型猪线粒体能量代谢通路相关mＲNA表达。结果：各组巴马小型猪血脂的比较：模型组较正常组TC、TG、LDL－C水平明显升高；PCＲarray结果显示：模型组与正常组相比，下调的≥4倍基因有17个，占总基因数的20%，如：ATP5A1、ATP5L、ATP5F1、ATP4A、ATP6V1E2等；上调≥4倍的基因转录占基因总数的10%，为OXA1L、NDUFB8、NDUFB9、NDUFS2、NDUFS8，涉及氢离子转运，琥珀酸脱氢酶亚基，NDUF 脱氢酶亚基相关基因。结论：脾虚痰浊AS对心肌线粒体能量代谢的影响可能与涉及氢离子转运，琥珀酸脱氢酶亚基，NDUF脱氢酶亚基相关基因表达改变有关。

关键词：PCＲarray；脾虚；痰浊；线粒体

中图分类号：Ｒ255．8文献标志码：A文章编号：1000-1719（2016）05-1069-03

Based on PCＲArray Technology Investigating Effect of Spleen Phlegm Atherosclerosis

Ｒelated mＲNA Expression in Myocardial Mitochondrial Energy Metabolism Pathway

CHENG Yanyan1，2，JIA Lianqun1，SONG Nan1，MA Yixin1，ZHANG Ni1，WU Jin1，GUAN Le2，YANG Guanlin1（1．Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Shenyang110847，Liaoning，China；2．Affiliated

Hospital of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Shenyang110032，Liaoning，China）

Abstract：Objective：To observe mＲNA expression genes related to Bama－mini pigs'heart mitochondrial energy metabolism signaling pathway in spleen deficiency and phlegm turbidity AS by PCＲarray technology and explore the relationship between the expression of the gene of AS and spleen deficiency and phlegm turbidity．Methods：Ten male Bama－mini common grade pigs were randomly divided into control group，spleen deficiency and phlegm AS group．Spleen deficiency and phlegm AS group was given improper diet，overstrain combined with high fat diet．Automatic biochemical analyzer was used for determination of TC，TG，LDL －C．By Bama－mini pigs myocardial totalＲNA extraction and application of myocardial mitochondrial energy metabolism path-way PCＲchip，determine spleen deficiency and phlegm syndrome AS related mＲNA expression．Ｒesults：Comparison of Bama－

mini pig's blood fat：spleen deficiency and phlegm syndrome AS patients compared with normal control group，triglycerides，total cholesterol and low density lipoprotein levels increased significantly．PCＲarray results：model group's down－regulated larger than or equal to4times genes were17，accounting for20%of the total gene numbers，such as：ATP5a1，ATP5L，ATP5F1，ATP4A，ATP6V1E2．Those raised more than or equal to four times，accounting for10%of the total number of genes，as OXA1L，NDUFB8，NDUFB9，NDUFS2，NDUFS8，involving hydrogen ion transport and succinate dehydrogenase subunit，dehydrogenase，NDUF subunit related genes．Conclusion：The effect of hyperlipidemia on myocardial mitochondria may be possibly related to the changes of genes expressions which are related to the hydrogen ion transport，the succinate dehydrogenase subunit and the NDUF dehydrogenase subunit．

Keywords：PCＲarray；spleen deficiency：phlegm turbidity：lmitochondrial

在中医学中，尚无与动脉粥样硬化（atherosclero-sis，AS）的记载，但在“眩晕”“胸痹”“痰浊”“中风”“真心痛”等疾病的记载当中有类似的描述。高脂血症是AS的主要致病因素，其多由过食肥甘厚味，饮食不节，损伤脾胃，脾土失运，精微输布失常，聚湿为痰，阻滞气机，壅阻脉道加之肝肾亏虚，肝主疏泄功能不畅，脾之运化水谷功能失调，聚湿生痰，瘀阻内生，体内物质和能量的转化出现障碍，体内的营养物质堆积形成［1］。本研究拟用PCＲarray技术检测脾虚痰浊AS巴马小型猪心肌线粒体能量代谢通路相关mＲNA表达变化来探讨其与脾虚痰浊AS的关系。

1材料

1.1实验动物

健康广西巴马小猪购自泰州泰和生物科技有限公司，均为单笼饲养。达到国家实验动物二级标准，常规检查及接种疫苗达标。动物合格证号：SCXK（苏）2011－0002，伦理符合中华人民共和国卫生部动物实验管理条例（No.55，2001）和辽宁中医药大学实验动物管理条例规定。实验室温度为（20.80?2.97）?，湿度为（47.30?15.31）%。

1.2主要试剂及仪器

TC、TG、LDL－C、试剂盒（批号：0113011），购自四川迈新生物技术有限公司。

ＲT2First Strand kit（QIAGEN）；ＲT2SYBＲGreen ＲOX qPCＲkit（QIAGEN）；ＲT2ProfilerTM PCＲArray Pig Mitochondrial energy metabolism（QIAGEN，CAPS 13068A）；ＲNeasy Plus Mini kit（QIAGEN）；7500Ｒeal Time PCＲ仪（Applied Biosystems，美国）；全自动生化分析仪（日本东芝）。

2方法

2.1动物分组及标本采集

10只巴马小型猪随机分为正常组、脾虚痰浊AS 组。每组5只，正常组予基础饲料喂食，模型组予高脂喂养，跑步机跑步过劳［2］。各组日进食量均为巴马小型猪体重的3%，24h不限制饮水，每周称重巴马小型猪，以周进行调整饲料量。自由饮水。于48周后采集血样，分离血清，－20?保存。取巴马小型猪心肌组织。

2.2检测指标及方法

2.2.1血脂利用全自动生化分析仪测定小型猪血清中血脂甘油三酯、总胆固醇、低密度脂蛋白。

2.2.2PCＲarray方法检测巴马小型猪心肌线粒体能量代谢通路相关基因mＲNA的表达取100mg心肌组织液氮研磨后加入1mL裂解液，转移至1.5mL离心管中，加入1/5体积氯仿，震荡、静置、离心，吸取上层水相，加等量的异丙醇沉淀ＲNA，离心，缓慢加入预冷的75%乙醇洗涤，离心，空气风干后加入无ＲNA酶水溶解。紫外分光光度计测定260nm及280nm OD 值，计算ＲNA的浓度和纯度。取0.5μgＲNA用于ＲT －PCＲ，按照PCＲ芯片试剂盒说明操作。

3结果

3.1各组巴马小型猪血脂的比较

见表1、插页Ⅷ图1。脾虚痰浊AS组较正常对照组甘油三酯、总胆固醇、低密度脂蛋白水平明显升高（P＜0.01）。

3.2各组巴马小型猪心肌线粒体能量代谢通路相关基因mＲNA表达

模型组与正常组相比下调的≥4倍基因有17个，分别是：ATP5A1、ATP5L、ATP5F1、ATP4A、ATP6V1E2、ATP6V0A2、ATP6V1C2、ATP6V1G3、ATP6V0D2、ATP12A、BCS1L、SDHA、SDHB、LHPP、NDUFS1、SDHD、SLC25A15，占总基因数的20%。上调≥4倍的基因转录为DNAJB1、OXA1L、NDUFA6、NDUFB8、NDUFB9、NDUFS2、NDUFS8、PPA2、NNT，占基因总数的10%。

表1各组巴马小型猪血清血脂水平（mmol/L，珋x?s）

组别n TG TC LDL－C

正常组50.32?0.0638 3.06?0.79050.91?0.1069

模型组50.86?0.1228＊＊13.56?1.360＊＊ 6.42?1.3518＊＊

注：与正常组比较，＊＊P＜0.01。

4讨论

脾失健运是高脂血症、AS的病理基础。有学者从脾论治，通过益气健脾，运脾化湿等方法用于治疗高脂血症有明显的疗效［3－7］。本实验结果显示脾虚痰浊AS巴马小型猪TC、TG、LDL－C与正常组均升高，出现了明显的血脂异常。

脾主运化功能与线粒体的功能有关。线粒体利用氧化磷酸化和电子的传递获得能量从而合成ATP，也可以称为细胞能量的工厂，心肌线粒体是心肌细胞的呼吸器官，为心肌的收缩提供能量，线粒体能量代谢的功能可以为肌肉提供运动所需要的能量，减少乳酸的产生，因此线粒体的功能决定心肌细胞生理功能的状态。有报道指出，线粒体的功能障碍能够引起生物能量的衰竭，从而引起神经肌肉疾病［8］。

本实验研究结果显示模型组与正常组相比下调的≥4倍基因有17个，其中：与氢离子转运相关：ATP5A1、ATP5L、ATP5F1、ATP4A、ATP6V1E2、

ATP6V0A2、ATP6V1C2、ATP6V1G3、ATP6V0D2、ATP12A，琥珀酸脱氢酶亚基：SDHA、SDHB、SDHD，NDUF脱氢酶亚基：NDUFS1等占总基因数的20%。上调≥4倍的基因转录为NDUF脱氢酶亚基：NDU-FA6、NDUFB8、NDUFB9、NDUFS2、NDUFS8等占基因总数的10%。

表2PCＲarray模型组/正常组表达的变化

基因名基因序列基因描述变化倍数ATP4A NM_214291ATPase，H+/K+exchanging，alpha polypeptide－7.21 ATP5A1NM_001185142ATP synthase，H+transporting，mitochondrial F1complex，alpha subunit1，cardiac muscle－25.99 ATP5L NM_001244137ATP synthase，H+transporting，mitochondrial Fo complex，subunit G－4.11 ATP5F1XM_003355244ATP synthase，H+transporting，mitochondrial Fo complex，subunit B1－4.35 ATP6V1E2XM_003481223ATPase，H+transporting，lysosomal31kDa，V1subunit E2－21.86 ATP6V0A2XM_003359098ATPase，H+transporting，lysosomal V0subunit a2－5.00 ATP6V1C2XM_003125387ATPase，H+transporting，lysosomal42kDa，V1subunit C2－6.87 ATP6V1G3XM_003130597V－type proton ATPase subunit G3－like－5.06 ATP6V0D2XM_003125581ATPase，H+transporting，lysosomal38kDa，V0subunit d2－6.41 ATP12A XM_005653851ATPase，H+/K+transporting，nongastric，alpha polypeptide－5.15 BCS1L NM_001243676BCS1－like（S.cerevisiae）－15.67 SDHA XM_005659031Succinate dehydrogenase complex，subunit A，flavoprotein（Fp）－4.00 SDHB NM_001104953Succinate dehydrogenase complex，subunit B，iron sulfur（Ip）－5.06 LHPP NM_001243608Phospholysine phosphohistidine inorganic pyrophosphate phosphatase－5.98 NDUFS1XM_003133603NADH dehydrogenase（ubiquinone）Fe－S protein1，75kDa（NADH－coenzyme Q reductase）－4.82 SDHD NM_001097516Succinate dehydrogenase complex，subunit D，integral membrane protein－8.02 SLC25A15NM_001243910Solute carrier family25（mitochondrial carrier：ornithine transporter）member15－4.41 DNAJB1NM_001244430DnaJ（Hsp40）homolog，subfamily B，member17.46（LOC100154992）OXA1L XM_005666273Mitochondrial inner membrane protein OXA1L－like 6.54 NDUFA6NM_001185178NADH dehydrogenase（ubiquinone）1alpha subcomplex，6，14kDa7.46 NDUFB8NM_001144842NADH dehydrogenase（ubiquinone）1beta subcomplex，8，19kDa 4.29 NDUFB9XM_001927804NADH dehydrogenase（ubiquinone）1beta subcomplex，9，22kDa7.26 NDUFS2XM_005663166NADH dehydrogenase（ubiquinone）Fe－S protein2，49kDa（NADH－coenzyme Q reductase） 4.99 NDUFS8XM_003122434NADH dehydrogenase［ubiquinone］iron－sulfur protein8，mitochondrial－like 4.07 PPA2XM_003129276Inorganic pyrophosphatase2，mitochondrial－like9.32 NNT XM_003133930NAD（P）transhydrogenase，mitochondrial－like 6.82

ATP是生命活动的直接供能者，其多少可以反映线粒体的生成高能磷酸化合物的能力和氧化呼吸活性，也可以反映出细胞的能力储备状态［9］。线粒体ATP酶调节细胞的氧化磷酸化过程，催化ATP的合成，参与细胞各种生命活动。ATP酶在能量代谢中起到重要的作用，它活性必然影响线粒体的能量代谢。本实验结果在一定程度上提供了脾虚痰浊AS对巴马小型猪心肌线粒体ATP酶相关mＲNA表达变化的信息等，但是变化基因之间的相互影响和其他因素之间的关系还不明确，尚需进一步的研究和验证。

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