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Triton X-100细胞裂解液

简介：

Triton X-100细胞裂解液是一种经典的快速裂解细胞组织并获得蛋白的裂解液。所获得的蛋白质可以用于PAGE 电泳，Western ，免疫沉淀(Immunol Precipitation ，IP)和免疫共沉淀(co-IP)等。Triton X-100、NaCl 、Tris-HCl 等组成，并含有多种蛋白酶抑制剂成分，可以有效抑制蛋白的降解，并维持原有的蛋白间相互作用。作用原理是利用去污剂Triton X-100破坏脂质双分子层，溶解胞质和细胞膜，破坏分子间微弱结合键的大部分蛋白质抗原。不宜用Bradford 法测定由Triton X-100 Lysis Buffer 获得样本的蛋白浓度。

组成：

操作步骤(仅供参考)：

(一)贴壁培养细胞

1、取Triton X-100 Lysis Buffer 室温溶解混匀，使PMSF 终浓度为1mM 。

2、去培养液，低速离心，弃上清。

3、按照6孔板每孔加入150～250μl 含有PMSF 的裂解液的比例加入Triton X-100 Lysis

Buffer 。移液器轻轻吹打，使裂解液和细胞充分接触。置于冰上或4℃裂解，通常裂解液作用于细胞1～3s 内，细胞就会被裂解。(如无低温离心机，室温下离心亦可)，取上清。

4、进行后续的SDS-PAGE 、Western 、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。

(二)悬浮培养细胞

1、取Triton X-100 Lysis Buffer 室温溶解混匀，加入PMSF ，使PMSF 终浓度为1mM 。

2、低速离心悬浮细胞，弃上清，收集沉淀。

3、用手指轻弹细胞，使其松散。按照6孔板每孔细胞加入150～250μl 含有PMSF 的裂

解液的比例，加入Leagene Triton X-100 Lysis Buffer

4、 4℃离心(如无低温离心机，室温下离心亦可)，取上清。

5、进行后续的SDS-PAGE 、Western 、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。

(三)组织样本

1、取Triton X-100 Lysis Buffer 室温溶解混匀后，加入PMSF ，使PMSF 终浓度为1mM 。编号名称 PS0016 Storage Triton X-100 Lysis Buffer 100ml -20℃ PMSF(100mM) 1.5ml -20℃ 使用说明书 1份

2、把组织剪切成细小的碎片，越小越好。

3、取在液氮或超低温冰箱中冷冻以上的组织，迅速用液氮研磨，研磨过程尽量控制在1～

2min之内，以减少蛋白的降解。

4、按照每20mg组织加入150～250μl裂解液的比例加入含有PMSF的裂解液。冰上或

4℃裂解。

5、步骤3、4亦可以采用如下过程：按照每20mg组织加入150～250μl裂解液的比例加

入含有PMSF的Triton X-100 Lysis Buffer。用玻璃匀浆器或组织研磨器匀浆，直至充分裂解，该过程尽量控制在1～2min之内，以减少蛋白的降解。

6、离心(如无低温离心机，室温下离心亦可)，取上清。

7、进行后续的PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。

注意事项：

1、去除贴壁细胞的培养液后，如果血清中的蛋白没有干扰，可以不用清洗。

2、如果裂解不充分可以适当增加裂解液的用量，如果需要高浓度的蛋白样品，可以适当减

少裂解液的用量。

3、如果细胞量较多，必需分装成50～100万细胞/离心管，然后再裂解。大团的细胞较难

裂解充分，而少量的细胞由于裂解液容易和细胞充分接触，相对比较容易裂解充分。

4、如果组织样品本身非常细小，可以适当剪切后直接加入裂解液裂解，通过强烈Vortex

使样品裂解充分

5、裂解产物中经常会出现一小团透明胶状物，属正常现象。

6、细胞裂解的操作步骤，应置于冰上或4℃进行。

(完整版)裂解液主要特点与区分

用于普通的Western、IP或co-IP，我们推荐使用Western及IP细胞裂解液，该裂解液已被国内各大研究机构广泛使用，用户普遍反映很好。裂解细胞或组织后，没有非常粘滞的透明状DNA 团块形成，不必采用超声处理等就可以非常理想地用于后续操作。另外该裂解液裂解的产物也适合用于磷酸化蛋白的Western检测。对于某些特殊蛋白的IP，如果发现Western及IP细胞裂解液效果不是非常理想，可以尝试用RIPA裂解液(强、中或弱)或NP-40裂解液。如果发现IP的时候背景很高，即非特异的蛋白也被IP下来，则需要选用裂解强度较高的裂解液，例如RIPA裂解液(强或中)。如果发现目的蛋白无法被IP下来，则说明裂解液的强度过强，可以使用较为温和的裂解液例如RIPA裂解液(弱)或

NP-40裂解液。对于某些难溶解蛋白的Western，如果发现Western及IP细胞裂解液效果不是非常理想，可以尝试使用裂解强度更高的裂解液例如RIPA裂解液(强、中)或SDS裂解液。 RIPA裂解液（强）（RIPA Lysis Buffer） Code No. PG410501 产品简介：?本公司的RIPA裂解液（RIPA Lysis Buffer）是一种传统的细胞组织快速裂解液。 RIPA裂解液裂解得到的蛋白样品可以用于常规的Western、IP等。 ?RIPA的本意是Radio Immunoprecipitation Assay。RIPA裂解液的配方有很多种，根据其裂解液的强度大致可以分为强、中、弱三类。 ?RIPA裂解液（强）的主要成分为50mM Tris （pH 7.4），150mM NaCl，1% Triton X-100，1% sodium deoxycholate，0.1% SDS，以及sodium orthovanadate， sodium fluoride，EDTA，leupeptin等多种抑制剂。可以有效抑制蛋白降解。 ?用RIPA裂解液裂解得到的蛋白样品，可以用本公司的BCA蛋白浓度测定试剂盒（PG400301）测定蛋白浓度。由于含有较高浓度的去垢剂，不能用Bradford法测定由本裂解液裂解得到样品的蛋白浓度。包装清单：?RIPA裂解液（强） ?说明书100ml 1份保存条件：?-20℃保存，一年有效。注意事项：?为取得最佳的使用效果，尽量避免过多的反复冻融。可以适当分装后使用。 ?需自备PMSF。 ?裂解蛋白的所有步骤都需在冰上或4℃进行。 ?为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。使用说明：?对于培养细胞样品： ?融解RIPA裂解液，混匀。取适当量的裂解液，在使用前数分钟内加入 PMSF，使PMSF的最终浓度为1mM。 ?对于贴壁细胞：去除培养液，用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍（如果血清中的蛋白没有干扰，可以不洗）。按照6孔板每孔加入 150-250微升裂解液的比例加入裂解液。用枪吹打数下，使裂解液和细胞充分接触。通常裂解液接触细胞1-2秒后，细胞就会被裂解。 ?对于悬浮细胞：离心收集细胞，用手指把细胞用力弹散。按照6孔板每孔细胞加入150-250微升裂解液的比例加入裂解液。再用手指轻弹以充分裂解细胞。充分裂解后应没有明显的细胞沉淀。如果细胞量较多，必需分装成50-100万细胞/管，然后再裂解。 ?充分裂解后，10000-14000g离心3-5分钟，取上清，即可进行后续的 PAGE、Western和免疫沉淀等操作。裂解液用量说明：通常6孔板每孔细胞加入150微升裂解液已经足够，但如果细胞密度非常高可以适当加大裂解液的用量到200微升或250微升。 ?对于组织样品： ?把组织剪切成细小的碎片。

溶液各种配制

附录：常用试剂配制及应用一、常用缓冲液、试剂的配制碳酸盐缓冲液(Carbonate-Bicarbonate Buffer) 由于碳酸盐pH值偏碱，因此，常用于pH>9的缓冲液配制（附表1）。附表1. 0.2 mol/L碳酸盐缓冲液（pH9.2～10.7）磷酸缓冲液(Phosphate Buffers，PB) 磷酸盐是使用最广泛的一种缓冲剂，由于它们是二级解离，有二个pKa 值， PO4：pKa1＝2.12，pKa2＝7.21；所以用它们配制的缓冲液，pH 范围最宽。NaH 2 HPO4：pKa1＝7.21，pKa2＝12.32。 Na 2 另外，磷酸盐还有钾盐分子形式，一般来说，低温时钠盐难溶，钾盐易溶，因此，配制细胞培养用试剂时常常添加钾盐试剂，但若配制十二烷基硫酸钠（SDS）-聚丙烯酰胺凝胶电泳的缓冲液时，只能用钠盐而不能用钾盐，因为SDS会与磷酸钾生成难溶的十二烷基硫酸钾。磷酸缓冲液的优点为：①可配制成不同离子强度的缓冲液；②适用pH缓冲范围较宽；③受温度影响缓冲液pH值变化较小；④离子强度对缓冲液pH影响较小，如0.1mol/L缓冲液稀释10倍其pH变化小于0.1。磷酸缓冲液的缺点是：①磷酸盐易与钙离子（Ca2+）、镁离子（Mg2+）及重金属离子结合生成不溶的沉淀物；②可能干扰某些化学反应过程，如对某些酶的催

化活性具有一定程度的抑制作用。 NaH 2PO 4 的pH值偏酸性，可用作pH<4的缓冲液。 Na 2HPO 4 的pH值偏碱性，可用作pH>10的缓冲液。而pH＝6～8的中性缓冲液是更常用的缓冲液，需要NaH 2PO 4 与Na 2 HPO 4 两种磷酸盐混合配制（附表2）。附表2. 0.2 mol/L磷酸盐缓冲液（pH5.7～8.2）磷酸盐缓冲溶液（Phosphate-buffered saline, PBS) 磷酸盐缓冲液是在磷酸缓冲液基础上添加NaCl以维持溶液的渗透压，因此，PBS适用于做细胞缓冲液，常用PBS配制如下。 NaCl 8g KCl 0.2g Na 2HPO 4 1.44g KH 2PO 4 0.24g

裂解液配制方法

1、红细胞裂解液（去除红细胞）配制试剂所需材料： 1. Ammonium Chloride x10 Lysing Concentrate Solution a) NH4Cl (1.5 M) 80 g b) KHCO3 (100 nM) 10 g c) Na4EDTA (10 nM) 3.7 g d) Distilled H2O 1000 mL 2. 1N HCl or 1N NaOH（调节pH值用）配制步骤： 1. 将以上a、b、c试剂溶于900ml 去离子水中； 2.调节溶液pH值到7.2-7.4，加去离子水定容到1000ml； 3.在制备工作液时，将此储存液稀释10倍后使用。保存： 1.10x 储存液储存于2-8°C不能超过半年（六个月）； 2.在使用前，工作液每天都应该新鲜配制放置于室温，当日用不完的弃掉。 2、ripa裂解液 NP-40 or Triton-100 1% TrisHCl (pH 8.0) 50mmol/L NaCl 150mmol/L PMSF（苯甲基磺酰氟）0.1mmol/L(100μg/ml) Pepstatin(胃蛋白酶抑制剂) 1 μmol/L(0.7μg/ml) Leupeptin（亮抑制肽）0.5mg/ml Aprotinin（抑蛋白酶肽）0.3μmol/L(1μg/ml) （注：PMSF 贮存液：100mmol/L即17.4mg/ml于异丙醇中； Aprotinin 贮存液：10mg/ml溶于0.01mol/LHEPES(pH8.0)； Leupeptin 贮存液：10mg/ml溶于水中； Pepstatin 贮存液10mg/ml于甲醇液中.均于-20℃保存） 3、细胞裂解液（Tris－HCL） 1．1M Tris 溶液的配置取Tris242.2g，加ddH2O至1600ml，加热溶解。 2．1M Tris－HCL Ph=8.0溶液的配置取1M Tris 溶液160ml用分析纯盐酸调至Ph=8.0（需浓盐酸约8.5ml），加ddH2O 定容至200ml，高压灭菌备用。 3. 0.5M EDTA溶液的配置称EDTA－Na2 37.2g 先用140ml ddH2O溶解，加入14ml NaOH（10M）使EDTA －Na2溶解，再用NaOH（10M）溶液调至Ph=8.0，加ddH2O定容至200ml，高压灭菌备用。 4. 细胞裂解液的配制称15gCTAB（Hexadecyltrimethylammonium bromide）（先用约600ml ddH2O加热溶解）放入烧杯中，加入75ml 1M Tris－HCL（Ph=8.0），58.5g NaCL（先用少量ddH2O溶解），30ml 0.5M EDTA，定容至1000ml，混合均匀备用。

高效RIPA组织、细胞裂解液使用说明

高效RIPA组织/细胞裂解液使用说明货号：R0010 规格：20ml/100ml 本产品配有一支PMSF（0.3ml/1.5ml）保存：RIPA裂解液4℃保存，PMSF-20℃保存。使用说明：如发现RIPA有沉淀，请放室温半小时或者常温水浴使沉淀溶解。根据使用量，取每1ml RIPA加入10ul PMSF，使PMSF的最终浓度为1mM。混匀备用（PMSF现用现加）。 1、样品前处理： a)对于贴壁细胞：去除培养液，用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍。按照6孔板每孔细胞量加入150-250ul裂解液的比例加入裂解液。用枪吹打数下，使裂解液和细胞充分接触。 b)对于悬浮细胞：离心收集细胞，用手指把细胞用力弹散。按照6孔板每孔细胞量加入150-250ul裂解液的比例加入裂解液，再用手指轻弹以充分裂解细胞。充分裂解后应没有明显的细胞沉淀。如果细胞量较多，必需分装成50-100万细胞/管，然后再裂解。 c)对于组织样品：把组织剪切成细小的碎片。按照每20mg组织加入150-250ul裂解液的比例加入裂解液。(如果裂解不充分可以适当添加更多的裂解液，如果需要高浓度的蛋白样品，可以适当减少裂解液的用量)。

用玻璃匀浆器匀浆，直至充分裂解。 2、后处理：将裂解后的样品10000-14000g离心3-5分钟，取上清，即可进行后续的蛋白浓度测定、SDS-PAGE、Western blotting和免疫沉淀等操作。注意事项：本试剂为强烈型裂解液，可以提取核蛋白，但在提取核蛋白的同时，也会将基因组一并释放出来，若细胞量多会造成细胞裂解液粘稠：此时可以直接加入蛋白上样缓冲液，煮沸再离心，离心后直接上样电泳；若想测定浓度，可入加少量SDS（1%），煮沸后离心测浓度。本系列蛋白提取试剂所提取的蛋白由于含有去污剂，所以不适合使用Bradford蛋白浓度测定试剂盒，请选择BCA法或者Lowry法检测蛋白浓度。如果需要检测和基因组结合特别紧密的蛋白，则可以通过超声处理打碎打散粘稠状物，随后离心取上清用于后续实验。相关试剂： P10201×PBS，PH7.2-7.4，0.01M R0020RIPA组织细胞裂解液 R0030非变性组织细胞裂解液 P10154×蛋白上悪缓冲液（含DTT） PC002BCA法蛋白浓度测定试剂盒 PC0030Lowry法蛋白浓度测定试剂盒

通用细胞裂解液

通用细胞裂解液产品简介：多种成分均可以从细胞中提取总蛋白，例如去Triton、SDS、NP-40等。通用细胞裂解液(Common Lysis Buffer )，是采用一种非变性裂解方法来裂解细胞，并获得总蛋白的裂解液。所获得的蛋白质可以用于PAGE电泳，Western，免疫沉淀(Immunol Precipitation，IP)和免疫共沉淀(co-IP)等，主要由Tris、Triton X-100等组成，并含有多种蛋白酶抑制剂成分，可以有效抑制蛋白的降解，并维持原有的蛋白间相互作用。用Common Lysis Buffer得到的蛋白，可以用leagene BCA蛋白浓度测定试剂盒(PT0001)测定蛋白浓度。由于含有较高浓度的Triton X-100等干扰物质，不宜用Bradford 法测定由通用细胞裂解液获得样本的蛋白浓度。主要成分：主要由Tris-HCl、NaCl、低浓度Triton X-100，低浓度sodium pyrophosphate，β-glycerophosphate，EDTA等多种蛋白酶抑制剂组成。自备材料： 1、高速离心机 2、微量移液器 3、PMSF，亦可采购Leagene的苯甲基磺酰氟溶液(PMSF,100mmol/L)(PI0011) 操作步骤（仅供参考）： (一)贴壁培养细胞 1、取Leagene Common Lysis Buffer 置于室温溶解混匀后，使用前取适当量的裂解液加入PMSF，使其最终浓度为1mM。 2、去除贴壁细胞的培养液，用PBS、NS或无血清培养液清洗1次，低速离心，弃上清，留取沉淀。 3、按照6孔板每1孔加入100～200μl含有PMSF的裂解液的比例，加入Common Lysis Buffer。移液器轻轻吹打，使裂解液和细胞充分接触。冰上或4℃裂解30～60min。 4、10000～12000g，4℃离心10～15min(如无低温离心机，室温下离心亦可)，取上清。

红细胞裂解液使用说明

红细胞裂解液使用说明货号：R1010 规格：100ml/500ml 保存：2-8℃保存，保质期2年。常温运输。产品简介：红细胞裂解液是利用细胞内外存在盐离子浓度差而导致细胞膜胀破的原理来裂解无核红细胞的。红细胞裂解液经无菌处理，主要用于经酶消化分散的组织细胞的分离纯化，淋巴细胞的分离纯化以及组织细胞蛋白与核酸提取等实验中红细胞的去除。使用说明： 1.1倍体积的新鲜全血，加入3倍体积的红细胞裂解液。如1ml新鲜全血加入3ml红细胞裂解液，轻轻涡旋或颠倒混匀。 2.冰上放置15分钟，其间轻轻涡旋混匀两次，红细胞裂解后，溶液应该是清亮透明的。 3.收集细胞：4℃，450×g离心10分钟以沉淀白细胞，小心吸弃上清液。 4.向白细胞沉淀中加入两倍体积的红细胞裂解液，轻轻涡旋充分重悬白细胞。如起始血液为1ml，则加入2ml的红细胞裂解液。 5.4℃，450×g离心10分钟沉淀白细胞，小心并彻底吸去上清液。 6.重悬细胞，用于后续实验；如提取RNA，最好于此步开始使用DEPC水配制的溶液进行操作。（组织细胞处理：新鲜组织经胰酶或胶原酶等消化分散成单个细胞悬液，离心弃去上清液，其余同上。）注意事项：

本裂解液为无菌产品，分离细胞用于细胞培养时请注意无菌操作。为了您的安全与健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。相关产品： D8210DEPC P10201×PBS，PH7.2-7.4，0.01M H1020Hanks，含钙镁，含酚红 31800RPMI Medium1640 T1300胰蛋白酶－EDTA消化液(0.25%)不含酚红 P1400青链霉素混合液(100×) D1800全血基因组DNA提取试剂盒 G1010姬姆萨染色液（工作液）

Western及IP细胞裂解液

Western及IP细胞裂解液产品简介：多种成分均可以从细胞中提取总蛋白，譬如Triton、SDS、NP-40等。Western及IP 细胞裂解液(Cell lysis buffer for Western and IP)，是采用一种非变性裂解方法来裂解细胞，并获得总蛋白的裂解液。所获得的蛋白质可以用于SDS-PAGE，Western，免疫沉淀(Immunol Precipitation，IP)和免疫共沉淀(co-IP)等，主要由Tris、Triton X-100组成，并含有多种蛋白酶抑制剂成分，可以有效抑制蛋白的降解，并维持原有的蛋白间相互作用。用Western及IP细胞裂解液裂解得到的蛋白样品，可以用leagene BCA蛋白浓度测定试剂盒(PT0001测定蛋白浓度。由于含有较高浓度的Triton X-100等干扰物质，不宜用Bradford法测定由Western及IP细胞裂解液获得的样本的蛋白浓度。产品组成：主要成分：主要由 Tris-HCl、NaCl、Triton X-100，以及sodium pyrophosphate、β-glycerophosphate、EDTA等多种蛋白酶抑制剂组成。自备材料： 1、高速离心机 2、微量移液器 3、PMSF，亦可采购Leagene的苯甲基磺酰氟溶液(PMSF,100mmol/L)(PI0011) 操作步骤（仅供参考）： (一)贴壁培养细胞 1、取Western及IP细胞裂解液置于室温溶解混匀后，使用前取适当量的裂解液加入 PMSF，使其最终浓度为1mM。 2、去除贴壁细胞的培养液，用PBS、NS或无血清培养液清洗1次，低速离心，弃上清，留取沉淀。 3、按照6孔板每1孔加入100～200μl含有PMSF的裂解液的比例，加入Western及IP 细胞裂解液。移液器轻轻吹打，使裂解液和细胞充分接触。通常裂解液作用于细胞1～5s内，细胞就会被裂解。 4、10000～12000g，离心3～5min（如果用冷冻离心机4℃离心效果更佳），取上清。

DNA提取液配方及步骤

裂解液配方：100mmol Tris-Hcl(PH8.0); 25mmol EDTA(PH 8.0); 500mmol NaCl; 1%SDS 母液配制： 1.500mmol Tris-Hcl（PH8.0）称取15.1425g Tris，加入150ml 蒸馏水，加入Hcl调PH至8.0，定容至250ml。 2.100mmol EDTA或EDTA-Na2 称取7.3062g EDTA或8.455g EDTA-Na2，加入200ml 蒸馏水，调PH至8.0，定容至250ml。 3.5mol NaCl 称取29.22g NaCl，加入90ml 蒸馏水，定容至100ml。 4.10% SDS 称取10gSDS,加入100ml蒸馏水。蛋白酶K配置：10mg/ml蛋白酶K溶液。称取10mg蛋白酶K粉末，加入1ml蒸馏水溶解。-20度保存。配制1000ml裂解液：加入溶液1体积为200ml，加入溶液2体积为250ml，加入溶液3体积为100ml，加入溶液4为100ml。配制500ml裂解液则相应减半。步骤： 1.在1.5ml离心管中加入0.2ml（200ul）裂解液，用配套的研磨棒杵成浆状，加入2ul浓度为10mg/ml的蛋白酶K至终浓度100ug/ml，45度水浴2-4h。 2.加入RNaseA至终浓度20ug/ml，水浴30min。 3.加入0.7ml苯酚：氯仿：异戊醇（25:24:1），轻微颠倒混匀，14000rpm离心5min。 4.中号枪头切去头部，抽取上清，重复抽提一次。 5.取上清，加入等体积氯仿：异戊醇（24:1），14000rpm离心5min。 6.取上清，加入2-2.5倍体积的无水乙醇，颠倒混匀，材料用量较多的昆虫可看到DNA沉淀，材料用量较少或酒精长时间浸泡着的标本可在-70度放置30min，14000rpm离心5min。 7.75%乙醇漂洗沉淀两次，无水乙醇漂洗，室温干燥。 8.根据沉淀量，加入30-50ulddH2O。方法二： 1.在1.5ml离心管中加入0.1ml（100ul）裂解液，用配套的研磨棒杵成浆状，用400ul裂解液冲洗研磨棒，加入5ul浓度为10mg/ml的蛋白酶K至终浓度100ug/ml，45度水浴1-2h。 2.加入RNaseA至终浓度20ug/ml，水浴15min。 3.加入等体积苯酚：氯仿：异戊醇（25:24:1），轻微颠倒混匀，14000rpm离心5min。 4.取上清，加入等体积氯仿：异戊醇（24:1），14000rpm离心5min。 5.取上清，加入2-2.5倍体积的无水乙醇，14000rpm离心10min。 6.75%乙醇漂洗沉淀两次，无水乙醇漂洗，室温干燥。 7根据沉淀量，加入30-50ulddH2O。

Western及IP细胞裂解液(无抑制剂)使用说明

Western及IP细胞裂解液(无抑制剂)使用说明货号：LS00160 规格：100mL 保存：-20℃保存，12个月。产品说明：多种成分均可以从细胞中提取总蛋白，如Triton、SDS、NP-40等，Western及IP细胞裂解液是采用一种非变性裂解方法来裂解细胞，并获得总蛋白的裂解液。所获得的蛋白质可以用于PAGE电泳，Western，免疫沉淀(Immunol Precipitation，IP)和免疫共沉淀(co-IP)等，主要由Tris-HCl、NaCl、低浓度Triton X-100，低浓度sodium pyrophosphate等组成，不含蛋白酶、磷酸酶抑制剂，并维持原有的蛋白间相互作用。用Western及IP细胞裂解液(无抑制剂)(Cell lysis buffer for Western and IP without inhibitors)得到的蛋白，可以用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。由于含有较高浓度的Triton X-100等干扰物质，不宜用Bradford法测定由Western及IP细胞裂解液获得样本的蛋白浓度。操作步骤(仅供参考)： (一)贴壁培养细胞 1、取Western及IP细胞裂解液室温溶解混匀，根据需要选择添加或不添加蛋白酶抑制剂。 2、去除贴壁细胞的培养液，用PBS、NS或无血清培养液清洗1次，低速离心，弃上清，留取沉淀。 3、按照6孔板每孔加入100～200μL裂解液的比例，加入Western及IP细胞裂解液。移液器轻轻吹打，使裂解液和细胞充分接触。通常裂解液作用于细胞1～5s内，细胞就会被裂解。

4、10000～12000g，离心3～5min(如果用冷冻离心机4℃离心效果更佳)，取上清。 5、进行后续的SDS-PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。 (二)悬浮培养细胞 1、取Western及IP细胞裂解液室温溶解混匀，根据需要选择添加或不添加蛋白酶抑制剂。 2、低速离心悬浮细胞，弃上清，收集沉淀。 3、用手指轻弹细胞，使其松散。按照6孔板每孔细胞加入100～200μL裂解液的比例，加入Western及IP细胞裂解液。通常6孔板每孔细胞加入100μL裂解液已经足够，但如果细胞密度非常高可以适当加大裂解液的用量到150～200μL，再用手指轻弹以充分裂解细胞。充分裂解后应没有明显的细胞沉淀。 4、10000～12000g，4℃离心3～5min(如无低温离心机，室温下离心亦可)，取上清。 5、进行后续的PAGE、Western、免疫沉淀等操作。 (三)组织样本 1、取Western及IP细胞裂解液置于室温溶解混匀，根据实验需要选择添加或不添加蛋白酶抑制剂。 2、把组织剪切成细小的碎片，越小越好。 3、取在液氮或超低温冰箱中冷冻30min以上的组织，迅速用液氮研磨，研磨过程尽量控制在1～2min之内，以减少蛋白的降解。 4、按照每20mg组织加入100～200μl裂解液的比例，加入含有PMSF的裂解液。冰上或 4℃裂解30～60min。 5、步骤3、4亦可以采用如下过程：按照每20mg组织加入100～200μL裂解液的比例加入 Western及IP细胞裂解液。用玻璃匀浆器或组织研磨器匀浆，直至充分裂解，过程尽量

蛋白裂解液

蛋白质的定位与蛋白质裂解液的选择：全细胞：NP-40或RIPA 细胞质（可溶）：Tris-HCl 细胞质（细胞骨架）：Tris-Triton 细胞膜：NP-40或RIPA 细胞核：RIPA 线粒体：RIPA RIPA裂解液配方 Aprotinin 10μg/μl ；用10mM HEPES-KOH（PH8.0）溶解，备用。 ●Nonidet P-40简称NP-40，乙基苯基聚乙二醇,常用非离子性去垢剂。 ●Na-deoxycholale，脱氧胆酸钠，离子型去垢剂。离子型去垢剂主要作用有：裂解细胞；溶解蛋白，尤其是可以溶解一些难溶于水的蛋白，如膜蛋白等；很适合做WB，但在Co-IP中使用，需要谨慎。 ●亮抑霉肽（Leupeptin）：抑制丝氨酸蛋白酶包括胰蛋白酶、纤溶酶、猪胰激肽原酶）和半胱氨酸蛋白酶（包括木瓜蛋白酶和组织蛋白酶B） ●抑肽素A（Pepstatin A）抑制各种天门冬氨酸蛋白酶，例如组织蛋白酶D、肾素、胃蛋白酶、细菌天门冬氨酸蛋白酶和HIV蛋白酶； ●胰凝乳蛋白酶抑制剂（Chymostatin）抑制具有糜蛋白酶类特异性丝氨酸蛋白酶（包括糜蛋白酶、胃促胰酶、组织蛋白酶G）和大多数丝氨酸蛋白酶（包括组织蛋白酶B，H，L） ●抗木瓜蛋白酶（Antipain）抑制木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和纤溶酶。 ●氟化钠抑制酸性磷酸酶 ●正钒酸钠：抑制碱性磷酸酶和酪氨酸磷酸酶（tyrosine phosphatase） ●焦磷酸钠（sodium pyrophosphate）：抑制丝氨酸-苏氨酸磷酸酶（serine－threonine phosphatase）。在与蛋白相关的检测中，首先最关键的一步便是蛋白质的提取。蛋白质的提取过程中，我们要经常加和蛋白酶抑制剂以防止蛋白质的降解。另外在磷酸化蛋白的研究过程中，磷酸酶抑制剂也是必不可少的，本文总结了常用的蛋白酶抑制剂PMSF，Leupeptin 亮肽素，Aprotinin 抑肽酶，Pepstatin胃蛋白酶抑制剂，EDTA-Na2等以及磷酸酶抑制剂NaF氟化钠，Na3VO4 原矾酸钠，BETA-glycerophosphate 甘油磷酸钠，Na2P2O4 焦磷酸钠等。对这些蛋白酶抑制剂的溶解配制，贮存液与工作液浓度，保存都做了详细的说明。

红细胞裂解液的配制

红细胞裂解液的配制我在一个公司的网站上看到的红细胞裂解液的说明书上说操作要点是：1.在37度预热；2.充分混匀细胞我就是这样做的，效果还可以。不过我只做流式细胞仪的检测，活性没测。我的裂解液是0.16M NH4Cl，0.13mM EDTA，12mM NaHCO3 我用的方法：全血：裂解液=1：3，如2ml的全血加上6ml的红细胞裂解液，充分混匀后，室温静置5mim，1000rpm离心6~10min。红细胞裂解得非常充分。 0.15 M NH4CL, 0.01 M NaHCO3 and 1 mM EDTA (Sigma) Ammonium chloride (NH4Cl) 8.29 g 0.155 M Potassium bicarbonate (KHCO3) 1 g 10mM EDTA 0.37 g 1mM H2O 1l. Filter with 0.45μm filter aliquot in 100 ml aliquots filter the solution to be used with 0.2μm filter. 我们用的是Tris-NH4Cl, 具体配方如下: NH4Cl:4.15克加双蒸水500ml,取450ml; Tris:1.0297克加双蒸水50ml,再加上上面的450ml,共计500ml,高压灭菌, 用时加10-20ml,静置5min,效果蛮好. 9月29日我用的配方

氯化铵3.735g，tris 1.3g，加在500ml水中，ph约7.2。将全血约5ml加入配好的加入30ml裂解液的50ml试管中5分钟或15分钟，发现5分钟组细胞要多些，15分钟组细胞要少些，而且红细胞仍然有。

SDS裂解液

SDS 裂解液简介：多种成分均可以从细胞中提取总蛋白，例如Triton 、SDS 、NP-40等。SDS 裂解液 (SDS Lysis Buffer)是一种极其强烈的细胞组织快速裂解液并获得总蛋白质。其裂解液强度大于NP-40裂解液、RIPA 裂解液(弱)、RIPA 裂解液(中)、通用细胞裂解液、Western 及IP 细胞裂解液，所获得的蛋白质可以用于Western 、染色质免疫共沉淀(ChIP)等。SDS Lysis Buffer 主要由Tris-HCl 、NaCl 、SDS 等组成，并含有多种蛋白酶抑制剂成分，可以有效抑制蛋白的降解，并维持原有的蛋白间相互作用。组成：操作步骤(仅供参考)： (一)贴壁培养细胞 1、取SDS Lysis Buffe 室温溶解混匀，使用前取适量裂解液加入PMSF ，使终浓度为1mM 。 2、去除贴壁细胞的培养液，低速离心，弃上清，留取沉淀。 3、按照6孔板每孔加入150～250μl 含有PMSF 的裂解液的比例加入SDS Lysis Buffer 。移液器轻轻吹打，使裂解液和细胞充分接触。通常裂解液作用于细胞内，细胞就会被裂解。如果是所提蛋白样品用于CHIP, 应置于冰上或4℃裂解。 4、离心(如无低温离心机，室温下离心亦可)，取上清。 5、进行后续的Western 、染色质免疫共沉淀(ChIP)等操作。 (二)悬浮培养细胞 1、取SDS Lysis Buffer 置于室温溶解混匀后，使用前取适量裂解液加入PMSF ，使其最终浓度为1mM 。 2、低速离心悬浮细胞，弃上清，收集沉淀。 3、用手指轻弹细胞，使其松散。按照6孔板每孔细胞加入150～250μl 含有PMSF 的裂解液的比例，加入SDS Lysis Buffer 。 4、 4℃离心(如无低温离心机，室温下离心亦可)，取上清。 5、进行后续的Western 、染色质免疫共沉淀(ChIP)等操作。 (三)组织样本编号名称 PS0015 Storage SDS Lysis Buffer 100ml -20℃ PMSF(100mM) 1.5ml -20℃ 使用说明书 1份

裂解液配制方法

裂解液配制方法 The manuscript was revised on the evening of 2021

Pepstatin 贮存液 10mg/ml于甲醇液中.均于-20℃保存） 3、细胞裂解液（Tris－HCL） 1．1M Tris 溶液的配置取Tris242.2g，加ddH2O至1600ml，加热溶解。 2．1M Tris－HCL Ph=溶液的配置取 1M Tris 溶液160ml用分析纯盐酸调至Ph=（需浓盐酸约），加ddH2O定容至200ml，高压灭菌备用。 3. 0.5M EDTA溶液的配置称EDTA－Na2 37.2g 先用140ml ddH2O溶解，加入14ml NaOH（10M）使EDTA－Na2溶解，再用NaOH（10M）溶液调至Ph=，加ddH2O定容至 200ml，高压灭菌备用。 4. 细胞裂解液的配制称15gCTAB（Hexadecyltrimethylammonium bromide）（先用约600ml ddH2O 加热溶解）放入烧杯中，加入75ml 1M Tris－HCL（Ph=），58.5g NaCL（先用少量ddH2O溶解），30ml 0.5M EDTA，定容至1000ml，混合均匀备用。 4、组织裂解液配方：` 7M Urea(60. 06) 4.2042 g 2M thiourea g 100mM DTT? g 4% CHAPS g 0.5mM EDTA? 0.00146 g 40Mm Tris? g 2%(v/v) NP-40 ml

组织裂解液和细胞裂解液的配制

组织裂解液和细胞裂解液如何配制? 一、细胞裂解液配制方法一一、试剂准备 1、新鲜配制冷的 RIPA 裂解缓冲液: 150 mM NaCL 1% NP-40 (去垢剂) 0.1% SDS (去垢剂) 2ug/ml Aprotinin (蛋白酶抑制剂) (使用前加入) 2ug/ml Leupeptin (蛋白酶抑制剂) (使用前加入) 1 mM PMSF (蛋白酶抑制剂) 1.5 mM EDTA (蛋白酶抑制剂) 1mM NaVanadate (磷酸脂酶抑制剂)(任选) 以上所有试剂均按比例溶于150 mM NaCL溶液中。 2、冷的PBS 中加入 1 mM PMSF 1.5 mM EDTA 1mM NaVanadate （钒酸钠）(任选) 3、对数期生长状态佳的细胞，75cm至少3-4瓶（90%以上生长面积）。二、实验步骤 1、将长满细胞的培养瓶放置在冰上，用吸液管吸出培养液。加入足够的冷的PBS在培养瓶中充分洗涤细胞表面，以洗去瓶中残留的培养基，倒掉PBS ，重复以上操作2-3遍。在最后一次洗涤中尽可能吸干残留的PBS，尽量在冰上操作。 2、向培养瓶中加入冷的RIPA 裂解缓冲液 (每75cm2 培养瓶加1ml). 然后用细胞刮子沿着瓶壁开始刮细胞，如果所需要刮的同种细胞有多瓶，则将第一瓶刮下的细胞液吸出转入下一瓶中继续刮(由于处理后的细胞裂解液较粘稠，所以宜用直径大点的吸液管吸取)。 3、吸出刮好的细胞裂解液置于14ml 离心管中（置于冰上），然后重复步骤2以刮取剩下的细胞。 4、尽可能将多的细胞裂解液收集到14ml的离心管中，样品插入冰盒进行超声，超声强度以不产生泡沫为准，超声每次2-3秒，重复3-4次。如仍有细胞碎片或沉淀，应离心10000rpm,10分钟，留取上清。 5、取出小量细胞裂解液测其蛋白浓度（用Biorad Bradford 试剂盒或紫外分光光度计，在A280测定），分装保存在 -70℃。

Tris-氯化铵红细胞裂解液说明书

北京索莱宝科技有限公司 Tris-氯化铵红细胞裂解液说明书货号：R1012 规格：500mL 保存：4℃保存，12个月有效。产品说明：在生物科研领域，经常需要去除红细胞，去除红细胞的方法有多种，如ACK Lysis Buffer、Tris-氯化铵红细胞裂解液、Gey's Lysis Buffer。Tris-氯化铵红细胞裂解液(Tris-NH4Cl Red Blood Cell Lysis Buffer)，也称为Tris-NH4Cl Lysis Buffer，是一种从人、鼠或其他哺乳动物等体内的组织样品或血液中裂解并去除无核红细胞的溶液，其主要有效成分为NH4Cl。 Tris-NH4Cl Lysis Buffer经过优化配方，在裂解无核红细胞的同时几乎不损伤淋巴细胞或其它有细胞核的细胞。本裂解液经过滤除菌，经过Tris-NH4Cl Lysis Buffer处理过的血液或组织细胞样品可以用于后续的细胞培养、细胞融合以及核酸或蛋白的提取及各种常规的分析和检测。自备材料：胰蛋白酶、离心机、PBS、HBSS、生理盐水或无血清培养液、胎牛血清注意事项： 1、制备细胞悬液时应根据实验需要，不一定要制备成单细胞悬液。 2、后续试验如果是用于细胞培养，操作过程中应注意无菌操作，尽量在超净工作台内操作。 3、离心步骤尽量在4℃离心机上操作。 4、常规步骤与快速步骤的区别在于：常规步骤多了一步洗涤过程的离心，可以节省洗涤液的用量，并且洗涤效果也更好，不需要大体积的离心管；快速步骤少了一次离心过程，洗涤效果略差一些，同时需要大体积的离心管。 5、离心洗涤后，通常极微量的红细胞不会影响后续的检测。 6、如果经过ACK Lysis Buffer处理后的样品后续用于总RNA的提取，在处理细胞时不必使用DEPC处理的溶液，即无需在该操作中特意去除RNase。 7、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。第1页共1页

红细胞裂解

对于组织细胞样品： 1. 新鲜组织经过胶原酶或胰酶等消化处理，通过适当方法分散成细胞悬液，离心弃上清。 2. 加入3-5倍细胞体积的红细胞裂解液，轻轻吹打混匀，裂解1-2分钟。例如细胞沉淀的体积为1ml，则加入3-5ml的红细胞裂解液。本步骤在室温或4度操作均可。 3. 400-500g离心5分钟，弃红色上清。4℃离心效果更佳。 4. 如果发现红细胞裂解不完全，可以重复上述步骤2和步骤3一次。通常极微量的红细胞不会影响后续的一些检测。 5. 洗涤1-2次：加入适量PBS、HBSS、生理盐水或无血清培养液，重悬沉淀，400-500g离心2-3分钟，弃上清。可再重复1次，共洗涤1-2次。洗涤液的用量通常应至少为细胞沉淀体积的5倍。4℃离心效果更佳。 6. 根据实验需要用适当溶液重悬细胞沉淀后即可进行计数等后续实验。对于组织细胞样品无需洗涤的快速操作步骤： 1. 新鲜组织经过胶原酶或胰酶等消化处理，通过适当方法分散成细胞悬液，离心弃上清。 2. 对于0.2ml细胞沉淀加入1ml红细胞裂解液，轻轻吹打混匀，裂解1-2分钟。本步骤在室温或4度操作均可。 3. 加入15-20ml PBS、HBSS、生理盐水或无血清培养液，混匀。 4. 400-500g离心5分钟，弃红色上清。4℃离心效果更佳。 5. 如果发现红细胞裂解不完全，可以重复上述步骤2和步骤3一次。通常极微量的红细胞不会影响后续的一些检测。 6. 根据实验需要用适当溶液重悬细胞沉淀后即可进行计数等后续实验。说明：对于常规步骤，多一步洗涤过程中的离心，但可以节省洗涤液的用量，并且洗涤效果也更好一些，同时不需要大体积的离心管。快速步骤少了一次离心，但洗涤效果略差一些，同时需要大体积的离心管。对于血液样品： 1. 取新鲜抗凝血，400-500g离心5分钟，离心弃上清。 2. 加入6-10倍细胞体积的红细胞裂解液，轻轻吹打混匀，裂解1-2分钟。例如细胞沉淀的体积为1ml，则加入6-10ml的红细胞裂解液。本步骤在室温或4度操作均可。注意：对于鼠的血液，裂解1-2分钟已经足够，对于人的外周血，宜延长裂解时间至4-5分钟，并且裂解过程中宜适当偶尔摇动以促进红细胞裂解。 3. 400-500g离心5分钟，弃红色上清。4℃离心效果更佳。 4. 如果发现红细胞裂解不完全，可以重复上述步骤2和步骤3一次。通常极微量的红细胞不会影响后续的一些检测。 5. 洗涤1-2次：加入适量PBS、HBSS、生理盐水或无血清培养液，重悬沉淀，400-500g离心2-3分钟，弃上清。可再重复1 次，共洗涤1-2次。洗涤液的用量通常应至少为细胞沉淀体积的5倍。4℃离心效果更佳。 6. 根据实验需要用适当溶液重悬细胞沉淀后即可进行计数等后续实验。注意：对于微量或少量的血液样品，可以在第一步中不进行离心弃上清的操作，直接在第二步中加入10倍血液体积的红细胞裂解液，并在室温或4℃裂解4-5分钟。对于鼠的血液，裂解4-5分钟已经足够，对于人的外周血，宜延长裂解时间至10分钟，但通常不宜超过15分钟，并且裂解过程中宜适当偶尔摇动以促进红细胞裂解。后续步骤相同。对于血液样品无需洗涤的快速操作步骤： 1. 每1ml新鲜抗凝血中加入10ml红细胞裂解液，轻轻吹打混匀，裂解4-5分钟。本步骤在

组织裂解液和细胞裂解液配制

组织裂解液和细胞裂解液如何配制一、细胞裂解液配制方法一一、试剂准备 1、新鲜配制冷的 RIPA 裂解缓冲液: 150 mM NaCL 1% NP-40 (去垢剂) 0.1% SDS (去垢剂) 2ug/ml Aprotinin (蛋白酶抑制剂) (使用前加入) 2ug/ml Leupeptin (蛋白酶抑制剂) (使用前加入) 1 mM PMSF (蛋白酶抑制剂) 1.5 mM EDTA (蛋白酶抑制剂) 1mM NaVanadate (磷酸脂酶抑制剂)(任选) 以上所有试剂均按比例溶于150 mM NaCL溶液中。 2、冷的PBS 中加入 1 mM PMSF 1.5 mM EDTA 1mM NaVanadate （钒酸钠）(任选) 3、对数期生长状态佳的细胞，75cm至少3-4瓶（90%以上生长面积）。二、实验步骤 1、将长满细胞的培养瓶放置在冰上，用吸液管吸出培养液。加入足够的冷的 PBS在培养瓶中充分洗涤细胞表面，以洗去瓶中残留的培养基，倒掉PBS ，重复以上操作2-3遍。在最后一次洗涤中尽可能吸干残留的PBS，尽量在冰上操作。 2、向培养瓶中加入冷的RIPA 裂解缓冲液 (每75cm2 培养瓶加1ml). 然后用细胞刮子沿着瓶壁开始刮细胞，如果所需要刮的同种细胞有多瓶，则将第一瓶刮下的细胞液吸出转入下一瓶中继续刮 (由于处理后的细胞裂解液较粘稠，所以宜用直径大点的吸液管吸取)。 3、吸出刮好的细胞裂解液置于14ml 离心管中（置于冰上），然后重复步骤2以刮取剩下的细胞。 4、尽可能将多的细胞裂解液收集到14ml的离心管中，样品插入冰盒进行超声，超声强度以不产生泡沫为准，超声每次2-3秒，重复3-4次。如仍有细胞碎片或沉淀，应离心10000rpm,10分钟，留取上清。 5、取出小量细胞裂解液测其蛋白浓度（用Biorad Bradford 试剂盒或紫外分光光度计，在A280测定），分装保存在 -70℃。方法二 NP-40 or Triton x-100 1% TrisHCl (pH 8.0) 50mmol/L NaCl 150mmol/L PMSF（苯甲基磺酰氟）0.1mmol/L(100μg/ml) Pepstatin(胃蛋白酶抑制剂) 1 μmol/L(0.7μg/ml) Leupeptin（亮抑制肽） 0.5mg/ml

流式常用试剂配制

一、流式细胞术常用试剂 1、10％NaN3：将10gNaN3溶解于100ml蒸馏水中，室温保存；活体实验或在辣根过氧化酶反应中可不使用NaN3。 2、3％BSA/PBS：100ml PBS中加入3g BSA，使之溶解，再加入0.2ml 10％的NaN3。 3、500mmol/L EDTA：将186g EDTA?Na2?2H2O溶解于400ml蒸馏水中，用NaOH将PH调至8.0，补充蒸馏水至500ml，分装，高压灭菌，室温保存。 4、4％多聚甲醛：在磁力搅拌下，将4g多聚甲醛溶于100ml PBS，加入数滴NaOH，在通风柜中于60度加热，使其溶解，调整PH至7.4，使用前新鲜配制。 5、消化液：0.25％胰蛋白酶（用培养液或PBS配制）或0.25％胰蛋白酶与0.02％EDTA的混合液。 6、红细胞裂解液：NH4Cl 4.16g，KHCO3 0.5g，EDTA?2Na 0.02g，溶于100ml水中，调PH 至7.2，补充蒸馏水至500ml，4度储存，使用时需恢复至室温。 7、流式细胞抗体稀释剂：0.1mmol/L PBS液（PH 7.4）＋1％BSA＋0.1％Na2N3。 8、常用细胞破膜剂：PBS液（PH 7.4）＋1％FBS（或BSA）＋0.1％NaN3＋0.1％saponin（Sigma 的效果不错）。 9、流式细胞染色洗涤液：含2％的BSA、0.1％NaN3的PBS（PH 7.4）。 10、PI染液（保存液，10×，用于细胞周期和凋亡检测）：10mg PI溶于10ml PBS，加入2mg 无DNA酶的RNA酶，4度保存备用。应用时，10倍稀释，每管加0.3ml～0.5ml PI染液。 11、Hanks液的配制（BSS，主要用于培养液、稀释剂和细胞清洗液，不能单独作为细胞、组织培养液）原液A NaCl 160g MgSO4?7H2O 2g KCl 8g MgCl?6H2O 2g CaCl2 2.8g 溶于1000ml双蒸水原液B 1）Na2HPO4?12H2O 3.04g KH2PO4 1.2g 葡萄糖20.0g 溶于800ml双蒸水 2）0.4％酚红溶液：取酚红0.4g置玻璃研钵中，逐滴加入0.1N NaOH并研磨，直至完全溶