免疫组化步骤

免疫组化步骤

1、烤片：放于60C烘箱内，20-25min ;

2、脱蜡：二甲苯 I、II、III , 3 次，5mi n/次；

注：从烘箱中拿出迅速放入二甲苯中，防止蜡凝；

3、复水:100%酒精---100%酒精---95%酒精---90%酒精---80%酒精

---70% 酒精---50% 酒精，5min/ 次；

4、ddHO洗 2 次，5min/ 次；

5、抗原修复：柠檬酸盐抗原修复液 1x (迈新MVS-0100, 125C,

5mi n;

注：1x修复液：198ml ddH2O + 2ml抗原修复液100x,混匀；

抗原修复高压锅的使用：确定垫圈和导热片的放入，加入700ml ddHO,放入铁架固定切片盒，注意不要压到导热片，盖上锅

盖检查排气嘴是否可以自由旋转，锅盖上的“close ”对准

白点，“open”所指处与边缘无缝隙，设置程序，开始；结束后等到排气口的红色指示消失即可打开锅盖；

6、修复结束后冷却至室温(30min), 1xPBS洗2次，5min/次；

7、去除H202酶：3%b?2, 15min;注意遮光；

注：用 1xPBS稀释 30%H02至 3%H b02 (如 5ml 30%H b02+45ml PBS

50ml 3%H02)

& PBS 2次，PBST 1 次，5min/ 次；

9、封闭(blocking )：先将片子擦干，注意保持组织部分的湿润，

再用专用记号笔沿距离组织 3mm处画圈，然后加入封闭液，室

温1h,湿盒；封闭液不要过多，以免溢出；

注：封闭液：IxPBS 0.3%Triton X-100, 10%goat serum （如:

870ulPBS+30ul 10%Triton X-100+100ul 10%goat serum 1ml 封闭液）；

10、孵一抗：用封闭液稀释一抗，不同的抗体稀释的倍数不同，4C, 过

夜（有的抗体是室温 1h），湿盒。对照组加不含抗体的封闭液；

注：拿到4C冰箱时动作延缓慢，小心不要使一抗跑出圈夕卜；加一抗前可以重新画圈，以免一抗外流；

常用抗体的稀释比例：GFAP--1:200, Ki67--1:200 ,

CD31--1:20~1:40 , Flag--1:200 , Nestin--1:200 ,

lll-Tubuli n--1:1000

11、室温，30min;（从冰箱拿出时动作也要缓慢）

12、PBST洗 3 次，5min/ 次；

注：PBST 1L 1xPBS+10ml 10%Triton X-1000 ;

13、①加荧光标记的二抗（封闭液稀释抗体1:1000 ）, 1h，室温，

湿盒；②加HRP标记的二抗（封闭液稀释抗体1:10000）,室温

30mi n;注：加二抗前可以重新画圈，以防二抗外流；

14、PBST洗 3 次，5min/ 次；

15、若①复染：DAPI染色，避光，5min;若②TSA放大3~10min,PBST 洗

3次，5min/次，再复染 DAPI;

注：DAPI: 50uM DAPI用 1xPBS稀释 1000 倍

16、封片：直接向组织滴加抗荧光淬灭剂，注意不要产生气泡，盖

盖玻片时也要注意不要产生气泡，避光 4~5min 后即可拍片

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18、（学习的目的是增长知识，提高能力，相信一分

耕耘分收获，努力就一定可以获得应有的回报）19、