生物化学实验报告
实验一糖类的性质实验
（一）糖类的颜色反应
一、实验目的
1、了解糖类某些颜色反应的原理。
2、学习应用糖的颜色反应鉴别糖类的方法。
二、颜色反应
（一）α-萘酚反应
1、原理糖在浓无机酸（硫酸、盐酸）作用下，脱水生成糠醛及糠醛衍生物，后
者能与α-萘酚生成紫红色物质。因为糠醛及糠醛衍生物对此反应均呈阳性，故此反应不是糖类的特异反应。
2、器材
试管及试管架，滴管
3、试剂
莫氏试剂：5％α-萘酚的酒精溶液1500mL.称取α-萘酚5g，溶于95％酒精中，总体积达100 mL，贮于棕色瓶。用前配制。
1％葡萄糖溶液100 mL
1％果糖溶液100 mL
1％蔗糖溶液100 mL
1％淀粉溶液100 mL
0.1％糠醛溶液100 mL
浓硫酸 500 mL
4、实验操作
取5支试管，分别加入1％葡萄糖溶液、1％果糖溶液、1％蔗糖溶液、1％淀粉溶液、0.1％糠醛溶液各1 mL。再向5支试管中各加入2滴莫氏试剂，充分混合。倾斜试管，小心地沿试管壁加入浓硫酸1 mL，慢慢立起试管，切勿摇动。观察记录各管颜色。
（二）间苯二酚反应
1、原理
在酸作用下，酮醣脱水生成羟甲基糠醛，后者再与间苯二酚作用生成红色物质。此反应是酮醣的特异反应。醛糖在同样条件下呈色反应缓慢，只有在糖浓度较高或煮沸时间较长时，才呈微弱的阳性反应。实验条件下蔗醣有可能水解而呈阳性反应。
2、器材
试管及试管架，滴管
3、试剂
塞氏试剂：0.05％间苯二酚－盐酸溶液1000 mL，称取间苯二酚0.05 g溶于
30 mL浓盐酸中，再用蒸馏水稀至1000 mL。
1％葡萄糖溶液100 mL
1％果糖溶液100 mL
1％蔗糖溶液100 mL
4、实验操作
取3试管，分别加入1％葡萄糖溶液、1％果糖溶液、1％蔗糖溶液各0.5 mL。
再向3支试管中各加入塞氏试剂5 mL，充分混合。将试管同时放入沸水浴中，。
观察记录各管颜色。
(二)糖类的还原作用
一、实验目的
1、理解并掌握糖类的还原性质；
2、学习常用的鉴定糖类还原性的方法。
3、了解斐林氏、本尼迪克特试法检验糖的原理。
二、实验原理
还原糖是指含有自由醛基（如葡萄糖）或酮基（如果糖）的单糖和某些二糖（如乳糖和麦芽糖）。在碱性溶液中，还原糖能将Cu2+、Hg2+、Fe3+、Ag+等金属离子还原，而糖本身被氧化成糖酸及其他产物。糖类的这种性质常被用于糖的定性和定量测定。
三、器材
试管及试管架，水浴锅电炉
四、试剂
1 斐林试剂
甲液氢氧化钠的质量分数为0.1 g/mL的溶液。乙液硫酸铜的质量分数为
0.05 g/mL的溶液。
2 本尼迪克特试剂
3 1％葡萄糖溶液100 mL
4 1％果糖溶液100 mL
5、1％蔗糖溶液100 mL
五实验操作
六思考题
1、斐林氏、本尼迪克特试法检验糖的原理是什么？
2、试比较斐林氏、本尼迪克特试法的方法。
实验二总糖的测定---蒽酮比色法
一、实验目的
掌握蒽酮法测定可溶性糖含量的原理和方法。
二、实验原理
强酸可使糖类脱水生成糠醛，生成的糠醛或羟甲基糖醛与蒽酮脱水缩合，形成糠醛的衍生物，呈蓝绿色，该物质在620nm处有最大吸收。在10-100ug围其颜色的深浅与可溶性糖含量成正比。这一方法有很高的灵敏度，糖含量在 30ug 左右就能进行测定，所以可做为微量测糖之用。一般样品少的情况下，采用这一方法比较合适。
三、仪器、试剂和材料
1 .仪器
(1) 分光光度计
(2) 电子顶载天平
(3) 三角瓶： 50m1 X 1
(4) 大试管： 9 支
(5) 试管架，试管夹
(6) 漏斗，漏斗架
(7) 容量瓶： 50 m1 X 2
(8) 刻度吸管： 1m1X3 ， 2m1X1 ， 5mlX1
(9) 水浴锅
2 .试剂
(1) 葡萄糖标准液： l00ug/ml
(2) 浓硫酸
(3) 蒽酮试剂:0.2g 蒽酮溶于100ml浓 H
2SO
4
中当日配制使用。
3 .材料
小麦分蘖节（或者其它材料）。
四、操作步骤
1 .葡萄糖标准曲线的制作
后一起浸于沸水浴中，管口加盖玻璃球，以防蒸发。自水浴重新煮沸起，准确煮沸 l0min 取出，用流水冷却，室温放置 10min ，在 620 nm 波长下比色。以标准葡萄糖含量（ug) 作横坐标，以吸光值作纵坐标，作出标准曲线。
2 .植物样品中可溶性糖的提取
将小麦分蘖节剪碎至 2mm 以下，准确称取 1g, 放入 50m1三角瓶中，加沸水25m1，在水浴中加盖煮沸10min ，冷却后过滤，滤液收集在50m1容量瓶中，
定容至刻度。吸取提取液2m1 ，置另一50m1 容量瓶中，以蒸馏水稀释定容，摇匀测定。
3 .测定
吸取lml 已稀释的提取液于大试管中，加入4.Oml 蒽酮试剂，以下操作同标准曲线制作。比色波长 620nm ，记录吸光度，在标准曲线上查出葡萄糖的含量（ug）。
查表所得糖含量(ug)×稀释倍数
五、结果处理
六、注意事项
1 该显色反应非常灵敏，溶液中切勿混入纸屑及尘埃。
2 H
2 SO
4
要用高纯度的。
3 不同糖类与蒽酮的显色有差异，稳定性也不同。加热、比色时间应严格掌握。
七、思考题
1蒽酮比色测定糖的原理是什么？
2 用水提取的糖类有哪些？
3 制作葡萄糖标准曲线应注意哪些事项？
4 分光光度计的原理是什么？使用时需要注意哪些？
实验三粗脂肪的提取和定量测定
一实验目的
1. 学习和掌握粗脂肪提取的原理和测定方法。
2. 熟悉和掌握重量分析的基本操作，包括样品的处理、定量转移、烘干、恒
重等。
二实验原理
本法为重量法，用脂肪溶剂将脂肪提出后进行称量。该法适用于固体和液体样品，通常将样品浸于脂肪溶剂，如乙醚或沸点为30-60度的石油醚，借助于索氏提取管进行循环抽提。本法提取的脂溶性物质为脂肪类似物的混合物，其中含有脂肪，游离脂肪酸，磷脂，酯，固醇，芳香油，某些色素及有机酸等，因此，称为粗脂肪。
用该法测定样品含油量时，通常采用沸点低于60度的有机溶剂，此时，样品中结合状态的脂类（脂蛋白）不能直接提取出来，所以该法又称为游离脂类定量测定法。
三仪器、试剂和材料
1 .仪器
索式提取器，分析天平，烧杯，烘箱，干燥器，恒温水浴，脱脂棉，脱脂滤纸，镊子
2 试剂和材料
石油醚芝麻或者花生等油料种子。
四、实验步骤
1.样品的准备
将花生在80度烘箱烘去水分，烘干时需避免过热，冷却后准确地称取1克左右放入研钵中研碎，再用滤纸将样品包裹好放入索氏提取管。注意勿使纸包样品高于提取管的虹吸部分，研磨后的研钵应用滤纸擦净并将滤纸放入提取管，用少量溶剂洗涤研钵，将溶剂倒入提取管中
2.抽提
2.1洗净提取瓶于105度烘干至恒重，记下其重量。装入石油醚达提取瓶容积的
一半，连接提取器各部分，不能漏气（不能用凡士林或真空脂）。
2.2 加热提取：使石油醚每小时循环10-20次，约2-2.5小时，用滤纸粗略判断
脂肪是否提取完全。
2.3 蒸去石油醚，烘干至恒重。
3.称量计算
粗脂肪%=脂肪重÷样品重×100%
思考题
1、索式提取法提取的为什么是粗脂肪？
2、做好本试验应注意哪些事项？
3、本实验装置磨口处为什么不能涂抹凡士林或真空脂？
实验四总氮量的测定——凯氏定氮法
一、实验目的
1、学习微量凯氏定氮法的原理
2、掌握微量凯氏定氮法的操作技术，包括标准硫酸铵含量的测定，未知样
品的消化、蒸馏、滴定及其含氮量的计算等。
二、实验原理
凯氏定氮法常用于测定天然有机物（如蛋白质，核酸及氮基酸等）的含氮量。
天然的含氮有机物与浓硫酸共热时，其中的碳、氢二元素被氧化成二氧化碳和水，而氮则变成氨，并进一步与硫酸作用生成硫酸铵。此时程称之为“消化”。
但是，这个反应进行得比较缓慢，通常需要加入硫酸钾或硫酸钠以提高反应的沸点，并加入硫酸铜作为催化剂，以促进反应的进行。
浓碱可使消化液中的硫酸铵分解，游离出氮，借水蒸汽将产生的氨蒸馏到一定量，一定浓度的硼酸溶液中，硼酸吸收氨后，氨与溶液中的氢离子结合，生成铵离子，使溶液中氢离子浓度降低。然后用标准无机酸滴定，直至恢复溶液中原来氢离子浓度为止，最后根据所用标准酸的当量数（相当于待测物中氨的当量数）计算出待测物中的氮量。
滴定时用甲烯蓝和甲基红混合指示剂，其指示围为pH5.2-5.6，将NH
4H
2 BO
3
的蓝色滴至原来H
3BO
3
的蓝紫色即为终点。
本法适用围0.2-1.0毫克氮。相对误差应小于2%。
三、材料、试剂与器具
（一）材料
人的血清或猪的血清
（二）试剂
1、浓硫酸（化学纯）
2、30%氢氧化钠（分析纯）溶液
3、0.9%NaCl溶液
4、硫酸钾—硫酸铜混合物：硫酸钾与硫酸铜（CuSO
4、5H
2
O）以3：1（W/W）
的配比混合研磨成粉末。
5、2%硼酸
6、混合指示剂的配制：
方法一：取50毫升0.1%甲烯蓝无水醇溶液与200毫升0.1%甲基红无水乙醇溶液混合配成，贮于棕色瓶备用，这种指示剂酸性时为紫色，碱性时为绿色，变色围窄且灵敏。
方法二：0.1%溴甲酚绿乙醇溶液10毫升与0.1%甲基红乙醇溶液2毫升混和即成。
本指示剂的变色围为
紫红色灰色绿色
7．0.01M HCl
8. 硼酸一指示剂混合液：取100毫升2%硼酸溶液，滴加混合指示剂贮备液，摇匀后溶液呈现紫红色即可。（约加1毫升左右混合指示剂）
9.标准硫酸铵溶液（0.3毫克氮/毫升）
（三）、器具
1、凯氏烧瓶
2、消化架
3、吸量管（1毫升、2毫升）
4、量筒（10毫升）
5、凯氏定氮蒸馏装置
6、微量滴定管（3毫升、5毫升，可读至0.02毫升）
7、锥形瓶（50-100毫升）
8、容量瓶（50毫升）
四、操作步骤
（一）样品的处理
血清样品：取人血（或猪血），放于离心管中，于冰箱中放置过液，次日离心除去凝血块，上层黄色透明清液即为血清。准确吸取血清 1.0毫升加入0.9%NaCl 4.0毫升，仔细混匀备用。
固体样品：某一固体样品中的含氮量是100克该物质（干重中所含氮的克数）来表示（%）。因此在定氮前，应将固体样品中的水份除掉。一般样品干燥的温度都采用105℃，因为非游离的水都不能在100℃以下烘干。
在称量瓶中称入一定量的磨碎的样品，然后置105℃的烘箱干燥4小时。用坩埚将称量瓶放入干燥器，待降至室温后称重，按上述操作继续烘干样品。每干燥1小时后，称量一次，直到两次称量的数量不变，即达恒重。
（二）消化
取2个50毫升的凯氏烧瓶，向第一号烧瓶加2毫升稀释血清溶液（或4毫升核酸制品溶液，或200毫克固体粉末）。注意，用吸量管直接将溶液（或用试管加入固体样品）加至烧瓶底部，切勿沾于瓶口或瓶颈上，向2号烧瓶加入2毫升水作空白对照。
在每个烧瓶加入硫酸钾—硫酸铜混合物约0.2克，浓硫酸3毫升，小瓷片两粒，摇匀。将烧瓶约60度角固定在铁架上，每个瓶口放一小漏斗，在通风厨的电炉上消化。
在消化开始时，应控制火力，不要使液体冲到瓶颈。待瓶水汽蒸完，硫酸开始分解并放出SO
2
白烟后，适当加强火力，继续消化，直至消化液呈透明绿色为止。消化完毕，待烧瓶容物冷却后，加蒸馏水10毫升（注意慢加，边加边摇）。冷却后将瓶容物转入50毫升的容量瓶中，并用蒸馏水洗烧瓶数次，溶液一并倒入容量瓶，最后定容至刻度摇匀，做上记号备用。
（三）蒸馏
1、仪器的洗涤：仪器应先经一般洗涤，再经水蒸气洗涤。
蒸馏器有几种，应用前需熟悉其使用方法。使用方法如下：
开放自来水龙头，使水E进入G，从K管流出（水不宜开得过大以免水从G
管溢出）。开放P
3
，使水进入A室，漏斗D中加蒸馏水约10毫升入B室。用拇指
将管口按紧，同时开放P
1
，则B室中的水先从Y型管口冲出，随后A室中水经K 管流出，一般情况下如此重复洗涤两次即可。若蒸馏器有氨存在，则应加入蒸馏水后，不加样品蒸馏一次方可使用。（可用PH试纸检查。）
A为蒸气发生室，P
3为其开关，P
1
为出水开关，B为蒸馏室，与出气室M相遇，
M管插入盛有定量酸液的锥形瓶，B室有Y型管，一端与A室相通，另一端经P
4
与漏斗D相连，可经此将样品及试剂加入B室，F为指形冷凝管，E为进水管，
水经F、G、K而流出，蒸馏时B室进消化好的样品及NaOH, 二者反应产生氨，B 室经M管进入锥形瓶中的酸吸收。
2、滴定标准样品
，使水进入先用标准硫酸铵溶液试验2~3次。蒸馏器洗净后，开放水龙头P
3
A室，水放至A室球部即可。
取3个50毫升的锥形瓶，各准确加入10毫升硼酸（加有混合指示剂）。用表面皿覆盖备用。
加样：用吸管吸取1毫升标准硫酸铵溶液，细心地由漏斗D倾入蒸馏室，再用蒸馏水1毫升清洗漏斗。取一个盛有硼酸—混合指示剂的锥形瓶，置于M管下，
使管口恰好接触硼酸溶液，用量筒从漏斗D加入30%氢氧化钠8毫升，随即将P
4夹紧，并往漏斗加入少量蒸馏水封闭。
蒸馏：用酒精灯加热（应用挡风板将灯围拢，维持火力恒定，沸腾不可高于Y管口以免A室溶液从Y管倒吸，待第一滴蒸馏液从冷凝柱F顶端滴下时起，继续蒸馏5分钟，然后将锥形瓶放低，使导管离开液面再蒸2分钟，最后用蒸馏水洗导管外壁，蒸馏完毕，取下锥形瓶，随即将蒸馏器洗净。）
3、样品及空白蒸馏：用吸量管分别吸取1毫升样品和1毫升蒸馏水按上述操作步骤进行蒸馏。
4、滴定：蒸馏完毕，用0.01N标准盐酸溶液滴定锥瓶溶液至淡紫色或灰色，记录所用盐酸的量。
（四）计算
若样品中除有蛋白外，尚有其他含氮物质，则样品蛋白质含量的测定要更复杂一些。首先需向样品中加入三氯乙酸，使其最终浓度为5%，然后测定未加三氯乙酸的样品及加入三氯乙酸后的样品的上清液中的含氮量，从而计算出蛋白氮，再进一步算出蛋白质的含量。
蛋白氮=总氮—非蛋白氮
蛋白质含量（克/%）=蛋白氮×6.25
五、注意事项
1、凯氏法的优点是适用围广，可用于动植物的各种组织，器官及食品等成组复杂样品的测定，只要细心操作都能得到精确的结果。其缺点是操作比较复杂，含有大量碱性氨基酸的蛋白质测定结果偏高。
2、普通实验室中的空气中常含有少量的氨，会影响结果，所以操作应在单独洁净的房间中进行，并尽可能快地对硼酸吸收液进行滴定。
七、思考题
1、正式测定未知样品前为什么必须测定标准硫酸铵的含氮量及空白？
2、写出以下各步的化学反应式：
①蛋白质消化
②氨的蒸馏
③氨的滴定
3．指出本测定方法产生的误差的原因。
实验五氨基酸分离鉴定——纸层析法
一、实验目的
通过氨基酸的分离，学习纸层析法的基本原理和操作方法。
二、实验原理
纸层析是以滤纸作支持物，用一定的溶剂系统展开，使混合样品达到分离分析的层析方法。其一般操作是将样品溶解在适当溶剂中，点样在滤纸的一端；再选用适当的溶剂系统，从点样的一端通过毛细现象向另一端展开，展开完毕，取出滤纸晾干或烘干，再以适当的显色剂或紫外灯、荧光灯下观察其图谱。样品经展开后其一物质在纸层析谱上的位置常用比移值R f来表示。
纸层析可看作是溶质（样品）在固定相与流动相之间的连续抽提，由于溶质在两相之间的分配系数不同而达到分离。一定的物质在两相间有固定的分配系数，因而在恒定条件（液剂、PH、温度）下，各物质有固定的R f值，据此可达到分析鉴定的目的。
由于滤纸纤维可吸收20～25%的水分；且其中6～7%以氢键形式与纤维素上羟基结合，一般条件下难脱去；所以纸层析实际上是以水相作固定相，展开的溶剂作流动相。
纸层析操作按溶剂展开方向可分为上行、下行和径向三种。氨基酸分离一般用上行法。上行法又分单向（成分较为简单的样品）和双向（单向时斑点重叠分离不开，于是在其垂直方向用另一种溶剂系统展层）。双相层析谱可分辨十几种以上的样品。
层析滤纸要求：
（1）质地均匀，平整无折痕，厚薄适当，溶剂能匀速展开。
（2）机械强度好，溶剂展开后能保持原状，不易折到。
（3）有一定纯度而少杂质，以免影响层析图谱背景。
（4）纤维松紧适宜，一般选用中速滤纸，或根据溶剂选择。如丁醇类粘度大，宜用快速滤纸；而氯仿、石油醚展开快，宜用慢速滤纸。
层析溶剂要求：
（1）被分离物质在该溶剂系统中R f在0.05～0.8之间，各组分之R f值相差最好能大于0.05，以免斑点重叠。
（2）溶剂系统中任一组分与分离物之间不能起化学反应。
（3）分离物质在溶剂系统中的分配较恒定，不随温度而变化，且易迅速达到平衡，这样所得斑点较圆整。
本实验采用八种混合氨基酸为样品，用酸性和碱性两种溶剂进行双向层析，以茚三酮为显色剂，可获得分离清晰的层析图谱。
三、试剂和器材
1、试剂
0.1%（W/V）茚三酮溶丙酮液。
溶剂系统：第一相：正丁醇∶88%甲酸∶水＝15∶3∶2（V/V）；
第二相：正丁醇∶吡啶∶95%乙醇∶水＝5∶1∶1∶1（V/V）。
2、测试样品
标准氨基酸混合溶液：亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丙氨酸、天门
冬氨酸、组氨酸、丝氨酸各100mg溶于50ml 0.01M盐酸中。
3、器材
层析缸25×40cm（×2）；培养皿15cm（×2）；喷雾器；毛细管径0.1cm；电吹风；烘箱。层析滤纸14×11cm；铅笔，尺。
四、操作方法
1、点样
取层析滤纸一（14×11cm），在距纸边1.2cm处划一基线；再将纸转90°，距纸边1.2cm处作一线与上线垂直。以毛细管吸取混合氨基酸溶液，点与二线交点处，点的直径控制在2mm左右，不可过大。待样品干燥后再点一次。滤纸上点样斑点干燥后，把滤纸卷成圆筒形，纸的两边以铬丝相连，但不可重叠相碰。
2、展层
在层析缸中平稳的放入装有第一相层析溶剂的培养皿。将圆筒形滤纸放入，点样一段接触溶剂，以点样处不浸入溶剂为准。待溶剂自下而上均匀展开，约2小时后溶剂到达距纸边0.5cm处取出滤纸，悬挂于室温中，以电吹风充分吹尽溶剂。然后裁去未走过溶剂的滤纸边缘，将滤纸转90°，卷成如前圆筒状，放入盛第二相溶剂的层析缸展开（操作同上），约1小时后溶剂展开到距纸边0.5cm 时取出，以电吹风吹尽溶剂使其干燥。
3、显色
以喷雾器将茚三酮均匀地喷在滤纸上，然后悬滤纸于65℃烘箱加热20分钟，即可看到紫红色氨基酸斑点，将图谱上的斑点用铅笔圈出。
五、注意事项
（1）烘箱加热温度不可过高，且不可有氨的干扰，否则图谱背景会泛红。（2）第一相溶剂最好在使用前再按比例混合，否则会引起酯化影响层析效果。（3）接触滤纸时，要戴手套。
六、思考题：
1、什么叫纸层析法？
2、何谓R
f 值？影响R
f
值的主要因素是什么？
3、怎样制备扩展剂？
4、层析缸中平衡溶剂的作用是什么？
5、酸性与碱性溶剂系统对氨基酸极性基团的解离各有何影响？
实验六蛋白质的性质实验
实验（一）蛋白质的呈色反应
一、实验目的
1.了解构成蛋白质的基本结构单位及主要联接方式。
2.了解蛋白质和某些氨基酸的呈色反应原理。
3.学习几种常用的鉴定蛋白质和氨基酸的方法
二、呈色反应：
(一)双缩脲反应：
1.原理：
尿素加热至180℃左右生成双缩脲并放出一分子氨。双缩脲在碱性环境中能与cu2+结合生成紫红色化合物，此反应称为双缩脲反应。蛋白质分子中有肽键，其结构与双缩脲相似，也能发生此反应。可用于蛋白质的定性或定量测定。
一切蛋白质或二肽以上的多肽部有双缩脲反应，但有双缩脲反应的物质不一定都是蛋白质或多肽。
2.试剂：
(1)尿素： 10克
(2)10%氢氧化钠溶液 250毫升
(3)1%硫酸铜溶液 60毫升
(4)2％卵清蛋白溶液 80毫升
3.操作方法：
取少量尿素结晶，放在干燥试管中。用微火加热使尿素熔化。熔化的尿素开始硬化时，停止加热，尿素放出氨，形成双缩脲。冷后，加10％氢氧化钠溶液约1毫升，振荡混匀，再加1％硫酸铜溶液1滴，再振荡。观察出现的粉红颜色。避免添加过量硫酸铜，否则，生成的蓝色氢氧化铜能掩盖粉红色。
向另一试管加卵清蛋白溶液约l毫升和10％氢氧化钠溶液约2毫升，摇匀，再加1％硫酸铜溶液2滴，随加随摇，观察紫玫色的出现。
(二)茚三酮反应
1.原理：
除脯氨酸、羟脯氨酸和茚三酮反应产生黄色物质外，所有α—氨基酸及一切蛋白质都能和茚三酮反应生成蓝紫色物质。
该反应十分灵敏，1：1 500 000浓度的氨基酸水溶液即能给出反应，是一种常用的氨基酸定量测定方法。
茚三酮反应分为两步，第一步是氨基酸被氧化形成CO
2、NH
3
和醛，水合茚
三酮被还原成还原型茚三酮；第二步是所形成的还原型茚三酮同另一个水合茚三酮分于和氨缩合生成有色物质。
反应机理如下：
此反应的适宜pH为5—7，同一浓度的蛋白质或氨基酸在不同pH条件下的颜色深浅不同，酸度过大时甚至不显色。
2.试剂：
(1)蛋白质溶液 100毫升
2％卵清蛋白或新鲜鸡蛋清溶液(蛋清：水＝1：9)
(2)0.5％甘氨酸溶液 80毫升
(3)0.1％茚三酮水溶液 50毫升
(4)0.1％茚三酮—乙醇溶液 20毫升
3.操作方法：
(1)取2支试管分别加入蛋白质溶液和甘氨酸溶液1毫升，再各加0.5毫升0.1％茚三酮水溶液，混匀，在沸水浴中加热1—2分钟，观察颜色由粉色变紫红色再变蓝。
(2)在一小块滤纸上滴一滴0.5％的甘氨酸溶液，风干后，再在原处滴上一滴0.1％的茚三酮乙醇溶液在微火旁烘干显色，观察紫红色斑点的出现。
(三)黄色反应：
1.原理：
含有苯环结构的氨基酸，如酪氨酸和色氨酸遇硝酸后，可被硝化成黄色物质，该化合物在碱性溶液中进一步形成深橙色的硝醌酸钠。反应式如下：
多数蛋白质分子含有带苯环的氨基酸，所以有黄色反应，苯丙氨酸不易硝化，需加入少量浓硫酸才有黄色反应。
2.试剂：
(1)鸡蛋清溶液 100毫升
将新鲜鸡蛋的蛋清与水按1：20混匀，然后用六层纱布过滤。
(2)大豆提取液 100毫升
将大豆浸泡充分吸胀后研磨成浆状用纱布过滤。
(3)头发
(4)指甲
(5)0.5％苯酚溶液 50毫升
(6)浓硝酸 200毫升
(7)0.3％色氨酸溶液 10毫升
(8)0.3％酪氨酸溶液 10毫升
(9)10％氢氧化钠溶液 100毫升
3.操作方法：
向7个试管中分别按下表加入试剂，观察各管出现的现象，有的试管反应慢可略放置或用微火加热。待各管出现黄色后，于室温下逐滴加入10％氢氧化钠溶液至碱性，观察颜色变化。
(四)乙醛酸反应
1.原理：
在浓硫酸存在下，色氨酸与乙醛酸反应生成紫色物质,反应机理尚不清楚，可能是一分子乙醛酸与两分子色氨酸脱水缩合形成与靛蓝相似的物质。
含有色氨酸的蛋白质也有此反应。
2.试剂：
(1)蛋白质溶液 100毫升
鸡蛋清：水＝1：20
(2)0.03％色氨酸溶液 10毫升
(3)冰醋酸 200毫升
(4)浓硫酸(分析纯) 100毫升
3.操作方法：
取3支试管。编号。分别按上表加入蛋白质溶液、色氨酸溶液和水，然后各加入冰醋酸2毫升。混匀后倾斜试试管，沿管壁分别缓缓加入浓硫酸约I毫升，静置。观察各管液面间紫色环的出现。若不明显，可于水浴中微热
实验（二）蛋白质的沉淀反应
一、蛋白质等电点的测定：
1.目的：
(1)了解蛋白质的两性解离性质。
(2)学习测定蛋白质等电点的一种方法
2.原理：
蛋白质是两性电解质。在蛋白质溶液中存在下列平衡：
蛋白质分子的解离状态和解离程度受溶液的酸碱度影响。当溶液的pH达到一定数值时，蛋白质颗粒上正负电荷的数日相等，在电场中，蛋白质既不向阴极移动，也不向阳极移动，此时溶液的pH值称为此种蛋白质的等电点。不同蛋白质各有其特异的等电点。在等电点时，蛋白质的理化性质都有变化，可利用此种性质的变化测定各种蛋白质的等电点。最常用的方法是测其溶解度最低时的溶液pH值。
本实验借观察在不同pH溶液中的溶解度以测定酪蛋白的等电点。用醋酸与酷酸钠(醋酸钠混合在酪蛋白溶液中)配制成各种不同pH值的缓冲液。向诸缓冲溶液中加入酪蛋白后，沉淀出现最多的缓冲液的pH值即为酪蛋白的等电点。
3.器材：
(1)水浴锅。
(2)温度计。
(3)200毫升锥形瓶。
(4)100毫升容量瓶。
(5)吸管。
(6)试管。
(7)试管架。
(8)乳钵。
4.试剂：
(1)0.4％酪蛋白醋酸钠溶液 200毫升
取0.4克酪蛋白，加少量水在乳钵中仔细地研6，将所得的蛋白质悬波移入200毫升锥形瓶，用少量40～50℃的温水洗涤乳钵，将洗涤液也移入锥形瓶。加入10毫升1当量/升醋酸钠溶液。把锥形瓶放到50℃水浴中，并小心地旋转锥形瓶，直到酪蛋白完全溶解为止。将锥形瓶的溶液全部移至100毫升容量瓶，加水至刻度，塞紧玻塞，混匀。
(2)1.00当量／升醋酸溶液 100毫升
(3)0.10当量／升醋酸溶液 100毫升
(4)0.01当量／升醋酸溶液 50毫升
5.操作方法：
(1)取同样规格的试营4支，按下表颠序分别精确地加入各试剂，然后混匀。
(2)向以上试管中各加酪蛋白的醋酸钠溶液1毫升，加一管，摇句一管。此时1、2、3、4管的pH值依次为5.9、5.3、4.7、3.5。观察其混浊度。静置10分钟后，再观察其混浊度。最混浊的一管的pH即为酪蛋白的等电点。
二、蛋白厦的沉淀及变性：
1.目的：
(1)加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的认识。
(2)了解沉淀蛋白质的几种方法及其实用意义。
(3)了解蛋白质变性与沉淀的关系。
2.原理：
在水溶液中的蛋白质分子由于表面生成水化层和双电层而成为稳定的亲水胶体颗粒，在一定的理化因素影响下，蛋白质颖拉可因失去电荷和脱水而沉淀。
蛋白质的沉淀反应可分为两类。
(1)可逆的沉淀反应：
此时蛋白质分子的结构尚未发生显著变化，除去引起沉淀的因素后，蛋白质的沉淀仍能溶解于原来的溶剂中，并保持其天然性质而不变性。如大多数蛋白质的盐析作用或在低温下用乙醇(或丙酮)短时间作用于蛋白质。提纯蛋白质时，常利用此类反应。
(2)不可逆沉淀反应：
此时蛋白质分子部结构发生重大改变，蛋白质常变性而沉淀，不再溶于原来溶剂中。加热引起的蛋白质沉淀与凝固，蛋白质与重金届离子或某些有机酸的反应都属于此类。
蛋白质变性后，有时由于维持溶液稳定的条件仍然存在(如电荷)，并不析出。因此变性蛋白质并不一定部表现为沉淀，而沉淀的蛋白质也未必都已变性。
3.试与材料：
(1)蛋白质溶液 500毫升
5％卵清蛋白溶液或鸡蛋清的水溶液(新鲜鸡蛋清：水＝1：9)
(2)pH4.7醋酸—醋酸钠的缓冲溶液 100毫升
(3)3%硝酸银溶液 10毫升
(4)5％三氯乙酸溶液 50毫升
(5)95％乙醇 250毫升
(6)饱和硫酸铵溶液 250毫升
(7)硫酸铵结晶粉末 1000克
(8)0.1当量／升盐酸溶液 300毫升
(9)0.1当量／升氢氧化钠溶液 100毫升
(10)0.1当量/升碳酸钠溶液 100毫升
(11)0.1当量/升醋酸溶液 100毫升
(12)甲基红溶液 20毫升
(13)2％氯化钡溶液 150毫升
4.操作方法：
(1)蛋白质的盐析。
无机盐(硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等)浓溶液能析出蛋白质。盐的浓度不同，析出的蛋白质也不同。
如球蛋白可在半饱和硫酸铵溶液中析出，而清蛋白则在饱和硫酸铵溶液中才能析出。由盐析获得的蛋白质沉淀，当降低其盐类浓度时，又能再溶解，故蛋白质的盐析作用是可逆过程。
加5％卵清蛋白溶液5毫升于试管中，再加等量的饱和硫酸铵溶液，混匀后静置数分钟则析出球蛋白的沉淀。倒出少量混蚀沉淀，加少量水，是否溶解，为什么？将管容物过滤，向滤液中添加硫酸铵粉末到不再溶解为止，l此时析出的沉淀为清蛋白。取出部分清蛋白，加少量蒸馏水，观察沉淀的再溶解。
(2)重金属离子沉淀蛋白质
重金属离子与蛋白质结合成不溶于水的复合物。取一支试管，加入蛋白质溶液2毫升，再加3％硝酸银溶液1～2滴，振荡试管，有沉淀产生。放置片刻，倾出上消液，向沉淀中加入少量的水，沉淀是否溶解？为什么？
(3)某些有机酸沉淀蛋白质
取一支试管，加入蛋白质溶液2毫升，再加入1毫升5％三氯乙酸溶液，振荡试管，观察沉淀的生成。放置片刻，倾出上清液，向沉淀中加入少量水，观察沉淀是否溶解。
(4)有机溶剂沉淀蛋白质
取一支试管，加入2毫升蛋白质溶液，再加入2毫升95％乙醇。混匀，观察沉淀的生成。
(5)乙醇引起的变性与沉淀
取3支试管，编号。依下表顺序加入试剂：
振摇混匀后，观察各管有何变化。放置片刻，向各管加水8毫升，然后在第2、3号管中各加一滴甲基红．再分别用0.1当量／升醋酸溶液及0.1当量／升碳酸钠溶液中和之。观察各管颜色的变化和沉淀的生成。每管再加0.1当量／升盐酸溶液数滴，观察沉淀的再溶解。解释各管发生的全部现象。
思考题：
1、通过本实验课你掌握了几种鉴定蛋白质和氨基酸的方法？这些方法的原理
是什么？
2、什么叫蛋白质的等电点？
3、举例说明蛋白质沉淀与变性的关系。