方案一:GST标签的蛋白纯化
1.200mL菌液离心所得的菌体用80mL 1×PBS 重悬,置于冰上超声10min(超声5s,停10s)。
2.超声所得产物留样1mL,剩余样品4℃,12000rpm离心30min。
3.收集上清,用0.45um的过滤器过滤,留样1mL 。沉淀用20mL 1×PBS 重悬,留样1mL。
沉淀于-30℃保存。
4.准备Binding Buffer 1×PBS,pH=7.3
Elution Buffer 50mM Tris-HCl,10mM 还原型谷胱甘肽,pH=8.0
分别加入1mM DTT用于洗脱和结合
8. 将Binding Buffer与柱子混合,500g、5min离心弃上清
9、用PBS洗3次混匀缓和离心,500g、5min离心弃上清
10.加入样品结合孵育1-2h500g、5min离心弃上清
11.使用Elution Buffer洗柱,(或者使用2mol/L,4,6,8,尿素各洗一次柱,收集相应产物)共收
集10柱体积的产物。剩余Elution Buffer用于去除杂蛋白。
12将沉淀留样使用电磁炉煮沸5min,12000rpm离心10min,吸取上清。同蛋白产物一同进
行SDS-PAGE电泳。
未诱导诱导上清沉淀Elution
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方案二:1.200mL菌液离心所得的菌体用80mL 1×PBS 重悬,置于冰上超声10min(超声
5s,停10s)。
2.超声所得产物留样1mL,剩余样品4℃,12000rpm离心30min。
3.离心后沉淀为包涵体,加入8M尿素重悬,静置半小时,12000 rpm 离心10min,上清即
为溶解的包涵体。