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固相萃取_超高效液相色谱分离测定洗涤用品中4种荧光增白剂_冼燕萍

2013年2

月Vol．31No．2February 2013

Chinese Journal of Chromatography

162 169

技术与应用

DOI :10．3724/SP．J．1123．2012．09041

*通讯联系人．E-mail ：docwu@126．com．

基金项目：国家质检总局科技项目（2009QK325）．收稿日期：2012-

09-28固相萃取-超高效液相色谱分离测定洗涤用品中4种荧光增白剂

冼燕萍，郭新东，罗海英，吴玉銮*

，陈意光，罗东辉，吴文海

（广州市质量监督检测研究院国家化妆品质量监督检验中心（广州），广东广州510110）

摘要：建立了固相萃取净化结合超高效液相色谱-二极管阵列检测器（UPLC-DAD ）同时检测洗衣液、洗衣粉等洗涤用品中荧光增白剂351、85、28和71的分析方法。样品经2%（体积分数）甲酸水溶液-甲醇提取，经WAX 固相萃取小柱净化后，采用Phenomenex Synergi Max-RP 色谱柱（150mm ?2.0mm ），以乙腈-10mmol /L 乙酸铵为流动相实现待测物（包括顺式和反式异构体）的良好分离，

以二极管阵列检测器检测，结合保留时间和光谱图定性，以标准曲线定量。结果表明，4种荧光增白剂在0.05 180mg /L 范围内线性关系良好，相关系数均大于0.9993；方法定量限（S /N =10）为1.5 15mg /kg ；添加水平为5 1500mg /kg 时，回收率为84.9% 105%，相对标准偏差（RSD ，n =6）为3.2% 6.1%。应用本方法分析了15个样品，阳性样品检出率为53.3%。该法前处理简单，回收率高，精密度好，适用于洗涤用品中4种荧光增白剂的测定。

关键词：固相萃取；超高效液相色谱-二极管阵列检测器；荧光增白剂；洗涤用品中图分类号：O658

文献标识码：A

文章编号：1000-

8713（2013）02-0162-08Determination of four fluorescent whitening agents in laundry

detergents by solid phase extraction combined with ultra-high performance liquid chromatography

XIAN Yanping ，GUO Xindong ，LUO Haiying ，WU Yuluan *，

CHEN Yiguang ，LUO Donghui ，WU Wenhai

（Guangzhou Quality Supervision and Testing Institute ，National Centre for Quality Supervision

and Testing of Cosmetics （Guangzhou ），Guangzhou 510110，China ）

Abstract ：A new method was established to determine three stilbene-type disulfonate and one distyrylbi-phenyl-type fluorescent whitening agents （FWA351，FWA85，FWA28and FWA71）in laundry deter-gents by solid phase extraction （SPE ）and ultra-high performance liquid chromatography with a diode ar-ray detector （UPLC-DAD ）．The fluorescent whitening agents were extracted from laundry detergents with 2%formic acid aqueous solution and methanol ，and purified by WAX SPE column ，and analyzed by UP-LC-DAD on a Phenomenex Synergi Max-RP column （150mm ?2.0mm ），employing acetonitrile-10mmol /L ammonium acetate as the mobile phase in a gradient elution mode．The fluorescent whitening a-gents were qualitatively determined by retention time ，and confirmed by the ultraviolet spectrum．The re-sults indicated that the target analytes were in the range of 0.05－180mg /L with the correlation coeffi-cients （r ）greater than 0.9993，and the method limits of quantification （MLOQ ）of target analytes were ranged from 1.5mg /kg to 15mg /kg （S /N =10）．The feasibility of this method was demonstrated by the determination of FWAs in samples with spiked recoveries．The recoveries were in the range between 84.9%and 105%，and the precision （relative standard deviation ，RSD ）ranged from 3.2%to 6.1%（n =6）．Among the 15samples analyzed ，the rate of positive samples was 53.3%，over 1000mg /kg of FWA351and FWA71were detected．The method is simple ，precise and has high recoveries for the deter-mination of fluorescent whitening agents in laundry detergent samples．

Key words ：solid-phase extraction （SPE ）；ultra-high performance liquid chromatography-diode array de-

第2期冼燕萍，等：固相萃取-超高效液相色谱分离测定洗涤用品中4种荧光增白剂tector（UPLC-DAD）；fluorescent whitening agents（FWAs）；laundry detergents

荧光增白剂（fluorescent whitening agents，FWA）可以提高基体的白度和保证基体的亮度，在洗涤用品、纺织品、纸张、涂料和塑料制品中的应用越来越广泛。纺织品在使用过程中会逐渐变黄，而洗涤剂中的荧光增白剂在洗涤过程中吸附在织物纤维上，吸收紫外光后，发射出的蓝紫色荧光补偿了纤维的黄色光，在视觉上认为被洗涤的白色织物洁白、明亮，从而会认为含荧光增白剂的洗涤剂具有更好的洗涤效果。我国允许在衣物洗涤剂中添加二苯乙烯基联苯类（如4，4'-双（2-磺酸钠苯乙烯基）联苯（disodium4，4'-bis（2-sulfonatostyryl）biphenyl，FWA351）等）和双三嗪氨基二苯乙烯类（如4，4'-双［（4-苯胺基-6-羟乙基氨基-1，3，5-三嗪-2-基）氨基］二苯乙烯-2，2'-二磺酸二钠盐（disodium4，4'-bis ［（4-anilino-6-hydroxyethylamino-1，3，5-triazin-2-yl）amino］stilbene-2，2'-disulphonate，FWA85）、4，4'-双［（6-苯胺基-4，4'-二羟乙基-氨基-1，3，5-三嗪-2-基）氨基］二苯乙烯-2，2'-二磺酸二钠盐（disodium4，4'-bis［6-anilino-［4-［bis（2-hydroxyethyl）amino］-1，3，5-triazin-2-yl］amino］stilbene-2，2'-disulphonate，FWA28）、4，4'-双［（4-苯胺基-6-吗啉基-1，3，5-三嗪-2-基）氨基］二苯乙烯-2，2'-二磺酸二钠盐（disodium 4，4'-bis［（4-anilino-6-morpholino-1，3，5-triazin-2-yl）amino］stilbene-2，2'-disulphonate，FWA71）等）荧光增白剂，但没有规定最大使用量，也没有相关检测方法。虽然有资料表明这两类荧光增白剂是低毒的［1，2］，但也可能因其大量的使用而产生环境污染和人体危害［3－12］，因此，为了维护消费者权益、监管洗涤用品质量和评估环境影响，有必要建立洗涤用品中荧光增白剂的定性定量检测方法。

国内外关于荧光增白剂的检测方法主要有紫外灯照射观测法［13］、荧光分光光度法［3］、液相色谱法［4－9］和液相色谱-串联质谱法［10－12］。紫外灯照射观测法只能检测样品中荧光增白剂的总量，不能鉴定荧光增白剂的品种；液相色谱法和液相色谱-串联质谱法均可应用于荧光增白剂的定性和定量检测，由于荧光增白剂的含量高，液相色谱法应用更广泛。文献报道多采用离子对试剂进行色谱分离和荧光检测器检测，如Shu等［6，7］应用离子对试剂（tetrabutyl-ammonium hydrogen sulfate，TBA）-液相色谱/荧光检测器检测洗涤剂和地表水、婴幼儿纺织品和纸张中的5种荧光增白剂，其中包括FWA28、FWA351和FWA71；Chen等［10，11］应用离子对试剂（di-n-hexyl-ammonium acetate，DHAA）-液相色谱/质谱实现环境水、婴幼儿纺织品和纸张中5种荧光增白剂的分离和检测，其中也包括了FWA28、FWA351和FWA71；练习中等［8］应用离子对试剂（TBA）-液相色谱/荧光检测器检测了食品中的荧光增白剂（包括FWA87、FWA251和FWA71）；邓凯芬等［9］应用液相色谱/荧光检测器检测纸塑包装中荧光增白剂FWA85。但离子对试剂可与固定相结合产生不可逆吸附，较难从色谱柱上洗脱，缩短了色谱柱的使用寿命；而且荧光增白剂易受溶剂极性、溶液pH、光照等因素的影响转变为顺式异构体，荧光消失，导致荧光检测器检测不出顺式结构，只能检测反式异构体［3，14－16］。

本文利用超高效液相色谱-二极管阵列检测器（UPLC-DAD）对洗涤用品中4种荧光增白剂（结构式见图1）进行定性和定量研究，并借助超高效液相色谱-质谱/质谱（UPLC-MS/MS）对待测物进行定性确证，表明了UPLC-DAD可以实现4种荧光增白剂的顺式和反式异构体的良好分离和准确检测，检测结果更能反映样品中待测物的含量情况，可更好地为相关企业和有关监管部门提供检测技术支持。

1实验部分

1．1仪器、试剂与材料

Acquity TM超高效液相色谱仪，配光电二极管阵列检测器（UPLC-PAD，Waters公司）；Acquity TM超高效液相色谱和Waters Xevo TM TQ MS三重四极杆串联质谱仪（UPLC-MS/MS，Waters公司）；LD5-2A 离心机（北京京立离心机有限公司）；MS3basic漩涡混合器（德国IKA公司）；KQ-250DV型数控超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司）；Milli-Q去离子水发生器（美国Millipore公司）；固相萃取装置（Waters公司）；Waters Oasis WAX固相萃取小柱：3 mL/60mg，30μm，临用前依次用3mL甲醇和3mL 水活化。

4种待测化合物对照品/参照品：FWA351（纯度＞98.0%）由TCI（梯希爱）公司提供；FWA28（纯度约为76%）由Sigma公司提供；FWA85（纯度约为

87%）和FWA71（纯度约为97%）由International laboratory（U．S．A）提供；其中FWA28、FWA85和FWA71的纯度是通过液相色谱分离后，以归一法计算得到。甲醇和乙腈（HPLC级，德国Merck公司），

361

色谱第31

卷

图14种荧光增白剂的结构式

Fig．1

Structures of four fluorescent whitening agents （FWAs ）

乙酸铵（HPLC 级，Sigma 公司），甲酸（HPLC 级，

CNW 公司），氨水（AR ，含量为25%，广州），超纯水（18.2M Ω·cm ）。10个洗衣液样品、5个洗衣粉样品均购于本地市场。1．2标准溶液的配制

称取各荧光增白剂对照品/参照品，用甲醇配制成质量浓度（按相应纯度折算）为5000mg /L 的标准贮备液。分别准确移取适量的标准贮备液于25mL 棕色容量瓶中，以水配成FWA28、FWA85和FWA71质量浓度均为300mg /L 、FWA351质量浓度为50mg /L 的混合标准溶液。以水稀释成7个浓度水平的混合标准工作液：FWA28、

FWA85和FWA71的质量浓度为0.3、

0.6、1.8、9、45、90、180mg /L ；FWA351的质量浓度为0.05、0.1、0.3、1.5、7.5、15、30mg /L 。1．3仪器条件

1．3．1

UPLC-PAD 检测条件

色谱柱：Phenomenex Synergi Max-RP 柱（150mm ?2.0mm ，4μm ，孔径8nm ）；流动相：A．10mmol /L 乙酸铵，B．乙腈。梯度洗脱程序：0.0 8.0min ，80%A 72%A ；8.0 13.0min ，72%A 62%A ；13.0 15.0min ，62%A 20%A ；15.0 18.0min ，20%A ；18.0 18.1min ，20%A 80%A ；18.1 22.0min ，80%A 。流速：0.5mL /min ；进样量：5μL ；柱温：25?；检测波长：350nm 。1．3．2

UPLC-MS /MS 检测条件

色谱条件同1.3.1节。

质谱条件：电喷雾离子源（ESI ），负离子扫描模式，毛细管电压1.0kV ；离子源温度150?；去溶剂气温度500?；去溶剂气：氮气，

800L /h ；锥孔气：氮气，

50L /h ；碰撞气：高纯氩气，0.2mL /min ；检测模式：多反应监测（MRM ）模式；4种化合物均选择响

应最高的［M －2Na ］2－

为母离子，各监测离子对

（m /z ）及锥孔电压、碰撞能等参数见表1，每个离子对的驻留时间均为0.04s 。

表14种待测物的质谱分析条件

Table 1MS parameters for the analysis of the

four compounds

Compound Precursor ion （m /z ）Daughter ion （m /z ）Cone voltage /V Collision energy /eV

FWA85413．3311．0*4025271．24025FWA28457．3333．2*

4525293．14530FWA351258．2226．2*

3520194．13522FWA71

439．3

284．3*

4030324．2

*Transitions for quantification．

1．4

样品的处理

称取0.5g （精确至0.001g ）试样于10mL 具塞比色管中，加入5mL 2%（体积分数）甲酸水溶液，

涡旋、超声溶解后，用甲醇定容，混匀，以2500r /min 离心5min ，待净化。

吸取1.0mL 提取清液于已活化的WAX 固相

461·

第2期

冼燕萍，等：固相萃取-超高效液相色谱分离测定洗涤用品中4种荧光增白剂

萃取小柱中，自然流出后，依次用5mL 25mmol /L 乙酸铵溶液（pH 4）、3mL 甲醇淋洗，用5mL 5%氨化甲醇洗脱，

接收洗脱液，于40?水浴中氮吹浓缩至干，

用50%（体积分数）甲醇水溶液定容至1.0图3图2中7个色谱峰的光谱图Fig．3

Ultra-violet spectra of the seven peaks in Fig．2

mL ，经聚四氟乙烯（PTFE ）滤膜过滤后测定。

结果与讨论

2．1

荧光增白剂对照品/参照品存在的问题

所研究的4种待测物均属于二苯乙烯型荧光增

白剂，有顺式和反式两种异构体。反式异构体在270nm 和349nm 有明显吸收，其中349nm 对应于二苯乙烯分子的共轭体系，

270nm 处是苯胺基团的吸收峰，而顺式异构体在270nm 处呈现明显的吸收峰，

349nm 处的吸收强度减弱并发生蓝移［14－16］。FWA351没有苯胺基团，故只有明显的349nm 吸收峰，其顺式异构体的紫外吸收蓝移至340nm 。

由于目前还无法买到纯度高的荧光增白剂标准品，

本实验根据液相色谱条件和对应色谱峰的光谱图，

结合UPLC-MS /MS 分析，确定待测物及其顺式和反式异构体，并以归一化法计算相应参照品的纯

度，

以每种待测物的顺式和反式异构体的2个色谱峰面积之和为其相应浓度的峰面积进行计算。

各待测物的混合标准溶液（包括顺式和反式异构体）的液相色谱图、光谱图分别见图2和图3。

其

图2各待测物混合标准溶液的液相色谱图

Fig．2Chromatogram of a standard mixture

of the analytes Peaks ：1．cis -FWA85；2．trans -FWA85；3．trans -FWA28；4．cis -FWA351；5．trans -

FWA351；6．trans -FWA71；7．cis -FWA71．中，FWA28只有反式异构体，其余3种目标物均包

含顺式和反式异构体。各化合物的保留时间分别为：FWA85（顺） 3.990min ，FWA85（反） 4.968min ；FWA28（反） 6.034min ；FWA351（顺）8.472min ，FWA351（反）9.692min ；FWA71（反）10.667min ，FWA71（顺）11.616min 。

561·

色谱第31卷

2．2

色谱分析条件的优化

对比了4根不同的反相色谱柱：柱1为三键键合的Waters Acquity UPLC BEH C18（100mm ?2.1mm ，1.7μm ）；柱2为单键键合C18、内嵌极性酰胺

基团、

TMS （三甲基硅烷基）封端的Waters Acquity UPLC BEH Shield RP18（50mm ?2.1mm ，1.7μm ）；柱3为单键键合C18、

TMS 封端的Phenomenex Luna C18（2）（150mm ?2.00mm ，3μm ，孔径10nm ）；柱4为单键键合C12、TMS 封端的Phenomenex Synergi Max-RP （150mm ?2.00mm ，4μm ，孔径8

nm ）色谱柱。不同色谱柱的分析谱图见图4

。

图4不同色谱柱对4种荧光增白剂的分离色谱图的对比Fig．4Comparison of chromatograms of the four FWAs

on different columns

a．Waters Acquity UPLC BEH C18（100mm ?2.1mm ，1.7

μm ），acetonitrile-3%TBA （pH 8）as mobile phase ；b．Waters Ac-quity UPLC BEH C18（100mm ?2.1mm ，

1.7μm ）；c．Waters Ac-quity UPLC BEH Shield RP18（50mm ?

2.1mm ，1.7μm ）；d．Phenomenex Luna C18（2）（150mm ?2.00mm ，3μm ）；e．Phe-nomenex Synergi Max-RP （150mm ?2.00mm ，4μm ）．Mobile

phase of b ，c ，d ，e was acetonitrile-10mmol /L ammonium acetate．

The peaks are the same as in Fig．2．

在4根色谱柱中，由于4种荧光增白剂在水溶

液中以阴离子的形式存在，

以水作为流动相的水相时，由于待测物的大分子结构的空间位阻在反相色

谱柱上呈现弱保留，

无法完全分离；使用阳离子型离子对试剂TBA 时，

增强了待测物与固定相的结合能力，可以较好地分离，但FWA71反式异构体的响应很低；使用10mmol /L 乙酸铵-乙腈为流动相时，均

可实现分离，

但柱1的色谱峰顶部分叉，峰形最差，柱2和柱3的峰形前伸，而柱4的峰形最佳，分离度

最好。因此，本实验确定选用柱4（Phenomenex Syn-ergi Max-RP 色谱柱），并初步选用乙酸铵或其他盐溶液为流动相的水相。

在Synergi Max-RP 色谱柱上进一步比较了甲醇和乙腈两种有机相、

10mmol /L 乙酸铵和10mmol /L KH 2PO 4溶液两种水相对待测物色谱行为的影响。

试验发现：乙腈比甲醇具有更好的洗脱能力和分离效果；使用10mmol /L KH 2PO 4的保留时间比10mmol /L 乙酸铵的保留时间延长，FWA351的峰形稍呈拖尾（见图5）。因此，本实验选用乙腈-10mmol /L 乙酸铵为流动相，采用梯度洗脱，液相色谱图见图2

。

图5

使用不同流动相时4种荧光增白剂在Synergi Max-RP 色谱柱上的色谱图对比

Fig．5Comparison of chromatograms of the four

FWAs on Synergi Max-RP column with

different mobile phases

a．methanol-10mmol /L ammonium acetate ；b．acetonitrile-10mmol /L ammonium acetate ；c．acetonitrile-10mmol /L KH 2PO 4．The peaks are the same as in Fig．2．

2．3

前处理净化条件的优化

考察了HLB （Waters ，3mL /60mg ）、

MAX （Wa-ters ，3mL /60mg ）、WAX （Waters ，3mL /60mg ）和NH 2（Phenomenex ，3mL /500mg ）4种固相萃取柱对待测物的净化回收效果，结果见表2。

4种待测物均含有磺酸基（-SO －3），酸性强（p K a ＜1），亲水性强。MAX 固相萃取小柱属于混合型强

阴离子交换柱，待测物的磺酸基与柱上的季铵阳离子结合，难以洗脱；HLB 固相萃取小柱属于亲水、亲酯的通用型固相萃取柱，待测物难以与亲水性和亲脂性吸附点紧密结合，净化效果较差；WAX 固相萃取小柱属于混合型弱阴离子交换柱，柱上的哌嗪环与待测物形成离子型吸附，用甲醇淋洗，可有效去除有机杂质，净化效果和回收率良好；NH 2固相萃取小柱上的脂肪族氨丙基在一定pH 条件下对水溶液中的阴离子选择性吸附，但由于这种伯胺基团的p K a 大约为9.8，需要使用碱性较强的洗脱液（p K a ≥11.8），使用12%氨水甲醇作为洗脱液，氮吹耗时较长，回收不理想，且过柱速度较慢。因此，本实验选用WAX 固相萃取柱对洗涤用品中的荧光增白剂进

·661·

第2期冼燕萍，等：固相萃取-超高效液相色谱分离测定洗涤用品中4种荧光增白剂

行净化处理。

表24种固相萃取小柱对待测物的净化回收率和

相对标准偏差（RSD）（n=3）

Table2Purification recoveries and relative standard

deviations（RSDs）of the analytes by four

SPE columns（n=3）%

Analyte

Recovery（RSD）

HLB MAX WAX NH2

FWA35162．3（11．2）0101（2．6）81．7（9．1）

FWA8564．4（12．7）092．6（4．3）89．5（7．5）

FWA2878．4（7．0）094．9（3．7）85．5（4．8）

FWA7178．8（8．4）093．1（3．2）78．3（5．9）

由于洗衣粉一般呈弱碱性，为了使WAX小柱更好地吸附待测物，故选用2%甲酸水溶液溶解样品，使样品溶液呈弱酸性，并以甲醇消除洗衣粉溶解时产生的泡沫。

2．4线性关系、检出限和定量限

按1.3.1节方法测定1.2节所述的待测物标准溶液系列。FWA351在0.05 30mg/L范围内、FWA85和FWA28在0.3 180mg/L范围内、FWA71在0.6 180mg/L范围内与峰面积呈线性关系。各种待测物的线性回归方程、相关系数（r）、仪器检出限（ILOD，S/N=3，以纯标准溶液测定）及方法定量限（MLOQ，S/N=10，通过在样品基质中加入标准溶液进行前处理后测定，结合样品称样量和稀释倍数计算出来）见表3。由表3可知：4种待测物在各自的线性范围内线性关系良好，相关系数均大于0.999；ILOD为0.02 0.2mg/L；MLOQ为1.5 15mg/kg。

表3待测物的线性方程、相关系数、仪器检出限和方法定量限Table3Regression equations，correlation coefficients

（r），the instrument limits of detection（IL-

OD）and the method limit of quantification

（MLOQ）of the analytes

Analyte Regression equation r

ILOD/

（mg/L）

MLOQ/

（mg/kg）

FWA351y=62595x+995．140．99970．021．5 FWA85y=12071x+1641．10．99930．18

FWA28y=12406x+937．530．99940．18

FWA71y=8236．6x+525．380．99930．215 y：peak area；x：mass concentration，mg/L．

2．5方法回收率与精密度

选取不含待测物的阴性洗衣液和洗衣粉样品进行加标回收试验，6次平行测定的回收试验结果见表4。不同样品在添加浓度范围内，FWA351、FWA85、FWA28和FWA71的回收率分别为92.5% 103%、86.9% 95.3%、92.5% 105%和84.9% 101%，RSD为3.2% 6.1%。

表4回收率和精密度测定结果（n=6）

Table4Determination results of recovery and

precision（n=6）

Analyte

Spiked/

（mg/kg）

Liquid laundry

detergent

Recovery/%RSD/%

Powder laundry

detergent

Recovery/%RSD/% FWA351597．43．993．74．5

2598．84．195．94．3

2501033．292．53．6

FWA853086．95．191．34．9

15095．34．794．15．2

150092．14．389．45．9

FWA283092．54．295．15．3

15096．14．993．84．5

150098．64．41056．1

FWA713089．74．984．95．5

15093．44．591．74．3

15001013．596．24．8

表515份样品中4种荧光增白剂的含量

Table5Contents of the four fluorescent whitening

agents in15samples mg/kg Sample No．FWA351FWA85FWA28FWA71 Liquid1*644．3400．6－10．

4 detergent2－－－

－

390．2－－

－

4582．7－－

－

5－－－

－

6－－－

－

71083－－

－

8－－－

－

9－－－

－

10－－－

－Powder1183．424．1－1544

detergent1219．0539．315．619．

1322．1－－

－

1446．5－－

2．7

15－－－

－*Baby use；－：not detected．

2．6实际样品的检测

使用本方法测定了本地市场上购买的10个洗衣液样品和5个洗衣粉样品，检测结果见表5。表5的数据表明：15个样品中，检出阳性样品8个，阳性样品检出率为53.3%；4种待测物中，FWA351的检出率最高，为53.3%，含量范围为22.1 1083 mg/kg，表明洗涤用品中较多使用该种荧光增白剂；在样品（洗衣粉）12中，同时检出了4种目标物，其液相色谱图见图6，采用液相色谱-质谱按1.3.2节方法确证的提取离子色谱图见图7。

3结论

建立了同时测定洗涤用品中4种荧光增白剂（FWA85、FWA28、FWA351和FWA71）的超高效液相色谱-二极管阵列检测方法。洗衣液和洗衣粉样品中的阴离子型荧光增白剂通过2%甲酸水溶液溶解，甲醇提取，WAX固相萃取小柱净化，获得较好的

761

色谱第31

卷

图6阳性洗衣粉样品的UPLC 色谱图Fig．6UPLC chromatogram of a positive sample

The peaks are the same as in Fig．

2．

图7阳性洗衣粉样品的提取离子色谱图

Fig．7Selected ion chromatograms of a positive sample

净化效果；采用Synergi Max-RP 色谱柱，以乙腈-10mmol /L 乙酸铵进行梯度洗脱，获得良好的分离度

（包括顺式和反式异构体），根据保留时间和光谱图定性，

标准工作曲线定量。通过对方法回收率、精密度等方法学技术指标的研究，表明方法具有较高的

回收率和精密度，且方法的前处理简单，可为定性和定量分析洗涤用品中荧光增白剂（包括顺式和反式异构体）提供一种准确有效的检测方法。

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第2期冼燕萍，等：固相萃取-超高效液相色谱分离测定洗涤用品中4种荧光增白剂

参考文献：

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固相萃取柱知识点

1、使用阳离子固相萃取柱前为什么要用甲醇和水活化要是使用的是高聚物基质的阳离子柱，可直接上样，不用活化，要是使用的是硅胶基质的阳离子柱，活化是为了打开键合在硅胶上的碳基团链，使之充分发生作用，甲醇是为了与碳链互溶，用水过度是为了能和样品溶液相溶。 2、固相萃取技术原理及应用一、固相萃取基本原理与操作 1、固相萃取吸附剂与目标化合物之间的作用机理固相萃取主要通过目标物与吸附剂之间的以下作用力来保留/吸附的 1）疏水作用力：如C18、C8、Silica、苯基柱等 2）离子交换作用：SAX, SCX，COOH、NH2等 3）物理吸附：Florsil、Alumina等 2、p H值对固相萃取的影响 pH值可以改变目标物/吸附剂的离子化或质子化程度。对于强阳/阴离子交换柱来讲，因为吸附剂本身是完全离子化的状态，目标物必须完全离子化才可以保证其被吸附剂完全吸附保留。而目标物的离子化程度则与pH值有关。如对于弱碱性化合物来讲，其pH值必须小于其pKa值两个单位才可以保证目标物完全离子化，而对于弱酸性化合物，其pH值必须大于其pKa值两个单位才能保证其完全离子化。对于弱阴/阳离子交换柱来讲，必须要保证吸附剂完全离子化才保证目标物的完全吸附，而溶液的pH值必须满足一定的条件才能保证其完全离子化。

3、固相萃取操作步骤及注意事项针对填料保留机理的不同（填料保留目标化合物或保留杂质），操作稍有不同。 1）填料保留目标化合物固相萃取操作一般有四步（见图1）： ? 活化---- 除去小柱内的杂质并创造一定的溶剂环境。（注意整个过程不要使小柱干涸） ? 上样---- 将样品用一定的溶剂溶解，转移入柱并使组分保留在柱上。（注意流速不要过快，以1ml/min为宜，最大不超过5ml/min）? 淋洗---- 最大程度除去干扰物。（建议此过程结束后把小柱完全抽干） ? 洗脱---- 用小体积的溶剂将被测物质洗脱下来并收集。（注意流速不要过快，以1ml/min为宜）如下图1:

实验高效液相色谱分离甲苯和乙苯

实验高效液相色谱分离甲苯和乙苯目的和要求 1.熟悉高效液相色谱仪的结构，理解反相HPLC的原理和应用； 2.掌握高效液相色谱法定性分析的原理。基本原理高效液相色谱法（HPLC）是以液体作为流动相的一种色谱分析方法。高效液相色谱采用细颗粒固定相，使流动相在色谱柱上渗透性大大减小，流动阻力增大，必须借助高压泵输送流动相。同其他色谱过程一样，HPLC也是溶质在固定相和流动相之间进行的一种连续多次交换过程。它借溶质在两相间分配系数、亲和力、吸附力或分子大小不同而引起的排阻作用的差别使不同溶质得以分离。不同组分在色谱过程中的分离情况，首先取决于各组分在两相间的分配系数、吸附能力、亲和力等是否有差异，这是热力学平衡问题，也是分离的首要条件。其次，当不同组分在色谱柱中运动时，谱带随柱长展宽，分离情况与两相之间的扩散系数、固定相粒度的大小、柱的填充情况以及流动相的流速等有关。所以分离最终效果则是热力学与动力学两方面的综合效益。本实验中，采用化合物的保留值进行定性分析。仪器高压泵紫外光度检测器六通进样阀色谱工作站柱温箱试剂甲苯、乙苯均为分析纯甲醇为色谱纯纯水为重蒸水标准溶液的配制配制含甲苯、乙苯为4‰（体积比）的甲醇溶液及混合溶液。实验条件色谱柱：C18 柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm) 流动相：甲醇：水（9：1或8：2，v/v），流量：1.0 ml·min-1 紫外分光检测器：测定波长254 nm

进样量：20μl 实验步骤 1.将配制好的流动相于超声波清洗器上脱气15 min 。 2.根据实验条件，将仪器按照仪器的操作步骤调节至进样状态，待仪器液路和电路系统达到平衡，基线平直时，即可进样。 3.吸取20μl标准溶液进样，记录色谱图，重复进样。数据及处理思考题 1.紫外光度检测器是否适用于检测所有的有机化合物，为什么？ 2.若实验中的色谱峰无法完全分离，应如何改善实验条件？

固相萃取与固相微萃取应用之原理

固相萃取与固相微萃取应用之原理一固相萃取固相萃取（Solid Phase Extraction，SPE）是一种基于液-固分离萃取的试样预处理技术，由柱液相色谱技术发展而来。SPE技术自70年代后期问世以来，由于其高效、可靠及耗用溶剂量少等优点，在环境等许多领域得到了快速发展。在国外已逐渐取代传统的液-液萃取而成为样品预处理的可靠而有效的方法。 SPE技术基于液相色谱的原理，可近似看作一个简单的色谱过程。吸附剂作为固定相，而流动相是萃取过程中的水样。当流动相与固定相接触时，其中的某些痕量物质（目标物）就保留在固定相中。这时用少量的选择性溶剂洗脱，即可得到富集和纯化的目标物。固相萃取可分为在线萃取线萃取前者萃取与色谱分析同步完成；而后者萃取与色谱分析分步完成，两者在原理上是一致的。一般固相萃取的操作步骤包括固相萃取柱（即吸附剂）的选择、柱子预处理、上样、淋洗、洗脱。在实验过程中需要具体考虑的因素如下： 1）吸附剂的选择 a.传统吸附剂在环境分析中最为常用的反相吸附剂较适用于水样中的非极性到中等极性的有机物的富集和纯化。其中有代表性的键合硅胶C18和键合硅胶C8等。该类吸附剂主要通过目标物的碳氢键同硅胶表面的官能团产生非极性的范德华力或色散力来保留目标物。正相吸附剂包括硅酸镁、氨基、氰基、双醇基键合硅胶及氧化铝等，主要通过目标物的极性官能团与吸附剂表面的极性官能团的极性相互作用（氢键作用等）来保留溶于非极性介质的极性化合物。由于其特殊的作用原理，在环境分析中常用于与其它类型的吸附柱联用，吸附去除干扰物，实现样品纯化。离子交换吸附剂则主要包括强阳离子和强阴离子交换树脂，这些树脂的骨架通常为苯乙烯-二乙烯基苯共聚物，主要是通过目标物的带电荷基团与键合硅胶上的带电荷基团相互静电吸引实现吸附的。 b.抗体键合吸附剂（Immunosorbents-IS）这类新型吸附剂充分利用了生物免疫抗原-抗体之间的高灵敏性和高选择性，尤其适应于水中痕量有机物的富集与分离。其特点为，由于绝大多数有机污染物为低分子量物质，不能在动物体内引发免疫反应，所以需把待定污染物键合到牛血清白蛋白的生物大分子载体上，使其具有免疫抗原活性，再注入纯种动物体内（如兔或羊），产生抗体，经杂交瘤技术制得相应于该有机污染物的单克隆抗体。将抗体键合到反相吸附剂的硅胶表面或聚合物表面（如C18固定相），就制得了抗体键合吸附剂，可用于分离、富集特定污染物。研制开发能专门检测各种优先污染物的单克隆抗体或多克隆抗体已成为SPE技术的前沿研究领域。抗体键合吸附剂洗脱时一般可采用20%～80%的甲醇-水溶液，该类吸附剂经冷藏保存可多次使用。进行SPE操作时应根据目标物的性质选择适合的吸附剂。表1- 1给除了常用的吸附剂类型及其相关的分离机理、洗脱剂性质和待测组分的性质。吸附剂的用量与目标物性质（极性、挥发性）及其在水样中的浓度直接相关。通常，增加吸附剂用量可以增加对目标物的保留，可通过绘制吸附曲线确定吸附剂用量。 2）柱子预处理活化的目的是创造一个与样品溶剂相容的环境并去除柱内所以杂质。通常需要两种溶剂来完成任务，第一个溶剂（初溶剂）用于净化固定相，另一个溶剂（终溶剂）用于建立一个适合的固定相环境使样品分析物得到适当的保留。每一活化溶剂用量约为1～2 mL/100 mg固定相。

高效液相色谱法测定甲硝唑的含量

实验二高效液相色谱法测定甲硝唑的含量一、实验目的 1.熟悉高效液相色谱仪主要结构组成及功能。 2.了解反相色谱法的原理、优点和应用。 3.了解流动相的选择依据及配制方法。 4.掌握高效液相色谱法进行定性和定量分析的基本方法。二、实验原理高效液相色谱法是采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱进行分离测定的色谱方法。注入的供试品，由流动相带入柱内，各成分在柱内被分离，并依次进入检测器，由数据处理系统记录色谱信号。本实验以甲硝唑为测定对象，以反相HPLC来分离检测未知样中甲硝唑的含量。以甲硝唑标准系列溶液的色谱峰面积对其浓度进行线性回归，再根据样品中甲硝唑的峰面积，由线性方程计算其浓度。三、实验内容（一）实验仪器与材料 1.实验仪器：高效液相色谱仪、精密天平、50mL烧杯、玻璃棒、称量纸、10mL容量瓶、50mL 容量瓶、注射器、洗瓶。 2.实验材料：甲硝唑原料、蒸馏水、HCl（0.1mol/L）、乙腈、三氟乙酸、超纯水。（二）实验内容 1、色谱操作条件的制定：色谱柱：C18柱（250×4.6mm,5μm）；流动相：乙腈：0.02%三氟乙酸水溶液（20：80）流速：1mL/min 检测波长：277nm 柱温：35℃ 进样量：20μL 2、标准溶液配制精密称取在105℃条件下干燥至恒重的甲硝唑对照品10mg，置于50mL容量瓶中，用0.1mol/L的HCl溶液溶解并定容至刻度，即得浓度为0.2mg/mL的甲硝唑标准储备液，备用。 3、标准曲线的建立（1）精密量取甲硝唑标准储备液分别为0.3mL、0.5 mL、0.7 mL、0.9 mL、1.1 mL置于10 mL的容量瓶中，然后用0.1mol/L的HCl溶液定容至刻度，得到浓度梯度为6μg/mL、10μg/mL、14μg/mL、18μg/mL和22μg/mL的标准溶液，分别过0.22μm的微孔滤膜过滤，滤

【开题报告】固相微萃取-高效液相色谱法测定己烯雌酚

开题报告化学固相微萃取-高效液相色谱法测定己烯雌酚一、选题的背景与意义己烯雌酚属激素类药物，是一种人工合成的非淄体雌激素，别名人造求偶素，其结构与天然雌激素的分子状况很相似，无色结晶粉末，能溶于甲醇，乙醇，乙醚，氯仿，脂肪油，强碱溶液中，几乎不溶于水。因其能促进蛋白合成，加快增重和骨骼钙化，提高动物的生长速度，并减少饲料消耗，被用作鸡，牛，羊等畜禽促长增肉剂；同时在水产养殖、女性丰胸化妆品的方面也有使用。许多科学实验已经证实，己烯雌酚是一种致癌物质，可以在动物的肝脏、肌肉、脂肪等处残留，会给消费者带来不良的生理影响（儿童性发育异常，男性出现女性特征），损害肝肾功能，甚至可诱发白血病、子宫癌等疾病，对人和动物都有着较大的危害。目前，世界上多国家禁止在食品中使用己烯雌酚。而对于己烯雌酚仍存在的滥用现象，其残留的检测分析引起了国内外的高度重视。1979年美国、加拿大及欧盟宣布禁用，之后，我国在国标中也对其使用做出了严格要求，除了作为治疗药物使用，DES在动物性食品和动物组织中要求零检出[1]。对己烯雌酚（DES）检测的方法,居国内外已有文献报道[2～8]主要有酶联免疫测定法、放射免疫法（RIA）、气相色谱-质谱机法（GC-MS）、气相色谱法（GC）、薄层色谱法（TLC）、高效液相色谱法（HPLC）、汽液色谱法（GLC），辐照分光光度法生物分析法，而从前人大量的DES残留量测定实验研究来看，它在动物组织或动物性食品中残留度很低，这就要求我们能测定出极低的浓度的DES，在对样品进行预处理时，我们选用具有富集作用的固相微萃取（SPME），使待测液的浓度达到HPLC的检出范围。二、研究的基本内容与拟解决的主要问题：在一定条件下，利用固相微萃取来富集己烯雌酚，并用高效液相色谱法准确测量己烯雌酚的含量。其中，主要的问题在于实验条件的优化，包括萃取时

常用固相萃取柱

常用固相萃取柱 HLB是英文"亲水-亲脂平衡"(hydrophilic-l;pophilicbalance)的缩写，它是. 一种新型的反相吸附剂，能同时表现出对亲水性化合物和亲脂性化合物的双重保留特性。固相萃取柱产品和应用指南(SPE column)返回提供VARIAN公司BondElut、Agilent公司AccuBond系列固相萃取柱，另可提供经济型国产萃取小柱及填料，并可根据用户需要订做各种规格产品 1word格式支持编辑，如有帮助欢迎下载支持。

硅胶上键合乙基 500mg 500mg 1000mg 3ml 6ml 6ml 50 30 30 合物。500mg 500mg 1000mg 3ml 6ml 6ml 50 30 30 核酸碱,核苷,表面活化剂。容量:0.2毫当量/克。 Phenyl 硅胶上键合苯基 100mg 200mg 500mg 500mg 1000mg 1ml 3ml 3ml 6ml 6ml 100 50 50 30 30 相对C18和C8，反相萃取,适合于非极性到中等极性的化合物 Alumnia A (acidic) 酸性 PH ~5 100mg 200mg 500mg 500mg 1000mg 1ml 3ml 3ml 6ml 6ml 100 50 50 30 30 极性化合物离子交换和吸附萃取,如维生素. Silica 无键合硅胶 100mg 200mg 500mg 500mg 1000mg 1ml 3ml 3ml 6ml 6ml 100 50 50 30 30 极性化合物萃取,如乙醇，醛, 胺,药物,染料，锄草剂,农药, 酮,含氮类化合物,有机酸,苯酚,类固醇 Alumnia B (basic) 碱性 PH~8.5 100mg 200mg 500mg 500mg 1000mg 1ml 3ml 3ml 6ml 6ml 100 50 50 30 30 吸附萃取和阳离子交换。 Cyano(CN) 硅胶上键合丙氰基烷 100mg 200mg 500mg 500mg 1000mg 1ml 3ml 3ml 6ml 6ml 100 50 50 30 30 反相萃取,适合于中等极性的化合物,正相萃取,适合于极性化合物,比如,黄曲霉毒素,抗菌素,染料,锄草剂,农药 ,苯酚,类固醇。弱阳离子交换萃取,适合于碳水化合物和阳离子化合物。 Alumnia N (neutral) 中性 PH~6.5 100mg 200mg 500mg 500mg 1000mg 1ml 3ml 3ml 6ml 6ml 100 50 50 30 30 极性化合物吸附萃取。调节pH,阳和阴离。子交换.适合于维生素,抗菌素,芳香油,酶, 糖苷,激素 Amino(NH2) 硅胶上键合丙氨基 100mg 200mg 500mg 500mg 1000mg 1ml 3ml 3ml 6ml 6ml 100 50 50 30 30 正相萃取,适合于极性化合物。弱阴离子交换萃取,适合于碳水化合物,弱性阴离子和有机酸化合物。 Florisil 填料-硅酸镁 100mg 200mg 500mg 500mg 1000mg 1ml 3ml 3ml 6ml 6ml 100 50 50 30 30 极性化合物的吸附萃取,如乙醇,醛,胺,药物,染料,锄草剂,农药,PCBs,酣,含氮类化合物,有机酸,苯酚,类固醇固相萃取柱及填料(SPE column) 2word格式支持编辑，如有帮助欢迎下载支持。

高效液相色谱法测定氨基酸

脑蛋白水解物溶液氨基酸含量分析方法研究方案 1、仪器与试药 1.1 仪器 1525型高效液相色谱仪（美国Waters公司）；Waters1525型泵，Waters2487型检测器，Waters5CH 型柱温箱，WatersBREEZE数据处理软件，水浴恒温器（精度±0.1℃），旋涡器，微量移液器，衍生专用管；CP225D型分析天平（德国）；4umNora-Pak TM C18（3.9mm×150mm，5μm）色谱柱（美国） 1.2 药品与试剂 16种氨基酸（门冬氨酸、丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸）由中国药品生物制品检定所提供。脑蛋白水解物注射液，云南盟生药业有限公司生产，规格10ml/支。批号：2013、2013、2013. 乙腈（HPLC级）；EDTA（分析纯）；磷酸（分析纯）；二乙胺（分析纯）；三水合乙酸钠（分析纯）。2、方法与结果 2.1色谱条件流动相A为AccQTag醋酸—磷酸盐缓冲液；由AccQTagEluent A浓缩制备AccQTag洗脱液,用前稀释10倍（或按以下方法配制：称19.04g三水合乙酸钠，加1000ml纯化水，搅拌，溶解，用50%H3PO4将pH调至5.2，加入1ml 1mg/ml的EDTA溶液，加入2.37ml二乙胺，用50%H3PO4滴定至pH4.95，用水溶性过滤器过滤，超声，脱气，备用。）；流动相B为60% HPLC级乙腈，按梯度表梯度洗脱；流速1.0ml/min；检测波长为254nm；进样量5μl；柱温38℃。

时间 (min) 流速 (ml/min) % A % B 曲线起始 1.0 100 0 * 0.5 1.0 98 2 6 15.0 1.0 93 7 6 19.0 1.0 90 10 6 32.0 1.0 65 35 6 33.0 1.0 65 35 6 34.0 1.0 0 100 6 37.0 1.0 0 100 6 38.0 1.0 100 0 6 42.0 1.0 100 0 6 2.2对照品溶液、供试品溶液的制备分别精密称取16种氨基酸标准品，用纯化水配制成浓度如下表所示的混合溶液。名称浓度（mg/ml）名称浓度（mg/ml）名称浓度（mg/ml）门冬氨酸 4.80 苏氨酸 1.20 异亮氨酸 1.10 丝氨酸 2.60 丙氨酸 2.50 亮氨酸 2.70 谷氨酸 6.20 脯氨酸 2.00 苯丙氨酸 1.20 甘氨酸 2.40 缬氨酸 1.60 色氨酸0.40 组氨酸0.90 甲硫氨酸 1.00 精氨酸 1.20 赖氨酸 3.45 取上述溶液0.1ml，加纯化水0.9ml，旋涡器混匀，作为对照品溶液；取脑蛋白水解物注射液，加水稀释成含总氮为1mg/ml的溶液，取0.1ml，加纯化水0.9ml,旋涡器混匀，作为供试品溶液。衍生剂配制将水浴锅设置55℃，加热，待温度稳定, 取AccQFluor衍生剂2A，轻轻弹击,确保AccQFluor 衍生剂2A粉末全落在瓶底，吸取AccQFluor衍生稀释剂2B 1ml并放掉，清洗移液器管，再吸取AccQFluor 衍生稀释剂2B 1ml，加入AccQFluor衍生剂2A的瓶中，振荡10秒钟，在恒温水浴锅中溶解，保持10分钟。于干燥器中室温保存一周,于干燥器中4℃保存二周。 2.3测定方法分别取20ul对照品溶液和供试品溶液加入衍生专用管底部，加入60uLAccQFluor硼酸

高效液相色谱分析原理及流程

高效液相色谱分析原理及流程高效液相色谱以经典的液相色谱为基础，是以高压下的液体为流动相的色谱过程。通常所说的柱层析、薄层层析或纸层析就是经典的液相色谱。所用的固定相为大于100um的吸附剂(硅胶、氧化铝等)。这种传统的液相色谱所用的固定相粒度大，传质扩散慢，因而柱效低，分离能力差，只能进行简单混合物的分离。而高效液相所用的固定相粒度小(5um-10um)、传质快、柱效高。高效液相色谱法(HPLC)是20世纪60年代后期发展起来的一种分析方法。近年来，在保健食品功效成分、营养强化剂、维生素类、蛋白质的分离测定等应用广泛。世界上约有80%的有机化合物可以用HPLC来分析测定。高效液相色谱分析原理 (一)高效液相色谱分析的流程由泵将储液瓶中的溶剂吸入色谱系统，然后输出，经流量与压力测量之后，导入进样器。被测物由进样器注入，并随流动相通过色谱柱，在柱上进行分离后进入检测器，检测信号由数据处理设备采集与处理，并记录色谱图。废液流入废液瓶。遇到复杂的混合物分离(极性范围比较宽)还可用梯度控制器作梯度洗脱。这和气相色谱的程序升温类似，不同的是气相色谱改变温度，而HPLC改变的是流动相极性，使样品各组分在最佳条件下得以分离。 (二)高效液相色谱的分离过程同其他色谱过程一样，HPLC也是溶质在固定相和流动相之间进行的一种连续多次交换过程。它借溶质在两相间分配系数、亲和力、吸附力或分子大小不同而引起的排阻作用的差别使不同溶质得以分离。开始样品加在柱头上，假设样品中含有3个组分，A、B和C，随流动相一起进入色谱柱，开始在固定相和流动相之间进行分配。分配系数小的组分A不易被固定相阻留，较早地流出色谱柱。分配系数大的组分C 在固定相上滞留时间长，较晚流出色谱柱。组分B的分配系数介于A，C之间，第二个流出色谱柱。若一个含有多个组分的混合物进入系统，则混合物中各组分按其在两相间分配系数的不同先后流出色谱柱，达到分离之目的。不同组分在色谱过程中的分离情况，首先取决于各组分在两相间的分配系数、吸附能力、亲和力等是否有差异，这是热力学平衡问题，也是分离的首要条件。其次，当不同组分在色谱柱中运动时，谱带随柱长展宽，分离情况与两相之间的扩散系数、固定相粒度的大小、柱的填充情况以及流动相的流速等

高效液相色谱(HPLC)法测定邻苯二甲酸酯

高效液相色谱（HPLC ）法测定邻苯二甲酸酯一、实验目的： 1. 了解高效液相色谱仪原理； 2. 学习高效液相色谱仪的基本操作方法； 3. 利用高效液相色谱仪测定邻苯二甲酸酯、邻苯二乙酸酯、邻苯二丁酸酯的峰图和含量。二、实验原理： ① 高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography \ HPLC ）是色谱法的一个重要分支，以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。高效液相色谱法有“四高一广”的特点：高压、高速、高效、高灵敏度和应用范围广。该方法已成为化学、医学、工业、农学、商检和法检等学科领域中重要的分离分析技术。在高效液相色谱中，若采用非极性固定相，如十八烷基键合相，极性流动相，即构成反相色谱分离系统。反之，则称为正相色谱分离系统。反相色谱系统所使用的流动相成本较低，应用也更为广泛。定量分析时，为便于准确测量，要求定量峰与其他峰或内标峰之间有较好的分离度。分离度（R ）的计算公式为： R ＝ 2[t (R2)-t (R1)] /1.7*(W 1＋W 2) //式中 t (R2)为相邻两峰中后一峰的保留时间；t (R1)为相邻两峰中前一峰的保留时间； W 1 及W 2为此相邻两峰的半峰宽。除另外有规定外，分离度应大于1.5。 ② 本实验对象为邻苯二甲酸酯，又称酞酸酯，缩写PAE ，常被用作塑料增塑剂。它被普遍应用于玩具、食品包装材料、医用血袋和胶管、乙烯地板和壁纸、清洁剂、润滑油、个人护理用品，如指甲油、头发喷雾剂、香皂和洗发液等数百种产品中。但研究表明，邻苯二甲酸酯在人体和动物体内发挥着类似雌性激素的作用，是一类内分泌干扰物。同时也有一定的致癌作用。如果要检测不同条件对谱图分离的影响，可按表1配制几种物质的混合溶液，在不同条件下进行HPLC 分离检测。三.仪器与试剂 1、仪器 Agilent 1100高效液相色谱仪，50ul 微量注射器。 2、试剂甲醇（色谱专用），高纯水，样品。出峰次序样品组成 1 邻苯二甲酸二甲酯（DMP ） 2 邻苯二甲酸二乙酯(DEP) 3 邻苯二甲酸二丁酯(DBP)

反相制备型高效液相色谱法分离纯化过程中的共性问题

成也萧何，败也萧何？！ ——反相制备型高效液相色谱法分离纯化过程中的共性问题内容概览：本文拟通过一个具体实例来介绍制备型高效液相色谱法的特点、影响制备型高效液相色谱分离纯化的因素，及其在合成药物、中药化学对照品研究中的实际应用，并对制备HPLC分离纯化过程中的共性问题做了总结并提出解决方案。实际应用：某合成药物最终产品的纯化，对其纯度的要求——HPLC-UV法，210 nm & 254 nm 下，以峰面积归一化法，≥98.0%，同时需提供MS、NMR数据。具体问题：某特定化合物系强极性有机小分子，极性大、难挥发，采用硅胶柱层析不易提纯，需用其他分离技术来纯化。解决方法：终极目的是提纯该物质。总体策略——“先看，后想，再行动”——“看化学结构，想理化性质，定纯化方法”。由于该化合物及相关杂质的理化性质决定了难以用常规的重结晶、蒸馏（精馏）、硅胶柱层析来分离纯化。结合实验室的具体条件，考虑采用反相制备型高效液相色谱法（Preparative HPLC）来分离纯化之。方法步骤：1.了解样品及有关组分的情况→2.样品预处理→3.建立Analytical HPLC Method→4.优化Preparative HPLC条件→5.检查出现的问题→6.回收纯化的物质。更细致地来讲，开始Preparative HPLC之前须明白：待分离样品及有关组分的信息——所含化合物的结构信息（重点关注酸、碱性等极性基团）、UV光谱图（涉及到后续试验检测波长设定）、分子量（分离后目标化合物LC-MS检测确认）、待分离体系的复杂程度（所含化合物的数目，preparative HPLC之前是否须经flash column粗分）；样品预处理——最主要的是样品的溶解度（将尽量多的样品溶于体积相对较小的溶液中）以及待分离体系里是否含强酸、强碱性物质（潜在的“柱杀手”），样品溶液是否需要中和等；建立Analytical HPLC Method——这一步，跟平常的HPLC相似，重点关注待分离的目标化合物，使该物质与其前、后组分分离得尽量相隔远些（起码得基线分离，利于后续制备时放大），

固相萃取(SPE)装置应用及原理

固相萃取（SPE）装置应用及原理装置：离线与在线SPE 离线SPE: 1.SPE与分析分别独立进行，SPE仅为以后的分析提供合适的试样。 2.为使试样溶液与填料有足够的接触，溶剂流量不能过高。 3.可由自动化仪器完成。自动SPE仪由柱架、柱塞泵、储液槽、管线和试样处理器组成。在线SPE：又称在线净化和富集技术，主要用于HLPC分析；柱预处理：目的： 1.除去填料中可能存在的杂质； 2.使填料溶剂化，提高固相萃取的重现性；加样： 1.为防止分析物的流失，试样溶剂浓度不宜过高； 2.以反相机理萃取时，以水或缓冲剂作为溶剂，其中有机溶剂量不超过10%（V/V）； 3.为克服加样过程中分析物流失，可采用弱溶剂稀释试样、减少试样体积、增加SPE柱中的填料量和选择对分析物有较强保留的吸附剂等手段。 SPE方法的建立：分析物的洗脱和收集（另一种情况是杂质被保留而分析物通过柱） 1.对反相萃取柱，清洗溶剂是含适当浓度有机溶剂的水或缓冲液； 2.为决定清洗溶剂的浓度和体积，加试样于SPE柱上，用5～10倍SPE柱床体积的溶剂清洗，依次收集和分析流出液，得到清洗溶剂对分析物的洗脱廓形。依次增加清洗溶剂强度，根据不同不同强度下分析物的洗脱廓形，决定清洗溶剂合适的强度和体积； 3.洗脱和收集目的：将分析物洗脱并收集在小体积的级分中，同时使比分析物更强保留的杂质尽可能多的保留在SPE柱上； 4.为提高分析物的浓度或为以后分析调整溶剂性质，可以把收集到的分析物级分用氮气吹干，再溶于小体积的溶剂中。

产品说明: 川一系列固相萃取仪(Solid-Phase Extraction,简称SPE)是一种被广泛应用且备受欢迎的样品前处理技术,是利用固体吸附剂将液体样品中的目标化合物吸附,与样品的基体和干扰化合物分离,然后再用洗脱液洗脱或加热解吸附,达到分离和富集目标化合物的目的（即样品的分离，净化和富集），目的在于降低样品基质干扰，提高检测灵敏度，其应用于各类食品安全检测、农产品残留监控、医药卫生、环境保护、商品检验、自来水及化工生产实验室。主要特征: 固相萃取仪整机由透明有机玻璃制作，耐腐蚀性强。防交叉污染，防雾化真空槽设计，操作简单快速。无相分离操作易于收集分析物组件并可处理小体积试样。固相萃取装置可配大容量采集容器，可批量处理样品也可单个处理样品。真空槽采用特硬玻璃模具成形，其壁厚均匀故可承受-0.098Mpa以上的高负压。萃取柱托盘采用特高分子材料制成，其美观耐腐蚀并且长期使用在高压力状态下不变形。内部试管架由聚四氟制成故有很高的耐腐蚀。各处受压均匀，气密性好，稳定性强。萃取速度一致性好、控制调整方便。多通道可独立控制，接头耐腐蚀。

高效液相色谱法的分类及原理

高效液相色谱法的分类及其分离原理高效液相色谱法分为：液-固色谱法、液-液色谱法、离子交换色谱法、凝胶色谱法。 1.液-固色谱法（液-固吸附色谱法）固定相是固体吸附剂，它是根据物质在固定相上的吸附作用不同来进行分配的。 ①液-固色谱法的作用机制吸附剂：一些多孔的固体颗粒物质，其表面常存在分散的吸附中心点。流动相中的溶质分子X（液相）被流动相S带入色谱柱后，在随载液流动的过程中，发生如下交换反应： X（液相）+nS（吸附）<==>X（吸附）+nS（液相）其作用机制是溶质分子X（液相）和溶剂分子S（液相）对吸附剂活性表面的竞争吸附。吸附反应的平衡常数K为： K值较小：溶剂分子吸附力很强，被吸附的溶质分子很少，先流出色谱柱。 K值较大：表示该组分分子的吸附能力较强，后流出色谱柱。发生在吸附剂表面上的吸附-解吸平衡，就是液-固色谱分离的基础。 ②液-固色谱法的吸附剂和流动相常用的液-固色谱吸附剂：薄膜型硅胶、全多孔型硅胶、薄膜型氧化铝、全多孔型氧化铝、分子筛、聚酰胺等。一般规律：对于固定相而言，非极性分子与极性吸附剂（如硅胶、氧化铜）之间的作用力很弱，分配比k较小，保留时间较短；但极性分子与极性吸附剂之间的作用力很强，分配比k大，保留时间长。对流动相的基本要求：试样要能够溶于流动相中流动相粘度较小流动相不能影响试样的检测常用的流动相：甲醇、乙醚、苯、乙腈、乙酸乙酯、吡啶等。 ③液-固色谱法的应用常用于分离极性不同的化合物、含有不同类型或不；数量官能团的有机化合物，以及有机化合物的不同的异构体；但液-固色谱法不宜用于分离同系物，因为液-固色谱对不同相对分子质量的同系物选择性不高。 2.液-液色谱法（液-液分配色谱法）将液体固定液涂渍在担体上作为固定相。 ①液-液色谱法的作用机制溶质在两相间进行分配时，在固定液中溶解度较小的组分较难进入固定液，在色谱柱中向前迁移速度较快；在固定液中溶解度较大的组分容易进入固定液，在色谱柱中向前迁移速度较慢，从而达到分离的目的。液-液色谱法与液-液萃取法的基本原理相同，均服从分配定律：K=C固/C液 K值大的组分，保留时间长，后流出色谱柱。 ②正相色谱和反相色谱正相分配色谱用极性物质作固定相，非极性溶剂（如苯、正己烷等）作流动相。反相分配色谱用非极性物质作固定相，极性溶剂（如水、甲醇、己腈等）作流动相。

高效液相色谱法

HJ997-2018 土壤和沉积物醛、酮类化合物的测定高效液相色谱法 Soil and sediment—Determination of carbonyl compounds —High performance liquid chromatography （发布稿）本电子版为发布稿。请以中国环境出版集团出版的正式标准文本为准。 2018-12-26发布2019-06-01实施生态环境部发布

目次前言 (ii) 1适用范围 (1) 2规范性引用文件 (1) 3方法原理 (1) 4试剂和材料 (1) 5仪器和设备 (2) 6样品 (3) 7分析步骤 (4) 8结果计算与表示 (5) 9精密度和准确度 (6) 10质量保证和质量控制 (7) 11废物处理 (7) 12注意事项 (7) 附录A（规范性附录）方法的检出限和测定下限 (8) 附录B（资料性附录）15种醛、酮类腙衍生物的参考色谱图 (9) 附录C（资料性附录）方法的精密度和准确度 (10) 附录D（资料性附录）2,4-二硝基苯肼（DNPH）的纯化及空白检验 (16) i

前言为贯彻《中华人民共和国环境保护法》和《中华人民共和国土壤污染防治法》，保护生态环境，保障人体健康，规范土壤和沉积物中醛、酮类化合物的测定方法，制定本标准。本标准规定了测定土壤和沉积物中醛、酮类化合物的高效液相色谱法。本标准的附录A为规范性附录，附录B～附录D为资料性附录。本标准为首次发布。本标准由生态环境部生态环境监测司、法规与标准司组织制订。本标准起草单位：天津市生态环境监测中心。本标准验证单位：国家环境分析测试中心、上海市环境监测中心、沈阳市环境监测中心站、青岛市环境监测中心站、天津市产品质量监督检测技术研究院和天津市滨海新区环境保护监测站。本标准生态环境部2018年12月26日批准。本标准自2019年6月1日起实施。本标准由生态环境部解释。 ii

高效液相色谱习题及答案 (2)

高效液相色谱法习题一、思考题 1．从分离原理、仪器构造及应用范围上简要比较气相色谱及液相色谱的异同点。2．液相色谱中影响色谱峰展宽的因素有哪些与气相色谱相比较, 有哪些主要不同之处 3．在液相色谱中, 提高柱效的途径有哪些其中最有效的途径是什么 4．液相色谱有几种类型 5．液-液分配色谱的保留机理是什么？这种类型的色谱在分析应用中，最适宜分离的物质是什么？6．液-固分配色谱的保留机理是什么？这种类型的色谱在分析应用中，最适宜分离的物质是什么？ 7．化学键合色谱的保留机理是什么？这种类型的色谱在分析应用中，最适宜分离的物质是什么？ 8．离子交换色谱的保留机理是什么？这种类型的色谱在分析应用中，最适宜分离的物质是什么？ 9．离子对色谱的保留机理是什么这种类型的色谱在分析应用中,最适宜分离的物质是什么 10．空间排阻色谱的保留机理是什么？这种类型的色谱在分析应用中，最适宜分离的物质是什么？ 11．在液-液分配色谱中，为什么可分为正相色谱及反相色谱？ 12．何谓化学键合固定相？它有什么突出的优点？ 13．何谓化学抑制型离子色谱及非抑制型离子色谱？试述它们的基本原理 14．何谓梯度洗提？它与气相色谱中的程序升温有何异同之处？15．高效液相色谱进样技术与气相色谱进样技术有和不同之处？ 16．以液相色谱进行制备有什么优点？二、选择题 1．液相色谱适宜的分析对象是（）。 A 低沸点小分子有机化合物 B 高沸点大分子有机化合物 C 所有有机化合物 D 所有化合物 2．HPLC与GC的比较，可忽略纵向扩散项，这主要是因为（）。 A 柱前压力高 B 流速比GC的快 C 流动相粘度较大 D 柱温低 3．组分在固定相中的质量为MA(g)，在流动相中的质量为MB（g），而该组分在固定相中的浓度为CA（g·mL－1），在流动相中浓度为CB（g·mL－1），则此组分的分配系数是( )。 A mA/m B B mB/mA C CB/CA D CA/CB。 4．液相色谱定量分析时，不要求混合物中每一个组分都出峰的是＿。 A 外标标准曲线法 B 内标法 C 面积归一化法 D 外标法 5．在液相色谱中，为了改善分离的选择性，下列措施（）是有效的？ A 改变流动相种类 B 改变固定相类型 C 增加流速 D 改变填料的粒度 6．在分配色谱法与化学键合相色谱法中，选择不同类别的溶剂（分子间作用力不同），以改善分离度，主要是（）。 A 提高分配系数比 B 容量因子增大 C 保留时间增长 D 色谱柱柱效提高 7．分离结构异构体，在下述四种方法中最适当的选择是（）。 A 吸附色谱 B 反离子对色谱 C 亲和色谱 D 空间排阻色谱 8．分离糖类化合物，选以下的柱子（）最合适。 A ODS柱 B 硅胶柱 C 氨基键合相柱 D 氰基键合相柱 9．在液相色谱中，梯度洗脱适用于分离（）。 A 异构体 B 沸点相近，官能团相同的化合物 C 沸点相差大的试样 D 极性变化范围宽的试样

高效液相色谱法测定有机化合物的含量

实验四高效液相色谱法测定有机化合物的含量 [目的要求] 1、了解仪器各部分的构造及功能。 2、掌握样品、流动相的处理，仪器维护等基本知识。 3、学会简单样品的分析操作过程。 [基本原理] 高效液相色谱仪液体作为流动相，并采用颗粒极细的高效固定相的主色谱分离技术，在基本理论方面与气相色谱没有显著不同，它们之间的重大差别在于作为流动相的液体与气体之间的性质差别。与气相色谱相比，高效液相色谱对样品的适用性强，不受分析对象挥发性和热稳定性的限制，可以弥补气相色谱法的不足。液相色谱根据固定向的性质可分为吸附色谱、键合相色谱、离子交换色谱和大小排阻色谱。其中反相键合相色谱应用最广，键合相色谱法是将类似于气相色谱中固定液的液体通过化学反应键合到硅胶表面，从而形成固定相。若采用极性键合相、非极性流动相，则称为正相色谱；采用非极性键合相，极性流动相，则称为反相色谱。这种分离的保留值大小，主要决定于组分分子与键合固定液分子间作用力的大小。反相键合相色谱采用醇-水或腈-水体系作为流动相，纯水廉价易得，紫外吸收小，在纯水中添加各种物质可改变流动相选择性。使用最广泛的反相键合相是十八烷基键合相，即让十八烷基（C18H37―）键合到硅胶表面，这也就是我们通常所说的碳十八柱。 [仪器试剂] 高效液相色谱仪（包括储液器、高压泵、自动进样器、色谱柱、柱温箱、检测器、工作站）、过滤装置待测样品（浓度约100 ppm）、甲醇、二次水 [实验步骤] 1、仪器使用前的准备工作（1）样品与流动相的处理配好的溶液需要用0.45 μm的一次性过滤膜过滤。纯有机相或含一定比便例有机相的就要用有机系的滤膜，水相或缓冲盐的就要用水系滤膜。水、甲醇等过滤后即可使用；水放置一天以上需重新过滤或换新鲜的水。含稳定剂的流动相需经过特殊处理，或使用色谱纯的流动相。（2）更换泵头里清洗瓶中的清洗液流动相不同，清洗液也不同，如果流动相为甲醇-水体系，可以用50%的甲醇；如果流动相含有电解质，通常用95%去离子水甚至高纯水。如果仪器经常使用建议每周更换两次，如果仪器很少使用则每次使用前必须更换。（3）更换托盘里洗针瓶中的洗液洗液一般为：50%的甲醇。

高效液相色谱原理

高效液相色谱法（HPLC）一、方法原理 1、液相色谱法概述高效液相色谱分析法

其工作流程为：高压输液泵将贮液器中的流动相以稳定的流速(或压力)输送至分析体系，在色谱柱之前通过进样器将样品导人，流动相将样品依次带入预柱、色谱柱，在色谱柱中各组分被分离，并依次随流动相流至检测器，检测到的信号送至数据处理系统记录、处理和保存。

HPLC仪器的基本结构 2、高效液相色谱法的特点（HPLC）与经典柱色谱原理相同，是由液体流动相将被分离混合物带入色谱柱中，根据各组分在固定相及流动相中吸附能力、分

配系数、离子交换作用或分子尺寸大小的差异来进行分离。由于高压输液泵、高灵敏度检测器和高效固定相的使用，提高了柱效率，降低了检出限，缩短了分析时间。特点是选择性高、分离效能高、分析速度快的特点。高沸点有机物的分析、离子型化合物、高分子化合物、热稳定性差的化合物以及具有生物活性的物质，弥补了气相色谱法的不足。高效液相色谱法与气相色谱法相比，各有所长，互相补充。如果能用气相色谱法分析的样品，一般不用液相色谱法，因为气相色谱法分析速度更快、更方便、成本更低。 3、高效液相色谱法的固定相和流动相（1）固定相表面多孔型和全多孔型两大类。（2）流动相（淋洗液）流动相的选择对改善分离效果产生重要的辅助效应。从实用，选用的流动相具有廉价、易购的特点外，还应满足下列要求： ①与固定相互不相溶，并能保持色谱柱的稳定性。 ②高纯度，以防所含微量杂质在柱中积累，引起柱性能的改变。 ③与所用的检测器相匹配。 ④应对样品有足够的溶解能力，以提高测定的灵敏度。 ⑤具有低的黏度（可减少溶质的传质阻力，提高柱效）和适当低的沸点。

高效液相色谱样品前处理

高效液相色谱样品前处理 1.高效液相色谱法分析样品为什么要进行样品前处理 (1)样品浓度调节：某些待测组分在样品中的浓度过低或过高，造成仪器检测困难，因此需要提前对样品进行浓缩或稀释。 (2)避免污染，保护仪器：某些样品的酸碱度、离子强度等易造成系统污染和缩短仪器使用寿命 (3)消除干扰：基体或共存物质的干扰 (4)介质置换：样品介质不适合后续的分离和检测，需要提前进行介质置换。 2.高效液相色谱法分析样品前处理的遵循原则 (1)去除基体杂质，消除干扰因素； (2)完整保留待测组分，处理过程中尽可能避免待测组分发生化学反应或被污染； (3)方法简单易行、重现性好、成本低。 3.高效液相色谱法分析样品前处理技术干扰物质，然后用洗脱液将待测组分分离出来。染分析微波辅助萃取利用高频电磁波的作用，使样品中待测组分从胞内释放出来，并在低温下溶解于萃取溶剂中，过滤，达到分离的目的。天然药物、农药残留、有机金属化合物等物质的提取超声波辅助萃取利用超声波的机械效应、空化作用以及热效应等，破坏样品细胞组织，加大细胞内的传质效率，从而促进待测组分的释放和提取。蛋白质、多糖、烟碱等物质的提取超临界流体萃取采用二氧化碳作为流体，在超临界条件下，二氧化碳使样品的各组分依次萃取出来，当恢复常温和常压时，溶解在二氧化碳中的待测组分立即以液体状态与气态流体分离。多用于天然物质的提取迪信泰检测平台以液相/气相为依托，采用HPLC/GC及LC-MS等检测平台，致力

于为各科研院所，高校，药企，生物工程类企业提供生物、食品、药物、环境等多领域的物质检测服务。