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有关基因工程的几个问题

有关基因工程的几个问题

1、DNA分子复制与PCR为什么需要引物?

无论体内复制还是体外复制,都需要引物。这是由DNA聚合酶的催化特点所决定的。聚合酶只能催化脱氧核糖核苷酸加到已有核酸链的游离3'-羟基上,而不能使脱氧核糖核苷酸自身发生聚合,也就是说,它需要引物链(primer strand)的存在。

体内复制时,初始的一段无法聚合形成DNA引物,只能由另一种酶引物合成酶合成RNA引物。RNA引物形成后,由DNA聚合酶Ⅲ催化将第一个脱氧核苷酸按碱基互补原则加在RNA引物3'-OH端而进入DNA链的延伸阶段。引物长度通常只有几个~10多个核苷酸。RNA引物的消除和缺口填补是由DNA聚合酶Ⅰ完成的,最后由DNA连接酶连接。为什么需要有RNA引物来引发DNA 复制呢?这可能与尽量减少DNA复制起始处的突变有关。DNA复制开始处的几个核苷酸最容易出现差错,因此,用RNA引物即使出现差错最后也要被DNA 聚合酶Ⅰ切除,提高了DNA复制的准确性。

而体外复制时,引物是人为设计合成加入反应体系的。自然可以简化成直接加入短DNA链,无需再消除填补。一般引物长度在15-30bp。

2、引物的作用是什么?PCR技术是否需准确知道基因的碱基序列?还是只知道引物结合的序列就可以了?

正因为有了人为设计合成的引物,PCR技术才实现了对目的基因的特异性扩增(或称选择性扩增)。真实的实验操作中,加入反应体系的模板决不仅仅是目的基因那一段序列。它往往是一定量还有目的基因的质粒,或是从细胞中提取出的全部基因组DNA。如何保证只针对我们要的那一段序列进行大量扩增呢?需要两段引物特异性的与目的区段的两端结合(通俗地讲就是卡住两头,延伸中间的一段)。我们根据目的基因两端的序列,设计与其碱基互补配对的引物,特异性的结合就实现了。因此,引物的作用,一方面为DNA聚合酶提供已有核酸

链的游离3'-羟基,另一方面更重要的是实现在众多序列中找到需要扩增的那段序列。由此可见,PCR技术扩增目的基因只要已知引物结合的两端序列就可以。

另外,为了保证引物在相应的退火温度下和退火反应时间内能顺利与两端序列结合,且特异性较高。在设计引物时有一些注意事项:15-30bp,过短特异性差,过长效率太低GC含量一般45-55%,GC含量太低导致引物Tm值较低,使用较低的退火温度不利于提高PCR的特异性,GC含量太高也易于引发非特异扩增(G≡C 结合形成H键,亲和力大)引物内部不应形成二级结构,彼此之间不能形成二聚体。实际上,有一些引物设计软件如OLIGO,可以帮助判断设计的引物是否合适。此外,提高退火温度或变短退火时间,也可以提高特异性。

3.什么是dNTP?

dNTP(脱氧核苷三磷酸)。学生会有这样的疑问:DNA的体内体外复制所需的原料为何不同?事实上在DNA体内复制时直接参与合成DNA的是四种脱氧核苷酸三磷酸(dATP、dGTP、dCTP、dTTP)。在DNA聚合酶催化作用下,引物链的3’—羟基对进入的脱氧核苷酸三磷酸α—磷原子发生亲核攻击,从而形成3’,5’—磷酸二酯键并脱下焦磷酸(PPi)。形成磷酸二酯键所需要的能量来自α—与β—磷酸基之间高能磷酸键的裂解。(摘于沈同、镜岩主编的第二版《生物化学》下册P328)。

高中所讲的原料脱氧核苷酸其实需要逐步转化为脱氧核苷三磷酸后再参与DNA的合成。这一反应中要接受ATP提供的磷酸基,在磷酸激酶的催化下完成。具体过程为:生物体可以利用氨基酸,C02,NH3和PRPP(磷酸核糖焦磷酸,phosphoribosylpyrophos-phate)合成核糖核苷单磷酸。然后,核糖核苷单磷酸(NMP)。在各自的具有碱基特异性的核苷单磷酸激酶的作用下转变成NDP (NMP+A TP→NDP+ADP),接着,在一种没有碱基特异性的核糖核苷酸还原酶的催化下,脱掉核糖2'位上的氧(NDP→dNDP);然后,由一种既无碱基特异性又无糖环特异性的核苷二磷酸激酶将dNDP转变成dNTP(dNDP+ATP→dNTP+ADP)。

所以,用dNTP作原料在体外利用PCR技术扩增目基因简化了反应过程。

这里同时想到体内复制和体外复制的另一个比较,体外复制为什么不需要提供ATP?

体内复制的A TP主要有两个用处:可以为解旋酶催化的反应提供能量;在生成dNTP的反应中作为原料。PCR技术对这两处进行了改变或简化,所以,PCR 反应体系中没有再加入ATP。

4.如何从基因文库中获取到目的基因?具体操作如何?

对已知序列目的基因的筛选

DNA探针筛选:利用原位DNA探针筛选目的基因。

PCR法筛选

未知序列目的基因的筛选

(1)从蛋白质寻找基因

早期寻找基因的方法,对特异表达的蛋白质进行序列分析,并推测一段核苷酸序列,合成DNA探针,筛选分离相应的基因。

(2)同源性序列搜索

在Genebank等网站中收录了大量DNA序列的数据,用同源性比较工具Blastn 软件,搜索基因之间存在着的一些保守序列,可以判断某些新基因的存在。(3)差示筛选组织特异的cDNA

是利用一对组织基因表达的差异,筛选出其中一种组织中受某种因素调控表达的一种或一组基因。制备两种细胞群体,目的基因在其中一种细胞中表达或高表达,在另一种细胞中不表达或低表达,然后通过杂交对比找到目的基因。

(4)DNA微列阵技术筛选基因

把某一生物体内全部已知基因分别点到DNA芯片上,再用不同发育阶段的cDNA与之杂交,就能了解某些基因对特定生长发育阶段的表达情况。建立正常人特定组织、器官的基因芯片,给出标准杂交信号图。用可疑病人的cDNA做

探针与之杂交,检查哪些基因的表达受抑制或激活----基因诊断。

(5)用抗体筛选目的基因

cDNA应克隆在表达载体中。表达载体有使外源基因表达的必要调控部分。如启动子、SD序列等。通过表达产物与抗体特定的结合来识别和分离目的cDNA克隆。

5.酶切质粒和目的基因时,一般用几种限制性酶?

用同一种限制性内切酶切割目的基因和载体后,目的基因两端粘性末端相同,可能会反接。因此,实验室的酶切实验一般都选择双酶切。