孕产妇血清α-L-岩藻糖苷酶的变化及意义

α- L-岩藻糖苷酶检测的几点临床价值

α- L-岩藻糖苷酶检测的几点临床价值 乔博明（北京大学人民医院检验科100044） 1引言 α-L-岩藻糖苷酶(α-L-Fucosidase，AFU)是一种溶酶体酸性水解酶，早期测定本酶主要用于遗传性AFU缺乏症的诊断，并借以与其他遗传性粘多糖贮积病的鉴别。1980 年Deugnier 发现原发性肝癌(PHC)患者的AFU升高，并被后来研究证实，故有人提出AFU可作为PHC的肿瘤标志物，从此对AFU临床意义有了更多更深的研究。近年来研究发现，AFU对某些疾病的发生、发展均具有重要意义，特别在肝炎、妊娠等多种临床病理、生理中得到应用。 2 生物学特性 AFU系统命名为α-L－岩藻糖苷岩藻糖水解酶（EC3.2.1.51）其生理功能是参与含岩藻糖基的各种糖脂、糖蛋白、粘多糖等大分子物质的分解代谢。AFU广泛存在于人体各组织细胞溶酶体和体液中，胎盘、胎儿组织、脑、肺、肝、胰、肾以及血清、尿液、唾液和泪液中均含有AFU。AFU的化学本质是一种糖蛋白，血清中的AFU分子量为270～390 kD。用神经氨酸苷酶处理血清AFU，可使其分子量降至37 kD±4 kD，在pH值3.8～5.9酶活性基本消失，而在pH6.2～7.0酶活性增强。AFU分子具有多态性，这可能由决定这些酶单位形成的结构基因位点的突变引起。AFU的糖蛋白性质和分子中含唾液酸说明它确实存在核蛋白合成后的修饰，从而使血清中的AFU独具特性[1]。 3 血清α-L-岩藻糖苷酶对于原发性肝癌的诊断 原发性肝癌（PHC）是一种常见的恶性肿瘤，血清甲胎蛋白（AFP）曾被认为是PHC的特异性好、阳性率高的标志物，但有30％左右的PHC患者血清AFP阴性。因此，寻找AFP 以外的肝癌标志物显得尤为重要。近年来，血清α-L-岩藻糖苷酶（AFU）被认为是肝癌的一个新的标志物。 肝癌时AFU升高机制：AFU是一种溶酶体酶，广泛分布于各种组织细胞体液中，参与糖蛋白等多种生物活性物质的分解代谢。肝脏是富含溶酶体的器官，当肝脏细胞癌变时，AFU合成增加并大量释放入血，其机制可能为：①血清AFU激活物存在影响酶活性。有文献报道，PHC及正常人血清都能使标准的AFU活性升高，正常人血清AFU激活物与AFU活性呈正相关。而在PHC时，血清AFU激活物含量增加且和AFU关系发生紊乱，提示AFU激活物含量增加对PHC血清AFU活性升高起重要作用；②AFU底物浓度升高而使AFU代偿性升高。PHC时血清PBF（蛋白结合岩藻糖）和岩藻糖基化AFU浓度增加，人体内与蛋白结合的岩藻糖为L-岩藻糖，含岩藻糖的糖蛋白是AFU生理底物之一。有研究表明，PHC患者血清PBF含量增加。③癌外肝细胞合成AFU增加，肝癌细胞可分泌某种刺激因子作用于正常肝细胞，促使酶蛋白合成增加，引起血清AFU活性增加。其他消化道肿瘤即使发生肝转移，血清AFU也无明显增加示这种刺激具有肝癌特异性[2]。 临床资料[3，4，5]表明，PHC患者血清AFU 活性不仅显著高于正常对照，而且也显著

糖苷酶实验指导

α-糖苷酶抑制剂抑制活性测定 实验原理： 食物中的淀粉（多糖）经口腔唾液、胰淀粉酶消化成含少数葡萄糖分子的低聚糖（或称寡糖）以及双糖与三糖，进入小肠经α- 葡萄糖苷酶作用下分解为单个葡萄糖，为小肠吸收。在生理状态下，小肠上，中、下三段均存在α- 葡萄糖苷酶，在服用α- 葡萄糖苷酶抑制剂后上段可被抑制, 而糖的吸收仅在中、下段，故吸收面积减少，吸收时间后延，从而对降低餐后高血糖有益, 在长期使用后亦可降低空腹血糖, 估计与提高胰岛素敏感性有关。 对硝基苯-α-D-葡萄糖苷（pNPG）经α-葡萄糖苷酶水解可产生对硝基苯酚，其在405nm呈特异性吸收，因此可以通过检测对硝基苯酚的生成量检测α-葡萄糖苷酶的活性。 仪器与试剂 缓冲液：0.1M的磷酸钠缓冲液（pH6.8）--每100ml中1mol/l磷酸氢二钠4.6 ml，1mol/l磷酸二氢钠5.4 ml。 酵母α-葡萄糖苷酶：将100U/ml酶原液用0.1M的磷酸钠缓冲液（pH6.8）稀释为1U/ml的酶溶液，冷冻备用。 底物pNPG配制：2mM的pNPG溶解于0.1M的磷酸钠缓冲液中。 阿卡波糖抑制剂配制：200μg/ml溶于0.1M的磷酸钠缓冲液中。 实验内容 1.分组：空白对照组、阴性对照组、阳性对照组、阳性对照组空白、待测样品 大、中、小剂量组、待测样品组空白 空白对照： 170μl缓冲液+30μl 2mM的pNPG 阴性对照组：10μl酶溶液+160μl缓冲液+30μl 2mM的pNPG 阳性对照：10μl酶溶液+60μl缓冲液+100μl阿卡波糖抑制剂+30μl 2mM 的pNPG 阳性对照空白：10μl酶溶液+90μl缓冲液+100μl阿卡波糖抑制剂 待测样品组：10μl酶溶液+60μl缓冲液+100μl待测样品+30μl 2mM的pNPG 待测样品空白：10μl酶溶液+90μl缓冲液+100μl待测样品 2.实验步骤

精浆中性α-葡萄糖苷酶定量试剂盒

精浆中性α-葡萄糖苷酶定量检测试剂盒 简介： 精浆中含有源于附睾的中性α-葡萄糖苷酶同工酶和前列腺分泌的酸性同工酶，后者能够被选择性抑制，因此测定中性α-葡萄糖苷酶可反映附睾的功能。Leagene 精浆柠檬酸定量检测试剂盒测定原理是硝基苯酚吡喃葡萄糖苷(PNPG)在α-葡萄糖苷酶的作用下分解成p-硝基苯酚(PNP)，p-硝基苯酚通过96孔板测定仪或分光光度计测定吸光值，同时做PNP 标准曲线，通过标准曲线来计算精液中PNP 的具体含量，经过换算获得中性α-葡萄糖苷酶的活性。 Leagene 精浆柠檬酸定量检测试剂盒是根据Cooper 法改良而来，在合适浓度范围内有较好的线性关系。用分光光度计测定吸光值，若采用比色杯时，应按照比例调节精液和试剂的量。该试剂盒仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。 组成： 自备材料： 1、 1.5ml 离心管 2、 正向置换型加样器 3、 水浴锅或恒温箱 4、 96孔板 5、 酶标仪或分光光度计 操作步骤(仅供参考)： 1、 制备标准曲线：用PNP Developer 稀释PNP 标准(5mM)。取离心管加入PNP 标准 (5mM)和PNP Developer 混合，即获得浓度为200μM 的PNP 标准；取离心管，分 编号 名称 TC0104 50T Storage 试剂(A): PNP Developer 100ml 4℃ 试剂(B): α-Gul Inhibitor 1ml -20℃ 试剂(C): PNPG powder 5支 4℃ 避光 试剂(D): PNPG buffer 50ml RT 试剂(E): PNPG Stopping buffer 50ml RT 试剂(F): PNP 标准(5mM) 2×1ml -20℃ 避光 使用说明书 1份

α-葡萄糖苷酶抑制活性的测定方法

2.2实验方法 2.2.1α-葡萄糖苷酶抑制活性的测定方法 2.2.1.1 反应溶液的制备 （1）配制底物PNPG溶液：精确称取0.3766gPNPG，加适量0.1mol/L磷酸缓冲液（pH为6.8）溶解，再用容量瓶准确定容到50mL，配制成25mmol/L的母液。将母液分别稀释成0.1、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mmol/L7个不同梯度的标准品溶液，备用。 （2）配制α-葡萄糖苷酶的酶溶液：将冻干酶粉（酶活力为14u/mg）用0.01mol/L 磷酸缓冲液（pH为6.8）溶解，配制成2u/mL的母液。再将酶液分别稀释，配制成0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1.0u/mL的酶溶液，备用。 （3）配制DNJ标准溶液（抑制剂）：精确称取0.0010g DNJ 标准品，用容量瓶准确定容到10mL，配制成1000μg/mL DNJ标准母液。将母液分别稀释成、1、5、10、20、40、60μg/mL六个不同梯度的标准品溶液，备用。 （6）0.2mol/L的Na2CO3：称取2.16g Na2CO3于烧杯中，加入适量蒸馏水溶解，并定容到100mL，4℃下保存，备用。 2.2.1.2 PNP标准曲线的绘制 精确称取0.0278g对硝基酚（PNP），加0.01mol/L磷酸缓冲液（pH为6.8）溶解，再用容量瓶定容至10mL，即得20mmol/L母液。用蒸馏水将其母液稀释成浓度分别为1、5、10、20、40、40、80和100μmol/L的标准溶液。取100μl上述标准液，各加入150μL 0.2mol/L 的Na2CO3，混匀1 min ，再于405 nm处测定其吸光度，得标准曲线方程： y=128.13x+0.3579 (R2 =0.9998)，其中y 为浓度，x为吸光值。

β - 木糖苷酶(β - xylosidase )测定试剂盒说明书

货号：QS2620 规格：50管/24样β-木糖苷酶（β-xylosidase）测定试剂盒说明书 可见分光光度法 注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。 测定意义： β-木糖苷酶(EC3.2.1.37)存在于植物、细菌和真菌等生物体，是催化木聚糖类半纤维素降解的关键酶，产物木糖可作为碳源应用于微生物发酵。另外，β-木糖苷酶还可以作为生物漂白剂应用于造纸工业，比传统的漂白法环保，具有广泛的应用价值。 测定原理： β-木糖苷酶催化对硝基苯酚-β-D-木糖苷产生对硝基苯酚，对硝基苯酚在405nm处有特征吸收峰，测定405nm光吸收增加速率，可计算β-木糖苷酶活性。 自备实验用品及仪器： 天平、低温离心机、可见分光光度计、1 mL玻璃比色皿和蒸馏水。 试剂组成和配制： 提取液：液体50mL×1瓶，4℃保存。 试剂一：液体2mL×1瓶，4℃避光保存。 试剂二：液体20mL×1瓶，4℃保存。 试剂三：液体20mL×1瓶，4℃保存。 粗酶液提取： 1.组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加 入1mL提取液）进行冰浴匀浆，然后10000g，4℃，离心20min，取上清待测。 2.细菌、真菌：按照细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500 万细胞加入1mL提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后10000g，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。 3.液体：直接检测。 β-木糖苷酶活性计算公式： 标准曲线：y=13.226x+0.0011，R2=0.9998；x为标准品浓度（μmol/mL），y为吸光值ΔA。 1、按蛋白浓度计算 酶活定义：45℃，pH7.4时每毫克蛋白1min内催化产生1 nmol对硝基苯酚为一个酶活单位。 第1页，共2页

岩藻糖苷酶临床意义

α-L-岩藻糖苷酶（AFU）是一种溶酶体酸性水解酶，分子量为270 ～390K D，主要参与含岩藻糖基的各种糖脂、糖蛋白、粘多糖等大分子物质的分解代谢。广泛存在于人体各种组织细胞溶酶体和体液中，胎盘、胎儿组织、脑、肺、肝、肾以及血清、唾液中均含有AFU。溶血、黄疸、高血脂、污染标本严重影响结果。 肝脏疾病 肝癌：原发性肝癌患者血清中AFU活性不仅显著高于正常，而且也显著高于转移性肝癌、胆管细胞、恶性间皮瘤、恶性血管内皮细胞瘤、肝硬化、先天性肝囊肿和其它良性肝占位性病变。血清AFU对原发性肝癌诊断有较高的敏感性和特异性。AFU诊断的敏感性好，而特异性较AFP低。在肝硬化患者中检测AFU，如其活性增加，对发现一些较小的肿瘤更具有价值，此时AFP不能对较小的肿瘤做出诊断。因此，应用和推广AFU作为原发性肝癌新的诊断指标，具有重要的意义，尤其是AFP阴性和小细胞肝癌的诊断价值更大。因与AFP无明显相关可互初诊断，联合检测可提高肝癌的检出率 肝炎：部分乙肝患者的血清AFU 活性有不同程度的升高，可能与肝细胞损伤、酶逆流入血有关。乙肝患者血清AFU活性和血清ALT活性的升高程度具有高度的正相关。经抗肝炎治疗后，血清ALT 活性下降，AFU活性也迅速下降，ALT活性持续不变或上升者，AFU活性也不下降。血清AFU活性测定有助于乙肝病情发展的预测。 肝硬化：肝硬化患者血清AFU 活性长期升高提示易发展为肝癌，或表示病情危险，或已有小病灶肝癌存在。所以血清AFU活性测定有助于肝硬化患者预后的观察 急性黄疸型肝炎：可使肝细胞发生一系列的病理改变：如肝细胞浑浊肿胀、点状坏死及灶性坏死，肝细胞不同程度增生，肝细胞内线粒体增生、数目增多、基质密度增深呈明显固缩性变，胞质中可见到大量空泡状结构。溶酶体增生并吞噬大量线粒体和脂滴，胞核中可见大空泡，狄氏腔内胶原纤维增生等雎。由于肝细胞的损伤，急性黄疸型肝炎时都有血清TBIL、ALT的明显升高，同时也伴有AFU的升高，但升高的程度不及肝硬化和肝癌。明随着治疗后TBIL和ALT的下降，AFU活性快速降至正常水平。 妊娠：健康孕妇伴随着妊娠周数的增加AFU 水平呈升高趋势，在自然分娩或人工终止妊娠后迅速下降，5d后降至正常。因此，孕妇血清中AFU增高应视为妊娠过程中的特殊生理反应，不同于肝病时的升高，临床医生应加以区别。 卵巢肿瘤：研究表明，卵巢癌患者血清AFU活性降低，且与疾病分期、肿瘤负荷、组织学分型和肿瘤分化程度无关。良恶性卵巢癌患者血清AFU活性降低可能与遗传因素有关 糖尿病：糖尿病患者血清AFU可反映HbA1C和GLU所提示的糖代谢控制现状，其机制目前尚不明了。有研究认为糖尿病患者持续高血糖状态可激活多元醇旁路系统，使醛糖还原酶活性增加，产生大量的山梨醇，同时抑制山梨醇脱氢酶活性，使山梨醇在细胞内大量积聚。由于AFU广泛分布于人体内的各种组织细胞（主要存在于细胞溶酶体内）中，而山梨醇等多元醇物质对溶酶体有很强的

β-葡萄糖苷酶的活性分离及其检测 2

β-葡萄糖苷酶的活性分离及其检测 一、实验目的 理解与掌握使用活性分离法分离β-葡萄糖苷酶。二、实验原理 在分离培养基中添加底物七叶苷和亚铁离子。如果存在β-葡萄糖苷酶，七叶苷会被细菌的β-葡萄糖苷酶分解生成七叶素，七叶素与培养基中的枸橼酸铁的二价铁离子发生反应形成黑色化合物。 培养基完全变黑为阳性，不变黑为阴性。 三、实验仪器与试剂 仪器 超净工作台、隔水式恒温箱、微波炉、摇床、10uL 移液枪、200uL 移液枪等 试剂 β-葡萄糖苷酶液体分离培养基、β-葡萄糖苷酶固体分离培养基、IPTG溶液、Amp溶液 四、实验步骤 1、利用微波炉融解β-葡萄糖苷酶固体分离培养基，

冷却培养基至50℃左右，在无菌操净台上加入50uLAmp 抗生素至终浓度为100μg/ml，加入50uL诱导剂IPTG，至终浓度为50μg/ml，小心混匀，避免气泡的产生；制备两块活性分离平板；每块分离平板20ml~25ml； 2用灭菌的牙签，将重组菌 Rosetta(DE3)plysS/pGXAG108G转移至一块分离平板上；在不同的平板位置点样3次；将对照菌株大肠杆菌Rosetta(DE3)plysS/pETBlue-2也转移至另外一块分离平板上；在不同的平板位置点样3次； 大致位置如下图所示

3、37℃恒温培养箱倒置培养24h左右; 观察结果； 4、在操净台中两瓶液体分离培养基中，分别加入 5uLAmp抗生素，至终浓度为100μg/ml，加入5uL诱导剂IPTG，至终浓度为50μg/ml； 5、利用牙签，在一瓶液体分离培养基中，加入重组菌Rosetta(DE3)plysS/pGXAG108G；在另外一瓶中加入对照菌株大肠杆菌Rosetta(DE3)plysS/pETBlue-2； 37℃恒温摇床10h，观察结果。 五、实验结果与分析 实验结果： 液体培养基加入重组Rosetta(DE3)plysS/pGXAG108G 的培养基颜色变深，不透光。加入对照菌株大肠杆菌Rosetta(DE3)plysS/pETBlue-2的培养基颜色不变，仍透光。 固体培养基对于点了对照菌株的6个位置均无变化，对于点了重组菌株的6个位置，其中4个正常变黑，1个未变化，1个黑色扩大有流出扩散现象，将周围一片均染黑。

α-L-岩藻糖苷酶临床应用

α-L-岩藻糖苷酶（AFU） （AFU）是一种溶酶体酸性水解酶，1980年法国学者Deugnier等研究发现，AFU在诊断肝细胞癌中敏感性好，阳性率高，是AFP阳性率的三倍以上，对AFP阴性病例及小细胞肝癌的诊断价值极大，是早期原发性肝癌诊断的有用指标。并被众多研究所证实。 一．生化特性：AFU，主要参与含岩藻糖基的各种糖脂、糖蛋白、粘多糖等大分子物质的分解代谢。广泛存在于人体各组织细胞溶酶体和体液中。 二．标本 血清、尿液、唾液、泪液等标本均可。标本应澄清，4℃保存3天，-20℃保存3个月，避免反复冻融。溶血、黄疸、高血脂、污染标本严重影响结果。 三．临床意义 1．肝癌：原发性肝癌患者血清中AFU活性不仅显著高于正常对照，而且也显著高于转移性肝癌、胆管细胞、恶性间皮瘤、恶性血管内皮细胞瘤、肝硬化、先天性肝囊肿和其它良性肝占位性病变。对原发性肝癌诊断的阳性率为64%-84%，特异性达90%左右。通过对原发性肝癌、肝硬化患者进行AFU、AFP检测，发现原发性肝癌和肝硬化后肝癌患者AFU、AFP 均增高，以AFP500ng/mL为诊断肝癌的临界值，其假阳性率为43%，AFU740nmol/(ml．h)为临界值，其敏感度为84%，特异性为94%。因此，血清AFU对原发性肝癌诊断有较高的敏感性和特异性。国内对24例肝细胞癌患者进行血清AFU和AFP相关研究，发现AFU诊断敏感必为87%，特异性为78%，而AFP则分别为65%和89%（诊断界限为，20ug/L）。提示AFU诊断的敏感性好，而特异性较AFP低。血清中AFU活性和阳性率与肝癌直径大小无明显相关性。小肝癌组血清AFU阳性率70.8%显著高于AFP（37.5%）。AFP阴性和AFP升高而不足以诊断原发性肝癌者，其血清AFU的阳性率达80.8%。肝组织活检证实为原发性肝癌者，血清AFU的阳性率为AFP阳性率的3倍以上。。在肝硬化患者中检测AFU，如其活性增加，对发现一些较小的肿瘤更具有价值，此时AFP不能对较小的肿瘤做出诊断。因此，应用和推广AFU作为原发性肝癌新的诊断指标，具有重要的意义，尤其是AFP阴性和小细胞肝癌的诊断价值更大。因与AFP无明显相关可互初诊断，联合检测可提高肝癌的检出率。2．妊娠与卵巢肿瘤：研究表明，随妊娠周数增加血浆AFU递增，在自然分娩或人工终止妊娠后，迅速下降，5天降到正常。卵巢癌患者血清AFU活性降低，且与疾病分期、肿瘤负荷、组织学分型和肿瘤分化程度无关。良恶性卵巢癌患者血清AFU活性降低可能与遗传因素有关。 3．其它：岩藻糖苷酶贮积患者由于先天性组织器官和体液中AFU缺乏或活力降低，导致糖蛋白或糖脂代谢紊乱。胃癌患者血清AFU升高，急性胰腺炎不升高，囊性纤维变性伴发胰腺炎时则下降，进行性锥体营养不良血清AFU活性下降

葡萄糖苷酶酶活测定优化

本科毕业论文 题目红佳酿酵母β-葡萄糖苷酶酶活测 定条件优化 学院食品科学与工程学院 专业生物工程 毕业届别2014届 姓名贾滔 指导教师王婧 职称副教授 甘肃农业大学教务处制 二〇一四年六月

目录 摘要 (1) 前言 (2) 1 材料与方法 (2) 1.1 试验材料 (2) 1.1.1 供试菌株 (2) 1.1.2 主要药品 (3) 1.1.3 供试培养基 (3) 1.2 试验方法 (3) 1.2.1 菌株活化 (3) 1.2.2 粗酶液的制备 (3) 1.2.3 β-葡萄糖苷酶活力的测定 (4) 1.2.3.1 标准曲线绘制 (4) 1.2.3.3 酶活力计算 (4) 1.2.4 酶活力测定条件的优化 (4) 1.2.4.1 单因素试验 (4) (1) 反应时间的选择 (4) (2) 反应温度的选择 (4) (3) 缓冲液pH值的选择 (5) (4) 底物浓度的选择 (5) 1.2.4.2 酶活力测定的正交试验 (5) 1.2.5 数据处理统计 (5) 2 结果与分析 (6) 2.1 单因素试验结果分析 (6) 2.1.1 反应时间对酶活力的影响 (6) 2.1.2 反应温度对酶活力的影响 (6) 2.1.3 底物浓度对酶活力的影响 (7) 2.1.4 缓冲液pH对酶活力的影响 (7) 2.2 正交试验 (7) 2.2.1 数据处理统计 (8) 3 讨论 (9) 4 结论 (9) 参考文献 (10) 致谢 (11)

红佳酿酵母β-葡萄糖苷酶的酶活测定条件优化 贾滔 （甘肃农业大学食品科学与工程学院生物工程班2010级） 摘要：以红佳酿酵母菌株为出发菌株，对其β-葡萄糖苷酶的酶活性测定条件进行研究。通过单因素试验研究了缓冲液pH值、反应时间、反应温度、底物浓度对β-葡萄糖苷酶活力的影响，并采用正交试验确定了最佳酶活测定条件。结果表明：缓冲液pH值5.0；反应时间为10min;反应温度为50℃；底物浓度为40mmol/L，在此条件下红佳酿酵母β-葡萄糖苷酶粗酶液的酶活力最高，达到47.58±0.58U/mL。 关键词：红佳酿；β-葡萄糖苷酶；酶活;测定方法；优化 To optimize the measurement conditions about enzyme activity of vintage r ed β- glycosidase Jia Tao （Gansu Agricultural University Food science and engineering college Biological engineering class The class of 2010） Abstract: In order to research the measurement conditions about enzyme activity of β- glycosidase ，use vintage red strains for test strains．The effect of buffer pH value，reaction time，temperature and substrate concentration on enzyme activity of β- glycosidase was studied by the method of single factor experiment，and we determines the best conditions for the enzyme activity by applying the orthogonal test ．The results showed that enzyme activity of Red wine yeast β- glycosidase is the highest under the condition of buffer solution pH value was 5.0，reaction time was 10min，temperature was 50℃and substrate concentration was 40mmol/L．Reached 47.58 ± 0.58U/mL。 Key words : Vintage red; β-glucosidase; Activity; Determination; Optimization

妊娠晚期孕妇血清碱性磷酸酶岩藻糖苷酶含量变化及意义.

妊娠晚期孕妇血清碱性磷酸酶岩藻糖苷酶含量变化 及意义 ［摘nbsp;nbsp;要］nbsp;目的：测定妊娠晚期孕妇血清中碱性磷酸酶(ALP)、岩藻糖苷酶(AFU)的含量，以探讨其含量变化在妊娠晚期中的意义。方法：实验组190 ［摘要］目的：测定妊娠晚期孕妇血清中碱性磷酸酶(ALP)、岩藻糖苷酶(AFU)的含量，以探讨其含量变化在妊娠晚期中的意义。方法：实验组190例为孕期32周～40周待产孕妇，对照组80例为健康查体者，分别检测血清ALP、AFU的含量。结果：实验组血清ALP、AFU的含量较对照组差异有显著性(P<0.01)，并随孕周的增加ALP、AFU的含量也有所增加。结论：血清ALP、AFU的活性检测，可以作为孕妇在妊娠晚期胎盘、胎儿动态观察的指标。 ［关键词］碱性磷酸酶；αL岩藻糖苷酶；妊娠晚期 血清碱性磷酸酶(ALP)在临床上主要用于骨骼、肝胆系统疾病的诊断和鉴别诊断，而αL岩藻糖苷酶(AFU)作为原发性肝癌(PHC)的特异性及诊断性血清标志物［1］也愈来愈多的被临床所接受和应用。在临床工作中我们又发现在孕妇的妊娠晚期，血清ALP、AFU含量均有所增高，对此我们做了一些相关实验，来探讨一下妊娠晚期血清ALP、AFU的含量变化以及临床意义。 1 对象与方法 1.1 对象实验组均为我院待产的妊娠32周～40周的孕妇，共190例，平均年龄25岁～30岁，经B超、肝功能化验排除肝胆疾患及女性肿瘤，HBsAg阴性。对照组为正常体检的健康育龄妇女，平均年龄22岁～28岁。 1.2 试剂与方法 ALP采用AMP缓冲液法，试剂为上海科华生物工程股份有限公司提供，产品批号200605229。AFU采用新型CNPF连续监测法，试剂为浙江夸克生物科技有限公司提供，产品批号060328。各受试者均在清晨抽取空腹血3 ml，3 000 r／min离心5 min，取上清液，2 h内于日立7600全自动生化分析仪进行检测，仪器进行正常的校准和室内质控。 1.3 统计学处理进行样本均数t检验。 2 结果 本实验室参考值范围为ALP：45 U／L～132 U／L，AFU：12 U／L～40 U／L。对照组及实验组血清ALP结果见表1，对照组及实验组血清AFU 结果见表2。 表1 对照组与实验组血清ALP测定结果(略) 表2 对照组与实验组血清AFU测定结果(略) 3 讨论 血清ALP是一种含锌的糖蛋白，广泛存在于各器官组织中，在碱性环境下可以水解各种天然及人工合成的磷酸单酯化合物底物。ALP有三种同工酶，即肝／骨／肾ALP、胎盘ALP和肠ALP［2］。αLAFU是一种溶酶体酸性水解酶，基本生理功能是催化含岩藻糖基的低聚糖、糖蛋白、糖肽、糖苷的分解代谢，广泛存在于人体内各种组织、细胞及体液中［3］。从本实验可以看出，实验组孕32周～40周妊娠晚期妇女血清ALP、AFU含量较对照组明显升

土壤β-1,4-葡聚糖酶 纤维二糖苷酶(S-C1)活性检测试剂盒说明书 微量法

土壤β-1,4-葡聚糖酶/纤维二糖苷酶（S-C1）活性检测试剂盒说明书微量法 注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。 货号：BC4035 规格：100T/48S 产品内容： 试剂一：甲苯2mL×1瓶，4℃保存；（自备） 试剂二：粉剂×2瓶，4℃保存；临用前每瓶加入7.5mL试剂三，充分溶解备用，用不完的试剂仍4℃保存； 试剂三：液体40mL×1瓶，4℃保存； 试剂四：液体30mL×1瓶，4℃保存； 标准品：液体1mL×1支，5mmol/L的对硝基苯酚溶液。临用前用试剂三将标准品稀释50倍得100μmol/L的标准溶液。 产品说明： β-1,4-葡聚糖酶/纤维二糖苷酶（C1，EC3.2.1.91）存在于细菌、真菌和动物体内，是纤维素酶系的组份之一，C1酶作用于纤维素线状分子的末端，水解β-葡萄糖苷键，每次切下1个纤维二糖分子。 S-C1能够催化对硝基苯纤维二糖苷(PNPC)生成对-硝基苯酚，后者在400nm有特征光吸收。 自备实验用品及仪器： 可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、研钵、冰、30-50目筛（或更小）、甲苯（不允许快递）和蒸馏水。 操作步骤： 一、样本处理： 新鲜土样自然风干或37℃烘箱风干，过30-50目筛。 二、测定步骤： （1）分光光度计/酶标仪预热30min，蒸馏水调零。波长调至400nm。

（2）加样表： 试剂名称测定管对照管标准管空白管 风干土样（g）0.030.03-- 试剂一（μL）1515--振荡混匀，使土样润湿，室温放置15min-- 试剂二（μL）120--- 试剂三（μL）150150-- 混匀，37℃水浴反应1h后，立即沸水浴5min（盖紧，防止水分 -- 散失），流水/冰浴冷却。 试剂二（μL）-120--10000rpm25℃离心10min，取上清液-- 上清液（μL）100100-- 标准品（μL）--100- 蒸馏水（μL）--100 试剂四（μL）200200200200充分混匀，室温静置2min后，吸取200μL于微量比色皿/96孔板中测定400nm处的吸光值A，分别记为A 测定管、A对照管、A标准管、A空白管。计算ΔA=A测定管-A对照管，ΔA标准=A标准管-A空白管。每个测定管设一个对照管。 三、S-C1活力计算： 单位的定义：每天每g土样中产生1μmol对-硝基苯酚定义为一个酶活力单位。 S-C1活力（U/g土样）＝ΔA÷(ΔA标准÷C标准)×V反总÷W÷T=0.684×ΔA÷ΔA标准÷W。 T：反应时间，1h=1/24d；V反总：反应体系总体积：2.85×10-4L；C标准：标准溶液浓度，100μmol/L；W：样本质量。 注意事项： 1、当吸光值大于1.5时，建议将上清液用试剂三稀释后测定或者减少土样质量测定。

土壤N-乙酰-β-D-葡萄糖苷酶(S-NAG)活性检测试剂盒说明书 可见分光光度法

土壤N-乙酰-β-D-葡萄糖苷酶（S-NAG）活性检测试剂盒说明书可见分光光度法 注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。 货号：BC4000 规格：50T/24S 产品内容： 试剂一：液体30mL×1瓶，4℃保存； 试剂二：粉剂×1瓶，-20℃保存；临用前加入7.5mL蒸馏水溶解，用不完的试剂仍-20℃保存； 试剂三：液体60mL×1瓶，4℃保存； 标准品：液体1mL×1支，5mmol/L的对硝基苯酚溶液，4℃保存。临用前用试剂一将标准品稀释50倍得100μmol/L的标准溶液。 产品说明： 土壤N-乙酰-β-D-葡萄糖苷酶（S-NAG）是土壤微生物分泌的溶酶体中的一种酸性水解酶。其活性变化与机体某些病理状态密切相关。 S-NAG分解对硝基苯β-N-乙酰氨基葡萄糖苷生成对-硝基苯酚，后者在400nm有最大吸收峰，通过测定吸光值升高速率来计算NAG活性。 自备实验用品及仪器： 可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵、冰、30目筛（或更小）、和蒸馏水。 测定操作： 一、样本处理： 新鲜土样自然风干或37℃烘箱风干，过30-50目筛。

二、操作步骤： （1）分光光度计预热30min，波长调至400nm，蒸馏水调零。 （2）加样表： 试剂名称测定管对照管标准管空白管风干土样（g）0.10.1-- 试剂一（μL）475475-- 试剂二（μL）125--- 混匀，37℃水浴1h后，立即沸水浴5min（盖紧，防止 -- 水分散失），流水/冰浴冷却。 试剂二（μL）-125-- 12000g25℃离心10min，取上清液-- 上清液（μL）500500-- 标准品（μL）--500- 蒸馏水（μL）--500 试剂三（μL）1000100010001000 室温静置2min后，10000g常温离心5min，取上清测定400nm处的吸光值A。分别记为A测定管、A对照管、A标准管、A空白管。计算ΔA=A测定管-A对照管，ΔA标准=A标准 管-A空白管。每个测定管设一个对照管。 三、S-NAG活力计算： 单位的定义：每天每g土样中产生1μmol对硝基苯酚定义为一个酶活力单位。 S-NAG活力（U/g土样）＝ΔA÷(ΔA标准÷C标准)×V反总÷W÷T=1.44×ΔA÷ΔA标准÷W。 T：反应时间，1h=1/24d；V反总：反应体系总体积：6×10-4L；C标准：标准溶液浓度，100μmol/L；W：样本质量。 注意事项： 1、当ΔA大于1时，建议将上清液稀释后进行测定；当ΔA小于0.02时，建议延长反应时间。计算公式中 注意乘以稀释倍数或注意反应时间变化。

糖苷酶及其抑制剂的研究

糖苷酶及其抑制剂的研究 摘要：糖苷酶是生命体正常运转的关键性酶，糖苷酶抑制剂可抑制糖苷酶的活性，阻断碳水化合物的分解，因此对一些糖代谢紊乱性疾病如糖尿病、肥胖病等有临床应用价值。本文研究了糖苷酶中的β－半乳糖苷酶、β－葡萄糖苷酶以及蔗糖酶的抑制剂。重点研究了β－半乳糖苷酶的分子结构和活性基团，并从结构出发筛选其抑制剂，发现此酶的抑制剂种类较少且抑制活性较低。本实验采用混合交叉筛选法筛选了多种金属离子和氨基酸对β－半乳糖苷酶的抑制作用，同时也筛选了天然产物和合成化合物。 关键词：糖苷酶β－半乳糖苷酶β－葡萄糖苷酶蔗糖酶抑制剂的筛选混合交叉法 1、前言 糖苷酶和糖基转移酶不仅参与了体内碳水化合物的消化，而且是糖脂、糖蛋白生物合成中寡糖链的修剪酶，它对糖蛋白中寡糖链的形成极为重要；糖链的组成与结构是糖蛋白特异生物功能的识别部位，

因此糖苷酶活性对糖蛋白生物合成有关键作用，而后者又涉及到免疫反应、神经细胞的分化、肿瘤的转移以及病毒和细菌的感染. 因此, 糖苷酶不仅是生命体正常运转的关键性酶,同时又是许多疾病的相关酶. 与病毒感染、癌症及一系列新陈代谢紊乱性疾病如糖尿病、肥胖病有关。由于糖苷酶重要的生物学意义，糖苷酶抑制剂的研究也引起了人们的极大兴趣。 糖苷酶抑制剂即是可抑制糖苷酶的活性，阻断碳水化合物的分解，抑制淀粉、麦芽糖、蔗糖转变成单糖；影响糖脂、糖蛋白生物合成中寡糖链的修剪；所以糖苷酶抑制剂不但对一些糖代谢紊乱性疾病如糖尿病、肥胖病等有临床应用价值[1] ，而且可作为抗AIDS病毒[2]、抗鼠白血病毒[3]的潜在治疗试剂。 本论文重点研究了糖苷酶中的β－半乳糖苷酶 β－半乳糖苷酶（β－galactosidase）又称β－D－半乳糖苷水解酶，（β－D－galactosid- -e galacto-hydrolase ,EC.3.2.1.23）,商品名为乳糖酶（Lactase），它广泛存在于豆类及其他各种动植物体内和微生物中。它能够催化β－半乳糖苷化合物中的β－半乳糖苷键发生水解，还具有转半乳糖苷的作用。由于它具有糖苷键结构特异性，可作为乳糖降解和双糖合成催化剂[4,5]，并有水解生物体内储存的多糖和半乳糖残基.引起血型转化等生理功能[6,7]而受到人们广泛关注，成为生物化学和酶催化化学的重要研究课题。 β－半乳糖苷酶的应用有着长远的历史，最初在食品工业中用来降解乳糖含量以满足乳糖不适症患者的需要，然而随着生物技术的发

β-葡糖苷酶(纤二糖酶)测定方法

试验二β-葡萄糖苷酶(BG; EC3.2.1.21)活性测定新鲜土样 比色法的原理：以对硝基苯-β-D-吡喃葡糖苷为基质，水解产生对硝基酚，比色测定（硝基酚比色法）。 1.配置溶液： （1）改进的通用缓冲溶液（MUB）贮备液：12.1g三羟甲基氨基甲烷（C4H11NO3即Tris）、11.6g马来酸（C4H4O4）、14g柠檬酸（C6H8O7）和6.3g硼酸（H3BO3）溶 于500ml 1mol.L-1 NaOH溶液中，用去离子水稀释至1L，于4℃下贮存。 （2）pH值6.0的MUB缓冲溶液：在继续搅拌下，在200ml MUB贮备液中分别滴加 0.1 mol.L-1 HcL或0.1mol.L-1 NaOH至溶液pH值为6.0，去离子水稀释定容至1L （3）4-Nitrophenyl-beta-D-glucopyranoside对硝基酚-β-D-吡喃葡糖苷（PNPG）溶液[C12H15NO8=25mmol.mol-1]：0.377g PNPG溶于40ml MUB溶液（pH为6.0） 中，用相同pH值的缓冲液稀释至50ml，于4℃下贮存。301.25（4）Cacl2溶液（0.5mol.L-1）：取无水Cacl2 55.49g加入1L的容量瓶中配置 （5）Tris缓冲液[c（C4H11NO3）=0.1mol.L-1，pH值12.0]：12.2 g三羟甲基氨基甲烷（Tris）溶于800ml去离子水，用0.5mol.L-1 NaOH调节pH至12.0，去离子水稀 释至1L （6）标准对硝基苯酚溶液：溶解0.500g 对硝基酚于400ml 双去离子水中，定容到500mL，保存于4度，用时再稀释10倍。稀释后为100ug.ml-1。（一般需1000ppm） 2.试验过程 (1)取1g新鲜土样(<2mm)于100ml三角瓶中，加0.25ml甲苯, 通风橱10min后，4ml pH为6.0的MUB溶液和1mm PNPG溶液，盖上瓶盖，充分混匀，在37℃培养1h。 (2)加1ml Cacl2溶液和4ml 0.1M pH值12.0的Tris缓冲液，摇匀，迅速用快速滤纸过滤，滤液在400nm处比色测定。做空白对照时，可在培养结束后，加Cacl2溶液和tris缓冲液之前加入1mL缓冲液（代替1mL底物）溶液。每个样品必须做一个空白和三次重复。 (3)标准曲线：吸取0，0.5，1，2，3，4，5, 6ml于100ml容量瓶中，加去离子水稀释至5ml，然后加1ml氯化钙溶液和4ml tris溶液，充分混匀后定容50ml，过滤，400nm处比色测定 结果计算 β-葡萄糖苷酶活性（μg对-硝基酚.g-1.h-1）=CV/dwt 式中：C表示样品对-硝基酚的含量（μg/ml）； V表示土壤溶液体 Dwt表示烘干土壤质量 个人做法实验终止后加入5mL离子水稀释后过滤（若果用微孔板，则可以不用加离子水）

纤维素酶活性检测方法简析

2011年第07期（总第257期） 吉 林 农 业 JILIN AGRICULTURE NO.07，2011 （CumulativetyNO.257） 156 JILIN AGRICULTURE 纤维素酶活性检测方法简析 邹 剑 （郑州市惠济区农业农村工作委员会，河南郑州 450000） 摘要：随着生物化学、分子生物学技术以及基因工程等多门交叉学科的快速发展，如何进一步阐明纤维素酶的结构与功能，明确纤维素酶的基因表达与调控的关系，并由此拓展更多更好的研究方法、手段，在纤维素酶的研究方面将具有重要意义。 关键词：纤维素酶；生物传感器；活性 中图分类号：Q539+.3 文献标识码：A 文章编号：1674-0432（2011）-07-0156-1 纤维素是地球上最丰富且可再生的生物聚合物，纤维物质由于结构复杂任何单一的酶都难以将其高效水解。纤维素酶活力测定方法很多，其主要原因在于纤维素酶作用的底物比较复杂，反应产物不同。近年来随着多种交叉学科的快速发展，生物化学、分子生物学以及基因工程等相关领域的研究，促进了更多更新的纤维素酶活测定以及动力学研究方法的出现。 1 纤维素酶系的分类组成 通常，由作用方式不同但能相互协同催化水解纤维素的三类酶，组成一个完整的纤维素酶系：内切葡萄糖苷酶，这类酶作用于纤维素分子内部的非结晶区；外切葡萄糖苷酶，又称纤维二糖水解酶，这类酶作用于纤维素线状分子末端；β-葡萄糖苷酶，这类酶将纤维二糖水解成葡萄糖分子。纤维素酶属于糖苷水解酶，随着各种催化残基鉴定方法出现，以及糖苷水解酶的氨基酸序列和３D结构研究的不断增多，在氨基酸序列相似性基础上确立的新的糖苷水解酶分类方法将糖苷水解酶分为111个族，纤维素酶占其中的16个族。 2 纤维素酶活性的检测方法 纤维素酶各组分的底物专一性不同，而且纤维素酶是多组分复合物。纤维素酶作用的底物也比较复杂，同时不同来源的纤维素酶其组成及各组分的比例有较大的差异，致使纤维素酶活力的测定方法复杂而不统一。 2.1 传统检测方法 曾报道过传统纤维素酶测定方法很多，如微晶纤维素酶活测定方法、滤纸酶活（FPA）测定方法、水杨苷酶活测定方法、、染色纤维素法、滤纸崩溃法、棉线切断法、羧甲基纤维素钠盐（CMC-Na）酶活性测定方法、棉花糖法、CMC粘度降低法、荧光定糖法平板法。 纤维素酶系总的糖化能力的测定常见有３种：一是通过测定荧光物质的荧光强度的大小，来计算其还原糖含量的荧光法，其主要是根据还原糖与反应液生成荧光物质。二是滤纸酶活（FPA）测定法，纤维素酶系总的糖化能力，通过以滤纸为底物经纤维素酶水解后生成的还原糖的量表征，因为滤纸是聚合度和结晶度都居“中等”的纤维性材料。三是滤纸崩溃法，以滤纸完全崩溃为粉末状所需的时间来表征纤维素酶的活力，在容器内加入缓冲液和适当稀释的酶液，放入一定尺寸的滤纸条，一定温度条件下反复振荡。 外切葡萄糖苷酶活力的测定有棉花糖化法方法和微晶纤维素酶活测定方法两种。两者均采用DNS显色法，通过计算还原糖的量来表征外切葡萄糖苷酶活力，主要是利用纤维素酶降解微晶纤维素、棉。 纤维素酶中内切葡萄糖苷酶对CMC-Na有降解能力，因此内切葡萄糖苷酶活力的表征主要为CMC-Na酶活性测定方法。用标准葡萄糖溶液作标准曲线，通过DNS法显色，针对内切葡萄糖苷酶与CMC-Na降解生成的葡萄糖等还原糖，以每分钟生成相当于1μmol 的葡萄糖所需酶量定义为一个酶活性单位，使用分光光度计测其吸光度。 Β-葡萄糖苷酶活性的测定常用方法有３种：一是将它们衍生为无荧光的底物，因为伞形酮（７-羟基香豆素）与４-甲基伞形酮具有强烈荧光的特点，使用荧光法进行测定；二是Barush和Swiain法，它以水杨苷作底物，使释放出来的水杨醇显色（或DNS 显色），酶解产物用４-氨基安替比林作显色剂，再用分光光度法比色测定；三是以对-硝基苯-β-葡萄糖苷为底物进行酶解，底物水解后释放出的配基对硝基苯酚可直接在400～420nm波长范围内测定。 2.2 传感器检测方法 与新型先进技术相比，传统方法进行还原糖以及多糖水解酶的酶活测定，还是存在一定缺点，虽然其操作相对简便、快捷。如实验步骤复杂，灵敏度低，有颜色底液严重干扰，重现性差。而生物传感器适应于复杂体系的实时及在线测定，具有快速测定、简便易携、高灵敏度、高专一性，而且检测样品一般可反复多次使用、不需另加其他试剂、不需要预处理、不要求样品清晰度等优点，在监测与控制中显示出巨大的优势。 压电生物传感器（piezoelectric biosensors）通过监测谐振器吸附待测物后频率的变化来检测待测物，主要是利用压电石英谐振器对质量的敏感性，是近二十年来发展起来的一种新型生物传感器。这类传感器最大的优点是不需要任何标记，具有响应灵敏、选择性好、仪器简单、操作方便、便于自动化等优点，成为生物传感器领域的研究热点之一，因此引起了人们的浓厚兴趣。 电化学酶传感器主要由固定化酶膜和电极组成。固定化酶膜可以催化被“识别”出的物质发生化学反应，进行选择性地“识别”被检测的物质，电极则通过仪表显示出来这一催化反应中底物或产物的变量转换成的电信号。 3 小结 不同来源纤维素酶，其组成及各组分的比例有较大的差异。仅运用传统方法对其研究已是远远不够的。而传感器灵敏度高、选择性好、操作简单，正逐步趋向微型化、阵列化，其作为近年发展起来的可对所分析物质进行快速、准确、实时检测的新方法，越来越广泛地应用在研究监测领域中。在已有的相关工作基础上，为今后研制出生产实践过程中纤维素酶酶活在线快速测定方法提供了一定意义和指导作用。 参考文献 [1] 刘佳.袁兴中.曾光明,等.表面活性剂对绿色木霉产纤维素酶影响的实验研究[J].中国生物工程杂志,2006. [2] 干宁.徐伟民.李天华.纤维素酶活性测定的生物传感器研究[J].纤维素科学与技术,2007. [3] 黄爱华,李君文,谌志强,等.基因芯片技术检测鉴定临床常见致病真菌初步研究[J].中华微生物学和免疫学杂志,2007.

β-N-乙酰葡萄糖苷酶(NAG)检测试剂盒(PNP微板法)

β-N-乙酰葡萄糖苷酶检测试剂盒(PNP 微板法) 简介： β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(NAG)可水解β-N-乙酰氨基葡萄糖苷，也能水解β-N-乙酰氨基半乳糖苷，该酶广泛存在于多种组织、体液、细胞，是溶酶体中的一种酸性水解酶，其测定方法有比色法和荧光光度法。 Leagene β-N-乙酰葡萄糖苷酶检测试剂盒(PNP 微板)(NAG Colorimetric Assay Kit)检测原理是在酸性条件下NAG 可使底物对硝基酚-β-N-乙酰氨基葡萄糖苷水解，释放出游离的对硝基酚(p -nitrophenol ，PNP)，在碱性条件下p -nitrophenol 呈黄色产物，产物黄色越深，说明β-N-乙酰葡萄糖苷酶活性越高，反之则酶活性越低，通过酶标仪测定处吸光值，据此通过比色分析就可以计算出酸性磷酸酶活性水平。该试剂盒可用于检测细胞或组织的裂解液或匀浆液、血浆、血清、尿液等样品中的β-N-乙酰葡萄糖苷酶活性。该试剂盒仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。 组成： 自备材料： 1、 96孔板 2、 恒温箱 3、 酶标仪 操作步骤(仅供参考)： 1、 配制检测工作液： ① 配制显色工作液： 取出4-NAG ，恢复至室温后溶解于NAG Assay buffer ，混匀， 冰上预冷备用。新配制的显色工作液应在10天内用完。 ② 配制标准品工作液：取出p -nitrophenol(10mM) 恢复至室温后，取溶解于ACP Assay buffer ，使p -nitrophenol 达到。 编号 名称 TE0061 50T Storage 试剂(A): NAG Assay buffer 7.5ml 4℃ 试剂(B): 4-NAG 1支 -20℃ 避光 试剂(C): Alkaline buffer 0.05ml 4℃ 试剂(D): p -nitrophenol(10mM) 0.05ml -20℃ 避光 试剂(E): ddH 2O 1ml RT 使用说明书 1份