生姜蛋白酶提取及反胶束纯化工艺初步研究_蔡海燕
生姜蛋白酶提取及反胶束纯化工艺初步研究
蔡海燕 周小华
*
(重庆大学化工系 重庆 400044)
天然产物研究与开发
2004 Vol 16 No 6NATURAL PRODU CT RESEARCH AND DEVELOPM ENT
收稿日期:2004 04 26 接受日期:2004 05 10 *通讯作者E mail:zhou65306590@https://www.wendangku.net/doc/fe10358228.html,
摘 要 本文研究了生姜中生姜蛋白酶的分布及贮藏中的活力变化,研究了从新鲜生姜中提取生姜粗蛋白
酶及用A OT 异辛烷和CT AB 庚烷/辛醇反胶束萃取该酶的工艺和方法。实验结果指出:在贮藏茎中生姜蛋白酶的活力为2.7 g /mL min -1,在膨大茎中该酶活力为0.68 g /mL min -1,而在幼嫩茎中活力最低,仅为0.48 g /mL min -1。新鲜生姜在0 下贮藏24h 即完全丧失活力,在室温下贮藏3d 后其活力损失达38 25%。用10倍0.2mol/L 、pH=6.0的磷酸缓冲液(4 )三次提取生姜蛋白酶,其提取率分别为64.75%、14.28%和5.2%。用65%饱和度的(NH 4)2SO 4沉淀提取液中的生姜蛋白酶,再以pH 6.2、0.1mol/L 的柠檬酸缓冲液溶解,其比活力达到4.21( g Pro/ g Pro min -1)。生姜蛋白酶的pI =5.4~5.5,在pH 5.4以上,用AOT 异辛烷反胶束不能萃取出生姜蛋白酶,但却可以萃取出71.86%的杂蛋白。用CTA B 庚烷/辛醇反胶束二次萃取AOT 异辛烷萃余液,其蛋白质萃取率为60.25%,萃取液中生姜蛋白酶理论比活力达到49.77( g Pro/ g Pro min -1)。
关键词 生姜蛋白酶;提取;反胶束;A OT 异辛烷和CT AB 庚烷/辛醇
PRIMARY RESEARCH OF PREPARATION AND ANTI MICELLE
EXTRACTING ABOUT GINGER PROTEASE(GP - )
CAI H ai y an,ZHOU Xiao hua *
(Chemistry Engineer ing College of Chongqing Univer sity ,Chongqing 400044,China)
Abstract It w as researched that ex isting place of Ginger Protease(GP )and the activity change during storage and primary process about ex tracting and anti micelle extracting of the enzy me by AOT isooctane or CTAB heptylane capry l alcohol.The experiment result w as as follows:activity
of GP is 2.7 g/mL min -1at storag e stem,0.68 g/mL min -1
at inflate stem ,only 0.48 g/mL min -1at tender stem respectively.The activity is dropped dow n zero at 0 during 24h,and the activity loses is arrived to 38.25%at room temperature during stored https://www.wendangku.net/doc/fe10358228.html,ing 0.2mol/L phosphate buffer solution which pH is 6.0,and temperature at 4 ,extraction rate of three times is espectively 64.75%,14.28%and 5.2%.GP in ex traction liquid be salted out by (NH 4)2SO 4w hile the last concentration is arrived to 65%,and after the settlings can be dis solved w ith 0.1mol/L citric acid that pH is 6.2the specific activity is increased to 4.21 g Pro/ gPro min -1.Isoelectric point of Ginger Protease(pI)is between pH 5.4to 5.5,and w hile the solution s pH is above 5.4the enzyme can t be extracted by AOT isooctane anti micelle,but oth er proteins are decreased 71.86%,and after using AOT isooctane the solution is second ex tracted w ith CTAB heptylane capryl alcohol,and the percentage extraction of protein is 60.25%,in
w hich the enzymatic specific activity in theory is arrived to 49.77 g Pro/ g Pro min -1
.
Key w ords Ginger Protease(GP );extracting;AOT isooctane or CTAB heptylane capryl alco
hol
用无机酸水解蛋白质(原料使用6mol 的HCl),在高温下长时间水解,产品颜色深,含有致癌
的氯丙醇,水解产物分子量分布宽广,含盐量达20%以上。此外,酸法生产也严重腐蚀设备并污染环境[1]。用碱水解蛋白质原料生成消旋产物,降低了水解蛋白的营养性,而且在过碱的环境中较长时
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间加热还原成赖氨酸基丙氨酸、羊毛硫氨酸及鸟氨酸基丙氨酸等交联产物,进一步降低蛋白质的营养性[2]。蛋白酶催化的蛋白质水解过程条件温和,水解产物颜色浅,不含致癌的氯丙醇,水解产物分子量分布均匀,氯化钠含量低于2%,对环境友好,因此该法成为发达国家生产水解蛋白的主要方法[3]。
生姜蛋白酶是从生姜中提取的一种新型的水解蛋白质的催化剂,其活性中心含有丝氨酸,与木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶属于同一个家族。能特异水解P2位是脯氨酸的的肽键,是一种非常有工业化应用前景的蛋白酶[4]。代景全等曾研究生姜蛋白酶的磷酸盐提取和硫酸铵沉淀[5],其酶学性质等已经有一些研究[6,7]。反胶束萃取是适合生化分离的新技术,成本低,溶剂可重复利用,萃取率高,条件温和,不引起蛋白质和酶的变性,操作简便[8]。应用该技术,可以在常温下分离蛋白质混合物、分离浓缩酶等[9]。本文研究了从新鲜生姜中提取蛋白酶的方法及生姜蛋白酶粗酶的反胶束萃取的工艺条件,旨在为开发这种新型蛋白酶提供部分应用研究数据。
1 材料与方法
1.1 实验仪器与材料
家用粉碎机;752C紫外可见分光光度计:上海分析仪器三厂;LD4 2离心机:北京医用离心机厂; T GL 16C离心机:上海安亭仪器厂;WD 9405A脱色摇床:上海沪西分析仪器厂;SC 1超级恒温水浴:重庆分析仪器厂;pHS 3C酸度计:上海雷磁仪器厂; CL 4磁力搅拌器:郑州长城科工贸有限公司;
江津生姜:市售;透析袋(Spectra por4):北京邦定泰克生物技术公司;AOT(丁二酸 2 乙基己基酯磺酸钠):实验试剂,嘉善巨枫化工厂;CTAB(溴化十六烷基三甲胺):中国医药集团上海化学试剂公司;考马斯亮兰G 250:其余试剂均为A.R。
1.2 实验方法
1.2.1 生姜蛋白酶提取液制备:取定量新鲜生姜,切成小块后加入10倍体积的pH6.0,0.2mol/L磷酸缓冲液(4 ),于粉碎机中匀桨,8层纱布过滤后于4000rpm离心10min,吸取上清液,加入高饱和度的(NH4)2SO4液使盐析体系中(NH4)2SO4终饱和度为60%,4000rpm离心15m in。收集上层不溶物,用少量pH7.50的柠檬酸缓冲液溶解,在4 下对同种缓冲液透析8h。透析液定容,即为生姜蛋白酶提取液。1.2.2 生姜蛋白酶的反胶束萃取
在生姜蛋白酶提取液加入等体积的AOT 异辛烷阴离子反胶束或CTAB 庚烷/辛醇阳离子反胶束,用磁力搅拌器以200rpm的速度进行搅拌5~ 10min,8000rpm离心10min,萃余液(下层)用考马斯亮兰法测定残留生姜蛋白酶酶活力和蛋白质量。
1.2.3 生姜蛋白酶活力测定
1.2.3.1 绘制标准曲线
配制各取6支刻度试管,分别加入0.4、0.8、1 2、1.6、2.0、2.4 g牛血清白蛋白2滴1 1HCl,及3mL考马斯亮兰G 250液,室温下显色30m in 后用蒸馏水定容至10mL,于595nm下测定OD595。以蛋白质质量为横坐标,OD595为纵坐标绘制标准曲线。其线性回归方程为:
Y=0 019X-0.001。
1.2.3.2 蛋白质浓度测定
取定量蛋白溶液,加入pH=6.0的磷酸缓冲液3mL,3mL考马斯亮兰G 250液及2滴1 1HCl,室温下显色30m in后用蒸馏水定容至10mL,于595nm下测定OD595,根据标准曲线或线性回归方程计算蛋白质含量。
1.2.3.3 生姜蛋白酶活力
各取0.2mol/L、pH=6.0的磷酸缓冲液3mL,分别加入0.2%牛血清白蛋白溶液2mL及1mL生姜蛋白酶溶液,于60 下反应15m in,反应完成后加入2滴1 1HCl以终止反应,对照则在加入生姜蛋白酶溶液之前加入同量1 1H Cl以阻止反应发生。加入3m L考马斯亮兰G-250液显色30分钟后定容至10mL。分别于分光光度计上测定OD595,以反应前后OD595差表示生姜蛋白酶活力。以每分钟内每mL蛋白酶提取液水解1 g牛血清白蛋白为生姜蛋白酶的活力单位。生姜蛋白酶活力=(酶反应液OD595 空白OD595)/m L酶液 m in-1,即 g 牛血清白蛋白/mL min-1。
1.2.4 生姜蛋白酶比活力
生姜蛋白酶比活力按下式计算:
生姜蛋白酶比活力=生姜蛋白酶活力数/单位重量生姜蛋白酶中蛋白质量( g Pro/ gPro m in-1)
2 结果与讨论
2.1 生姜蛋白酶的提取
洗净新鲜生姜,分别截取其生长部位,膨大茎及
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天然产物研究与开发2004 Vol 16 No 6
贮藏茎部位,制备生姜蛋白酶提取液。取定量提取液,测定生姜蛋白酶活力,结果见表1。
表1 生姜主要部位蛋白酶活力
T able 1 T he protease activit y in main sect ion of Ginger
部位
Section
生长茎(嫩)Growt hing stem (tender)膨大茎(中)Inflated stem (m i ddle)
贮藏茎(老)
Stora g e st e m (old)
生姜蛋白酶活力( g/mL min -1)
Protease cativity of Ginger
0.480.68 2.7
从表1的结果可知;新鲜生姜中贮藏茎中蛋白酶活力最高,约为嫩茎的4.5倍。生姜是一年生的植物,其生命的延续靠贮藏的老茎出芽完成。生姜的嫩茎是该植株的生长点所在,在生姜生长期中,大量的蛋白质及蛋白酶在此合成后被运输到其贮藏茎保存,以适应其营养生殖分解贮藏蛋白质的需要。因此,提取生姜蛋白酶应使用其贮藏茎做原料。取定量新鲜生姜,称量后加入10倍0.2mol/L pH=6.0的磷酸缓冲液后匀浆,过滤后再次加入同体积的同样磷酸缓冲液匀浆,过滤。反复三次,各次滤液均定容至100mL 。分别吸取定量提取液,测定其中生姜蛋白酶活力,结果见表2。
表2 提取次数与蛋白酶提取率的关系
T able 2 Relat ionship o n extracting times and the yield of
protease
提取次数(次)Extracting times
123总计Assemble 蛋白质( g)Protei n
18.5
5.1
2.626.2生姜蛋白酶总活力( g/min)Total protease activity of Gi nger
64.7514.28
5.2
84.23
从表2的结果可以看出:提取次数与蛋白酶的提取率呈反比例,随着提取次数的增加,蛋白酶提取率降低。第一次提取率为70.6%,第三次则降为9 9%;从生姜蛋白酶提取率来看,第一次提取率为76.87%,第二次为16.95%,第三次为6.17%。显然,提取次数增加,会提高抽提液等的消耗,从而增加成本。因此以提取二次为宜。
各取10g 新鲜生姜老茎,分别按表3的要求用不同pH 0.1mol/L 的柠檬酸缓冲液制备生姜蛋白酶提取液,取定量提取液,测定其中生姜蛋白酶活力。其结果如表3。
表3的结果指出:当pH 为6.2时,提取效果最好。在此条件下蛋白质的提取量是pH 5.0时的
122.3%,而生姜蛋白酶活力则为139%,比活力为
533%。生姜蛋白酶是一种简单蛋白质,其分解蛋白质的最适pH 是6.0[10]。在生物体系中酶是以溶液形式与底物作用,发挥催化活力。所以,在pH 6 0附近该酶的溶解性应该较大。
表3 pH 值对提取生姜蛋白酶的影响
T able 3 Effect of pH value on extracting the pr otease
pH 值pH value
5.0 5.4 5.8
6.2 6.6蛋白质( g)Protein 45.738.154.955.956.7酶活力( g/mL min)Protease activity 1.69 1.05 2.05 2.35 2.33比活力( g/mg 蛋白质)The specific activi ty ( g/mg protei n )
0.70
2.76
3.73
4.21
4.11
图1是生姜蛋白酶粗酶提取液的滴定曲线,从该曲线中可以看出;粗酶提取液的pI 在pH 5.40~5.50,而在此pH 下,生姜蛋白质及其生姜蛋白酶的提取量均低,所以,可以推论:生姜蛋白酶的等电点就在此pH 。故提取该酶时提取液的pH 值应尽量远离其等电点。从表3的结果还可以看出:在pH 5.4以下提取生姜蛋白酶的效果远不如在pH 5.4以上提取的效果好,这说明在前者条件下,生姜蛋白酶的溶解性差,不能被缓冲液提取。因此宜在pH 5.4以上的条件下提取生姜蛋白酶。
图1 生姜蛋白酶的滴定曲线Fig.1 T itration curve of Ginger protease
取粗生姜蛋白酶(NH 4)2SO 4盐析沉淀,分别加入20倍0.2mol/L NaCl(pH 6.5),0.2mol/L 磷酸缓冲液(pH 6.0)或蒸馏水溶解,真空抽滤后定容至25mL 。取1mL 测定溶解液蛋白质浓度及酶活力,结果见表4。
高浓度的盐会干扰粗酶纯化,而经(NH 4)2SO 4
盐析处理后析出的粗酶沉淀中含有高浓度的(NH 4)2SO 4,必须脱除。由于饱和(NH 4)2SO 4的pH 值约在4.5~ 5.5之间[11],刚好在生姜蛋白酶的等
5452004 Vol 16 No 6蔡海燕等:生姜蛋白酶提取及反胶束纯化工艺初步研究
电点附近(图1)。水或NaCl溶液均无缓冲酸碱能力,因此,溶解生姜蛋白酶(NH4)2SO4盐析沉淀的效果均不好;为保持体系pH值的恒定,用0.2mol/ L,pH6.0的磷酸缓冲液溶解盐析酶沉淀效果较好。从表4的结果看出,该磷酸缓冲液溶解生姜蛋白质(NH4)2SO4盐析沉淀的量分别是NaCl或水的166%或136%;而且,从溶解出的蛋白酶活力来看,磷酸缓冲液的选择性更强,其溶解出的生姜蛋白酶比活力分别是NaCl的11 94倍或水的6.32倍。因此,用磷酸缓冲液溶解生姜蛋白酶(NH4)2SO4盐析沉淀较为适宜。
表4 (NH4)2SO4盐析生姜蛋白酶在几种溶液中溶解性
T able4 Solubilit y of Ginger protease salted out by
(NH4)2SO4in some solutions
溶液Resolution
氯化钠
(0.2mol/L)
NaCl
磷酸缓冲液
(0.2m ol/L)
Phosphate
butter
蒸馏水
Dis tilled
w ater
蛋白质( g)
Protei n( g)14.423.917.6
酶活力( g/mL min-1)
Protease activity
0.728.6 1.36
比活力( g/mgPro min-1)
T he specific activity
( g/mg protein)
1.259.0 1.93
按表5的要求分别取定量新鲜生姜,贮藏于冷冻、冷藏及室温下过夜,次日分别制备生姜蛋白酶提取液并测定其生姜蛋白酶活力,结果见表5。
表5 不同贮藏条件下生姜蛋白酶的活力
T able5 Pr otease activity of Ginger in di stinct stor ag e
condition
贮藏条件
Storage condi tion4 -18 20~25
蛋白质量( g)Protein13.9814.6411.47
酶活力( g/mL min-1)
Protease activity of Ginger
2.890 2.13
表5的结果指出:生姜不能在冷冻下贮藏,冷冻后,其细胞的选择性透性丧失,蛋白质溶出量增加。而且,在溶解时,由于冰晶的破坏,使生姜蛋白酶完全失活。
表6是在室温条件下储藏生姜蛋白酶的活力变化。从表6中可知储藏时间超过3d后,生姜蛋白酶的活力急剧降低到38.25%。第六天时,生姜蛋白酶活力仅为第一天时的7 4%,因此,从新鲜生姜中提取生姜蛋白酶应控制储藏期在3d以内。
表6 储藏时间与生姜蛋白酶活力的关系
T able6 Relationship on pr otease activ ity o f Ginger and stor ag e time
时间(天)
Time/day123456酶活力( g/mL min-1)
Protease activity of Ginger 2.85 2.24 1.76 1.250.530.21 2.2 生姜蛋白酶的反胶束分离纯化
取25mL生姜蛋白酶提取液,加入等体积0.05 mol的AOT 异辛烷反胶束液,控制磁力搅拌器转速约为200rpm,室温萃取5min。分离后分别测定萃余液中蛋白质和生姜蛋白酶活力,结果如表7。
表7 A OT 异辛烷反胶束萃余液中蛋白质和生姜蛋白酶活力
T able7 Protein and protease activity of Ginger in solution ex tracted by AOT isooctane anti micelle
萃取前
Un extracting
萃余液
Solution extracted
蛋白质( g)Protein25.487.17
生姜蛋白酶活力( g/mL m i n-1)
Protease activity of Ginger8.68.6从表7可以看出:萃取前后水相中蛋白质变化很大,萃余液中残存的蛋白质仅为萃取前的28 14%,但是生姜蛋白酶活力却没有变化,说明该酶未被AOT 异辛烷反胶束所萃取。生姜蛋白酶的pI在pH5.4~5.5,因此,在pH7.5时,该蛋白酶带负电荷,与阴离子表面活性剂AOT相互排斥,所以不能被萃取进入反胶束。但是,用AOT 异辛烷反胶束萃取却可以将带正电荷的蛋白质分离,使生姜蛋白酶比活力提高3倍以上,达到部分纯化的目的。
取25mL生姜蛋白酶提取液,加入等体积0 1 mol的CTAB庚烷/辛醇反胶束液,控制磁力搅拌器转速约为200rpm,室温萃取5min。分离后分别测定萃余液中蛋白质和生姜蛋白酶活力,结果见表8。
表8的结果指出;CTAB和庚烷/辛醇反胶束萃取后萃余液中蛋白质和生姜蛋白酶活力均发生明显变化,萃余液中蛋白质下降至13.4 g,下降率为47.4%;其中生姜蛋白酶活力下降率则达到88 14%,即有88 14%的生姜蛋白酶被萃取入反胶束。因此,在CTAB庚烷/辛醇反胶束中,生姜蛋白酶比活力上升至15.69,比萃取前提高74.33%。这说明CTAB庚烷/辛醇阳离子反胶束能够部分纯化处于负电荷的生姜蛋白酶。
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天然产物研究与开发2004 Vol 16 No 6
表8 CT AB和庚烷/辛醇反胶束萃取后萃余液中蛋白质和生姜蛋白酶活力
T able8 Prot ein and protease act ivity of G ing er in solution extr acted by CT AB hept ylane capryl alcohol anti
micelle
萃取前
U n extracting
萃余液Solution extracted
蛋白质( g)Protein25.4813.4
酶活力( g/mL min-1)
Protease activity8.6 1.02
比活力( g/ g Pro min-1)
S pecifi c activity9.0 2.06
将用AOT 异辛烷反胶束萃取蛋白质后的生姜蛋白酶提取液再用CTAB庚烷/辛醇阳离子反胶束萃取,分离后分别测定萃余液中蛋白质和生姜蛋白酶活力,结果见表9。
表9 AO T萃取后CT AB庚烷/辛醇二次萃取萃余液中蛋白质和生姜蛋白酶活力
T able9 Prot ein and protease act ivity of G ing er in solution extr acted two times by CT AB heptylane capr yl al
cohol anti micelle
萃取前Un extracting
萃余液Solution extracted tw o times
蛋白质( g)Protein7.17 2.85
酶活力( g/mL min-1)
Protease activity8.60
比活力( g/ gPro min-1)
S pecifi c activity23.60
从表9的结果可以看出:经过CTAB反胶束二次萃取,萃余液中已经没有生姜蛋白酶活力,蛋白质也仅残存2.85 g,说明生姜蛋白酶已经全部被萃取进入CTAB反胶束中。经过CTAB反胶束二次萃取,反胶束中酶比活力从理论上达到49.77 g/mg Pro m in-1。
调节生姜蛋白酶提取液pH值(见图2),用等体积CTAB庚烷/辛醇反胶束萃取,测定萃余液中蛋白质和残存生姜蛋白酶活力,结果见图2。
从图2中可知:在pH6.5~7.5区间,萃余液中蛋白质及生姜蛋白酶残留活力均随pH值升高而降低,显然,这是生姜蛋白酶提取液中的蛋白质在不同pH下所带净电荷的差异所致。CTAB是一种阳离子表面活性剂,推动带负电荷的蛋白质反胶束萃取,在一定条件下,两者的净电荷差大,则有利于蛋白质被萃取入反胶束[12]。生姜蛋白酶的pI在pH5.4~ 5.
5,随着酶提取液的pH升高,所带负电荷增加,该酶溶解性增加,因此,被萃取量增加,萃余液中残留活力降低。从图2中还可以看到:当pH超过8.0后,残留酶活力几乎不再降低,而且,高pH也容易引起酶蛋白变性。故应在pH8.0及以下用CTAB 庚烷/辛醇反胶束萃取生姜蛋白酶。
图2 pH对CTAB庚烷/辛醇反胶束萃取生姜蛋白酶的影响Fig.2 Effect of pH on ex tracting Ginger Protease by AOT isooctane anti micelle
3 结论
生姜蛋白酶在贮藏茎的活力为2.7 g/m L min-1,在膨大茎的酶活力为0.68 g/mL m in-1,而在幼嫩茎中含量为0.48 g/mL m in-1;新鲜生姜在0 下贮藏24h即完全丧失活力,在室温下贮藏3d后其活力损失达38.25%。用0.2mol/L pH= 6.0的磷酸缓冲液(4 )三次提取生姜蛋白酶,其提取率分别为64.75%、14.28%和5.2%。用65%饱和度的(NH4)2SO4沉淀提取液中的生姜蛋白酶,再以pH6.2、0.1mol/L的柠檬酸缓冲液溶解,其比活力达到4.21( g Pro/ gPro min-1)。生姜蛋白酶的pI=5.4~ 5.5,在pH5.4以上,用AOT 异辛烷反胶束不能萃取出生姜蛋白酶,但是却可以萃取出71.86%的杂蛋白。用CTAB庚烷/辛醇反胶束二次萃取AOT 异辛烷萃余液,其蛋白质萃取率为60 25%,萃取液中生姜蛋白酶理论比活力达到49 77( g Pro/ g Pro min-1)。
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(下转第551页)
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2004 Vol 16 No 6蔡海燕等:生姜蛋白酶提取及反胶束纯化工艺初步研究
离心机4 40000rpm离心10min,即可得到澄清的上清液,再通过胰酶、氯仿 苯酚 多糖溶液除去游离氨基酸及小分子肽,脱色脱蛋白都很彻底。
我们所提多糖为酸性,所以选用离子交换层析法提取多糖精品,效果较好。继续用凝胶柱层析进行纯度鉴定,结果都为单一吸收峰,说明分离出的两种多糖组分在一定分子量范围内是均一组分。
通过高效液相色谱分析,我们初步得出两种多糖组分的单糖成分和含量,其中IPS A中主要含有L 岩藻糖、L 鼠李糖;IPS B中主要含有D 木糖和L 鼠李糖,但两种组分均未发现有葡萄糖醛酸,而在糖醛酸含量的测定中,我们发现IPS A含有糖醛酸约13.37 0.45 g/mg,究竟是何种糖醛酸有待进一步证实。通过两种多糖组分的红外光谱分析,我们发现IPS A和IPS B皆为酯多糖,都含有 型吡喃糖苷键;另外都含硫酸根,这与硫酸比浊法检测的结果一致。
以上结果与吴洁[3]运用碱抽提法得到的极大螺旋藻多糖的分子量及单糖组分都有较大差异,与日本Kataoka Naoko[4]提出的两个组分多糖的差别也很大。这种同一属种螺旋藻组分及结构不同是由多种原因引起的,除了提取方法不同以外,还与藻种来源、培养条件等有关。多糖组分复杂,其结构的分析还有待更多的实验来验证。
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2004 Vol 16 No 6张 威等:极大螺旋藻胞内多糖分离纯化及其结构的初步分析
年产1000吨酸性蛋白酶的生产工艺设计
1. 前言 酸性蛋白酶是一类最适pH值为2.5?5.0的天冬氨酸蛋白酶，相对分子质量为30000 ?40000。酸性蛋白酶主要来源于动物的脏器和微生物分泌物,包括胃蛋白酶、凝乳酶和一些微生物蛋白酶。根据其产生菌的不同，微生物酸性蛋白酶可分为霉菌酸性蛋白酶、酵母菌酸性蛋白酶和担子菌酸性蛋白酶.根据作用方式可分为两类：一类是与胃蛋白酶相似，主要产酶微生物是曲霉、青霉和根霉等；另一类是与凝乳酶相似，主要产酶微生物是毛霉和栗疫霉等。细菌未发现产酸性蛋白酶的菌株.由于酸性蛋白酶具有较好的耐酸性，因此被广泛地应用于食品、医药、轻工、皮革工艺以及饲料加工工业中。 国外关于酸性蛋白酶的生产研究从20世纪初就开始了。1908年，德国科学家从动物的胰脏中提取出胰蛋白酶，并将其用于皮革的鞣质。1911年美国科学家从木瓜中提取木瓜蛋白酶（在酸性，碱性和中性的条件下都能分解蛋白质的酶）并将木瓜蛋白酶用于除去啤酒中的蛋白质浑浊物。自1954年吉田首次发现黑曲霉可产生酸性蛋白酶以来，国外对微生物发酵生产酸性蛋白酶进行了广泛的研究。1964年外国科学家首次发现大孢子黑曲霉突变体能产生两种不同的酸性蛋白酶，即酸性蛋白酶和酸性蛋白酶。1965年又从血红色陀螺孔菌，中分离出了一种酸性蛋白酶，并对该酶进行了纯化和结晶。1968年从微小毛霉中筛选出了一种酸性蛋白酶，并对其进行了纯化和酶学性质分析。1995年外国科学家对烟曲霉酸性蛋白酶的基因进行了克隆和测序。2001年又从假丝酵母中筛选出了一种酸性蛋白酶菌株，并对该酶进行了核苷酸序列分析和功能分析。国外学者对曲霉酸性蛋白酶的结构和功能等己经研究的较为透彻。 与国外相比，我国对酸性蛋白酶的研究相对较晚些。1970年上海工业微生
菠萝蛋白酶的提取实验报告
菠萝蛋白酶的提取、初步分离纯化及活性测定 12食安2班陈志廉 摘要 本文阐述了通过运用高速离心法提取粗酶，盐析分离提纯，透析除杂等方法提取出了菠萝蛋白酶并将其初步分离纯化且测定了各个步骤的酶活性的过程。关键词 菠萝蛋白酶纯化酶活性 前言 菠萝蛋白酶（Bromelain，EC3.4.22.3）简称菠萝酶，是从凤梨属植物菠萝中提取的一组复合的半胱氨酸巯基蛋白水解酶，1891年Mercaro于菠萝的汁中首先发现。 在食品工业中菠萝蛋白酶作为一种食品添加剂，能分解蛋白质、肽、酯和酰胺等，可用于肉质嫩化、水解蛋白、啤酒澄清、干酪生产等。菠萝蛋白酶来可以用来增加豆饼和豆粉的PDI值和NSI值，从而生产出可溶性蛋白制品及含豆粉的早餐、谷类食物和饮料。其它还有生产脱水豆类、婴儿食品和人造黄油；澄清苹果汁；制造软糖；为病人提供可消化的食品；给日常食品添味等。 在医药上它可以治疗水肿及多种炎症，并有助消化，健胃消食等功能。 菠萝蛋白酶属于糖蛋白，是由巯基蛋白酶和非蛋白酶组分构成的复杂复合物，因含有一个不稳定的游离巯基，所以菠萝蛋白酶极易被氧化而使其酶活下降。本文主要验证了从新鲜菠萝皮中提取菠萝蛋白酶并将之纯化的方法，以求改进工艺等。 1实验材料与仪器 1.1实验材料与试剂 新鲜菠萝、0.1mo1/L pH7.8磷酸缓冲液（PBS）、0.01mo1/L pH7.8磷酸缓冲液（PBS）、1％酪蛋白、激活剂、10％三氯乙酸(TCA)、牛血清白蛋白、考马斯亮蓝G250
1.2实验仪器 722型可见光分光光度计：上海舜宇恒平科学仪器有限公司； 752型光栅分光光度计：北京光学仪器厂； TDL-60B台式离心机：上海安宁科学仪器厂； D5M离心机：长沙湘智离心机仪器有限公司； DK-8D电热恒温水浴锅：上海森信实验仪器有限公司； 可控硅恒温水浴锅：上海锦屏仪器仪表有限公司； AMPUT电子天平：深圳安普特科技有限公司； BS110S分析天平北京赛多利斯天平有限公司； DS-1型高速组织捣碎机：上海标本模型厂； HZS-H型水浴振荡器：哈尔滨市东联电子技术开发有限公司 2实验方法 2．1菠萝蛋白酶的粗酶提取 称取菠萝皮材料30g，将菠萝皮在清水中洗净，沥干，切成小段后置于超高速搅拌机中，加入约60mL预冷的0.1mo1/L pH7.8PBS，持续搅拌10~15min至粉碎，搅拌完成后用4层纱布过滤，得到滤液后，用冷冻离心机于4°C3000rpm 离心6min，弃沉淀，即得到菠萝蛋白酶粗提液，测定粗提液的体积、蛋白质含量和酶活性。 2．2盐析 根据附录的“硫酸铵饱和度计算表”，按30%硫酸铵饱和度计算在上述酶提取液中需添加的固体硫酸铵量，称取固体硫酸铵于研钵中，研磨呈粉末，慢慢小量分次向酶提取液中添加固体硫酸铵，边加边搅拌，使溶液最终硫酸铵饱和度为30%，放置于冰水混合物（4℃）30min后，酶蛋白沉淀析出，4°C3000rpm离心6min，收集沉淀，加入0.1mo1/L pH7.8PBS约15mL至完全溶解，测定其体积、蛋白质含量和酶活性。 2．3透析 将溶解液装入2.5cm×8cm透析袋（预先将透析袋在蒸馏水中煮沸30min）中，于500mL烧杯中，在磁力搅拌器搅拌下用蒸馏水透析，15min换水一次，换水3～4次后，检查SO42-是否已被除净（检查的方法是：取2mLBaCl2溶液
黄姜皂素提取新工艺研究_潘鹤林
2011 年 4 月 Journal of Chemical Engineering of Chinese Universities Apr. 2011文章编号：1003-9015(2011)02-0296-06 黄姜皂素提取新工艺研究 潘鹤林, 陈晨, 商利容 (华东理工大学化工学院, 上海 200237) 摘要：以酒精为溶剂提取黄姜干粉中的皂苷，皂苷经水解、过滤、中和、干燥、石油醚抽提、结晶、重结晶得到纯 度较高的黄姜皂素。实验中采用热提取和高压均质提取两工艺。研究了热提取工艺中溶剂用量、料液比、温度、时间 和次数等对皂素收率的影响：溶剂为95%(v)的酒精，料液比为5:1，提取温度为60℃，提取3次，提取时间分别为2 h、 1 h、0.5 h时，皂素收率可达2.45%。在此基础上，为提高提取效率，也考察了高压均质提取工艺过程，60 MPa压力 下均质提取可达到与热提取同等效果。热提取和高压均质提取工艺因预先分离了皂苷、淀粉和纤维素等，因此大大降 低了酸解工艺的处理量，使得皂苷酸解耗酸量和废水量较传统工艺大幅下降，且皂素收率有所提高。 关键词：黄姜皂素；溶剂；热提取；高压均质提取 中图分类号：TQ028.9；TQ467.8；文献标识码：A Research on New Extraction Process for Diosgenin PAN He-lin, CHEN Chen, SHANG Li-rong (College of Chemical Engineering, East China University of Science & Technology, Shanghai 200237, China) Abstract: The dioscin was extracted from dried yam powder with alcohol in this study. After hydrolysis, filtration, neutralization, dehydration drying, extraction with petroleum ether and recrystallization, high purity diosgenin was obtained. Experiments were carried out by method of hot extraction and high pressure homogeniser extraction, respectively. Results of hot extraction process show that, after three times extraction for 2 h-1 h-0.5 h, the yield of diosgenin can reach 2.45% by using 95%(v) alcohol as solvent, liquid-solid ratio 5:1 and temperature 60℃. High pressure homogeniser extraction process was also studied to increase extraction efficiency. The result shows that the effect of high pressure homogeniser extraction with pressure 60 MPa is equal to that of hot extraction. Because active ingredient dioscin was beforehand separated from starch and cellulose, treatment capacity of hydrolyzing process reduced. Acid consumption and waste water in hot extraction and high pressure homogeniser extraction decrease dramatically in comparison with the traditional process, and the yield of diosgenin increases. Key words: diosgenin; solvent; hot extraction; high pressure homogeniser extraction 1引言 黄姜皂素又名薯蓣皂苷元(Diosgenin)，化学名为△5-异螺旋甾烯-3β-醇，是一种重要的精细化工中间体，在医药、农药、保健品等领域应用广泛[1~7]。黄姜皂素是甾体类化合物，化学合成过程线路长且不经济，工业上采用从植物原料黄姜中提取的方法生产。黄姜被誉为“药用黄金”，其所含皂素可用作多种甾体药物的生产原料，为我国特有品种，根茎含有黄姜皂素及45% ~ 50% 淀粉，40% ~ 50% 的纤维素，还含有黄色素、单宁等，其中黄姜皂素含量约为2.5%，居世界薯蓣属植物之冠，因此黄姜是一种经济效益高、开发潜力大的药用植物资源。 目前国内大多皂素厂都采用预发酵-酸水解工艺生产黄姜皂素，传统生产工艺皂素收率低、污染严重，据统计，每生产1 t皂素所产生的废水高达500~1 000 m3[4]，严重阻碍了皂素生产的可持续发展。本研究 收稿日期：2010-01-23；修订日期：2010-06-18。 作者简介：潘鹤林(1965-)，男，江苏扬州人，华东理工大学副教授，硕士。通讯联系人：潘鹤林，E-mail：panhl@https://www.wendangku.net/doc/fe10358228.html,
酸性蛋白酶生产工艺
第六节酸性蛋白酶生产工艺 07040642 47 李继江 1 蛋白酶、蛋白类酶、酸性蛋白酶 1.1 蛋白酶的定义 蛋白酶是催化肽键水解的一类酶，它可迅速水解蛋白质为胨、肽类，广泛存在于动物内脏、植物茎叶、果实和微生物中。同时大多数微生物蛋白酶都是胞外酶。 1.2 微生物蛋白酶分类 微生物蛋白酶按其作用的最适pH可分为酸性蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶三类。 碱性蛋白酶为透明褐色液体，能与水混溶，最适温度50~60℃，最适pH8.5。 中性蛋白酶为金属酶，褐色颗粒或液体，易溶于水，最适温度45~55℃，最适pH5.5~7.5。 酸性蛋白酶为近乎白色至浅黄色无定型粉末或液体，易溶于水，最适温度45℃，最适pH2.5。 1.3 蛋白类酶 蛋白类酶主要是指由蛋白质组成的酶（P酶）；而主要由核糖核酸组成的酶称为核酸类酶（R酶）。 蛋白类酶分为氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂合酶、异构酶、合成酶（或称连接酶）。 1.4 酶的生产方法 酶的生产方法主要有：提取分离法、生物合成法、化学合成法。 酶的微生物合成法主要有：液体深层发酵、固体培养发酵、固定化细胞培养、固定化原生质发酵。 酸性蛋白酶用微生物发酵法生产，采用液体深层发酵。 液体深层发酵是指液体培养基在发酵罐中灭菌冷却后，接入产酶细胞，一定条件下发酵，适用于微生物细胞、动植物细胞的培养。具有机械化程度高、技术管理严格、酶产率高、质量稳定，产品回收率高的特点，是目前酶发酵的主要方式。 1.5 酸性蛋白酶制剂的性能 1.5.1 酸性蛋白酶的作用机理 酶是一种蛋白质，它是活细胞产生的生物催化剂，生物体的新陈代谢活动都离不开酶的作用。酶的种类很多，酸性蛋白酶是水解酶类的一种，能够在微酸环境下（pH2．5～4．0）
木瓜蛋白酶的提取
木瓜蛋白酶的提取、分离纯化及其生物学研究综述及实验方法 13生物技术第二大组第二小组 组员：王玓玥（组长）、王子贺、王思瑶、王宇涛、王守鑫、谭国栋一、研究背景： 在经济飞速发展的今天，人们的生活水平已远远不只在于吃饱穿暖，食品的安全和营养问题受到人们越来越多的关注，绿色健康的生活也成为大家共同的追求，木瓜蛋白酶以它自身耐热及特殊结构等特点被广泛的用于食品行业，如何分离纯化得到高纯度低成本的木瓜蛋白酶则是人们现在研究的重点，本小组便也以此为研究主题展开实验。 二、木瓜蛋白酶基本介绍：木瓜蛋白酶，又称木瓜酶，是一 种蛋白水解酶。木瓜蛋白酶是番木瓜中含有的一种低特异性蛋白水解酶，广泛地存在于番木瓜的根、茎、叶和果实内，其中在未成熟的乳汁中含量最丰富。木瓜蛋白酶的活性中心含半胱氨酸，属于巯基蛋白酶，它具有酶活高、热稳定性好、天然卫生安全等特点，这种蛋白水解酶，分子量为23406，由一种单肽链组成，含有212个氨基酸残基。至少有三个氨基酸残基存在于酶的活性中心部位，他们分别是Cys25、His159和Asp158，当Cys25被氧化剂氧化或与金属离子结合时，酶的活力被抑制，而还原剂半胱氨酸（或亚硫酸盐）或EDTA能恢复酶的活力木瓜蛋白酶是一种在酸性、中性、碱性环境下均能分解蛋白质的蛋白酶。它的外观
为白色至浅黄色的粉末，微有吸湿性；木瓜蛋白酶溶于水和甘油，水溶液为无色或淡黄色，有时呈乳白色；几乎不溶于乙醇、氯仿和乙醚等有机溶剂。木瓜蛋白酶是一种含巯基(-SH)肽链内切酶，具有蛋白酶和酯酶 的活性，有较广泛的特异性，对动植物蛋白、多肽、酯、酰胺等有较强的水解能力，但几乎不能分解蛋白胨。木瓜蛋白酶的最适合PH值6～7(一般3～9.5皆可)，在中性或偏酸性时亦有作用，等电点（pI）为8.75；木瓜蛋白酶的最适合温度55～65℃(一般10～85℃皆可)，耐热性强，在90℃时也不会完全失活；受氧化剂抑制，还原性物质激活。。另外六个半胱氨酸残基形成了三对二硫键,且都不在活性部位。纯木瓜蛋白酶制品可含有：（1）木瓜蛋白酶，分子量21000，约占可溶性蛋白质的10%；（2）木瓜凝乳蛋白酶，分子量26000，约占可溶性蛋白质的45%；（3）
年产8吨脂肪酸提取纯化生产工艺的设计
年产8吨脂肪酸提取纯化生产工艺的设计 1.概述 1.1脂肪酶的来源 脂肪酶广泛的存在于动植物和微生物中。植物中含脂肪酶较多的是油 料作物的种子，如蓖麻籽、油菜籽，当油料种子发芽时，脂肪酶能与其他的酶协同发挥作用催化分解油脂类物质生成糖类，提供种子生根发芽所必需的养料和能量；动物体内含脂肪酶较多的是高等动物的胰脏和脂肪组织，在肠液中含有少量的脂肪酶，用于补充胰脂肪酶对脂肪消化的不足，在肉食动物的胃液中含有少量的丁酸甘油酯酶。在动物体内，各类脂肪酶控制着消化、吸收、脂肪重建和脂蛋白代谢等过程；细菌、真菌和酵母中的脂肪酶含量更为丰富（Pandey等）。由于微生物种类多、繁殖快、易发生遗传变异，具有比动植物更广的作用pH、作用温度范围以及底物专一性，且微生 物来源的脂肪酶一般都是分泌性的胞外酶，适合于工业化大生产和获得高纯度样品，因此微生物脂肪酶是工业用脂肪酶的重要来源，并且在理论研究方面也具有重要的意义。 1.2脂肪酸的性质 脂肪酶，又称甘油三酷水解酶，是一类特殊的酯键水解酶，它广泛地存在于动物组织、植物种子和微生物体中。脂肪酶能催化天然底物油脂（甘油三酯）水解, 产生脂肪酸和甘油，在水解过程中会产生中间产物甘油单酯和甘油二酯。脂肪酶 可以催化酯类化合物的分解、合成和酯的交换，它具有化学选择性和高度的立体异构专一性，且反应不需要辅酶，反应条件温和，副产物少。脂肪酶的另一显著特点是：它只能在异相系统（即油一水界面）或有机相中作用，这不仅发展了“界面酶学”，也促进了“非水酶学”的研究和深入。脂肪酶属于丝氨酸水解酶，且它含有相同的结构序列，G- XI —S-X2 —G（G为甘氨酸，S为丝氨酸，X伪组氨酸, X2为天冬氨酸），它的三维结构对酶的催化作用影响很大。微生物脂肪酶的温度适应范围很
黄姜皂素在甾体激素药物合成中的应用_向纪明
甾体激素是指含有甾体母核结构的激素，主要包含性激素和肾上腺皮质激素。它是一类维持生命、保持正常生活、促进性器官发育、维持生殖的重要生物活性物质，在调节机体物质代谢、细胞发育分化、皮肤疾病治疗、性功能及免疫调节以及维持生命保持正常生活方面具有极其重要的作用［１］。甾体激素是在研究哺乳动物内分泌系统时发现的内源性物质，很少剂量就会产生明显作用，当体内甾体激素水平低下或缺乏时，会产生非常痛苦的症候群，甚至危及生命［２］。早期用动物腺体粗提物作为甾体激素替补药物，挽救了无数生命，但此方法来源有限，价格昂贵。由于甾体结构较复杂，目前采用全合成的方法较困难，通常以具有甾体母核结构的天然产物为原料采用半合成的方法制取。近代以相关植物提取的皂素为原料，通过半合成得到一系列甾体激素药物，甾体激素药物的发现及成功合成是近半个世纪来医药工业发展最引人注目的成果之一。２０１１年甾体激素药物销售额突破２８０亿美元，约占世界医药总销售额的６％，成为产量仅次于抗生素的第二大类药物。我国为甾体激素原料药生产大国，甾体药物年产量占世界总产量的１／３左右，皮质激素原料药生产能力和实际产量均居世界第一。特别是随着甾体激素药物生产技术的不断更新，其应用领域的不断扩大，市场应用前景更加广阔［３］。 世界上皂素含量较高的植物资源不多而且分布范围较窄，主要分布在我国和墨西哥，主要有黄姜、穿地龙、葫芦芭等。其中黄姜的薯蓣皂素含量最高，是 甾体激素药物合成的最主要的药源植物，在我国的陕南及湖北广泛种植，是黄姜的主要种植基地，目前世界上三分之二以上的甾体激素药物是以薯蓣皂素作基础原料生产的。薯蓣皂素是以糖苷（薯蓣皂苷）的形式存在于黄姜中，薯蓣皂素主要由薯蓣皂苷与一个葡萄糖和两个鼠李糖形成的苷，在酶及酸性条件下水解，糖基脱掉而转化为薯蓣皂素。薯蓣皂素（Ｄｉｏｓ－ｇｅｎｉｎ）学名为薯蓣皂苷元或黄姜皂素，黄姜中的含量约为３．３％￣４．９％，白色或微黄的结晶性粉末，熔点：２０４￣２０７℃，不溶于水，溶于常用有机溶剂及醋酸中，可利用石油醚、汽油、甲醇、乙醇、丙酮及氯仿等有机溶剂将它萃取出来，是合成甾体激素药物的基础原料和起始中间体。以黄姜皂素为起始原料经过结构改造、化学半合成，可以合成雄性激素、同化激素、雌性激素、孕激素、皮质激素等３００种以上激素类药物，因此黄姜皂素亦有“药用黄金”的美誉［４］。黄姜皂素是生产甾体激素药物最理想的基础原料，所以黄姜皂素在甾体激素药物生产中具有十分重要的地位 。 收稿日期：2014-03-28 基金项目：陕西省教育厅科研项目（11JK0585）；安康学院高层次人才引进项目（AYQDZR201108） 作者简介：向纪明，男，陕西旬阳人，安康学院化学化工系教授，博士，主要从事有机化学教学与研究。 摘要：甾体激素药物因具有很强的抗感染、抗病毒和抗休克等药理作用，广泛用于治疗风湿病、心血管病、 癌症、皮肤病等，是一类重要药物中间体。本文综述了利用黄姜皂素为原料合成甾体激素药物雄性激素、雌性激素、孕激素和肾上腺类皮质激素的进展，对临床上广泛应用的甾体激素药物如睾丸素、雌二醇、黄体酮、炔诺酮、可的松、氢化可的松、地塞米松及布地奈德等的合成路线进行了描述，以期为资源的进一步开发提供思路。 关键词：黄姜皂素；甾体药物；合成；进展中图分类号：Ｏ６２９．２；Ｒ９７９．９ 文献标识码：Ａ文章编号：１６７４－００９２（２０１４）０３－０００１－０５ 黄姜皂素在甾体激素药物合成中的应用 向纪明 （安康学院化学化工系，陕西安康７２５０００） ２０１４年６月第２６卷第３期 安康学院学报 ＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｎｋａｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｊｕｎｅ．２０１４Ｖｏｌ．２６Ｎｏ．３ 薯蓣皂苷薯蓣皂苷元（黄姜皂素）
木瓜蛋白酶提取实验记录
木瓜蛋白酶实验记录 2016.11.3 实验前准备： 所需试剂的配制： 饱和硫酸铵：取150ml蒸馏水，放入冰桶中，不断加入硫酸铵固体，直至沉淀不能溶解，过滤取滤液，保存在4℃冰箱中。 酶保护剂：准确称量1.21g的半胱氨酸于100ml蒸馏水中，调节PH 至9.0，溶解半胱氨酸，再加入0.1871g的EDTA，定容至250ml，转入棕色瓶中。 预实验：确定实验的可行性 酶液提取： ①用薄的不锈钢刀片沿未成熟的番木瓜的纵线将果皮割破，深度为2~3mm，根据果实大小的不同，每个果实可以5~10条刀口。 ②将木瓜放于一个大烧杯中，使木瓜乳汁流入大烧杯中。 ③收集5ml乳汁加入95ml蒸馏水水，匀速轻柔搅拌1h，得浆液。 ④浆液用8层纱布进行过滤,将所得液分装到离心管中，用离心机在3500r/min的条件下，离心15min。 ⑤收集上清液至一洁净的试管中，既得木瓜蛋白酶原液，-20℃存取10ml酶原液。 ⑥分装木瓜蛋白酶原液，加入2ml酶保护剂（0.04mol/L的半胱氨酸和0.002mol/L的EDTA），混匀后如下表加入试剂。
对静置的酶液继续处理
2016．11.4 试剂配制 考马斯亮蓝G-250染液（0.01%）：称取0.1g考马斯亮蓝G-250固体粉末，溶于50mL 95%乙醇中（95%乙醇取实验室无水乙醇47.5mL加2.5mL蒸馏水）再加入86% 磷酸100mL，倒入1000mL容量瓶加蒸馏水定容至1000mL。静置1h后，取棕色试剂瓶用乙醇清洗干净用滤纸过滤溶液后封存。 重提木瓜蛋白酶 实验设置对照 一组开始即加入酶保护剂编号酶B*、一组加硫酸铵之前才加酶保编号酶*。 ①用薄的不锈钢刀片沿未成熟的番木瓜的纵线将果皮割破，深度为2~3mm，根据果实大小的不同，每个果实可以5~10条刀口。 ②将木瓜放于一个大烧杯中，使木瓜乳汁流入大烧杯中。 ③收集10ml乳汁加入190ml蒸馏水水，匀速轻柔搅拌1h，得浆液。 ④浆液用8层纱布进行过滤,将所得液分装到离心管中，用离心机在3500r/min的条件下，离心15min。 ⑤收集上清液至一洁净的试管中，既得木瓜蛋白酶原液，-20℃存取
年产1000吨酸性蛋白酶的生产工艺设计
1. 前言 酸性蛋白酶是一类最适pH值为的天冬氨酸蛋白酶，相对分子质量为30000 40000。酸性蛋白酶主要来源于动物的脏器和微生物分泌物,包括胃蛋白酶、凝乳酶和一些微生物蛋白酶。根据其产生菌的不同，微生物酸性蛋白酶可分为霉菌酸性蛋白酶、酵母菌酸性蛋白酶和担子菌酸性蛋白酶.根据作用方式可分为两类：一类是与胃蛋白酶相似，主要产酶微生物是曲霉、青霉和根霉等；另一类是与凝乳酶相似，主要产酶微生物是毛霉和栗疫霉等。细菌中尚未发现产酸性蛋白酶的菌株.由于酸性蛋白酶具有较好的耐酸性，因此被广泛地应用于食品、医药、轻工、皮革工艺以及饲料加工工业中。 国外关于酸性蛋白酶的生产研究从20世纪初就开始了。1908年，德国科学家从动物的胰脏中提取出胰蛋白酶，并将其用于皮革的鞣质。1911年美国科学家从木瓜中提取木瓜蛋白酶（在酸性，碱性和中性的条件下都能分解蛋白质的酶）并将木瓜蛋白酶用于除去啤酒中的蛋白质浑浊物。自1954年吉田首次发现黑曲霉可产生酸性蛋白酶以来，国内外对微生物发酵生产酸性蛋白酶进行了广泛的研究。1964年外国科学家首次发现大孢子黑曲霉突变体能产生两种不同的酸性蛋白酶，即酸性蛋白酶和酸性蛋白酶。1965年又从血红色陀螺孔菌，中分离出了一种酸性蛋白酶，并对该酶进行了纯化和结晶。1968年从微小毛霉中筛选出了一种酸性蛋白酶，并对其进行了纯化和酶学性质分析。1995年外国科学家对烟曲霉酸性蛋白酶的基因进行了克隆和测序。2001年又从假丝酵母中筛选出了一种酸性蛋白酶菌株，并对该酶进行了核苷酸序列分析和功能分析。国外学者对曲霉酸性蛋白酶的结构和功能等己经研究的较为透彻。 与国外相比，我国对酸性蛋白酶的研究相对较晚些。1970年上海工业微生物研究所首先从黑曲霉中筛选出一株产酸性蛋白酶菌株，并和上海酒精厂协作进行中试生产，填补了我国酸性蛋白酶制剂的空白.近年来国内在酸性蛋白酶上的研究大都致力于选育产酶活力高、抗逆性好的菌种，并获得了一些很有应用前途的产酶菌株。目前用于酸性蛋白酶生产的高产菌株主要有黑曲霉、宇佐美曲霉和青霉及它们的突变株。李永泉等，对宇佐美曲霉所产的酸性蛋白酶进行了发酵过程动力学研究.戚淑威等对青霉产酸性蛋白酶的适宜条件和酶学性质进行了分析。谢必峰等，采用硫酸铵盐析法和离子交换层析法分离纯化了黑曲霉产酸性蛋
胃蛋白酶提取的分离纯化
胃蛋白酶提取法中分离纯化技术的研究进展 摘要：本文就胃蛋白酶的生物提取法，对其在生产过程中的分离、纯化技术展开综述。其中，分离技术主要介绍了：盐析法、有机溶剂沉淀法、底物亲和法、透析法。纯化技术主要介绍了：凝胶过滤法、透析离子交换法。综合比较各分离纯化方法的特点，得到最优的分离纯化方法有机溶剂与盐析共沉淀法、膜分离技术、等电点沉淀法与底物亲和法。 关键词：胃蛋白酶分离纯化应用 ．生物提取法生产胃蛋白酶 1．1 工艺路线 （自溶、过滤）（脱脂、去杂质） 猪胃黏膜→自溶液→上清液 （浓缩、干燥） →胃蛋白酶成品 工艺过程 （1）原材料的选择和预处理：胃蛋白酶原主要存在于胃粘膜基底部，采集原料时剥取的粘膜直径大小与收率有关。一般取直径10cm、深2-3mm的胃基底部粘膜最适宜，每头猪胃平均剥取粘膜100g左右。（2）自溶、过滤：在夹套锅内预先加水100升及盐酸升，加热至50度时，在搅拌下加入200千克猪胃黏膜，快速搅拌使酸度均匀，保持45—48度，消化3-4小时，得自溶液。用纱布过滤除去未消化的组织尿蛋白，收集滤液。（3）脱脂、去杂质：将滤液降温至30℃以下，加入15-20％氯仿或乙醚，搅匀后转入沉淀脱脂器内，静置24-48小时，使杂质沉淀，分出弃去，得脱脂酶液。（4）浓缩、干燥：取清酶液，在40℃以下减压浓缩至原体积的1／4左右，再将浓缩液真空干燥。球磨过80-100目筛，即得胃蛋白酶粉。 2胃蛋白酶的分离技术 有机溶剂法
可用于胃蛋白酶的初步提取浓缩。通常使用的有机溶剂有甲醇、乙醇、丙酮、异丙酮，其沉淀蛋白质的能力为：丙酮＞异丙酮＞乙醇＞甲醇。当然此顺序也不是一成不变的，因为还要受温度、pH、离子强度等因素的影响。丙酮沉淀能力最好，但挥发损失多，价格较昂贵，所以工业上常采用乙醇作为沉淀剂。 2．2盐析法 盐析法是酶制剂工业中常用方法之一，硫酸镁、硫酸铵、硫酸钠是常用的盐析剂，其中用的最多的是硫酸铵。美国专利（2，701,228）改进后，用锌盐沉淀胃酶。当母液含醇（或酮）在50%--55%、pH在—时几乎全部胃酶可以用醋酸锌沉淀，沉淀物为胃酶的锌盐，然后用金属螯合剂除去锌盐，得15000—16000倍活力的酶，收集率为%%。此法较上述有机溶剂沉淀所得的胃酶活力和得率都高。 底物亲和法 底物亲和法是利用酶（胃蛋白酶）与其底物（酪蛋白）的亲和性，从胃粘膜中提取得到胃蛋白酶。使底物和酶在的乳酸缓冲液中充分结合，然后调pH至4（底物的等电点）沉淀底物和酶的结合物，随后让沉淀物再溶解于乳酸缓冲液中，添加低浓度的SDS将底物和酶分离，得到酶—SDS复合物，再进一步分离纯化。陈躬瑞（2001）成功的应用此法对蛇胃蛋白酶进行了实验室分离，得率大约为30%。与传统的分离方法比较，此法具有简单高效的优点，为后续的纯化工艺避免了昂贵的活化试剂和配基的使用，同时具有较高的特异性。【2】 透析法 胃蛋白酶的分离过程中还经常用到透析法。该法是利用蛋白质大分子对半透膜的不可透过性而与小分子物质及盐分开的。由于透析主要是扩散过程，如果袋内外的盐浓度相等，扩散就会停止，因此要经常换溶剂，一般一天换2—3次。如在冷处透析，则溶剂也要预先冷却，避免样品变性。透析时的盐是否除净，可用化学试剂或电导仪来检测。【1】 3胃蛋白酶的纯化技术 凝胶过滤法
茶多酚的提取纯化工艺研究
茶多酚的提取纯化工艺研究 一、实验目的:研究茶多酚在茶叶中的大致含量，并分析比较现有的醇提和水提工艺，结合不同的纯化方法，通过具体的实验数据，比较得出其优缺点，为工业化生产提供指导。 二、实验原理：1.，（粗提部分）茶多酚易溶于热水，含水乙醇和乙酸乙酯等溶液中，而不溶于氯仿，苯等试剂，利用茶多酚在上述溶剂中具有具有不同分配系数等特性，经过多次萃取进进行提取分离纯化。 2.，（纯化部分）未氧化的茶多酚及其初级氧化产物易溶于乙酸乙酯 3，（纯化部分）茶多酚能与无机盐中的金属离子(如Ca2+、Mg2+ 、Zn2+ 等)配位生成沉淀而对茶多酚进行分离 4，在一定PH值条件下，酒石酸能与多酚类物质反应形成蓝紫色络合物，该络合物在540nm波长下具有最大吸光度。在适当范围内，茶多酚的含量与络合物的吸光度成正比，符合朗柏-比尔定律，因此可用分光光度法对茶多酚定量分析。 三、实验仪器：干茶，真空干燥箱，分液漏斗，旋转蒸发仪，乙醇，氯仿，乙酸乙酯，纱布，烧杯，玻棒，漏斗，电子天平，水浴锅，95％乙醇，氯化钙(无水)，氯化镁，硫酸，氨水均为分析纯。索氏抽提器；PHS一3C数字酸度计；800型离心沉淀器；GSP一805型圆盘搅拌器；79—1磁力加热搅拌器；UV-9100紫外可见分光光度计；微波炉；LD4—800大容量低速离心机。 四、实验步骤： （一）：茶多酚乙醇提取和有机溶剂纯化实验（3次平行实验） 1、乙醇提取：称茶叶磨碎样3g于烧杯中，加入5倍量（15ml）85%乙醇，将烧杯置于30-40℃水浴锅中，浸提20min,浸提过程不断搅拌，然后滤出滤液，剩下的茶渣再加2-3倍量（约6~9 ml）85%乙醇，再浸提20min,过滤。合并两次滤液。（取3ml留样分析） 2、减压浓缩：将滤液装入旋转蒸发仪中，在40-50度水浴温度下减压浓缩至基本除去乙醇为止。 3、氯仿除去杂质：将浓缩液装入分液漏斗中，将同等体积的氯仿加入，摇匀后混合液分为两层。除去下层液即氯仿层（含有脂溶色素，树脂，咖啡碱等杂质）。上层液再加氯仿萃取3次，直至氯仿层基本无色为止。最后倒出上层液即茶多酚层，用热气驱去残余氯仿及乙醇，冷却。 4、乙酸乙酯萃取茶多酚：由于未氧化的茶多酚及其初级氧化产物易溶于乙酸乙酯，故用乙酸乙酯把茶多酚从水相中萃取出来，乙酸乙酯：水=1:1，乙酸乙酯的密度小于水。放出下层水相，再加乙酸乙酯重复萃取3次。 5、浓缩干燥：上述乙酸乙酯萃取液装入旋转蒸发仪中，在40-50水浴温度下减压浓缩到较小体积，基本除尽乙酸乙酯，剩下的即为纯化后的茶多酚。
黄姜皂素生态生产新工艺的研究
黄姜皂素生态生产新工艺的研究 发表时间：2019-09-03T16:47:40.917Z 来源：《科学与技术》2019年第07期作者：孙艳娟[导读] 皂素纯度及收率均高于传统工艺，整个工艺流程几乎无酸水排放，达到真正的清洁生产。 摘要：黄姜皂素行业特点薯蓣皂素是合成甾体激素药物的基础原料，目前国内市场需求量大。传统水解工艺优缺点：工艺简单，成本低廉，但是原材料消耗大，能源消耗大，污水排放量大，对环境污染大；传统的提取薯蓣皂苷元的方法是直接将盾叶薯蓣根茎用酸水解成苷元，然后用有机溶剂提取薯蓣皂苷元。其缺点是废酸水排放大，对水体的危害非常严重。新工艺采用提取方法得高含量薯蓣皂苷，皂苷用少量酸水解成苷元，酸水用量以浓酸计低于传统工艺的1/50。皂素纯度及收率均高于传统工艺，整个工艺流程几乎无酸水排放，达到真正的清洁生产。关键词：黄姜皂素传统水解工艺薯蓣皂苷元新工艺清洁生产 一、黄姜皂素行业特点 1、黄姜皂素含量比较高，且具有良好的栽培性状，野生资源濒临枯竭，基本转向人工栽培； 2、据资料显示，黄姜的种植面积由10年前的1000万亩上升到4000万亩，扩大了4倍； 3、黄姜主要种植面积集中在湖北、陕西两省，约占全国70%，加工量占全国50%； 4、国内薯蓣皂素生产厂家急剧膨胀，其中陕西加工厂集中在汉江流域，许多生产厂家对污水没有经过任何处理，直接排放，对南水北调中线水源区水质污染十分严重； 5、皂素项目目前有猛增趋势，但皂素生产存在有严重的技术问题，对环境的污染十分不利。 二、传统工艺三废污染情况及急需解决的难点 1、工业废水直接流入渠道，江河，湖泊污染地表水，如果毒性较大会导致水生动植物的死亡甚至绝迹； 2、工业废水还可能渗透到地下水，污染地下水； 3、如果周边居民采用被污染的地表水或地下水作为生活用水，会危害身体健康，重者死亡； 4、工业废水渗入土壤，造成土壤污染。影响植物和土壤中微生物的生长。 5、有些工业废水还带有难闻的恶臭，污染空气。 6、工业废水中的有毒有害物质会被动植物的摄食和吸收作用残留在体内，而后通过食物链到达人体内，对人体造成危害。 四、目前的生产解决途径 1、少用酸，少用水减少被水解物料量提取皂苷后水解利用物理、化学和生物的方法对废水进行处理，使废水净化，减少污染，以至达到废水回收、复用，充分利用水资源 2、不用酸，以生物活性酶解替代酸水解 五、新工艺流程
蛋白酶的工厂设计
年产1500m3蛋白酶的工厂设计 摘要 蛋白酶是催化肽键水解的一类酶，它可迅速水解蛋白质为胨、肽类，广泛存在于动物内脏、植物茎叶、果实和微生物中。同时大多数微生物蛋白酶都是胞外酶。微生物蛋白酶按其作用的最适pH可分为酸性蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶三类。酸性蛋白酶是一种羧基蛋白酶，它的分子质量为30-40kD，等电点（pH3.0-5.0） 酸性蛋白酶现已广泛应用于食品、饲料、酿造、毛皮与皮革、医药、胶原纤维等各个行业之中。本设计采用豆饼粉、玉米粉、淀粉为主要的培养基原料，并选用黑曲霉（Aspergillus niger ）3.350菌种发酵。其中豆饼粉3.75%，玉米粉0.625%，鱼粉0.625%，氯化铵1%，氯化钙0.5%，磷酸氢二钠0.2%。 本设计利用通风搅拌式发酵罐进行发酵，同时利用离子交换树脂对母液进行提取，提高了酸性蛋白酶的生产效率，减少了生产成本。设计还包括发酵罐，全厂平面图，车间平面布置图，工艺流程图。 关键词：酸性蛋白酶发酵工厂设计
The Process Design of the Protease used for Section with the Capacity of 1500m3 Annually Abstract protease is a kind of Peptone and peptide. It has been discover across in animal giblets ,the stem of plant,fruit , microbial and so on.Most of the Microbial protease are ectoenzyme .According to its best Optimum pH function ,Microbial protease Can be divided into Acid protease ,Neutral protease and alkaline protease .Acid protease is a kind of Carboxyl protease , Its molecular weight is 30-40 kd, lower isoelectric point (pH3.0-5.0) Acid protease in food, medicine, textile, leather, feed, cosmetics, washing industries have applications, natural health, avirulent and harmless, quite safe. So in this paper the basic content of more acid protease, production process and application development were introduced. This design USES the bean cake powder, corn flour, starch as the main medium of raw materials, and selects the Aspergillus Niger, Aspergillus Niger) 3.350 bacterial fermentation. With bean cake powder 3.75%, corn flour 3.75%, 0.625% fish meal, 1% ammonium chloride, calcium chloride 0.5%, disodium hydrogen phosphate 0.2%. This design using the ventilation agitator in fermentor, using ion exchange resin in mother liquid was extracted at the same time, improve the efficiency of the acid protease production, reduce the production cost. The design also includes Fermentor, The factory plan, Shop floor plan, Flow Chart. Key Words: Acid protease ; fermentation; plant-design;
菠萝蛋白酶提取方法的研究
菠萝蛋白酶提取方法的研究 本文主要研究了以菠萝废弃物为原料,采用硫酸铵盐析法结合超滤浓缩法的技术从菠萝皮中提取菠萝蛋白酶。首先,在硫酸铵盐析分离提取菠萝皮浸提液中菠萝蛋白酶的过程中,实验研究结果表明,硫酸铵液体加入法要优于固体加入法；随着菠萝皮浸提液的pH值的增大,菠萝蛋白酶的酶活回收率先增大后减小,pH值为7时,得到的菠萝蛋白酶酶活回收率最大,为83.6%；随着硫酸铵浓度的增大,菠萝蛋白酶的酶活回收率先增大后减小,当硫酸铵的饱和度达到40%的时侯,菠 萝蛋白酶的酶活回收率最大,为83.6%；在选定的实验温度范围内,随着温度的升高,菠萝蛋白酶的酶活回收率先增大后减小,20℃时菠萝蛋白酶的酶活回收率最大,为86.9%；随着盐析时间的增加,菠萝蛋白酶的酶活回收率先增大后减小,当盐析时间为60min时菠萝蛋白酶的酶活回收率最大,为89.2%。 其次,在超滤法浓缩提取菠萝皮浸提液中的菠萝蛋白酶的过程中,实验研究结果表明,选择截留分子量为20KD的超滤膜对菠萝皮浸提液进行超滤,收集其截留液,酶活截留率可达94%,或者选择截留分子量为100KD的超滤膜,酶活截留率为10.3%,可收集透过液；随着离心分离转速的增加,菠萝蛋白酶的酶活回收率逐渐增大,当离心分离转速当达到8000rpm转速时,菠萝蛋白酶的酶活截留率不再发生变化,为89.3%；使用20KD的超滤膜时,随着操作压力的增大,超滤膜的渗透通量先增大后减小,当操作压力为0.35MPa时,渗透通量达到最大值为 5.57L·m-2·h-1；使用100KD的超滤膜时,随着操作压力的增大,超滤膜的渗透通量先增大后减小,当操作压力为0.25MPa左右时,渗透通量达到最大值为 7.69L·m-2·h-1；无论是未经过处理,还是经过处理的超滤膜,随着使用次数的增加,其本身的渗透通量都逐渐减小,同时,经超滤菠萝皮浸提液得到的蛋白酶活
酸性蛋白酶的作用机理(仅供参照)
酸性蛋白酶与碱性蛋白酶生产工艺的不同之处？ 酸性蛋白酶是一种在酸性环境下（pH 2.5-4.0）催化蛋白酶水解的酶制剂，适用于酸性介质中水解动植物蛋白质。可用于毛皮软化，酒精发酵，啤酒、果酒澄清，动植物蛋白质水解营养液，羊毛染色，废胶片回收，饲料添加剂等等。本品在酸性条件下有利于皮纤维松散，且软化液可连续使用，是当前理想的毛皮软化酶制剂；在酒精发酵中，添加酸性蛋白酶，能有效水解原料中的蛋白质，破坏原料颗粒粒间细胞壁的结构，有利于糖化酶的作用，使原料中可利用碳源增加，从而可提高原料出酒率；另一方面，蛋白质的水解提高了醪液中α-氨基态氮的含量，促进酵母菌的生长与繁殖，提高发酵速度，从而缩短发酵周期和提高发酵设备的生产能力。 碱性蛋白酶碱性蛋白酶是在碱性条件下水解蛋白质肽键的酶类,是一类非常重要的工业用酶,最早发现于猪胰脏。碱性蛋白酶广泛存在于动、植物及微生物中。微生物蛋白酶均为胞外酶,不仅具有动植物蛋白酶所具有的全部特性,还有下游技术处理相对简单、价格低廉、来源广、菌体易于培养、产量高、高产菌株选育简单、快速、易于实现工业化生产等诸多优点。1945年瑞士M等在地衣芽孢杆菌中发现了微生物碱性蛋白酶。 碱性蛋白酶是由细菌原生质体诱变选育出的地衣芽孢杆菌2709，经深层发酵、提取及精制而成的一种蛋白水解酶，其主要酶成分为地衣芽孢杆菌蛋白酶，是一种丝氨酸型的内切蛋白酶，它能水解蛋白质分
子肽链生成多肽或氨基酸，具有较强的分解蛋白质的能力，广泛应用于食品、医疗、酿造、洗涤、丝绸、制革等行业。 1、碱性蛋白酶是一种无毒、无副作用的蛋白质，属于丝氨酸型内切蛋白酶，应用在食品行业可水解蛋白质分子肽链生成多肽或氨基酸，形成具有独特风味的蛋白质水解液。 2、碱性蛋白酶成功应用于洗涤剂用酶工业，可添加在普通洗衣粉、浓缩洗衣粉和液体洗涤剂当中，既可用于家庭洗衣，也可用于工业洗衣，可以有效的去除血渍、蛋类、乳制品、或肉汁、菜汁等蛋白类的污渍，另外也可作为医用试剂酶清洗生化仪器等。 3、在生物技术领域，碱性蛋白酶可作为工具酶用于核酸纯化过程中的蛋白质（包括核酸酶类）去除，而对DNA无降解作用，避免对DNA 完整性的破坏。 酸性蛋白酶如何灭活第一种方法几乎所有酶都适用，就是加热。第二种，既然是酸性酶，加入强碱应该也是可以的。 酸性蛋白酶产生菌的筛选方法？酸性蛋白酶是一种能在酸性环境下水解蛋白质的酶类，其最适作用pH值为2.5-5.0。由于酸性蛋白酶具有较好的耐酸性，因此被广泛地应用于食品、医药、轻工、皮革工艺以及饲料加工工业中。目前用于工业化生产的酸性蛋白酶大多为霉菌酸性蛋白酶，此类酶的最适作用pH值为3.0左右，当pH值升高时，酸性蛋白酶的酶活会明显降低，且此类酶不耐热，当温度达到50℃以上时很不稳定，从而限制了酸性蛋白酶的应用范围。因此，本研
植物蛋白酶提取纯化工艺
植物蛋白酶提取纯化工艺 生物工程09-2班陈福泉学号：3090343214 一、实验目的 1、了解植物蛋白酶常用的提取纯化方法的基本原理和基本操作； 2、掌握双水相和反胶束萃取的原理和操作步骤； 3、掌握蛋白质含量和蛋白酶酶活的检测方法 二、实验原理 植物蛋白酶常用的提取纯化方法有缓冲盐溶液提取、初步纯化的方法有有机溶剂法、乙醇粉法、丙酮粉法、盐析法、双水相法、反胶束萃取法等 以pH6.0的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液为提取溶剂所得酶活力较高，最佳工艺为：以pH6.0磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液25℃提取2次，料液比1∶1；应用硫酸铵盐析及透析袋透析对粗酶液进行纯化，粗酶液再以60%硫酸铵盐析24h，透析袋（14000）低温透析12h，冻干；酶学性质研究表明：生姜蛋白酶以酪蛋白为底物其最适pH值为 6.0，30℃保温30min，酶活稳定。 三、实验材料 材料与试剂 新鲜生姜、酪蛋白（化学纯）、考马斯亮蓝G-250、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、无水碳酸钠、碳酸氢钠、柠檬酸、硫酸铵、丙酮等试剂均为分析纯。 0.01%（w/v）考马斯亮蓝G-250溶液：将100mg考马斯亮蓝G-250溶于50mL 90%vol乙醇中，加入85%正磷酸100mL，蒸馏水定容至1000mL。 0.5%酪蛋白溶液：称取0.5g酪蛋白，先用少量0.55mol/L碳酸钠溶液润湿，再加少量 0.02 mol/L pH7.5的磷酸缓冲液稀释，水浴中煮沸溶解，定容至100mL。 四、实验步骤 方法一：生姜蛋白酶提取液制备: 取定量新鲜生姜,切成小块后加入10 倍体积的pH 6. 0, 0. 2 mol/ L 磷酸缓冲液( 4 e ) , 于粉碎机中匀桨, 8 层纱布过滤后于4000 rpm 离心10 min, 吸取上清液, 加入高饱和度的( NH4) 2SO4 液使盐析体系中( NH4) 2SO4 终饱和度为60% , 4000 rpm 离心15 min。收集上层不溶物, 用少量pH 7. 50 的柠檬酸缓冲液溶解, 在4 e 下对同种缓冲液透析8 h。透析液定容, 即为生姜蛋白酶提取液。 方法二：生姜蛋白酶的提取取外形完好、无机械损伤和腐烂、富含纤维的生姜，切成小块，与磷酸缓冲液（0.03mol/L，pH7.5，内含1 mmol/L EDTA和5mmol/L L-半胱氨酸）按料液比1：2打浆，所得浆液低速搅拌20m i n，搅拌过程中缓慢加入20％（m/v）固体硫酸铵，四层纱布过滤后，将姜汁4℃下静置2h，离心（4 800rpm，5min）去除沉